Summary
Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.
Abstract
Fare embriyonik kök hücrelerinin nöronal soylara kült haline alınması ve ayırt edilmesi için adım adım prosedürü ve ardından farklılaştırılmış hücreleri karakterize etmek için bir dizi tahlil açıklıyoruz. E14 fare embriyonik kök hücreleri, asılı bırakma yöntemiyle embriyoid cisimleri oluşturmak için kullanıldı ve daha sonra retinoik asit ile nöral progenitör hücrelere farklılaşmaya teşvik edildi ve son olarak nöronlara farklılaştı. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ve immünofluoresans deneyleri, nöral progenitörlerin ve nöronların sırasıyla 8 ve 12. Sox1 promotör güdümlü bir GFP muhabirini ifade eden bir E14 hattında yapılan akış sitometrisi deneyleri, 8. günde hücrelerin yaklaşık% 60'ının GFP pozitif olduğunu ve bu aşamada nöral progenitör hücrelerin başarılı farklılığını gösterdiğini göstermiştir. Son olarak, küresel transkriptomik değişikliklerin profilini çıkarmak için RNA-seq analizi kullanılmıştır. Bu yöntemler, nöronal farklılaşma sırasında hücre kimliği geçişini düzenlemede belirli genlerin ve yolların katılımını analiz etmek için yararlıdır.
Introduction
Gelişmekte olan fare blastosistlerinin iç hücre kütlesinden ilk türetmelerinden bu yana1,2, fare embriyonik kök hücreleri (mESC) kök hücre kendini yenileme ve farklılaşmayı incelemek için güçlü araçlar olarak kullanılmıştır3. Ayrıca, mESC farklılaşması, nörodejeneratif bozukluklar gibi hastalıkların tedavisinde kök hücre bazlı tedavide verimliliği ve güvenliği artırabilecek moleküler mekanizmaların muazzam bir şekilde anlaşılmasına yol açar4. Hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, bu in vitro sistem pratik ve değerlendirmede basitlik, hayvanların aksine hücre hatlarının bakımında düşük maliyet ve genetik manipülasyonlarda göreceli kolaylık gibi birçok avantaj sağlar. Bununla birlikte, farklılaştırılmış hücre türlerinin verimliliği ve kalitesi genellikle farklı mESC çizgilerinin yanı sıra farklılaşma yöntemlerinden etkilenir5,6. Ayrıca, farklılaşma verimliliğini değerlendirmek için geleneksel tahliller, sağlamlıktan yoksun olan seçilmiş marker genlerinin nitel incelemesine dayanır ve bu nedenle gen ifadesindeki küresel değişiklikleri kavrayamazlar.
Burada nöronal farklılaşmanın sistematik olarak değerlendirilmesi için bir dizi tahlil kullanmayı hedefliyoruz. Seçilen belirteçlerde hem geleneksel in vitro analizleri hem de RNA-seq kullanarak, bu süreçteki transkriptomik değişikliklerin yanı sıra farklılaşma verimliliğinin ölçümü için bir platform oluşturuyoruz. Daha önce belirlenmiş bir protokol7'ye dayanarak, asma damla tekniği ile embriyoid cisimleri (EBs) oluşturduk, ardından daha sonra nöral indüksiyon ortamına sahip nöronlara farklılaştırılmış olan nöral progenitör hücreler (NPC' ler) oluşturmak için suprafizyolojik retinoik asit (RA) kullanarak indüksiyon oluşturduk. Farklılaşmanın verimliliğini incelemek için, geleneksel RT-qPCR ve immünofluoresans (IF) testlerine ek olarak, RNA-seq ve akış sitometrisi gerçekleştirdik. Bu analizler, aşamaya özgü farklılaşmanın ilerlemesinin kapsamlı bir ölçümünü sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mESC kültürü
- 10 cm doku kültürü ile işlenmiş bir plakayı% 0.1 jelatin ile kaplayın ve jelatin aspire etmeden önce en az 15-30 dakika ayarlanın.
- Önceden ısıtılmış mESC ortamında (Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) %15 fetal sığır serumu (FBS), esansiyel olmayan amino asitler ile mESC'leri kültlemeden bir gün önce tohum γ ışınlanmış fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler), β-mercaptoethanol, L-glutamin, penisilin/streptomisin, sodyum piruvat, LIF, PD0325901 (PD) ve Chir99021 (CH)).
