Summary
Vi presentiamo un protocollo ECG tecnicamente facile, economico, veloce e conveniente in piccoli topi e che può essere eseguito con una maggiore sensibilità. Suggeriamo questo metodo come approccio di screening per studiare gli agenti farmacologici, le modifiche genetiche e i modelli di malattia nei topi.
Abstract
L'elettrocardiogramma è uno strumento prezioso per valutare il sistema di conduzione cardiaca. La ricerca sugli animali ha contribuito a generare nuove informazioni genetiche e farmacologiche riguardanti l'elettrocardiogramma. Tuttavia, effettuare misurazioni dell'elettrocardiogramma in piccoli animali in vivo, come i topi, è stato impegnativo. A tal fine, abbiamo usato un metodo di registrazione dell'elettrocardiogramma in topi anestesi con molti vantaggi: è una procedura tecnicamente semplice, è poco costosa, ha poco tempo di misurazione ed è conveniente, anche nei giovani topi. Nonostante le limitazioni con l'utilizzo dell'anestesia, i confronti tra il controllo e i gruppi sperimentali possono essere eseguiti con una maggiore sensibilità. Abbiamo trattato topi con agonisti e antagonisti del sistema nervoso autonomo per determinare la validità di questo protocollo e confrontato i nostri risultati con i rapporti precedenti. Il nostro protocollo ECG ha rilevato un aumento della frequenza cardiaca e degli intervalli QTc sul trattamento con atropina, diminuzione della frequenza cardiaca e intervalli QTc dopo il trattamento con carbacholo, e frequenze cardiache e intervalli QTc più elevati con isoprena, ma non ha notato alcuna modifica nei parametri ECG sulla somministrazione del propranolololo. Questi risultati sono supportati da relazioni precedenti, che confermano l'affidabilità di questo protocollo ECG. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato come approccio di screening per effettuare misurazioni ECG che altrimenti non sarebbero tentate a causa di costi elevati e difficoltà tecniche.
Introduction
L'elettrocardiogramma (ECG), un test che misura l'attività elettrica del battito cardiaco, è uno strumento prezioso per valutare il sistema di conduzione cardiaca. I parametri misurati da un ECG includono la frequenza cardiaca, l'intervallo PR, la durata QRS e l'intervallo QT. In breve, l'intervallo PR corrisponde al tempo necessario affinché un impulso elettrico viaggi dal nodo del seno atriale attraverso il nodo atrioventricolare fino alle fibre Purkinje; La durata QRS è il tempo per la depolarizzazione ventricolare che si verifica attraverso il sistema Purkinje e il miocardio ventricolare; e l'intervallo QT è la durata della ripolarizzazione ventricolare.
Le registrazioni ECG nei topi hanno aiutato i ricercatori a esaminare la funzione cardiaca e a determinare i meccanismi fisiologici e patofisiologici dei fenotipi cardiaci, come l'aritmia, la fibrillazione atriale e l'insufficienza cardiaca. La maggior parte della ricerca cardiovascolare ha coinvolto studi su modelli murini geneticamente ingegnerizzati. Spesso è difficile ottenere dati significativi sulle registrazioni ECG da piccoli topi che sono stati geneticamente manipolati.
Esistono diversi metodi per eseguire ECG nei topi1. Gli studi suggeriscono che le registrazioni ECG negli animali coscienti sono preferite rispetto agli animali anestesizzati quando possibile poiché gli effetti dell'anestesia sulla funzione cardiaca sono stati ben stabiliti2. Due protocolli che registrano L'ECG in topi coscienti sono di nota1. Il sistema di radiotelemetria ECG è lo standard d'oro per il monitoraggio continuo a lungo termine di ECG in topi coscienti1,3. Nonostante la loro forza nell'essere registrati in uno stato cosciente, le misurazioni ECG accoppiate alla radiotelemetry hanno diverse limitazioni, tra cui l'elevata spesa per la configurazione e per l'impianto, il suo requisito di un operatore altamente esperto, un periodo di stabilizzazione di oltre 1 settimana, la sua necessità di topi di grandi dimensioni (> 20 g), e l'acquisizione di un solo lead di registrazione ECG1. Un altro sistema che utilizza elettrodi conduttivi di dimensioni dosare incorporati in una piattaforma consente registrazioni ECG in topi coscienti senza anestesia o impianti1,4. Questo sistema non invasivo è un metodo alternativo in situazioni in cui i sistemi di radiotelemetrynono non sono disponibili in quanto non ha molti vantaggi: nessun requisito di trattamento chirurgico, nessuna necessità di anestesia, basso costo per mouse (solo la configurazione iniziale è costosa), tempo per la misurazione e convenienza dei neonati1,4. Lo svantaggio principale di questo sistema è che non è adatto per il monitoraggio continuo a lungo termine1.
