Summary
Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.
Abstract
Los linfocitos ingenuos recirculan de la sangre a los tejidos linfoides bajo condición fisiológica y comúnmente se reconoce como un fenómeno importante en la inmunidad intestinal. El estroma de órganos linfoides secundarios, como los parches de Peyer (PPs) o los ganglios linfáticos mesentericos, es donde los linfocitos ingenuos detectan antígenos. Los linfocitos ingenuos circulan a través del torrente sanguíneo para llegar a ventules endoteliales altos, el portal de entrada en PPs. Se estima que algunos inmunomoduladores influyen en la migración de linfocitos, pero la evaluación precisa de la dinámica de microcirculación es muy difícil, y establecer un método para observar la migración de linfocitos in vivo puede contribuir a la clarificación de los mecanismos precisos. Refinamos el método de recolección de linfocitos del conducto linfático y observando la dinámica detallada de los linfocitos trópicos intestinales en los PPs de rata. Elegimos la microscopía de escaneo láser confocal para observar los PPs de rata in vivo y la grabamos usando fotografía de lapso de tiempo. Ahora podemos obtener imágenes claras que puedan contribuir al análisis de la dinámica de los linfocitos.
Introduction
Los parches de Peyer consisten en cientos de folículos linfoides en la propria lamina del intestino delgado. Los PPs se dividen en folículos, la región interfollicular y los centros germinales ubicados en la parte inferior de los folículos, donde los linfocitos son estimulados por la presentación de antígenos. No hay vasos linfáticos aferentes, y los antígenos invaden la propria lamina del lúmenes intestinales a través de la capa celular epitelial. La región epitelial que cubre folículos linfoides se llama epitelio asociado al folículo, dentro del cual las células M intercaladas especializadas captan antígenos mucosos. Las células M toman antígenos del lado luminal y los antígenos son capturados por células dendríticas y presentados hacia linfocitos ingenuos que fluyen en PPs a través del endotelio de ventules endoteliales altos (HEV)1. Los PPs desempeñan un papel importante en la inmunidad intestinal y están relacionados con la etapa temprana de la inflamación. Muchas interacciones moleculares implican la entrada de linfocitos a órganos linfoides secundarios (SLOs), incluyendo moléculas de adhesión, quimioquinas2,3y esfingosina-1-fosfato4; por lo tanto, hay muchas dianas terapéuticas esperadas. Por lo tanto, observar la dinámica de linfocitos dentro de los PPs nos permite echar un vistazo a la etapa muy temprana de la inflamación y examinar la utilidad de varios fármacos prometedores.
El método aquí se centra en la migración de linfocitos en PPs, que incluye varios procedimientos (cannulación en el conducto torácico5 y recolección de linfocitos y observación a largo plazo después de la inyección en linfocitos recogidos). Dado que estos procedimientos son complejos y era difícil ver exactamente cómo se realizaba cada procedimiento en informes anteriores, mencionamos aquí algunos consejos para lograr una observación exitosa. Por ejemplo, la canulación de los tubos en el conducto torácico fue muy difícil, y la tasa de éxito inicial de la canulación fue inferior al 50%. Sin embargo, mejoramos el método y logramos una tasa de éxito superior al 80%. Mencionamos algunos otros consejos en este manuscrito que son necesarios para la observación exitosa para permitir la evaluación cuantitativa de la migración transendotelial de linfocitos en varias condiciones.
En informes anteriores, era difícil entender los cambios tridimensionales con el tiempo, como la inyección intravenosa de tinta india para manchar la estructura vascular de los PPs6,o el microscopio siendo monofocal7. En los últimos años, un método observacional utilizando algunos animales transgénicos de proteína de fluorescencia fotoconvertible como ratones Kaede han aclarado los movimientos celulares sistemáticos in vivo8. El otro estudio aclaró el apagado independiente CD69 de la salida de linfocitos de PPs9. Utilizamos microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) debido a su alta capacidad analítica. Ahora podemos obtener fácilmente imágenes de alta resolución y utilizarlas para analizar la dinámica de los linfocitos.
En este informe, demostramos una serie de métodos para evaluar la migración de linfocitos en los PPs. En primer lugar, mostramos métodos refinados de canulación de conductos torácicos para recolectar linfocitos. En segundo lugar, mejoramos los métodos de observación de varias maneras para mantener órganos objetivos siempre que sea posible bajo observación microscópica, lo que nos permite obtener imágenes de alta calidad durante 3 horas. En tercer lugar, cuantificamos los movimientos celulares de la migración de linfocitos para evaluar los efectos de algunos medicamentos. Estos protocolos modificados contribuirán al desarrollo de evaluaciones de inmunología mucosa.