- E14 hücrelerini kültlemeden önce γ ışınlanmış MEF'lerin yerleşmesine ve plaka yüzeyine bağlanmasına izin verin.
- E14 ESC'leri 37 °C su banyosunda çözün ve hücreleri ılık mESC ortamına sahip 15 cm konik bir tüpte hızla aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 200 x g'da peletin ve süpernatant çıkarın.
- Hücreleri 10 mL mL mESC ortamda yeniden depola ve hücreleri daha önce tohumlanmış γ ışınlanmış MEF'leri içeren kültür plakasına plakala. Hücre kültürünü% 5 CO2altında 37 ° C inkübatörde kuluçkaya yatırın.
- Kültür geçişi için, ortamı epire edin ve plakayı steril 1x PBS ile yıkayın. Plaka yüzeyini kaplayacak ve 37 °C'de 3 dakika kuluçkaya yatıracak kadar % 0,05 trypsin ekleyin.
- Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için trypsin'i mESC orta ve pipetle nötralize edin. Hücreleri 200 x g'da 3 dakika santrifüj edin ve üst yapıyı çıkarın.
- Hücreleri bir hemositometre veya hücre sayacı ile sayın ve 10 cm'lik bir kültür plakasında yaklaşık5.0 x 10 5 hücre tohum.
- Hücreleri 10 mL mL mESC ortamında yeniden biriktirin, jelatin kaplı doku kültürü plakasındaki hücreleri plaka edin ve daha önce açıklandığı gibi kültürleri kuluçkaya yatırın.
NOT: Hücrelerin kolonilerinde farklılaşmalarını önlemek için her 2 günde bir MESC'lerin geçirilmesi önerilir. Ortadaki fenol kırmızısı sadece bir pH göstergesi olarak işlev görüyor ve hücresel yoğunluğa bağlı olarak, 2 günden daha kısa bir sürede sarımsı (daha asidik) hale gelebilir. Bu nedenle, ortamı her gün değiştirmek gerekebilir. γ ışınlanmış MEF'ler birkaç pasajdan sonra sonunda ölecekler.
2. EB, NPC ve nöron farklılaşması
- Daha önce bahsedilen kültür geçirme protokolünü gerçekleştirin ve hücreleri sayın (adım 1.7–1.10).
- Asılı bırakma yöntemi (gün 0)
- 10 cm hücre kültürü plakası için, 20 μL farklılaşma ortamında 5.0 x 102 hücrenin askıyaılacağı kabaca 2.5 x 104 hücre (%15 FBS'li DMEM, esansiyel olmayan amino asitler, β-mercaptoethanol, L-glutamin, penisilin/streptomisin ve sodyum pirruvat) sayar. Hücreleri içeren kabaca elli 20 μL damlacık, 10 cm'lik bir plaka üzerine kaplanabilir.
- Uygun sayıda hücreyi aliquot ve daha sonra 3 dakika boyunca 200 x g'da hücreleri santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.
- Hücreleri,20 μL başına 5,0 x 10 2 hücrelik bir hücre yoğunluğu için uygun farklılaşma ortamı hacminde yeniden biriktirin (örneğin, 1 mL farklılaşma ortamında2,5 x 10 4 hücre).
- Bir mikropipette veya tekrarlayıcı pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 20 μL damlacığı doku kültürü plakasının kapağına yerleştirin. Damlacıkların birleşmesini önlemek için birbirine çok yakın olmadığından emin olun.
NOT: Damlacıklar, plakanın kendisine değil, kapağın üzerine yerleştirileceği için doku kültürüyle işlenmiş bir bağlantı plakasına veya süspansiyon plakasına kaplanabilir. Daha uygulanabilir ve steril bir yaklaşım için, damlacıkları bir bağlantı doku kültürü plakasına plakalayın ve aşağıda açıklandığı gibi bir süspansiyon plakasına aktarın. - Plakayı 5-10 mL 1x PBS ile doldurun ve kapağı dikkatlice tabağa geri koyun. Kültürü 37 °C inkübatörde kuluçkaya yatırın.
NOT: Damlacıkların kurumasını önlemek için kültür plakasına PBS eklenir.
- 2. günde,damlacıkları kapaktan toplamak ve 10 mL farklılaşma ortamı ile dolu 10 cm hücre kültürü süspansiyon plakasına yerleştirmek için bir mikropipette kullanın. Kuluçka makinesinde düşük hızda sallanan bir yörüngesel çalkalayıcı üzerinde kültürü kuluçkaya yatırın.