Qui introduciamo un altro metodo di registrazione ECG economico, semplice e veloce in topi anestesizzati e dimostriamo la sua validità e sensibilità eseguendo un ECG dopo blocco/stimolazione autonomica del sistema di conduzione cardiaca. Suggeriamo questo metodo ECG per lo screening degli effetti degli agenti farmacologici, delle modifiche genetiche e dei modelli di malattia nei topi.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal comitato locale per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Kyung Hee University (numero di licenza: KHUASP(SE)-18-108) e conformi alla Guida degli Istituti nazionali di salute degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Animali sperimentali
- Tenere tutti i topi (39 topi, Balb/c, maschi, 7-u20129 settimane) in una struttura priva di agenti patogeni, come da guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
- Mantenere i topi su un ciclo di 12 h luce / buio a temperatura costante con accesso gratuito al cibo e all'acqua.
2. Preparazione di anestetici
NOTA: Il tribromoetanolo viene utilizzato su combinazioni di ketamina e isoflurane, in base alla stabilità della frequenza cardiaca e alla riproducibilità dell'ecocardiografia nei topi tribromoetanolo-anestesizzati1,5,6
- Fare una soluzione di magazzino di 2,2,2-tribromoetanolo ad una concentrazione di 1 g per 1 mL di alcool terziario di amil. Riscaldare a 40,u201245 gradi centigradi per 24 h. Conservare a 4 gradi centigradi per 12 mesi.
- Per la soluzione di lavoro, diluire 0,5 mL di soluzione stock in 19,5 mL di salina (0,9% NaCl) a 25 mg/mL. Riscaldare a 40-u201245 s per 1 h. Conservare a 4 gradi centigradi per 1 mese.
3. Configurazione del sistema ECG
- Assicurarsi di impostare il sistema in modo che non vi sia rumore o vibrazione entro 2 m poiché i segnali ECG nel mouse sono sensibili al rumore e al movimento ambientale.
- Preparare la configurazione hardware: un sistema di acquisizione dati, un amplificatore biologico e un computer installato con un software di analisi dei dati ECG.
- Collegare il sistema di acquisizione dati alla rete elettrica (AC) utilizzando il cavo di alimentazione.
- Collegare il sistema di acquisizione dati al computer utilizzando un cavo USB.
- Collegare l'uscita del segnale sul pannello posteriore dell'amplificatore biologico a un ingresso analogico sul pannello anteriore del sistema di acquisizione dati utilizzando un cavo.
- Collegare l'uscita I2C del sistema di acquisizione dati all'ingresso I2C dell'amplificatore biologico utilizzando il cavo I2C.
- Collegare il cavo dell'amplificatore bio a 3 cavi alla presa di ingresso a 6 pin sul pannello anteriore dell'amplificatore biologico.
- Accendere il sistema di acquisizione dati utilizzando l'interruttore sul pannello indietro.
NOTA: In breve, i segnali vengono amplificati attraverso un amplificatore biologico e registrati utilizzando un sistema computerizzato di acquisizione e analisi dei dati con le seguenti impostazioni di canale: velocità di campionamento di 2 k/s, intervallo di 20 mV e impostazione del filtro passa-basso di 200 Hz.
- Aprire il programma software di analisi e configurarlo per l'acquisizione dei dati ECG.
- Andare a Setup (Configurazione) Impostazioni canale. Impostare la frequenza di campionamento su 2 k/s. Impostare l'intervallo su 20 mV. Impostare l'amplificatore di ingresso su 200 Hz di passaggio basso.