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Protocol
El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Investigación Animal del Colegio Médico de Defensa Nacional (nº 16058). Los animales se mantuvieron en la comida de laboratorio estándar (CLEA Japan Inc, Tokio, Japón). Los animales de laboratorio fueron tratados de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Recolección y separación de linfocitos
NOTA: Dado que los linfocitos deben estar frescos y no pueden almacenarse, deben ser recogidos de ratas para cada experimento. Además, los linfocitos trópicos intestinales deben recogerse directamente del conducto torácico donde circulan. Se espera que todos los procedimientos se completen en un plazo de 6 horas, y todos los instrumentos, guantes y superficies estén limpios. Con el fin de mantener a los animales en un estado fisiológicamente estable, todos los salinas y otros fluidos utilizados en el experimento deben mantenerse calientes.
- Formar un tubo de canulación (1 mm de diámetro) como una curva de heparina (un radio de unos 5 mm) después de sumergirlo en agua caliente (aproximadamente 80-90 °C) y fijarlo a una placa de plástico utilizando cinta adhesiva durante unas horas de antelación.
- Anestesiar una rata Wistar macho (8-12 semanas) con inyección intraperitoneal de una mezcla de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) y Betulphar (2,5mg/kg) y cortar el vello corporal del abdomen usando un cortapelos. Retire el cabello firmemente después de afeitarse para que el cabello no entre en la cavidad abdominal.
- Después de confirmar que la profundidad estable de la anestesia requerida para el procedimiento se obtiene mediante pellizco de dedo del pie, hacer una incisión con tijeras quirúrgicas horizontalmente desde la línea media hasta el área subcostal izquierda. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos en el peritoneo parietal observando los vasos bajo la luz.
- Envuelva el estómago con gasa húmeda y mueva el estómago suavemente hacia la derecha fuera del cuerpo para revelar los órganos retroperitoneales. Inserte una muesca entre los músculos erectores de la columna vertebral y el tejido adiposo usando tijeras quirúrgicas y sepámelas sin rodeos con los dedos.
- Retire cuidadosamente el tejido conectivo alrededor del conducto torácico. El exceso de tejido conectivo aumenta con la edad. Exponga el conducto torácico desde justo debajo de los crus izquierdos del diafragma caudalmente hasta que se visibilizó una longitud de 20 mm del conducto torácico. Separe suavemente las adherencias entre el conducto torácico y la aorta utilizando pinzas de precisión o hisopos de algodón húmedo.
- Realice este proceso cuidadosamente porque algunas ratas tienen arterias ramificadas de la arteria abdominal cruzando sobre el conducto torácico o un conducto torácico corto debido a una posición más alta del plexo linfático (pequeños conductos torácicos que se propagan como telarañas). Evite el contacto innecesario con el conducto torácico para evitar inducir edema.
- Aplicar una ligadura por una cuerda (3-0 de seda) en el conducto torácico justo debajo de los crus izquierdos del diafragma. El conducto torácico caudal se distete.
- Hacer un agujero (5 mm de diámetro) en la pared abdominal apuñalando el filo de las tijeras quirúrgicas, pasar el tubo de canulación curvada de horquilla, y ligar el tubo en el músculo iliopsoas en un momento dado. Llene el tubo de canulación con solución salina normal que contenga 10 heparinaS/ml.
- Después de colocar una cuerda (3-0 de seda) debajo del conducto torácico distecido, apuñale el conducto torácico con el borde de corte afilado de un tubo de canulación, lo cannulate hacia la cola de unos 5 mm y ligar el conducto torácico con tubo de canulación para su fijación.
- Para suministrar solución salina para evitar la deshidratación, cree un agujero (3 mm de diámetro) en la pared anterior del átrum del estómago utilizando pinzas de precisión y pase el tubo de silicio (2 mm de diámetro) al duodeno a través del anillo pilórico. Después de coser una herida y mantener a los animales en las jaulas de Bollman, comience a infundir solución salina cargada de azúcar en el duodeno de cada rata desde el tubo de silicio a un caudal de 3 ml/h. Cubra toda la jaula con una toalla de papel para mantenerla caliente.
