Summary
אנו מציגים שיטה ללא הנדסה גנטית (ללא GM) כדי להשיג תאים עם פנוטיפ עצבי מתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש. הפעלה של מסלול איתות המקושר לחלבון חדשני הקשור ל- GPI אנושי חושפת שיטה יעילה ללא GM להשגת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
Abstract
הפרעות נוירולוגיות אנושיות רבות נגרמות על ידי ניוון של נוירונים ותאי גליה במוח. בשל מגבלות באסטרטגיות פרמקולוגיות וטיפוליות אחרות, אין כיום תרופה זמינה למוח הפגוע או החולה. החלפת תאים מופיעה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה לתנאים ניווניות. עד היום, תאי גזע עצביים (NSCs) נוצרו בהצלחה מרקמות עובריות, תאים עובריים אנושיים (ES) או תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC). תהליך של דיפרנציה יזם על ידי הפעלה של גליקופרוטאין אנושי חדשני הקשור ל- GPI, המוביל ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטים. תאי גזע פלוריפוטנטים אלה שמקורם בדם (BD-PSCs) מבדילים במבחנה לתאים עם פנוטיפ עצבי כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיה brightfield ו- immunofluorescence. ניתוח אולטרה-מבני של תאים אלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים מאשר את המבנה הפרימיטיבי שלהם, כמו גם מורפולוגיה דמוית נוירונים ומאפיינים תת-תאיים.
Introduction
פיתוח שיטות מחקר בסיסיות ופרה-קליניות של תאי גזע מעודד יישום קליני של טיפולים מבוססי תאי גזע למחלות נוירולוגיות. טיפול פוטנציאלי כזה תלוי באופן קריטי בשיטה ליצירת תאים עצביים אנושיים המובילים להתאוששות תפקודית1.
תאי גזע עצביים (NSCs) מחדשים ומבדילים לנוירונים חדשים לאורך החיים בתהליך הנקרא נוירוגנזה בוגרת. רק אזורי מוח מוגבלים מאוד מכילים NSCs המוכשרים ליצור נוירונים שזה עתה נולדו בבגרות. NSCs כאלה יכולים להוליד נוירונים בוגרים, המעורבים בלמידה ובזיכרון, ובכך להחליף נוירונים אבודים או פגומים. למרבה הצער, NSCs אלה נמצאים בכמויות מוגבלות זה neurogenesis מוגבל פוחתת במהירות במהלך התפתחות לנוער2. לכן, מקורות אחרים של תאים עצביים חייבים להיחשב במטרה טיפול בתא.
מחלות נוירולוגיות ניווניות קשה לרפא באמצעות גישות פרמקולוגיות סטנדרטיות. אסטרטגיות טיפוליות חדשות לאימוץ הפרעות נוירולוגיות רבות שאינן ניתנות לחיסון מבוססות על טיפולים בתחליפי תאים של רקמה חולה ופצועה. השתלת המל"ל יכולה להחליף תאים פגומים ולספק השפעות מועילות. מקורות אחרים להחלפת תאים עצביים כוללים תאי גזע עובריים אנושיים (ESC), הנגזרים ממסת התא הפנימית של הבלסטוציסטות של היונקים3, כמו גם IPSCs4, אשר יש יכולת התחדשות עצמית נרחבת כמו ESCs ומסוגלים להבדיל לתוך שושלות תאים שונות. NSCs יכול גם להיווצר על ידי תכנות מחדש ישיר מפיברובלסטים אנושיים הימנעות מצב pluripotent5.
טיפול בתחליפי תאים הוא עדיין נושא מאתגר. למרות ש- ESC, עוברי או IPS יכולים להיות מקור ליצירת תאים עצביים לטיפול במחלות נוירולוגיות רבות חשוכות מרפא, החלפת תאי SCs למבוגרים אוטולוגיים של רקמות פגומות היא חלופה טובה יותר שעוקפת חששות אימונולוגיים, אתיים ובטיחותיים.
הפעלה של חלבון הקשור ל- GPI אנושי על ידי קישור נוגדנים באמצעות זרחן של PLCγ / PI3K / Akt / mTor / PTEN יוזמת דיפרנציאציה של תאי צאצא דם ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטים שמקורם בדם (BD-PSCs)6. תאים אלה מבדילים במבחנה כלפי תאים עצביים כפי שאושרו באמצעות ניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים בהירה, אימונופלואורסצנטיות ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM).
