Summary
我们提出了一个ECG协议，在技术上简单，便宜，快速，价格实惠的小老鼠，并可以执行与增强的灵敏度。我们建议使用这种方法作为研究小鼠药理剂、基因修饰和疾病模型的筛选方法。
Abstract
心电图是评价心脏传导系统的宝贵工具。动物研究有助于生成有关心电图的新的遗传和药理学信息。然而，在小动物体内进行心电图测量（如小鼠）一直具有挑战性。为此，我们在麻醉小鼠中使用了心电图记录方法，具有许多优点：它是一种技术简单的程序，价格低廉，测量时间短，而且价格实惠，即使在幼鼠中。尽管使用麻醉有局限性，但控制组和实验组之间的比较可以增强灵敏度。我们用自主神经系统的激动剂和拮抗剂治疗小鼠，以确定此协议的有效性，并比较我们的结果与以前的报告。我们的心电图协议检测到使用阿托平治疗的心率和QTc间隔增加，在治疗中降低心率和QTc间隔，以及更高的心率和QTc间隔与异丙氨酸，但没有发现ECG参数在丙丙醇给给。这些结果由以前的报告支持，证实了此 ECG 协议的可靠性。因此，此方法可用作进行心电图测量的筛选方法，否则由于高成本和技术困难，不会尝试进行。
Introduction
心电图（ECG）是测量心跳电活动的测试，是评估心脏传导系统的宝贵工具。由心电图测量的参数包括心率、PR 间隔、QRS 持续时间和 QT 间隔。简言之，PR 间隔对应于电脉冲从心房窦节点通过电序节点到 Purkinje 光纤所需的时间;QRS持续时间是通过Purkinje系统和心室心肌发生心室去极化的时间;和QT间隔是心室再极化的持续时间。
小鼠的心电图记录有助于研究人员检查心脏功能并确定心律失常、心房颤动和心力衰竭等心脏表型的生理和病理生理机制。大多数心血管研究都涉及基因工程小鼠模型的研究。从被基因操纵的小老鼠获得心电图记录方面有意义的数据通常具有挑战性。
在小鼠1中执行心电图的方法有几种。研究表明，有意识的动物的心电图记录在可能的情况下比麻醉动物更可取，因为麻醉对心脏功能的影响已经建立得很好。在有意识的小鼠中记录心电图的两种协议是注1。心电图放射测量系统是连续长期监测意识小鼠1、3中的心电图的黄金标准。尽管无线电测量耦合ECG测量具有强度，但有几个限制，包括安装和植入物的高费用、对经验丰富的操作者的要求、超过1周的稳定期、对大小鼠的需求（> 20g），以及只获得一条ECG记录1的铅。另一个系统，使用爪子大小的导电电极嵌入在一个平台允许心电图记录在有意识的小鼠没有麻醉或植入物1,1，4。这种非侵入性系统是无线电遥测系统不可用的一种替代方法，因为它有许多优点：没有手术治疗的要求，不需要麻醉，每只鼠标成本低（只有初始设置昂贵），测量时间短，新生儿1，4的可负担性。该系统的主要缺点是，它不适合连续的长期监测1。
在这里，我们介绍了麻醉小鼠中另一种廉价、简单、快速的ECG记录方法，并在心脏传导系统自主封锁/刺激后执行心电图，以证明其有效性和灵敏度。我们建议使用这种心电图法来筛选药物、基因修饰和小鼠疾病模型的影响。
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Protocol
所有动物程序均经庆熙大学实验室动物护理和使用地方委员会批准（许可号：KHUASP（SE）-18-108），并符合美国国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南。
1. 实验动物
- 根据实验室动物护理和使用指南，将所有小鼠（39只小鼠，Balb/c，雄性，7\u20129周大）留在无病原体设施中。
- 在恒定温度下保持小鼠在12小时光/暗循环下，可免费获得食物和水。
2. 麻醉剂的准备
注：三溴二醇用于氯胺酮组合和异氟烷，基于心率的稳定性和三溴醇麻醉,小鼠,1、5、6中超声心动图的可重复性1
- 以每1 mL第三醇1克的浓度进行2，2，2-三溴二醇的库存溶液。在 40°u201245 °C 下加热 24 小时，在 4 °C 下存放 12 个月。
- 对于工作溶液，将0.5 mL的库存溶液稀释至19.5 mL的盐水（0.9%NaCl）至25毫克/mL。在 40°u201245 °C 加热 1 小时，在 4 °C 下存放 1 个月。
3. 心电图系统设置
- 确保设置系统，使 2 米内没有噪音或振动，因为鼠标中的 ECG 信号对环境噪音和移动敏感。
- 准备硬件设置：数据采集系统、生物放大器和安装 ECG 数据分析软件的计算机。
- 使用电源线将数据采集系统连接到电源 （AC）。
- 使用 USB 电缆将数据采集系统连接到计算机。
- 使用电缆将生物放大器后面板上的信号输出连接到数据采集系统前面板上的模拟输入。
- 使用 I2C 电缆将数据采集系统的 I2C 输出连接到生物放大器的 I2C 输入。
- 将 3 引脚生物放大器电缆连接到生物放大器前面板上的 6 针输入插座。