- Fije el tubo de canulación al agujero en el centro de la tapa de un tubo cónico de 50 ml sobre hielo que contenga 6 heparina U/ml, 10% suero bovino fetal y MEDIO RPMI 1640 (pH 7.4; ver la tabla de materiales) y recoger linfocitos de conducto torácico (TDL) en hielo. Tenga cuidado de no entrar en contacto con la punta del tubo a la pared del tubo cónico para evitar la oclusión del tubo cannulado debido a la formación de coágulos de fibrina dentro del tubo. El líquido linfático (aproximadamente 20 ml) incluyendo aproximadamente 1.0 x 108~ 109 linfocitos se puede obtener en 6 horas. Para obtener los linfocitos bajo anestesia completa, se controla el plano de anestesia y se observa adecuadamente el flujo linfático. Los mismos anestésicos se añaden a la misma dosis unas 3 horas después de que las ratas son puestas en la jaula de Ballman para obtener anestesia profunda continuamente durante 6 horas.
2. Etiquetado de linfocitos con éster de diacetato de carboxofluorescetina (CFDSE)
- Disolver CFDSE (Tabla de Materiales) en sulfóxido de dimetil (DMSO) a 15,6 mM (500 μg de CFDSE disuelto en 60 μL de DMSO).
- Incubar linfocitos (1 x 108~109)en 50 ml de RPMI 1640 con 50 μL de solución CFDSE durante 30 min a 37 °C como se describió anteriormente10.
3. Configuración experimental para estudios microvasculares
- Ratas receptoras de anestesia (8-12 semanas) con inyección intraperitoneal de una mezcla de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) y Betulphar (2,5mg/kg) y confirmar la profundidad de la anestesia por pellizco de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos. Moje el abdomen antes de acicalar la piel para minimizar la contaminación del cabello. A continuación, abra el abdomen de la rata Wister receptora a través de una incisión de línea media.
- Coloque una rata en una placa portátil de acero inoxidable (aproximadamente 120 x 300 mm) con un agujero rectangular alrededor del centro cubierto con un tobogán de vidrio (24 x 50 mm). Elija unos 10 cm del segmento ileal, incluidos los PPs para la observación.
- Mantenga el intestino lo más caliente posible y húmedo con solución salina amortiguada por fosfato (PBS) calentada a 37 °C. Remoje la gasa que se utiliza para cubrir el intestino delgado con PBS.
- Mientras que dar anestesia continua con 2 % isoflurano (ver tabla de materiales), poner la diapositiva en el escenario del microscopio y elegir áreas adecuadas para la observación de la microcirculación en PPs donde algunos HEV están corriendo a través de la serosa. Rango de PPs en tamaño; los más grandes son adecuados para la observación de la microcirculación utilizando CLSM. El intestino delgado no es recto en algunos lugares; un segmento recto de al menos 2 cm de largo sin ninguna tensión es adecuado para la observación.
- Cubra el segmento intestinal adyacente y la mesentería con algodón absorbente empapado con PBS. Coloque el segmento intestinal entre dos bolas de algodón enrolladas y colóquelo lo más lejos posible del cuerpo de la rata para evitar que vibre los latidos del corazón y la respiración de la rata.
- Usando una jeringa de 1 ml, inyecte lentamente (más de 1 min) TDL etiquetados con CFSE (1 x 108 células) en la vena yugular de las ratas receptoras. Una inyección intravenosa rápida puede influir en la circulación sistémica.
4. Microcirculación de linfocitos
- Supervise continuamente los TDLs en la microvasculatura de los PPs utilizando CLSM y grabe en un ordenador durante 3 horas utilizando fotografías de lapso de tiempo a intervalos de 30 s. La profundidad de la serosa al HEV de los PPs es de aproximadamente 25 μm, lo que permite la observación de los vasos linfáticos estroboscópicos y capilares a una profundidad de 30 μm.
- Inyectar Texas Red-dextran (25 mg/kg) en la vena yugular de cada rata receptora para manchar el torrente sanguíneo y Hoechest 33342 (5 mg/kg) para manchar los núcleos celulares.
- (Opcional) Para cuantificar la dinámica de los linfocitos, defina los linfocitos que se adhieren a los HEV durante más de 30 segundos como "linfocitos adhesivos" y linfocitos que emigran de hevs a estroboscómicos como "linfocitos migratorios". A continuación, calcule el porcentaje medio de migración (linfocitos migratorios / linfocitos adhesivos + linfocitos migratorios) por campo de visión (aproximadamente 0,3 mm2).