בעבודה זו אנו מתארים את הדור ללא GM של מחשבי BD-PSCs ואת ההבחנה מחדש המוצלחת שלהם לתאים עם פנוטיפ עצבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אישורים אתיים התקבלו בעת ביצוע הניסויים.
1. בידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMNCs)
- ודא שכל התורמים חתמו על הסכמה מדעת לפני נסיגת דם בהתאם להנחיות המוסדיות.
- קח 30 מ"ל של דם מתורמים בריאים על ידי צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.
- בודד מחשבי PBMNCs לפי מדיית מעבר צבע בצפיפות. השתמש 10 מ"ל של מדיה עם 25 מ"ל של דם 1:1 מדולל עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 30 דקות.
- בודדו את השכבה הבין-ביזה בין הפלזמה למדיה ההדרגתית בצפיפות על-ידי צנרת. לשטוף את התאים המבודדים עם 5 מ"ל של PBS סטרילי וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות. חזור פעמיים.
- ספירת מספר התאים בשיטות סטנדרטיות באמצעות תא ספירה.
2. הפעלה של גליקופרוטאין מעוגן GPI אנושי על ידי קישור נוגדנים על פני השטח של PBMNCs
- מקם את 6 x 106 תאים מונונוקלאריים (MNCs) בצינורות 15 מ"ל ולבצע שיתוף בין נוגדנים על ידי הדגירה של התאים עם נוגדן ספציפי לחלבון ממברנה הקשור ל- GPI אנושי (30 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 30 דקות ב- PBS עם אלבומין סרום בקר 1% (BSA) ב 37 °C (37 °F).
- החלף מדיום דגירה במדיום Dulbecco המותאם של Iscove בתוספת סרום בקר עוברי 10%.
- לגדל תאים ב 15 mL צינורות פוליסטירן, לשים את הצינורות באינקובטור ב 37 °C ו 5% CO2 במשך 8-10 ימים (ללא רועד). על D5, להוסיף 1-2 מ"ל נוספים של מדיום של Iscove בתוספת עם 10% FBS לכל צינור 15 מ"ל.
3. מיון של תאים שהופקו לאחרונה
- ספירת תאים עם מונה תאים אוטומטי (השעיית תא 18 μL + 2 μL פלואורסצנטיות צבע) או בתא ספירה.
- מתלה תא בתרבית צנטריפוגה (5-7 x 106) ב 300 x g במשך 10 דקות ושאף את supernatant וכתוצאה מכך עם פיפטת פסטר סטרילי.
- להשעות מחדש את גלולה התא ב 90 μL של PBS מקורר מראש pH 7.2, 0.5% BSA ו 2 mM EDTA.
- הוסף CD45 חרוזים מגנטיים בגודל ננו חיובי (80 μL) השעיית התא ודגרה על קרח במשך 15 דקות.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חוצץ PBS צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות.
- להשעות מחדש את התאים ב- 500 μL של מאגר PBS.
- לשטוף את העמודה עם 500 μL של חוצץ PBS מקורר מראש ומניחים אותו בשדה המגנטי.
- מקם את מתלה התא על העמודה ולשטוף אותו עם 500 μL של מאגר PBS (פעמיים) ואת זרימת הצנטריפוגה המכילה CD45 תאים שליליים. לאסוף אותם במדיום של Iscove בתוספת עם 1% BSA.
- תספור את התאים בתא הספירה.
4. הכנת מנות תרבית תאים לבידול עצבי של תאי גזע חדשים שנוצרו
- מצופים את כלי התרבות עם פולי-L-אורניתין ולמינין לגידול תאים עצביים.
- מניחים את כיסויי הזכוכית בצלחות 4-well ומצופה אותו עם 1:5 פולי-L-אורניתין מדולל (0.1 מ"ג / מ"ל ב ddH2O) ב ddH2O. מניחים את כיסויים לתוך אינקובטור 37 °C במשך 1 שעה. ואז לשטוף עם ddH2O.
- מפשירים לאט למינין (0.5-2.0 מ"ג/מ"ל) ומוסיפים לראש כיסויים. לדגור אותו ב 37 °C (55 °F) במשך 2 שעות.
- הכן אינדוקציה עצבית בינוני N2 המורכב 49 מ"ל של D-MEM / F12, 500 μL של תוספת N2, 400 μL של חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), פתרון FGF בסיסי בריכוז סופי 20 ננוגרם / מ"ל (מוכן מ 100 תמיסת מלאי מיקרוגרם / מ"ל), והפרין בריכוז סופי 2 ng / mL.