- 使用后面板上的开关打开数据采集系统。
注：简言之，信号通过生物放大器进行放大，并使用计算机数据采集和分析系统进行记录，其通道设置如下：采样速率为2 k/s，采样速率为20 mV，低通滤波器设置为200 Hz。
- 打开分析软件程序，并设置它进行心电图数据采集。
- 转到设置 |频道设置。将采样速率设置为2 k/s.将范围设置为20 mV。将输入放大器设置为低通的 200 Hz。
- 转到ECG 分析 |ECG 设置。在"检测和分析预设"设置中选择"鼠标"。
- 在平均面板中，选择将连续心脏循环的 N（例如，4 次节拍或 60 s）串联到平均视图和表视图的单个平均信号中。
- 在 QTc 面板中，选择"Bazett"方法，该方法定义为 QT 间隔的心率校正值：QTc = QT / （RR/100）0.5，RR间隔 = 60 /心率 7。
4. 心电图测量
- 将鼠标放在精密刻度上并记录其重量。
- 通过注射三叶醇的工作溶液（每公斤体重18 mL的工作溶液（b.w.），在小鼠中诱导麻醉。
- 将麻醉小鼠放在上角位置。确保鼠标完全麻醉（少于 2 分钟）。
- 根据铅 II ECG 方案，将针灸针皮下插入左右前肢和左后肢，然后用胶带固定电极（图 1）。确保插入电极的深度和位置在整个实验中保持一致。
- 通过单击电极到 3 引线生物放大器电缆导线另一端的三个捕捉连接器，连接电极的另一端。
- 注射药物（即注射药物）3分钟后麻醉剂已交付（图2）.
- 注射麻醉剂后10分钟开始记录心电图。记录完成后，使用注射麻醉剂后 12 至 17 分钟的心电图数据进行分析。
- 在 ECG 记录会议结束时，小心地取出电极。
5. 心电图数据分析
- 转到ECG 分析 |平均视图并确保软件在单个节拍中正确识别 P 波、QRS 复合和 T 波的开始和结束。如有必要，通过将放错位置的光标移动到适当的位置，可以手动校正这些波和间隔。
注：如图3A 所示，PR 间隔将 P 波的开始范围到 QRS 复合物（主要是小鼠 ECG 中缺少 Q 波）。QRS 持续时间从 Q 波的开始（主要是小鼠 ECG 中的 R 波）延伸到 S 波的末尾。QT 间隔包括 Q 波（主要是小鼠 ECG 中的 R 波）到 T 波结束的开始。请注意，相对于人类心电图8，小鼠心电图中Q波和ST段的持续时间和缺失时间较短。 - 转到ECG 分析 |表通过检查平均视图窗口中的单个节拍来查看和选择正确识别的 ECG 数据。
注：图 3显示了实际鼠标 ECG 信号的几个示例。图 3A表示在 P 波、QRS 复合和 T 波方面正确识别的正常野生类型信号。计算机化选择的 PQRS 波可能会产生错误的错误位置，例如在图 3B中，一个正常的野生类型信号，错位了 P 波的启动。在图 3C中，ECG 信号错放 QRS 复合物的末尾，导致对 QRS 持续时间的高估。在图 3D中，由于 T 波不明确，导致 QRS 复合物的误放，导致 QRS 复合物被低估，图 3E是具有无法识别的 T 波的 ECG 信号。如果没有排除或手动更正，PQRS 间隔可能会超过或低估。请务必选择已正确识别的 ECG 信号和不错过目标峰值的信号。因此，在准确估计心电图参数时，不包括此类情况，包括Figure 3B、C、D和E（图3）。 - 在表视图中选择感兴趣的 ECG 数据，并将其复制/粘贴到电子表格文件中。
6. 统计分析
- 使用统计程序执行统计分析。分析实验条件盲的数据。执行学生t- test 和 Mann-Whitney U 测试进行 2 组比较。每个图中的数字表示每个组使用的鼠标数。将结果报告为均值 = SEM。
- 将与p < 0.05 的 U 检验差异考虑为具有统计显著性：*、p< 0.05; p**， p < 0.01;和***，p < 0.005 与相应的控件。
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Representative Results
药理学实验
为了确定我们的非侵入性心电图测量是否反映了自主调制对心脏传导系统的影响，正常的Balb/c小鼠受到自主神经系统（ANS）的激动剂和拮抗剂的挑战。阿托平和卡巴乔尔分别用于对寄生虫自主性封锁和刺激，而丙醇和异丙醇则分别用于引起交感的自主封锁和刺激。
与车辆（车辆、 391p × 13 bpm vs atropine， 487 × 15 bpm vs 卡巴乔尔，p 158 × 7 bpm; 车辆， 382 × 14 bpm vs 异丙丙烯， 548 × 8 bpm; 车辆， 404 × 25 bpm vs propranol， 303 × 16 bpm） （图 4）. ）.p此外，在阿托平-（p < 0.05）和异丙氨酸治疗小鼠（p< 0.05）中，QTc间隔上升，在治疗巴醇的小鼠中减少（p < 0.005） 与车辆 （车辆， 46.5 × 0.6 ms 与阿托平， 51.1 × 1.3 ms vs 卡巴乔尔， 29.4 × 1.0 ms; 车辆， 41.8 × 1.2 ms 对异丙氨酸， 57.5 × 3.5 ms） （ 图4）. ）.图 5显示了在阿托平、卡巴乔尔和车辆处理小鼠中具有代表性的图表视图和 ECG 信号的平均视图。
