Summary
Представлен генетически модифицированный (gm-free) метод получения клеток с нейрональным фенотипом из перепрограммированных клеток периферической крови. Активация сигнального пути, связанного с новым человеческим GPI-связанным белком, показывает эффективный безГМ-метод получения плюрипотентных стволовых клеток человека.
Abstract
Многие неврологические расстройства человека вызваны дегенерацией нейронов и глиальных клеток в головном мозге. Из-за ограничений в фармакологических и других терапевтических стратегиях в настоящее время нет доступного лечения для поврежденного или больного мозга. Замена клеток является многообещающей терапевтической стратегией для нейродегенеративных состояний. По сей день нервные стволовые клетки (НСК) успешно генерируются из тканей плода, эмбриональных клеток человека (ЭС) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). Процесс дедифференциации был инициирован активацией нового человеческого GPI-связанного гликопротеина, который приводит к генерации плюрипотентных стволовых клеток. Эти полученные из крови плюрипотентные стволовые клетки (BD-PSC) дифференцируются in vitro в клетки с нейронным фенотипом, как показано в яркой и иммунофлуоресцентной микроскопии. Ультраструктурный анализ этих клеток с помощью электронной микроскопии подтверждает их примитивную структуру, а также нейроновидную морфологию и субклеточные характеристики.
Introduction
Разработка основных и доклинических методов исследования стволовых клеток способствует клиническому применению терапии на основе стволовых клеток для неврологических заболеваний. Такая потенциальная терапия критически зависит от метода генерации нервных клеток человека, приводящего к функциональномувосстановлению1.
Нервные стволовые клетки (НСК) самообновляются и дифференцируются в новые нейроны на протяжении всей жизни в процессе, называемом взрослым нейрогенезом. Только очень ограниченные области мозга содержат НСК, компетентные генерировать новорожденные нейроны во взрослом возрасте. Такие НСК могут давать начало зрелым нейронам, которые участвуют в обучении и памяти, заменяя таким образом потерянные или поврежденные нейроны. К сожалению, эти НСК присутствуют в ограниченных количествах, и этот ограниченный нейрогенез быстро уменьшается во время развития ювенильнойособи 2. Поэтому другие источники нервных клеток должны учитываться в цели клеточной терапии.
Дегенеративные неврологические заболевания трудно вылечить с помощью стандартных фармакологических подходов. Новые терапевтические стратегии для охвата многих немедикабельных неврологических расстройств основаны на клеточной заместительной терапии больных и поврежденных тканей. Трансплантация NSC может заменить поврежденные клетки и обеспечить полезные эффекты. Другие источники замещения нервных клеток включают эмбриональные стволовые клетки человека (ESC), которые получены из внутренней клеточной массы бластоцист млекопитающих3,а также iPSCs4,которые обладают обширной способностью к самообновлению, как ЭСК, и способны дифференцироваться в различные клеточные линии. НСК также могут генерироваться путем прямого перепрограммирования из фибробластов человека, избегая плюрипотентного состояния5.
Клеточная заместительная терапия по-прежнему является сложной проблемой. Хотя ESC, fetal или iPS могут быть источником генерации нейрональных клеток для лечения многих неизлечимых неврологических заболеваний, аутологичная замена клеток SCs у взрослых поврежденных тканей является лучшей альтернативой, которая обходит иммунологические, этические проблемы и проблемы безопасности.
Активация человеческого GPI-связанного белка путем сшивания антител путем фосфорилирования PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN инициирует дедифференцировку клеток-прогениторов крови и генерацию плюрипотентных стволовых клеток крови (BD-PSC)6. Эти клетки дифференцируются in vitro к нейрональным клеткам, что подтверждается с помощью анализа Brightfield, иммунофлуоресценции и просвечивательной электронной микроскопии (TEM).
В этой работе мы описываем ГМ-свободную генерацию BD-PSC и их успешную редифференцировку в клетки с нейрональным фенотипом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этические одобрения были получены при проведении экспериментов.
1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови человека (ПБМНК)
- Обеспечить, чтобы все доноры подписали информированное согласие до изъятия крови в соответствии с институциональными руководящими принципами.
- Возьмите 30 мл крови у здоровых доноров обученным медицинским персоналом по стандартному протоколу.