- הסר למינין עודף על ידי pipetting ולהוסיף N2 בינוני עצבי מנות תרבות.
5. פולחן של תאי דם נוירונים מפוזרים
- תרבית BD נגזר CD45 תאים שליליים על למינין / אורניתין מצופה מכסה במשך יומיים באינקובטור ב 37 °C (5% CO2 במדיום N2 ליזום בידול עצבי של תאים חדשים שנוצרו על ידי BD.
- תאי תרבות עוד יותר במדיום בידול עצבי המורכב 48 מ"ל של בינוני Neurobasal, 500 μL של L-גלוטמין, 1 מ"ל של תוספת B27, 500 μL של NEAA, 50 μL של גורם נוירוטרופי גליה אנושי רקומביננטי (GDNF) ב 5 מיקרוגרם / 250 μL ב PBS / 0.1% BSA, ו 50 μL של המוח האנושי רקומביננטי נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF) ב 5 מיקרוגרם / 200 μL ב PBS / 0.1% BSA ו 50 μL של פתרון חומצה אסקורבית 2.9 גרם / 50 מ"ל ב- PBS. מניחים צלחות באינקובטור ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
6. ניתוח מיקרוסקופיה חיסונית של תאים עצביים שמקורם בדם
- תרבית את התאים כמתואר לעיל במשך 16 ימים ולהסיר את המדיה.
- דגירה עם קיבוע מחמם מראש המורכב 75 מ"ל של מים סטריליים, 4 גרם של paraformaldehyde. מוסיפים 10 N NaOH לפי הצורך ומערבבים עד שהפתרון מתפנה. לאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של 10x PBS, 0.5 מ"ל של MgCl2, 2 מ"ל של 0.5 M EGTA, ו 4 גרם של סוכרוז. טיrate ל- pH 7.4 עם 6 N HCl, ולהביא ל 100 מ"ל של מים סטריליים במשך 15 דקות, על פי Marchenko ואח'7.
- להשליך את הקיבעון ולשטוף את התאים 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם. הוסיפו מיד תמיסה טריה של טריטון X 0.3% וחלחלו לתאים למשך 5 דקות. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS ולהוסיף פתרון חסימה שנעשה על ידי PBS ו- 5% BSA.
- לחסום את התאים בטמפרטורת החדר על צלחת רוקר במשך שעה אחת.
- הכן דילול מתאים של נוגדנים ב 1% BSA / PBS ודגר את התאים עם דילול נוגדנים על צלחת רוקר במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד, לדגור על התאים עם DAPI ולהעלות את כיסויים עם מדיה הרכבה להדמיה על מיקרוסקופ.
הערה: נוגדנים המסומנים ישירות המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלת החומרים.
7. ניתוח מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור של תאים שנוצרו לאחרונה
- זרע את התאים עבור TEM בשקופיות תא 8-well.
- תקן את התאים ב 3.5% גלוטרדהיד עבור 1 שעות ב 37 °C (55 °F), לאחר תיקון ב 2% OsO4 במשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר וכתם 2% אצטט אורניל בחושך ב 4 °C (50 °F) במשך 2 שעות 30 דקות.
- לבסוף, לשטוף את התאים במים מזוקקים, לייבש אותו באתנול ולהטביע שרף אפוקסי לילה. למחרת להעביר את הדגימות לתנור 70 מעלות צלזיוס עבור 72 שעות עבור התקשות שרף.
- נתק את תרביות התא המוטבעות מהשקופית התאית והדבק לבלוקי ארלדיט.
- חותכים מקטעים טוריים דקים למחצה (1.5 מיקרומטר) עם מכונה, נטענים על מגלשות זכוכית ומכתימים קלות עם כחול טולואידין 1%.
- הדבק מקטעים דקים למחצה בחרו לבלוקי ארלדיט וניתקו אותם ממגלשת הזכוכית על ידי הקפאה חוזרת (בחנקן נוזלי) והפשרה.
- הכן מקטעים דקים במיוחד (0.06-0.08 מיקרומטר) עם מכונה וניגודיות נוספת עם ציטוט עופרת.
- השג מיקרוגרפים באמצעות מיקרוסקופ סריקת אלקטרונים עם מצלמה דיגיטלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות מספקות ראיות לכך ששיטה חדשנית זו ללא GM מסוגלת להחזיר תאי אבות דם למצבם הפרימיטיבי ביותר מבלי לפעול ישירות על הגנום האנושי.