- 4. günde, EB'leri toplamak için, hücreleri toplayın, 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjün ve süpernatantı çıkarın.
NOT: ED'ler, sonraki deneylerin gereksinimlerine göre 1x PBS ile de yıkanabilir. - Prosedüre devam etmek ve EB farklılaşmasını nöral progenitör hücrelere (NPC' ler) teşvik etmek için, farklılaşma ortamını 5 μM retinoik asit (RA) ile hazırlayın.
- 3 dakika boyunca 100 x g'da 100 x g'da EB'leri peletleyarak eski ortamı çıkarın veya eski ortamı arzulamadan önce ED'lerin yerleşmesine izin verin. Kültür plakasına 5 μM RA içeren farklılaşma ortamının 10 mL'lik kısmını ekleyin.
- 6. günde,plakayı eğerek ve yukarıda açıklandığı gibi ortamı pipetleyarak ortamın en az yarısını 5 μM RA içeren taze ortamla değiştirin.
NOT: Ortamın en az yarısının 5 ve 7. günlerde taze RA içeren ortamla değiştirilmesi önerilir. Fenol kırmızı göstergesini not alın; sarımsı olursa, tüm ortamı değiştirmek en iyisidir. - 8. günde,hücreleri toplayarak, 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj yaparak ve süpernatantı çıkararak NPC'leri hasat edin.
NOT: NPC'ler, sonraki deneylerin ihtiyaçlarına göre 1x PBS ile de yıkanabilir. Gerekirse, NPC'ler daha sonraki kültür ve analizler için dondurulabilir ve tekrar çözülebilir. NPC'ler kültürlenecekse, trypsin'e alternatif olarak accutase de kullanılabilir. - Prosedüre devam etmek ve NPC'leri nöronlara ayırt etmek için, NPC'leri santrifüjleme ile 15 mL konik bir tüpte toplayın, tripsinle ayırın ve 37 ° C'de 3 dakika kuluçkaya yatırın. Tüm NPC agregalarının ayrışmasını sağlamak ve trypsin'i ortamla nötralize etmek için NPC'leri pipetle.
- Hücreleri 40 μm naylon hücre süzgeçli filtreleyin ve hücreleri N2 ortamında 1,5 x 105/cm2 yoğunluğa kaplamadan önce sayın (DMEM/F12 orta + 3 mg/mL glikoz + 3 mg/mL lipid bakımından zengin sığır sonraki PCR ve batı leke deneyleri için doku kültürüyle işlenmiş bir plaka üzerinde serum albümin (LBSA) + 1:100 N2 takviyesi + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL kalem/strep + 1 mM L-glutamin); veya immünofluoresans deneyleri için bir doku kültürü odasında.
- 9. günde,eski ortamı taze bir N2 ortamı ile değiştirin.
- 10. günde,N2 ortamını N2/B27 ortamı (%50 DMEM/F12 ve %50 nöral bazal, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 takviyesi, 1:100 B27 takviyesi, 50 U/mL kalem/strep ve 1 mM L-glutamin) ile değiştirin.
- 11-12 gün, nöronları aşağıdaki gibi hasat edin. Hücreleri 1x PBS ile yıkayın, tripsin ekleyin ve tripini 3 dakika boyunca 200 x g'da orta ve santrifüj ile nötralize etmeden önce 37 °C inkübatördeki kültürü 3 dakika kuluçkaya yatırın.
3. MESC'lerin ve farklılaştırılmış hücrelerin karakterizasyonu
- Alkali fosfataz (AP) tahlili
- Alkali fosfataz aktivitesini değerlendirmek için bir kit kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Ortamı kültür plakasından çıkarın ve ESC'leri 1x PBS ile yıkayın.
- Kit ile birlikte verilen sabit çözeltinin 1 mL'lik kısmını (formaldehit ve metanolden oluşur) tabağa ekleyin ve oda sıcaklığında 2-5 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Düzeltme çözümündeki aşırı inkübasyon AP etkinliğini tehlikeye atabilir. - Düzeltme çözümünü çıkarın, ESC'leri 1x PBS ile yıkayın ve plakada bir miktar PBS bırakın.
NOT: AP etkinliğini tehlikeye atmayacak şekilde ESC'leri PBS'de nemli tutun. - A, B ve C substrat çözümlerini 1:1:1 oranında karıştırarak AP çözümünü hazırlayın. Önce A ve B çözeltilerini karıştırın ve C çözeltisini eklemeden önce karışımı oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın.
