여기서는 흉부 덕트 림프구를 수집하고 시간 경과 사진을 사용하여 3 시간 동안 쥐 페이어의 패치에서 장 열대 림프구의 이동을 관찰하는 정확한 방법을 설명합니다. 이 기술은 림프구의 역학이 염증 성 조건하에서 어떻게 영향을 받는지 명확히 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
순진한 림프구는 생리적인 조건 하에서 림프구에 혈액에서 재순환하고 일반적으로 창 자 면역에 중요 한 현상으로 인식. Peyer의 패치 (PPs) 또는 막질 림프절과 같은 이차 림프구의 기질은 순진한 림프구가 항원을 감지하는 곳입니다. 순진한 림프구는 높은 내피 정맥, PPs에 입력의 포털에 도달하기 위해 혈류를 통해 순환. 일부 면역 조절기는 림프구 이동에 영향을 미치는 것으로 추정되지만, 미세 순환 역학의 정밀한 평가는 매우 어렵고 생체 내에서 림프구 이동을 관찰하는 방법을 확립하는 것은 정밀한 메커니즘의 해명에 기여할 수 있다. 우리는 림프덕에서 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서 장 열대 림프구의 상세한 역학을 관찰하는 방법을 정제했습니다. 우리는 생체 내에서 쥐 P를 관찰하기 위해 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사를 선택하고 시간 경과 사진을 사용하여 기록했습니다. 이제 림프구 역학 분석에 기여할 수 있는 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.
서론
Peyer의 패치 (PPs)는 소장의 라미나 프로프리아에 있는 림프성 여포의 수백으로 이루어져 있습니다. PPs는 여포, 간 간 지역 및 항원 프리젠 테이션에 의해 림프구가 자극되는 여포의 하부에 위치한 발아 센터로 나뉩니다. 포신성 림프관이 없으며 항원들은 상피 세포 층을 통해 장 루멘에서 라미나 프로프리아를 침범합니다. 림프모를 포함하는 상피 영역은 모낭 관련 상피라고하며, 그 내에서 전문화된 M 세포가 점막 항원들을 섭취합니다. M 세포는 발광측과 항원으로부터 항원에서 항원에서 복용한 다음 수지상 세포에 의해 포획되고 높은 내피 정맥(HEV)의 내피성 정맥을 통해 PPs로 흐르는 순진한 림프구를 향해제시된다. PPs는 장 면역에 있는 중요한 역할을 하고 염증의 초기 단계와 관련있습니다. 많은 분자 상호 작용은 접착 분자, 케모키인2,3및스핑고신-1-인산염4를포함하여 이차 림프구 기관(STO)에 림프구의 입구를 포함합니다. 따라서, 많은 예상 된 치료 대상이 있다. 따라서, PPs 내의 림프구 역학을 관찰하면 염증의 초기 단계를 엿볼 수 있으며 여러 유망한 약물의 유용성을 검사 할 수 있습니다.
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프로토콜
실험 프로토콜은 국방 의과 대학의 동물 연구위원회 (No. 16058)에 의해 승인되었다. 동물은 표준 실험실 차우 (CLEA Japan Inc., 도쿄, 일본)에 유지되었습니다. 실험실 동물은 건강의 국가 학회 지침에 따라 취급되었습니다.
1. 림프구의 수집 및 분리
참고: 림프구는 신선해야 하고 저장할 수 없으므로 각 실험에 대해 쥐에서 수집해야 합니다. 또한, 창 자-열대 림프 구체는 순환 흉부 덕트에서 직접 수집 해야 합니다. 모든 절차는 6시간 이내에 완료될 것으로 예상되며 모든 계측기, 장갑 및 표면은 깨끗합니다. 동물을 생리적으로 안정된 상태로 유지하기 위해서는 실험에 사용되는 모든 식염수 및 기타 유체를 따뜻하게 유지해야 합니다.
- 뜨거운 물(약 80~90°C)에 담근 후 헤파린 곡선(반경 약 5mm)과 같은 캐너레이션 튜브(1mm 직경)를 형성하고 몇 시간 전에 접착제 테이프를 사용하여 플라스틱 보드에 고정합니다.
- 미다졸람(2mg/kg), 도미토르(0.15mg/kg), 베툴파르(2.5mg/kg)의 혼합물을 관성 주사로 남성 위스타 쥐(8-12주)를 마취시키고 모발 클리퍼를 사용하여 복부의 체모를 자른다. 모발이 복강에 들어가지 않도록 면도 후 ....
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결과
림프에서 림프구 수집
흉부 덕트 캐넌션에 대한 쥐를 준비하려면 도 1에 표시된 것처럼 긴장된 흉부 덕트에서 절개를 한 다음 도 2에표시된 볼만의 케이지에서 쥐를 유지한다.
림프구가 잘 수집되면 약 20mL/6 h 림프액을 약 10 7~108/mL 림프구를 얻을 수 있습니다. TL 중 70%는 CD4를 발현하며, 그 중 약 90%의 세포가 CD62L을 발현하며, 이는 TDL의 주요 구성(>60%)을 의미합니다. 순진한 창 자-열대 림프구로 구성. 여기서 수집된 림프구는 특히 장내로 이동하는 세포이기 때문에 Peyer의 패치에서 마이그레이션 상태를 평가하기에 적합합니다.
현미경 관찰
형광 림프구의 적절한 복용량을 .......
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토론
여기에서 우리는 순진한 창자 열대 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서그들의 이주를 관찰하기위한 프로토콜을 설명했다. 이 절차는 림프구가 PPs의 microvasculature에서 어떻게 움직이는지 밝히고 정상 또는 약용 조건하에서 그들의 역학을 시각적으로 비교하는 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 역학의 직접적인 관찰은 관측 기간이 불과 몇 시간으로 제한되지만 일부 약물에 의한 면역 학적 수정에 대한 단서를 얻는 데 많은 장점이 있습니다.
우리는 방법에 몇 가지 팁을 언급했다. 그 중 에서도 가장 섬세한 절차 중 하나는 작업자가 흉부 덕트를 빠르고 정확하게 캐너레이트할 수 있어야 한다는 것입니다. 수술이 오랜 시간이 걸리고 불필요한 손상을 수반하는 경우, 상당한 출혈과 염증이 발생하여 결합 조직의 부종과 흉부 덕트의 방해로 인해 TDL 수집이 감소합니다. 우리는 작은 최첨단가있는 가위를 사용하여 흉부 덕트에 작은 절개를 한 후 튜브를 캐너레이트하는 데 사용했습니다. 그러나, 이 절차.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국방의과 대학의 보조금과 일본 보건복지부의 난치성 질병에 대한 연구를 위한 보건 노동과학 연구 보조금에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical | Industries 099-06571 | |
| RPMI 1640 매체 | GIBCO | 11875093 | |
| 텍사스 레드– 덱스트란 | 써모 피셔 사이언티픽 | D1863 |
참고문헌
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-....
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재인쇄 및 허가