הוכחנו בעבר כי קישור נוגדנים ספציפי לחלבון הקשור ל- GPI יוזם באמצעות PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation של גנים רלוונטיים התפתחותית שמורים מאוד כגון WNT, NOTCH ו- C-Kit, ובכך יוזםתהליךשל דיפרנציה שמוביל לשלב הראשון ליצירת HSCs ושני ואחרון לדור של BD-PSCs 6,8.
תרביות MNC מופעלות היו נתונות למיון אימונומי באמצעות חיידקי CD45. תאי דם בוגרים שלא ניתן לתכנת מחדש בשיטה זו (למשל, תאים חיוביים CD45) נשמרו בעמודה, ואילו השבר השלילי המכיל תאים מתוכנתים מחדש (CD45 תאים שליליים) שימש ליצירת תאי שושלת עצביים שונים.
חקרנו לראשונה את ההיבטים המורפולוגיים של תאים היקפיים המופרשים BD באמצעות אור ו- TEM. כפי שניתן לראות באיור 1,קישור נוגדני גליקופרוטאין ספציפיים המעוגנים GPI של MNCs אנושיים מייצר אוכלוסייה חדשה וגדלה של תאים (איור 1A). ניתחנו את התאים האלה באמצעות TEM. תאים בעלי דיפרנציה BD קטנים ומציגים את המאפיינים של תאים אגרנוליים לא בוגרים, עם בהדרגה פחות אברונים ונגרעינים גדולים עם כרומטין מרוכז, בדומה ל- ESCs (איור 1B). תרבויות שאינן מטופלות הראו מגמה של היעלמות הדרגתית.
BD-CD45 תאים שליליים היו נתונים בידול עצבי בשני שלבים. יזמנו את ההבחנה כלפי שושלות עצביות על ידי זריעת התאים השליליים CD45 על לוחות תרבות מצופים פולי-L-אורניתין / למינין במשך יומיים במדיום N2 בעקבות תרבית במדיום בידול עצבי. תמונות ברייטפילד נרכשו בימים 4, 8, 10, 14 ו -30 בהתאמה עם תחילת בידול עצבי של תאי גזע שנוצרו על ידי BD.
כבר 4 ימים לאחר תחילת ההבחנה הממוקדת של תאים חדשים שנוצרו, ניתן היה לזהות את התאים העצביים הראשונים עם מבנים ארוכים להסתעפות. אנו מתבוננים בשינויים המורפולוגיים מ-D2 עד D30 עם מבנה מורכב יותר הכולל השלכות, מה שמרמז על תהליך פעיל לבידול לשושלות עצביות לאורך כל תקופת הזמן התרבותית (איור 2). כדי לאשר את התכונות העצביות של תאים מובחנים מחדש לאחר culturing אותם במדיום עצבי במשך 16 ימים, תאים תוקנו על פי פרוטוקול קודם7, וחיסון (ICC) בוצע באמצעות זיהוי נוגדנים לקנן, חלבון חומצי פרברי גליה (GFAP), חלבון הקשור microtubule 2 (MAP2) ו בטא-טובולין III ספציפי נוירון (Tuj1).
GFAP הוא החלבון המהווה חלק של ציטוסקלטון באסטרוציטים המייצגים את חוט הביניים העיקרי של אסטרוציטים בוגרים. כפי שמוצג באיור 3, הנוגדן ל- GFAP מזהה מבנים אלה בתאים העצביים החדשים שנוצרו, ומאשר כי מחשבי BD מסוגלים להבחין מחדש בין אסטרוציטים אנושיים9.
MAP2 הוא חלבון ציטוסקלטון שנקשר לטובולי ומייצב מיקרוטובולים. זה בא לידי ביטוי בתוך אקסונים, דנדריטים וגופי תאים וביטוי זה הוא רקמה - ספציפי התפתחותית. תוצאות המיקרוסקופיה האימונופלואורסצנטית מאשרות את הביטוי של חלבון זה בתאים מובחנים מחדש10.
Tuj1 הוא סמן תא עצבי טיפוסי. תפקידו הוא לייצב microtubili בגוף התא העצבי אקסונים. זה גם מעורב בתחבורה אקסונית11. תאים חדשים שהובחנו מחדש אישרו בבירור את הביטוי של חלבון זה ב- D16 עם תחילת הבידול העצבי בתנאי המתואר כאן.