图1：ECG铅放置。
针灸针电极根据铅II ECG方案（左右前肢和左后肢）在皮下插入，并用胶带固定。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：麻醉和药物治疗方案。
注射麻醉剂三分钟后（如三溴二醇），给药（如甲丙苯、卡巴多酚、异丙醇和丙醇;即p.）。麻醉剂送达10分钟后，开始记录心电图。注射麻醉剂后12\u201217分钟收集心电图数据。请单击此处查看此图的较大版本。
图 3：鼠标心电图信号示例。
（A） 与P波、QRS复合体和T波正确识别的正常野生型信号。（B） 一种正常的野生型信号，它错放 P 波的开始。（C） 一个心电图信号，错放 QRS 复合物的端。（D） 由于模棱两可的 T 波而错位 QRS 复合物的 ECG 信号。（E） 具有无法识别的 T 波的 ECG 信号。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：使用自主神经系统的激动剂和拮抗剂治疗的小鼠的ECG测量。
（A） 阿托平（1毫克/千克）的剂量会增加心率和QTc间隔。（B） 卡巴乔尔 （0.5 毫克/千克） 降低心率和 QTc 间隔.（C） 异丙醇 （1 毫克/千克） 增加心率和 QTc 间隔。（D） 丙烯（1毫克/千克）不会改变任何心电图参数。*， p < 0.05;， p < 0.005。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：用对等感神经系统的激动剂和拮抗剂治疗的小鼠的代表性心电图信号。
（A） 从图表视图和平均视图（数据分析程序）获取的车辆处理鼠标的 ECG 信号。（B） 被阿托平处理的小鼠的信号。（C） 卡巴多治疗小鼠的信号.请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
协议中有几个关键步骤。周围环境应无噪音和振动。ECG 电极必须稳定且一致地插入皮肤下，插入步骤需要初步实验，直到研究人员在技术上有经验。此外，麻醉剂应适当准备和储存，并在适当的剂量下使用。最后，PQRS 波应在平均视图窗口中的单个 ECG 节拍中适当定位。
我们的研究包括药物测试。但是，如果省略药理学测试，步骤4.7可以通过在麻醉剂注射后5分钟开始记录进行修改，并且ECG数据可在10至15分钟内使用。心电图值在麻醉后15分钟内相对稳定，并在第一次测量5后6小时在同一只小鼠中复制。
药物的自主封锁和刺激引起心率差异反应。在心电图研究中已经使用了几种协议。基于小鼠的遥测心电图记录，阿托平， 异丙氨酸和丙烯醇没有显著改变心率，而卡巴醇显著降低心率（野生型，739 × 33 bpm;阿托平，726 × 5 bpm;卡巴乔尔，205 × 54 bpm;异丙醇，722 × 32 bpm;丙醇，560 × 21 bpm）9。根据使用嵌入平台中的爪子大小的导电电极的非侵入性系统的ECG记录，阿托平和异丙氨酸显著降低小鼠的心率（p < 0.05）， 而丙烯醇没有改变它（p = NS） （野生类型， 706 × 13 bpm; 阿托平， 727 × 12 bpm; 异丙醇， 12 = 2% 增加对控制; 丙醇， 584 × 53 bpm）4，10。有了这种非侵入性心电图系统，异丙醇诱发ST段抑郁症4。
表面心电图信号（通过肢体电极引线II）是在具有超声波系统11的高分辨率跨胸超声心动图（TTE）期间在异氟肛门麻醉下获得的。TTE的ECG记录表明，心率在阿托平11号被点电后15分钟增加。与我们的协议类似，使用 5 针电极（每个肢体植入皮下 1 个电极，将 1 个置于前皮质位置）麻醉下使用三溴二醇进行 6 铅 ECG 记录，这些电极连接到具有放大器集12的数据采集系统。使用这种方法，使用 6 铅心电图， 卡巴乔尔显著降低心率（p < 0.001） 和增加 QT 间隔（p < 0.001）， 但丙醇没有显著改变这两个参数 （野生类型， 395 × 65 bpm; 卡巴乔尔， 177 × 36 bpm; 丙醇， 351 × 30 bpm）12。另一份在麻醉下用三溴二醇进行3铅心电图测量的报告表明，异丙醇显著增加野生型小鼠的心率（p < 0.01）（野生型，422×17 bpm;异丙醇，503~27 bpm）13 。1314总体而言，在麻醉下，心电图测量中的心率低于有意识小鼠的心率。控制组和药物治疗组之间的差异在麻醉下的ECG记录中以及使用嵌入在平台中的爪子大小的导电电极的系统、有意识的鼠标中很好地反映出来，因为心率和QT间隔的变化在治疗中检测到阿托平、卡巴多醇和异丙氨酸，而不是仅用丙丙醇10、11、12、13。10,11,12,13相比之下，遥测心电图记录只检测卡巴乔尔9的心率变化。