- 1x PBS'yi çıkarın ve daha önce hazırlanan AP çözümünü ekleyin.
- Kültür plakasını alüminyum folyo ile sararak veya karanlık bir odada 3.5 adımını gerçekleştirerek ESC'leri karanlıkta yaklaşık 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Reaksiyonun izlenmesi ve spesifik olmayan lekelerin önlenmesi için çözelti parlak olduğunda reaksiyon çözeltisini çıkarın.
- ESC'leri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- ESC'leri 1x PBS veya montaj ortamı ile kaplayarak numunenin kurumasını önleyin.
NOT: AP ifadesi için kırmızı veya mor bir leke görünecektir. Plaka 4 °C buzdolabında saklanabilir.
- RT-qPCR
- ESC'ler, ESB'ler ve NPC'ler için sırasıyla 1.6–1.7 ve 2.4 adımlarını izleyerek çeşitli aşamalarda hücreleri toplayın.
- RNA, DNA ve protein ekstraksiyon çözeltisi kullanarak RNA'yı izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Ters transkriptaz kiti ile cDNA oluşturun (Malzeme Tablosunabakın) ve üreticinin el kitabını izleyin.
- Sabitleme ve gömme
- Yukarıda açıklandığı gibi EBs ve NPC'leri hasat edin (adım 2.6) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1x PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile sabitlayın.
- PFA'yı çıkarın ve numuneyi 1x PBS ile 5 dakika yıkayın.
- Numuneyi 25\u201228 °C'de 1x PBS, %10-, %20 ve %30 sakkaroz çözeltilerinin seri seyreltilmesine yerleştirin ve burada numune 30 dakikalık inkübasyondan sonra bir sonraki çözüme aktarılır.
NOT: Numune, gömme adımına devam etmeden önce% 30 sakkaroz çözeltisinde 4 °C'de saklanabilir. - Numuneyi (istiflemeden) kriyo-kalıbın ortasına yerleştirmeden önce pipet ucunu sakkaroz çözeltisi ile ıslatın ve fazla sıvıyı pipetlayın.
NOT: Filtre kağıdı fazla çözeltiyi çıkarmak için de kullanılabilir. Pipet ucunu sakkaroz çözeltisi ile ıslatmak, EBs ve NPC'lerin ucun duvarlarına yapışmasını önlemek için önemlidir. - Numuneleri yeniden canlandırmadan kalıba optimum kesme sıcaklığı (OCT) çözeltisi dikkatlice ekleyin ve fazla kabarcıkları pipetle çıkarın.
- Numuneyi 15 dakika hafifçe çalkalamak için numuneyi bir laboratuvar mikserine düşük hızda yerleştirin. Bu, EBS ve NPC'lerin OCT çözümünde yeniden nünmeleri durumunda en alta yerleşmesine yardımcı olur.
- Kalıbı sıvı nitrojene veya kuru buza yerleştirerek numuneyi hızla dondurun.
NOT: Numuneler bir sonraki adıma geçmeden önce -70 °C dondurucuda saklanabilir.
- Kriyoseksiyon
- Numuneyi cihaza aktarmadan önce kriyostatı -20 ila -18 °C'ye kadar soğumaya ayarlayın.
- Donmuş OCT bloğunu kalıptan ayırın ve tutucunun yüzeyine yerleştirilmiş küçük bir OCT çözeltisi ile tutucuya sabitleyin.
- EBS'ler ve NPC'ler kesitleme sırasında numunenin kaybolmamasını sağlamak için bıçağa en yakın olacak şekilde OCT bloğunu hizalayın.
- Bloğun 10 μm'lik bölümünü dikkatlice bölümleyin ve numuneyi içeren dilimlere çok dikkat edin.
- Numuneyi içeren OCT dilimini doku gömme cam kaydırağın üzerine hızla yerleştirin ve OCT dilimlerinin oda sıcaklığında 1 saat boyunca havayla kurumasını bekleyin.
NOT: Numuneler daha sonra kullanılmak üzere -70 °C'de saklanabilir.
- İmmünofluoresans (IF)
- %10 normal eşek serumunda nöron içeren OCT bölümlerini veya kültür odalarını bloke edin/%0,1 Triton X-100 1x PBS'de oda sıcaklığında 1 saat.
- %5 normal eşek serumunda seyreltilmiş primer antikordaki örnekleri inkübasyona sokun/%0,05 Triton X-100 1x PBS'de bir gecede 4 °C'de.