- Vai all'analisi ECG Impostazioni ECG. Scegliere "Mouse" nella finestra delle impostazioni Rilevamento e Analisi.
- Nel pannello Media, scegliere di concatenare N (ad esempio, 4 battute o 60 s) cicli cardiaci consecutivi in un unico segnale medio per la vista in media e la vista tabella.
- Nel pannello QTc, selezionare il metodo "Bazett", definito come il valore corretto della frequenza cardiaca dell'intervallo QT: QTc , QT / (RR/100)0,5, intervallo RR : 60 / frequenza cardiaca7.
4. Misurazione ECG
- Posizionare il mouse su una bilancia di precisione e registrarne il peso.
- Indurre l'anestesia nel topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione di lavoro di tribromoetanolo (18 mL di soluzione di lavoro per kg peso corporeo (b.w.)).
- Posizionare un topo anetizzato in posizione supina. Assicurarsi che il mouse sia completamente aerato (meno di 2 min).
- Inserire gli elettrodi con aghi di agopuntura sottocutaneamente negli arti anteriori destro e sinistro e nell'arto posteriore sinistro secondo lo schema ECG di piombo II e fissarli con del nastro adesivo (Figura 1). Assicurarsi che la profondità e la posizione degli elettrodi inseriti siano coerenti durante gli esperimenti.
- Collegare le altre estremità degli elettrodi facendo clic su di esse nei tre connettori a scatto all'altra estremità dei fili di piombo del cavo dell'amplificatore bio a 3 piombo.
- Farmaci per l'iniezione (i.p.) 3 min dopo la consegna degli anestetici (Figura 2).
- Iniziare a registrare l'ECG 10 min dopo l'iniezione di anestetici. Una volta completata la registrazione, utilizzare i dati ECG da 12 a 17 min dopo l'iniezione di anestetici per l'analisi.
- Alla fine della sessione di registrazione ECG, rimuovere con attenzione gli elettrodi.
5. Analisi dei dati ECG
- Vai all'analisi ECG Media Vista e assicurarsi che il software identifichi correttamente l'inizio e la fine dell'onda P, del complesso QRS e dell'onda T in singoli battiti. Se necessario, la correzione manuale di queste onde e intervalli è possibile spostando i cursori spostati nelle posizioni appropriate.
NOTA: come illustrato nella figura 3A, l'intervallo PR si estende l'insorgenza dell'onda P a quella del complesso QRS (per lo più manca l'onda Q in un ECG del mouse). La durata QRS si estende dall'inizio dell'onda Q (principalmente un'onda R in un ECG del topo) fino alla fine dell'onda S. L'intervallo QT comprende l'insorgenza dell'onda Q (per lo più l'onda R in un ECG del topo) fino alla fine dell'onda T. Si noti la durata più breve e l'assenza di un segmento Q wave e ST nel mouse ECG rispetto all'ECG8umano . - Vai all'analisi ECG Vista tabella e selezionare i dati ECG identificati correttamente controllando le singole battute nella finestra Vista media.
NOTA: la figura 3 mostra diversi esempi di segnali ECG del mouse effettivi. Figura 3A rappresenta un normale segnale wild-type che è stato identificato correttamente per quanto riguarda P onda, complesso QRS, e onda T. La selezione computerizzata delle onde PQRS può incorrere in errori di spostamento, come nella Figura 3B un normale segnale wild-type che sposta fuori strada l'insorgenza dell'onda P. Nella figura 3C un segnale ECG che sposta male la fine del complesso QRS, con conseguente sopraelevazione della durata di QRS. Nella figura 3D un segnale ECG che sposta male la fine del complesso QRS, con conseguente sottovalutazione del complesso QRS a causa dell'onda T ambigua e Figura 3E un segnale ECG con un'onda T non identificabile. Senza esclusione o correzioni manuali, gli intervalli PQRS possono essere superati o sottovalutati. Assicurarsi di selezionare i segnali ECG che sono stati identificati correttamente e i segnali che non perdono i picchi di destinazione. Di conseguenza, tali casi, tra cui B, C, D ed E(Figura 3),sono esclusi nella stima accurata dei parametri ECG in generale. - Selezionare i dati ECG di interesse in Visualizza come tabella e copiarli/incollarli in un file di foglio di calcolo.