这种三溴二醇麻醉下的ECG方法也注意到在给给时与阿托平、卡巴乔尔和异丙氨酸，但不是丙醇的心率和QTc间隔的差异，这意味着其高灵敏度。在这里，通过自主干扰，我们显示了心率和QTc间隔的变化。此外，我们出版了一份手稿，使用我们的ECG方法，描述了PR间隔的变化，另一个手稿描述了QRS持续时间和QTc间隔的变化，部分支持所有PQRS波15，16的灵敏度。
该协议具有许多优点，可与非侵入性方法相媲美，该方法允许ECG在有意识鼠标中记录，并嵌入平台中的爪大小的电极。然而，我们协议的主要限制是使用麻醉剂，如三溴二醇。三溴二苯酚用于氯胺酮组合和异氟烷， 基于心率的稳定性和三叶醇麻醉小鼠超声心动图的可重复性,6，虽然,5有意识动物的心电图记录比麻醉下的动物更受选择，但交感和准同情的音调变化，以及相对较高的心率，有时使有意识的测量在小鼠中低于理想的所有应用超常心电图6。
总的来说，尽管存在局限性（例如，使用麻醉），我们的心电图方法有许多优点：（i） 这是一个技术上简单的程序，只需要在皮肤下稳定插入心电图电极，（ii） 实验成本低 - 支出主要用于初始硬件设置;（iii） 每只小鼠测量时间短，小于20分钟，可对幼鼠进行测量（根据我们的经验，体重为15克）16甚至新生儿（产后2\u20124）17 。17因此，可以快速、无需花费每只小鼠任何费用即可对药物和各类小鼠（如转基因、疾病模型）进行筛选实验，构成可靠和敏感的分析，并可用作电传电图记录以外的附加支持数据。
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Disclosures
提交人不声明任何利益冲突，无论在财务上还是其他方面。
Acknowledgments
这项工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）（2015R1C1A2A0101052419和2018R11A1B07042484）管理的基础科学研究计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G | anesthetics, Avertin |
| Animal | Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan | Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks | |
| Atropine | Sigma-Aldrich | A0123 | parasympathetic antagonist |
| BioAmp | AD Instruments, Bella Vista, Australia | ML132 | bio amplifier |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | parasympathetic agonist |
| Electrodes with acupuncture needles | DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea | DB106 | 0.20 x 15 mm |
| Isoprenaline | Sigma-Aldrich | I2760 | sympathetic agonist |
| LabChart 8 | AD Instruments, Bella Vista, Australia | data analysis software | |
| Mouse food | LabDiet, St. Louis, MO, USA | 5L79 | Mouse diet |
| PowerLab 2/28 | AD Instruments, Bella Vista, Australia | data acquisition system | |
| Propranolol | Sigma-Aldrich | P0884 | sympathetic antagonist |
| SPSS Statistics program | SPSS | SPSS 25.0 | statistics program |
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