- Numuneleri 1x PBS/%0,1 Triton X-100 üç kez 5 dakika boyunca yıkayın.
- Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1x PBS'de %5 normal eşek serumu/%0,05 Triton X-100'de seyreltilmiş ikincil antikorla kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri 1x PBS/%0,1 Triton X-100 üç kez 5 dakika boyunca yıkayın, ardından numuneleri 1 μg/mL DAPI'da kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri bir kapak ve bir miktar montaj ortamı ile monte edin ve kurumasını bekleyin.
- Floresan mikroskop altında örnekleri gözlemleyin.
- RNA-seq analizi
- Hücreleri çeşitli aşamalarda toplayın ve RNA ayıklaması gerçekleştirin (bkz. adım 3.2).
- cDNA kütüphanelerini hazırlayın, Wang ve ark.8'deaçıklanan protokole göre derin sıralama ve veri analizi yapın.
- Gene Ontology (GO) analizini R paketi clusterProfiler kullanarak gerçekleştirin.
- Akış sitometrisi
- 1.6–1.7 adımlarını izleyerek ESC'leri toplayın ve hücreleri orta olarak yeniden uygulayın. 2.4 adımını izleyerek DB'leri ve NPC'leri toplayın ve hücreleri orta olarak yeniden biriktirin.
- 40 μm naylon hücre süzgecini kullanarak hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL konik tüpe filtreleyin.
- Akış sitometresini (kurumun çekirdek tesisi tarafından gerçekleştirilen) kullanarak numunelerin GFP sinyalini ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yöntemimizin bir temsili olarak, E14 hücreleri üzerinde EB, NPC ve nöron farklılaşma deneyi gerçekleştirdik. E14 hücreleri, γ ışınlanmış MEF popülasyonu seyreltilene kadar γ ışınlanmış MEF'lerde kültürlenmiştir (Şekil 1A). Nanog ve Oct4 belirteçleri için Alkalin Fosfataz (AP) boyama ( Şekil 1B ) ve daha sonra RT-qPCR (aşağıya bakın) gerçekleştirerekE14hücrelerinin pluripotency'liğini doğruladık. γ ışınlanmış MEF içermeyen E14 hücreleri daha sonra Şekil 2A'daözetlenen protokol kullanılarak farklılaşma için indüklenmiştir. Kısaca, kültür plakasının kapağına 500 hücre içeren 20 μL'lik farklılaşma ortamı damlacıkları tohumlanmıştır (ayrıntılar için protokol bölüm 2'ye bakın). Oluşan EBs daha sonra toplanarak taze farklılaşma ortamlarında süspansiyona alındı. 4. günden 8. güne kadar, NPC'leri teşvik etmek için kültür plakalarına 5 μM RA eklendi. Farklılaştırılmış EBs yuvarlak şekil gösterdi ve farklılaşma sırasında boyutları artmaya devam etti (Şekil 2B). 8. günde, NPC'ler hasat edildi ve denendi ve daha sonra ortaya çıkan tek hücre süspansiyonu DMEM / F12 ortamında bir doku kültürü odasında N2 takviyesi ve daha sonra B27 takviyesi ile kaplandı. 10. güne kadar, nöronlara farklılaşan NPC'ler uzun hücre şekline sahip gibi görünmektedir (Şekil 2B).