6. Analisi statistica
- Eseguire l'analisi statistica utilizzando un programma di statistiche. Analizzare i dati con le condizioni sperimentali accecate. Esegui il test tdi Student e il Mann-Whitney U-test per i confronti di 2 gruppi. I numeri in ogni figura indicano il numero di topi utilizzati per ogni gruppo. Segnalare i risultati come media : SEM.
- Considerare le differenze con p < 0,05 per U-test come statisticamente significative: , p < 0,05; p < 0,01; e , p < 0,005 rispetto ai rispettivi controlli.
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Representative Results
Esperimenti farmacologici
Per determinare se la nostra misurazione ECG non invasiva riflette l'influenza della modulazione autonomica sul sistema di conduzione cardiaca, i normali topi Balb/c sono stati sfidati con agonisti e antagonisti del sistema nervoso autonomo (ANS). L'atropina e il carbacholo sono stati utilizzati rispettivamente per il blocco e la stimolazione autonomici parasimpatici, mentre il propranololo e l'isoprenal sono stati somministrati per provocare il blocco e la stimolazione autonomici, rispettivamente9.
La frequenza cardiaca è aumentata in modo significativo nei topi atropina- ((p < 0,05) e nei topi trattati con isoprena (p < 0,05) e diminuita con carbachol (p < 0.005) rispetto al veicolo (veicolo, 391 x 13 bpm contro atropina, 487 x 15 bpm contro carbachol, 158 , 7 bpm; veicolo, 382 x 14 bpm contro isoprena, 548 x 8 bpm; veicolo, 404 bpm contro propranolol, 303 - 16 bpm) (Figura 4). Inoltre, l'intervallo QTc è aumentato nei topi trattati con atropina( (p < 0,05) e in isoprena (p < 0,05) e ridotto in topi trattati con carbachol (p < 0,005) rispetto al veicolo (veicolo, 46,5 x 0,6 ms contro atropina, 51,1 x 1,3 ms contro carbachol, 29,4 x 1,0 ms; veicolo, 41,8 x 1,2 ms contro isoprena, 57,5 x 3,5 ms) (Figura 4). La figura 5 mostra le visualizzazioni dei grafici rappresentative e le viste di media per i segnali ECG nei topi trattati con atropina, carbachol e veicolo.
Figura 1: posizionamento dei lead ECG.
Gli elettrodi ad ago da ago agoniano sono inseriti sottocutaneamente secondo lo schema ECG di piombo II (arti anteriori destro e sinistro e l'arto posteriore sinistro) e sono fissati con nastro adesivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema di trattamenti anestetici e farmacologici.
Tre minuti dopo l'iniezione di anestetici (ad esempio, tribromoetanolo), somministrare farmaci (ad esempio, atrotpina, carbacholo, isoprenal e propranololo; i.p.). Dieci minuti dopo la consegna degli anestetici, iniziare a registrare l'ECG. Raccogliere i dati ECG da 12-u201217 min dopo l'iniezione di anestetici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi di segnali ECG del mouse.
(A) Un normale segnale wild-type che è correttamente identificato per quanto riguarda l'onda P, complesso QRS, e onda T. (B) Un normale segnale wild-type che smarrisce l'insorgenza dell'onda P. (C) Un segnale ECG che smarrisce la fine del complesso QRS. (D) Un segnale ECG che smarrisce la fine del complesso QRS a causa di un'onda T ambigua. (E) Un segnale ECG con un'onda T non identificabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Misurazioni ECG in topi trattati con agonisti e antagonisti del sistema nervoso autonomo.
(A) La somministrazione di atropina (1 mg/kg) aumenta la frequenza cardiaca e l'intervallo QTc. (B) Carbachol (0,5 mg/kg) diminuisce la frequenza cardiaca e l'intervallo QTc. (C) Isoprenalina (1 mg/kg) aumenta la frequenza cardiaca e l'intervallo QTc. (D) Il propranolololo (1 mg/kg) non modifica alcun parametro ECG. p < 0,05; , p < 0.005. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Segnali ECG rappresentativi di topi trattati con agonisti e antagonisti del sistema nervoso parasimpatico.