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Representative Results
Recolección de linfocitos de la linfa
Para preparar la rata para la canulación del conducto torácico, haga una incisión en el tenso conducto torácico como se muestra en la Figura 1 y luego mantenga a la rata en la jaula de un Bollman como se muestra en la Figura 2.
Cuando los linfocitos están bien recogidos, podemos obtener alrededor de 20 ml/6 h de líquido linfático que contiene aproximadamente 107~ 108/mL linfocitos. De los TDL, el 70% expresa CD4, entre los cuales alrededor del 90% de las células expresan CD62L, lo que significa la composición principal de los TDL (>60%) consiste en linfocitos trópicos intestinales ingenuos. Dado que los linfocitos recogidos aquí son células que migran específicamente al tracto intestinal, son adecuados para evaluar el estado de migración en los parches de Peyer.
Observación microscópica
Después de inyectar una dosis adecuada de linfocitos fluorescentes, monte el intestino de la rata receptora en una diapositiva de vidrio como se muestra en la Figura 3. En la Figura 4se muestra una imagen microscópica de los PPs en la condición fisiológica.
Para la micro-observación, las ratas pueden ser anestesiadas establemente bajo laparotomía durante aproximadamente 3 horas. Los linfocitos se adhieren a los HEV, ruedan y migran al estroma circundante, y luego migran a capilares linfáticos. Cuantificamos y evaluamos el porcentaje de linfocitos que migraron en el estroma dentro del período de observación.
Después de la inyección de una dosis adecuada de linfocitos fluorescentes, los linfocitos trópicos intestinales comienzan a adherirse a los HEV y migran a través del endotelio en el estroma en aproximadamente 1 hora. La mayoría se mueven dentro del estroma, mientras que otros migran a capilares linfáticos en aproximadamente 2-3 horas. El etiquetado de fluorescencia ex vivo bien desarrollado en este estudio resultó de alta intensidad y nos permite observar dinámicas de linfocitos de área muy profunda. Además, mediante el uso de un tipo diferente de etiquetado de fluorescencia, podemos observar fácilmente dinámicas de diferentes tipos de linfocitos simultáneamente. Esta migración de linfocitos trópicos intestinales puede ser aclarada visualmente para supresión por algunos inmunomoduladores como FTY720 como se muestra en nuestro informe anterior.
La observación del propio sistema microcirculatorio es extremadamente difícil, y es deseable establecer un método de evaluación fácil. Este estudio también ha hecho posible averiguar dónde está el sitio de acción de la droga en los parches del Peyer. En particular, la administración ex vivo de FTY720 a linfocitos hizo posible limitar el sitio de acción sólo a los linfocitos, pero no al endotelio. Combinado con la clasificación de linfocitos específicos, se obtendrían resultados más detallados.
Figura 1: Procedimiento para exponer el conducto torácico y realizar la canulación. Después de cortar el peritoneo longitudinalmente, el conducto torácico puede exponerse moviendo el estómago cranealmente y diseccionando el tejido conectivo en el lado derecho dorsal de la aorta abdominal. El tejido conectivo alrededor del diafragma debe diseccionarse cuidadosamente para prevenir lesiones. El conducto torácico debe exponerse lo más ampliamente posible cranealmente para crear suficiente espacio para la canulación y luego ligarse por una sutura de seda 3-0 justo debajo del diafragma para detener el flujo de linfa y retener el líquido caudalmente. El líquido linfático lechoso es visible a través del conducto linfático, donde se puede insertar el catéter. El conducto torácico de la rata debe tensarse ligeramente para garantizar una canulación suave. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Una imagen de todo el entorno para recoger linfocitos de conductos torácicos (TDL). Las ratas se mantienen en las jaulas de Bollman y los TDL se recogen a través del tubo de canulación en cada vial. Los viales se establecen en hielo y se reemplazan cada 12 horas para recoger líquido linfático fresco. La solución salina cargada de azúcar se administra a través de un tubo de silicona utilizando una bomba de jeringa a una velocidad de alrededor de 3 ml/h para prevenir la deshidratación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La rata se coloca en el escenario del microscopio conectada a la máquina de anestesia, y se inyecta una sustancia fluorescente o linfocitos con etiqueta fluorescente desde el catéter venoso a través de la vena yugular interna (A). El área de observación del tracto intestinal se arregló suavemente entre dos bolas de algodón enrolladas. El tracto intestinal se arregló lejos del tronco para evitar vibraciones por movimientos respiratorios. Las bolas de algodón enrolladas se remojaron en solución salina tamponada de fosfato para evitar el secado del intestino durante el período de observación (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen microscópica de los parches de Peyer en estado fisiológico (A). Los núcleos de las células endoteliales vasculares están teñidos de azul. El plasma sanguíneo es rojo y el flujo sanguíneo se detecta por el flujo de células no manchadas. Linfocitos trópicos intestinales (verde manchado) adheridos a ventules endoteliales altos (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí describimos un protocolo para recolectar linfocitos ingenuas de intestino y trópicos y observar su migración en PPs de ratas. Estos procedimientos pueden revelar cómo los linfocitos se mueven en la microvasculatura de los PPs y permiten comparar visualmente su dinámica bajo una condición normal o medicada. La observación directa de estas dinámicas tiene mucho mérito para obtener una pista de modificación inmunológica por parte de algunos fármacos, aunque el período observacional se limita a sólo unas pocas horas.