Farklılaşma deneyimimizi daha fazla değerlendirmek için 8. günde E14 NPC'lerde ve 12. günde E14 nöronlarında immünofluoresans (IF) deneyleri gerçekleştirdik. NPC'lerde nestin için pozitif lekelenme ve nöronlar için nörofilament (NF) sinyali gözlemledik (Şekil 3A). Alternatif olarak, RT-qPCR ve RNA-seq, NPC işaret genlerinin indüksiyonunu ve NPC'lerde pluripotency genlerinin kaybını doğruladı (Şekil 3B, D, F). ESC farklılaşması başarısını test etmek için nicel bir yöntem olarak, Sox1 promotör odaklı GFP reporter9'u ifade eden bir fare ESC çizgisini farklılaştırdık ve ardından ESC'ler ve NPC'ler üzerinde akış sitometri analizi yaptık. NPC aşamasındaki toplam hücrelerin %58,7'sinin GFP pozitif olduğunu, ESC aşamasında ise GFP sinyalinin %0,0 olduğunu tespit ettik(Şekil 3C). Farklılaşma sırasındaki transkriptomik değişikliklerin profilini çıkarmak için, E14 ESC'ler, EB gün 3 ve NPC 8 için RNA-seq deneyleri yapıldı ve ilgili aşamalarla ilişkili gen kümeleri ortaya çıkarıldı (Şekil 3D). RNA-seq ısı haritasındaki genler, farklılaşma sırasında farklı aşamalarda farklı olarak ifade edilen genleri tanımlamak için ifade seviyelerine göre sıralandı. Dört gen kümesi için Gen Ontolojisi (GO) analizi, bu kümelerin farklı hücresel fonksiyonlara veya mESC nöronal farklılaşmanın üç hücre aşamasının her birinin kendi aşamasında yüksek oranda ifade edilen ancak diğerlerinde ifade olmayan bir gen grubuna sahip olduğunu gösteren yollara karşılık geldiğini göstermiştir (Şekil 3E). Örneğin, Küme 3'teki genler E14 NPC'lerde diğer aşamalara göre yüksek oranda ifade edilir ve nöronal gelişimle ilgili yollara karşılık gelir. 1, 2 ve 4 kümeleri, herhangi bir mikrop tabakası soy spesifikasyonu ile ilgili yüksek oranda ifade edilen genler içermez, ancak hücresel büyüme ve çoğalma ile ilgilidir. Bu nedenle, RNA-seq ve beraberindeki GO analizi, E14 hücrelerinin farklılaşmanın 8.
Şekil 1: Kültürde E14 ESC'ler. (A) Işık mikroskop görüntüleri, γ ışınlanmış MOF'ların üzerinde kolonilerde büyüyen E14 hücrelerini (siyah ok) göstermektedir. E14 kolonileri, 1. gün ve 3. gün kültürleri arasındaki koloni büyüklüğü farkının görüldüğü gibi çoğalmaya devam eder. (B) E14 ESC'lerin pluripotency alkali fosfataz (AP) lekesi ile doğrulanması. Mor oklar AP lekesi için pozitif olan MESC'leri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: E14'ün EBs, NPC'ler ve nöronlara farklılaşması. (A) Şematik, E14 hücrelerini EBS, NPC'ler ve nöronlar olarak ayırt etmek için ana adımları özetler. (B) E14 ESC'ler LIF ve 2i olmadan orta derecede kültürlenmiş, süspansiyon plakasında, sonraki günlerde büyümeye ve genişlemeye devam ettikleri 2. RA, NPC'lere farklılaşmayı teşvik etmek için farklılaşmanın 4. 4 günlük indüksiyondan sonra, bu NPC'ler alt panelde gösterilen nöronlara farklılaşma için kaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklılaştırılmış hücrelerin karakterizasyonu. (A) Üst paneldeki immünoresans görüntüleri, nestin (yeşil) ve çekirdek (DAPI, mavi) için problanmış 8. Alt panel, nörofilament (yeşil) için araştırılan 12. Birleştirilen görüntülerdeki kırmızı kutu, daha iyi görüntü için 3 kat yakınlaştırılıyor. (B) E14 ESC'lerin ve NPC'lerin pluripotency işaretleyicilerini (Nanog ve Oct4) ve NPC işaretleyicilerini (Pax6, NeuroD1ve Nes) gösteren RT-qPCR analizi ±. 8. günde hem ESC'ler hem de NPC'ler akış sitometrisi ile pozitif GFP floresan sinyali için ölçülmektedir. (D) Isı haritası ESC, EB ve NPC aşamalarında ifade edilen genlerin belirlenen FPKM'si için z-skorlarını gösterir. ESC, EB veya NPC evresinde farklı olarak ifade edilen gen gruplarını gösteren dört farklı gen kümesi tanımlanmıştır. (E) GO analizi, RNA-seq'te tanımlanan dört küme üzerinde R paketi olan clusterProfiler kullanılarak gerçekleştirildi. (F) Grafik, ESC, EB gün 3 ve NPC gün 8 aşamalarında E14 hücreleri için nöral işaretleyiciler, NeuN, Map2 ve Tubb3 gibi diğer üç pluripotency işareti olan Sox2, Klf4ve Myc için FPKM değerlerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare embriyonik kök hücrelerinin sinirsel farklılaşması için yöntem onlarca yıldır oluşturulmuştur ve araştırmacılar önceki protokolleri değiştirmeye veya çeşitli amaçlar için yenilerini oluşturmaya devam etmişlerdir7,10,11. MESC'lerin nöronlara farklılaşma aşamalarının verimliliğini ve ilerlemesini kapsamlı bir şekilde analiz etmek için bir dizi tahlil kullandık, bu da fare veya insan ESC'lerin diğer soy farklılaşmalarının analizinde kullanılabilir. Ayrıca, yaklaşımlarımız belirli genlerin veya yolların nöronal farklılaşma üzerindeki etkisini değerlendirmek için yararlı araçlar olduğunu kanıtlamaktadır in vitro8.