(A) Segnali ECG del mouse trattato con i veicoli acquisiti da Chart Views e Averaging Views (un programma di analisi dei dati). (B) Segnali del topo trattato con atropina. (C) Segnali del topo trattato con carbachol. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo prevede diversi passaggi critici. L'ambiente circostante dovrebbe essere libero da rumore e vibrazioni. Gli elettrodi ECG devono essere inseriti sotto la pelle in modo stabile e coerente di cui il passo di inserimento richiede esperimenti preliminari fino a quando il ricercatore è tecnicamente esperto. Inoltre, l'anestetico deve essere preparato e conservato in modo appropriato e utilizzato alla dose appropriata. Infine, le onde PQRS dovrebbero essere posizionate in modo appropriato nelle singole battute ECG nella finestra Vista in via di media.
I nostri studi hanno incluso il test dei farmaci. Tuttavia, se i test farmacologici vengono omessi, il passaggio 4.7 può essere modificato iniziando la registrazione di 5 min dopo l'iniezione di anestetici e i dati ECG possono essere utilizzati da 10 a 15 min. I valori ECG sono relativamente stabili oltre 15 min di post-anestesia e sono stati replicati nello stesso topo 6 h dopo la prima misurazione5.
Il blocco autonomo e la stimolazione da parte dei farmaci suscitano risposte differenziali per quanto riguarda la frequenza cardiaca. Diversi protocolli sono stati utilizzati nella ricerca ECG. Sulla base di registrazioni ECG telemeterate in topi, atropina, isoprenaline, e propranolol non ha modificato significativamente la frequenza cardiaca, mentre il carbacholo l'ha significativamente diminuita (wild-type, 739 - 33 bpm; atropina, 726 5 bpm; carbachol, 205 - 54 bpm; isoprenaline, 722 - 32 bpm; propranolol, 560bpm9). Sulla base delle registrazioni ECG del sistema non invasivo che utilizza elettrodi conduttivi di dimensioni dopanti incorporate in una piattaforma, atropina e isoprenaline ha aumentato significativamente la frequenza cardiaca nei topi,10(p < 0.05), mentre il propranololo non l'ha modificata (p - NS) (wild-type, 706 - 13 bpm; atropina, 727 - 12 bpm; isoprenaline, 12 - 2% aumento rispetto al controllo; propranolol, 584pm) Con questo sistema ECG non invasivo, la depressione del segmento ST indotta dalla ISoprenalina4.
I segnali ECG superficiali (piombo II tramite elettrodi degli arti) vengono acquisiti sotto anestesia isoflurana durante l'ecocardiografia transtoracica ad alta risoluzione (TTE) con un sistema a ultrasuoni11. Le registrazioni ECG della TTE hanno suggerito che la frequenza cardiaca è aumentata di 15 minuti dopo la somministrazione di atropina11. Simile al nostro protocollo, registrazioni ECG a 6 derivanti in anestesia con tribromoetanolo che utilizzaelettrodi a 5 aghi (1 elettrodo impiantato sottocutaneo in ogni arto e 1 posto in posizione precordiale) che sono collegati a un sistema di acquisizione dati con un insieme di amplificatori12. Con questo metodo, utilizzando l'ECG a 6 lead, il carbachol ha abbassato significativamente la frequenza cardiaca (p < 0.001) e l'aumento dell'intervallo Di QT (p < 0.001), ma il propranololo non ha modificato in modo significativo nessuno dei due parametri (wild-type, 395 - 65 bpm; carbachol, 177 - 36 bpm; propranolol, 351 -302). Un altro rapporto che ha effettuato misurazioni ECG a 3 derivazioni in anestesia con tribromoetanolo ha mostrato che l'isoprenalina ha aumentato significativamente la frequenza cardiaca nei topi selvatici (p < 0.01) (wild-type, 422 - 17 bpm; isoprenaline, 503 - 27 bpm)13. 14 Nel complesso, la frequenza cardiaca è più bassa nelle misurazioni ECG in anestesia rispetto a quelle in un topo cosciente. Le differenze tra i gruppi di controllo e di trattamento farmacologico si riflettono bene nelle registrazioni ECG in anestesia e dal sistema che utilizza elettrodi conduttivi di dimensioni dopanti incorporati in una piattaforma, in un topo consapevole, perché i cambiamenti nella frequenza cardiaca e nell'intervallo QT sono rilevati sul trattamento con atropina, carbachol e isoprenalma ma non propranolol da solo10,11,,1313. Al contrario, le registrazioni ECG telecmetriche rilevano solo cambiamenti nella frequenza cardiaca da carbachol9.