Mencionamos algunos consejos en los métodos. Entre ellos, uno de los procedimientos más delicados es que el operador debe canular el conducto torácico de forma rápida y precisa. Si una operación toma mucho tiempo e implica daños innecesarios, se producen sangrados e inflamación significativos, lo que resulta en una disminución de la recolección de TDL debido al edema del tejido conectivo y la obstrucción del conducto torácico. Solíamos cansar el tubo después de crear una pequeña incisión en el conducto torácico usando tijeras con un pequeño filo de corte. Sin embargo, este procedimiento interfiere con el sitio de canulación debido al drenaje de la linfa. Por lo tanto, ahora no cortamos el conducto torácico; más bien, lo apuñalamos con un borde afilado. Este método facilita la canulación y aumenta las tasas de éxito. Además, el sitio de incisión en el conducto torácico es muy importante debido a la cavidad abdominal limitada. Si el sitio de incisión está demasiado cerca del diafragma, la parte curva del tubo de canulación chocaría contra el diafragma. Si está demasiado lejos del diafragma, también es difícil cannular el tubo lo suficiente como para asegurar la fijación debido al plexo linfático del conducto torácico caudal. Incluso en casos de buena canulación, el tubo de canulación puede ser fácilmente ocluido por la formación de fibrina. Por lo tanto, recomendamos lavar periódicamente suavemente el tubo con heparina.
Los recientes avances en CLSM hicieron posible observar el área enfocada con mayor claridad y precisión en tiempo real en comparación con un estudio anterior11. Ahora usamos CLSM en nuestro laboratorio, pero podemos observar la microcirculación con mayor claridad utilizando un microscopio multifotófonos. Aunque el protocolo requiere modificación en varios puntos junto con los avances técnicos, permite la observación de la zona localizada del órgano de interés12,13.
El mérito y la clave del método es que implica separar los linfocitos de los animales receptores, incubarlos usando cualquier tipo de compuestos in vitro, y observarlos después de su inyección en animales receptores. Esto permite esclarecer los efectos de los linfocitos solo. Por el contrario, si queremos dilucidar los efectos de cualquier tipo de compuestos en células distintas de los linfocitos, como el endotelio vascular, podemos tratar a los animales receptores con cualquier tipo de compuestos y observarlos después de la inyección de linfocitos de control. Para dilucidar las mismas cosas usando ratones, debemos crear animales condicionales genéticamente manipulados uno por uno. Además, la clasificación de los linfocitos aislados mediante el uso de marcadores de superficie específicos permitiría estudiar la dinámica de tipos específicos de linfocitos.
Como se muestra en el video de este estudio, los linfocitos se mueven indefinida y lateralmente a través del endotelio vascular del cuerpo real, por lo que es difícil evaluar los efectos sobre su comportamiento utilizando observaciones in vivo solamente. Además, si se debe examinar el mecanismo de acción de un medicamento administrado, originalmente no es adecuado para examinar cada lugar de acción. El mérito de este estudio es que al separar los linfocitos e incubarlos in vitro, los efectos medicinales se pueden examinar por separado en los lados vascular y linfocito. Menos variables son más fáciles de analizar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por subvenciones del National Defense Medical College y por una beca de investigación de Salud y Ciencias del Trabajo para la investigación sobre enfermedades intratables del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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