Yöntemlerimiz ile retinoik asit (RA) ile tedavi edilen pluripotent un-committed ESC'ler sinirsel soylara yüksek verimlilikle bağlanır ve nöronlar oluşturmak için daha da indüklenir7. ES hücrelerinin sinir hücrelerine başarılı bir şekilde farklılaştırılmasını iyileştirmek ve heterojenliği azaltmak için, ES hücrelerini farklılaşmamış bir durumda tutmak önemlidir12. γ ışınlama veya mitomycin C ile tedavi edilen proliferatif olmayan MED'ler, ESC'lerin pluripotency'liğini korumak ve büyümeleri için bir iskele sağlamak için işlev görür13,14. Tutarlı sonuçlar elde etmek için, her farklılaşma deneyini γ ışınlanmış MF'lerde kültürlenmiş MESC'lerle başlatıyoruz. Birkaç pasajdan sonra, γ ışınlanmış MF'ler ölür ve kültür sonunda mESC hücreleri için homojen hale gelir. Alternatif olarak, mESC'ler jelatin üzerinde yaklaşık 45 dakika önceden kaplanabilir, γ ışınlanmış MF'ler bir sonraki geçitte daha iyi çıkarmak için tohumlanır. Lösemi inhibitör faktörü (LIF), JAK/STAT yolu15 , 16,17'yiaktive ederek kültürlü fare ES hücrelerinin pluripotency durumunu korumak için uzun zamandır kullanılmaktadır. Daha yakın zamanda, PD0325901 (PD, bir MEK inhibitörü) ve CHIR99021 (CH, bir GSK inhibitörü) ES hücrelerinin ek pluripotency bakımı sağlamak için bulundu3,18. Protokolümüzde, mESC'lerin yüksek pluripotency korumak için LIF ile birlikte bu inhibitörlerle mESC'leri kültürlüyoruz.
Başarılı bir farklılaşma elde etmek için bir diğer kritik faktör de EBs kalitesidir. E14 hücrelerinin farklılaşmasını, diğer araştırmacılar tarafından uygulanan asılı bırakma yöntemi ilegerçekleştiriyoruz 5,19,20. Bu yöntemle, tek ES hücrelerinin kendiliğinden topladıkları ve EB oluşturdukları 2 gün boyunca farklılaşma orta damlacıkta askıya almalarına izin verilir. Elde edilen EBs tipik olarak morfolojileri açısından daha iyi tanımlanmıştır (Şekil 2B), izole edilmiş MESC'leri orta derecede askıya alma yöntemine kıyasla, bu da deneyimimizde çok daha geniş bir aralıkta EB boyutlarına neden olur (veriler gösterilmez). EBs'nin plakalara bağlanmasını önlemek için, farklılaşma sürecine devam eden 3. günden itibaren düşük hızlı bir dönüş yapmak önemlidir. EB'ler, RA ile tedavi ederek NPC'lere farklılaşmak için indüklenir. EB gün 4'te RA tedavisinden elde edilen NPC'ler tipik olarak oligodendrositler ve astrositler21gibi sinir hücreleri için heterojendir. RT-qPCR veya immünoresans kullanılarak, NPC popülasyonu nöron ve astrositler için Gfap ve oligodendrositler için Olig2 gibi diğer sinirsel soy belirteçleri için araştırılabilir. NPC'lerin nöronlara farklılaşmasına daha fazla neden olmak için, NPC'ler en önemli bileşenlerin N2 ve B27 takviyeleri olduğu optimal nöron ortamında kültürlenir. N2 takviyesi esas olarak NPC'lerin nöronal soylara bağlanmalarına yardımcı olurken, B27 takviyesi nöronların uzun ömürlülüğünü korumak için işlev eder.