נסטין התאפיין לראשונה ב- NSCs ומייצג חלבון תאי גזע אפיתל עצבי, השייך לחלבון חוט ביניים (IF)12 המבדיל בין תאי אבות עצביים מתאי עצב מובחנים יותר. חלבוני IF אלה באים לידי ביטוי בעיקר בתאי עצב שבהם הם מעורבים בצמיחה הרדיאלית של האקסון, אך הם נמצאים גם במספר רקמות נוספות. Nestin כסמן של NSCs בעיקר מתבטא חלש בתאים כבר על הנתיב כדי להבדיל לתוך שושלות עצביות ספציפיות כפי שהוא המקרה עם BD-מחדש תאים מובחנים ב D16.
איור 1: דור תאי גזע מפוזרים (פלוריפוטנטים). (A) תאים מונונוקלאריים מבודדי פיקול גדלו במדיום של Iscove בתוספת 10% FBS. מיקרוגרפים של תאים בתרבית מופעלים נלקחו בימים 1, 5 ו -10, בהתאמה. MNCs שאינם מופעלים נחקרו כפקד. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (B) ניתוח TEM של תאים חדשים שנוצרו לאורך זמן התרבות מראה כי אברונים של תאים בוגרים (D1) נעלמים בהדרגה (D8), מה שמוביל ליצירת תאים מפוזרים לחלוטין הדומים ל- ESCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הבחנה מחדש נוירו של מחשבי BD. (א) תאים מצופים BD הונחו במנות תרבות מצופות אורניתין/למינין ותרבות במשך 30 יום כמתואר בפרוטוקול. מיקרוגרפים נלקחים בימים 4, 8, 10, 14 ו -30 בהתאמה, לאחר שגדלו בתנאי בידול עצביים. רוב התאים בתרבית שינו את המורפולוגיה שלהם מצורות כדוריות קטנות לצורות גדולות ומוארכות יותר ובמקרים מסוימים הסתעפו תאים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) תאים BD-dederentiated גדלו במשך 16 ימים במדיום עצבי, קבוע glutaraldehyde וניתוח EM שבוצעו כמתואר בסעיף פרוטוקול. גוף התא והתהליכים של תאים אלה הראו מורכבות גבוהה יותר מאלה של תאים לא מופרעים במונחים של אברונים וציטוסקלטון המציגים צפיפות גבוהה של בור ים מוערם של רטיקולום אנדופלסמי מחוספס וחבילות שופעות של חוטי אקטין (א, ב). שלא כמו תאי BD לא מובחנים, תאים הגדלים במדיה בידול נוצרו לעתים קרובות אנשי קשר בין תאים. חלק ממגעים מיוחדים אלה כללו גוף תאי (ג) בעוד שאחרים כללו תהליכים תאיים בצורה דמוית נויריט (ד). סרגלי קנה מידה: (א) 20 מיקרומטר; (b-d), 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אימונופנוטיפינג של תאים עצביים חדשים שנוצרו. תאים DD-dederentiated היו תרבית כמתואר בפרוטוקול במשך 16 ימים ניתוח אימונוציטוכימיה בוצע באמצעות נוגדנים סמנים עצביים קנין, GFAP, MAP2 ו Tuj1. מוצגים מיקרוגרפים בהירים של תאים מובחנים מחדש המלווים בתמונות אימונופלואורסצנטיות עם DAPI ככתמים גרעיניים, כמו גם כתמים בנוגדנים רלוונטיים. מתוארים השדות המציגים אוכלוסייה מסוימת המבטאית את אחד הסמן העצבי הספציפי האופייני לקווים ספציפיים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. השליטה מוצגת באיור 1 המשלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: בקרת תאים מפוזרים BD. תאי BD לא מופקים מתורבתים במדיום של Iscove Dulbecco שונה בתוספת 10% FBS במשך 16 ימים כמתואר בפרוטוקול ומוכתם בנוגדן לקנן GFAP, Tuj1 ו- MAP2. DAPI שימש להכתמת גרעין. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת התמנות מחדש של תאים אנושיים המתוארים בעבודה זו מבוססת על הפעלה ממברנה לגרעין של מכונות איתותים מאחורי גליקופרוטאין הממברנה האנושית הקשורה ל- GPI היוזמת את תהליך הדיפרנציאציה המובילה ליצירת ex vivo והרחבת מחשבים מתחדשים עצמית המתקבלים מדם היקפי אנושי שאינו מניפולציה. תאים אלה כאשר מתורבתים במדיה המתאימה מסוגלים להבדיל מחדש לתאים השייכים לשכבות נבט שונות6.