Questo metodo ECG in anestesia con tribromoetanolo rileva anche differenze nella frequenza cardiaca e nell'intervallo QTc nella somministrazione con atropina, carbacholo e isoprenal ma non propranololo, implicando la sua elevata sensibilità. Qui con disturbi autonomici, abbiamo mostrato cambiamenti nella frequenza cardiaca e nell'intervallo QTc. Inoltre abbiamo pubblicato un manoscritto con il nostro metodo ECG che descrive un cambiamento nell'intervallo PR e un altro che affronta i cambiamenti nella durata QRS e nell'intervallo QTc, sostenendo parzialmente la sensibilità in tutte le onde PQRS15,16.
Il protocollo ha molti vantaggi paragonabili al metodo non invasivo che consente la registrazione ECG in un topo cosciente con elettrodi di dimensioni zampa incorporati in una piattaforma. Tuttavia, la principale limitazione del nostro protocollo è l'uso di anestetici come il tribromoetanolo. Il tribromoetanolo è usato su combinazioni di ketamina e isoflurane, sulla base della stabilità della frequenza cardiaca e della riproducibilità dell'ecocardiografia nei topi tribromoetanolo anetizzato1,5,6 Anche se le registrazioni ECG in un animale cosciente sono preferite a quelle sotto l'anestesia, variazioni nel tono simpatico e parasimpatico, e la frequenza cardiaca relativamente elevata a volte rendono le misurazioni in topi coscienti meno ideali di tutte le applicazioni dell'ecocardiografia6.
Nel complesso, nonostante i suoi limiti (ad esempio, l'uso dell'anestesia), il nostro metodo ECG ha molti vantaggi: (i) è una procedura tecnicamente semplice che richiede solo l'inserimento stabile di elettrodi ECG sotto la pelle, (ii) ha bassi costi sperimentali - l'esborso è principalmente per la configurazione hardware iniziale; (iii) ha tempi di misurazione brevi inferiori a 20 min per mouse, e può essere condotto su giovani topi (>15 g peso corporeo, nella nostra esperienza)16 e anche neonati (giorni postnatali 2,u20124)17. Pertanto, gli esperimenti di screening per i farmaci e vari tipi di topi (ad esempio, modelli geneticamente modificati, di malattia) possono essere eseguiti rapidamente e senza molto costo per mouse, costituendo un'analisi affidabile e sensibile e possono essere utilizzati come dati di supporto aggiuntivi al di là delle registrazioni ECG telemetririzzate.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dai programmi di ricerca scientifica di base gestiti dalla National Research Foundation of Korea (NRF) (2015R1C1A2A01052419 e 2018R1D1A1B07042484).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G | anesthetics, Avertin |
| Animal | Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan | Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks | |
| Atropine | Sigma-Aldrich | A0123 | parasympathetic antagonist |
| BioAmp | AD Instruments, Bella Vista, Australia | ML132 | bio amplifier |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | parasympathetic agonist |
| Electrodes with acupuncture needles | DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea | DB106 | 0.20 x 15 mm |
| Isoprenaline | Sigma-Aldrich | I2760 | sympathetic agonist |
| LabChart 8 | AD Instruments, Bella Vista, Australia | data analysis software | |
| Mouse food | LabDiet, St. Louis, MO, USA | 5L79 | Mouse diet |
| PowerLab 2/28 | AD Instruments, Bella Vista, Australia | data acquisition system | |
| Propranolol | Sigma-Aldrich | P0884 | sympathetic antagonist |
| SPSS Statistics program | SPSS | SPSS 25.0 | statistics program |
References
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