Örnekler, pluripotency ve ektoderm belirteçleri için RT-qPCR gerçekleştirerek farklılaşma sürecini izlemek için farklılaşma süresi boyunca (örneğin, ESC aşaması, EB gün 2, EB gün 4, NPC gün 6, NPC gün 8, nöronlar gün 10 ve nöronlar gün 12) toplanabilir. Oct4, Nanog, Sox2, Klf4ve Myc gibi pluripotency işaretleyicilerinin farklı hücre aşamaları arasında karşılaştırılması, mESC'lerin pluripotency'liğini doğrulayacaktır (Şekil 3B,F). Sinirsel farklılaşmanın verimliliğini araştırmak için, Hand1, Snai1ve Tbxtgibi mezoderm tabakası için belirteçler; ve Eomes ve Gata4 gibi endoderm katmanı da araştırılabilir (veriler gösterilmez). Daha fazla doğrulama, NPC veya nöronal belirteçler için immünofluoresans (IF) problama ile yapılabilir (Şekil 3A). Ancak, bu yöntemler nicel değildir ve seçilen işaretçilere karşı önyargılı değildir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için akış sitometrisi ve RNA-seq analizlerini(Şekil 3C\u2012F)dahil ediyoruz. Akış sitometrisi deneyinde kullanılan hücre çizgisi, özellikle bu deneyde NPC farklılaşma prosedürünün kalitesini değerlendirmek için kullanılan bir Sox1-GFP E14 hücre hattıdır. Sox1, nöroektoderm gelişimi sırasında en erken spesifik nöronal belirteçlerden biridir22, bu nedenle NPC soyu için mükemmel bir belirteçtir. Sox1, NPC popülasyonunu değerlendirmek için RT-qPCR veya Batı blotunu kullanmak için araştırılabilir. Bu analizler özellikle gen manipülasyonu veya kimyasal tedavinin neden olduğu farklılaşma kusurunu araştırmak için faydalıdır.
Burada sunulan protokolümüze birkaç sınırlama olduğunu belirtmek önemlidir. Her şeyden önce, sadece bir vahşi tip mESC hücre hattı için kapsamlı analiz sunuyoruz. Farelerden veya insanlardan kaynaklanan diğer ESC hatları, başarılı ve verimli nöron farklılaşmasını sağlamak için protokolde değişiklikler ve daha fazla optimizasyon gerektirebilir. İkincisi, doğal olarak kendi sınırlamalarını taşıyan bir in vitro nöron farklılaşma yöntemi sunuyoruz. Daha önce de belirtildiği gibi, EB'ler NPC soyuna doğru sürmek için suprafizyolojik bir RA seviyesi ile tedavi edilir. Elde edilen NPC'ler daha sonra fizyolojik koşulları taklit etmek ve nöron soy bağlılığını, büyümesini ve uzun ömürlülüğünü teşvik etmek için nöron optimum ortama yerleştirilir. Burada, N2 ve B27 takviyeleri nöronları kültürlemek için kullanılır, ancak benzer amaçlar için NS2123 gibi nöron farklılaşmanın başarısını ve verimliliğini değiştirebilecek diğer takviyeler de mevcuttur. Bu durumlar, fizyolojik durumları tam olarak temsil lamayabilecek hücre kültürü tahlillerinde sentetik olarak yeniden inşa edilir. EBs, NPC'ler ve nöronların kalitesi başlangıç mESC'lerine bağlıdır. çok fazla kez geçirilen ve 1 haftadan fazla kültürde tutulan mESC'ler tipik olarak pluripotency kaybetmeye başlar ve başarılı bir şekilde farklılaşmaya maruz kalmayabilir. Bu nedenle, MESC'leri en uygun durumda tutmak, ES, NPC'ler ve nöronlara etkili bir şekilde farklılaşabilmelerini sağlamada anahtardır. 3D modeller gibi diğer nöron kültürü yöntemleri de daha iyi fizyolojik koşulları taklit etmek için önerilmiştir24,25,26 bazen verim ve fizibilite pahasına27,28. Protokollerimizin bu 3D kültür modellerini karakterize etmek için yararlı olduğuna inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarların olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH'den (1R35GM133496-01) Z. Gao'ya verilen bir hibe ile desteklendi. Bölümlemedeki yardımları için Dr. Ryan Hobbs'a teşekkür ederiz. Penn State College of Medicine'ın Genom Bilimleri ve Biyoinformatik, İleri Işık MikroskopiSi Görüntüleme ve Akış Sitometrisi gibi temel tesislerine teşekkür ediyoruz. Ayrıca RNA-seq analizindeki yardımları için Dr. Yuka Imamura'ya teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