הנתונים המוצגים בעבודה זו מראים כי תאי BD-PSCs שנוצרו ללא GM כאשר תרבית במדיה בידול עצבי רכש פנוטיפ שונה לחלוטין, עם צורות מוארכות, פיתוח גבוה יותר של organelles שלהם ויצר אינטראקציות מורכבות יותר בין תאים. יתר על כן, הבחנה מחדש באמצעות מצב המתואר כאן, מרמז על הבחנה עצבית כלפי שושלות עצביות שונות.
כדי להשיג את המספר האופטימלי ואת האיכות הטובה ביותר של תאים מתוכנתים מחדש לשימושם במחקרי בידול מחדש, תכשירי MNC טריים עשויים להיות יתרון בהשוואה להכנות MNC קפואות. שיטת המיון האימונומגנטי שהפריד בין מחשבי BD-PSCs לתאים מובחנים באופן סופני שלא ניתן לתכנת מחדש בשיטה זו יכולה להיות חלקית הדורשת לחזור על ההליך, וזה מלחיץ מאוד עבור תאים וגורם למותם בטרם עת.
השלב הקריטי בפרוטוקול מתייחס למספר ולאיכות של MNCs שניתן להשיג בשיטה המתוארת. שינוי של מדיה בידול עצבי, כמו גם זמן תרבות יכול לשפר את פוטנציאל הבידול של BD-PSCs, ובכך להוביל לייצור סוגים ספציפיים של תאים עצביים.
מגבלה של שיטה זו היא האופי הלא טרטוגני של תאים אלה מתוכנתים מחדש מכיוון שלא ניתן ליצור את קווי התא בשיטה זו. ברגע שהתאים המושפלים הגיעו לשלב הסופי, זה של פלוריפוטנס, הם הופכים בעיקר לשקט וחלק חדש של MNCs חייב להיות מפוזר שוב כדי לקבל מספר גבוה יותר של BD-PSCs.
תכנות מחדש המתואר כאן מסתמך על הפעלת קישור נוגדנים על פני השטח של תאי אבות הדם. פרדיגמה זו מספקת יתרונות פוטנציאליים רבים ביחס לבטיחות קלינית בהשוואה לשיטות GM. המטרה של השגת תאי גזע אוטולוגיים לייצור רקמות עצביות יכולה להיות מושגת על ידי מניפולציה אקס ויוו מינימלית; לכן מציע בחום כי טיפול בתא זה יכול להיות מועמד מבטיח לגישה קלינית יעילה ובטוחה בנוירולוגיה.
מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר ואיסכמיה מוחית הן בין המחלות עם הנטל החברתי והכלכלי הגבוה ביותר עבור החברה באירופה ובעולם. נטל ההפרעות הנוירודגנרטיביות צפוי לגדול עם הזדקנות האוכלוסייה, להפוך לבעיה חברתית-כלכלית חשובה וליצור צורך נואש בתשובה לבעיה. השיטה המוצגת פותחת שדרה חדשה לאסטרטגיות טיפוליות לא פולשניות על ידי ניצול הליך פשוט וחסכוני ליצירת אוכלוסיות תאי גזע אוטולוגיות מתאימות המחזיקות בתקווה לריפוי מחלות נוירולוגיות בלתי פתירות כיום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברת המקבילה מצהירה כי היא מחזיקת פטנט הקשורה לחלבון הקשור ל- GPI אנושי חדשני, כמו גם היא ייסדה ועובדת עבור ACA CELL Biotech. המחברים האחרים מצהירים כי אין להם כל ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
מוקדש לזכרו של ד"ר ריינר סאפריך.
המחברים אסירי תודה במיוחד לחוזה מנואל גרסיה-ורדוגו ווויסנטה הרנץ-פרז על ביצוע ניסויים וניתוח EM במעבדה לנוירוביולוגיה השוואתית, מכון קוואניל למגוון ביולוגי וביולוגיה אבולוציונית, אוניברסיטת ולנסיה, CIBERNED, ולנסיה, ספרד, שנתמכה על ידי מימון מחקר מענק פרומטאו לקבוצות מחקר מצוינות PROMETEO/2019/075. שאר העבודה נתמכה על ידי ACA CELL ביוטכנולוגיה GmbH היידלברג, גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