- Изолируйте PBMMC по среде градиента плотности. Используют 10 мл среды с 25 мл крови 1:1, разбавленной фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS), и центрифугу в 300 х г в течение 30 мин.
- Изолируют межфазный слой между плазмой и средой градиента плотности путем пипетирования. Промыть изолированные клетки 5 мл стерильного PBS и центрифугой при 300 х г в течение 10 мин. Повторить дважды.
- Подсчитывайте количество ячеек стандартными методами с помощью счетной камеры.
2. Активация гликопротеина человека, закрепленного GPI, путем сшивания антител на поверхности PBMNCs
- Поместите 6 x 106 мононуклеарных клеток (MНК) в пробирки по 15 мл и выполните сшивание антител путем инкубации клеток с человеческим GPI-связанным мембранным белково-специфическим антителом (30 мкг/мл) в течение 30 мин в PBS с 1% бычонного сывороточного альбумина (BSA) при 37 °C.
- Замените инкубационную среду модифицированной средой Dulbecco от Iscove, дополненной 10% фетальной бычий сывороткой (FBS).
- Вырастите клетки в 15 мл полистирольных трубок, поместите трубки в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 на 8-10 дней (без встряхивания). На D5 добавьте дополнительно 1-2 мл среды Iscove, дополненной 10% FBS, к каждой трубке 15 мл.
3. Сортировка вновь генерируемых дедифференцированных клеток
- Подсчитывайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячеек (18 мкл клеточной суспензии + 2 мкл флуоресцентного красителя) или в счетной камере.
- Центрифугу культивируют клеточной суспензией (5-7х 10 6)при 300 х г в течение 10 мин и аспирируют полученный супернатант стерильной пипеткой Пастера.
- Повторно суспендируют ячейку гранулы в 90 мкл предварительно охлажденного PBS pH 7,2, 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
- Добавьте CD45 положительные наноразмерные магнитные шарики (80 мкл) в клеточную суспензию и инкубируют на льду в течение 15 минут.
- Промыть ячейки, добавив 2 мл буфера PBS и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин.
- Повторно приостановить клетки в 500 мкл буфера PBS.
- Промыте колонну 500 мкл предварительно охлажденного буфера PBS и поместите его в магнитное поле.
- Поместите клеточную суспензию на колонку и промыть ее 500 мкл буфера PBS (два раза) и потоком центрифуги, содержащим CD45 отрицательные ячейки. Соберите их в среде Iscove, дополненной 1% BSA.
- Подсчитайте ячейки в счетной камере.
4. Приготовление блюд для клеточной культуры для нейронной дифференцировки вновь генерируемых стволовых клеток
- Покрывают сосуды культуры поли-L-орнитином и ламинином для выращивания нейрональных клеток.
- Поместите стеклянные крышки в 4-луночные пластины и положите их разбавленным поли-L-орнитином (0,1 мг/мл в ddH2O) в ddH2O. Поместите крышки в инкубатор при 37 °C в течение 1 ч. Затем промыть ddH2O.
- Медленно разморозить ламинин (0,5-2,0 мг/мл) и добавить в верхнюю часть обшивки. Инкубировать при 37 °C в течение 2 ч.
- Получают нейронную индукционную среду N2, состоящую из 49 мл D-MEM/F12, 500 мкл добавки N2, 400 мкл незаменимых аминокислот (NEAA), основного раствора FGF при конечной концентрации 20 нг/мл (приготовленного из 100 мкг/мл раствора) и гепарина при конечной концентрации 2 нг/мл.
- Удалите избыток ламинина путем пипетирования и добавьте нейронную среду N2 в культуральную посуду.
5. Культивирование нейрональных дедифференцированных клеток крови
- Культивировать CD45-отрицательные клетки, полученные из BD, на стеклянные покровы с покрытием ламинин/орнитин в течение 2 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в среде N2, чтобы инициировать нейронную дифференцировку новых BD-генерируемых клеток.
- Культивировать клетки далее в нейрональной дифференцировальной среде, состоящей из 48 мл нейробазальной среды, 500 мкл L-глутамина, 1 мл добавки B27, 500 мкл NEAA, 50 мкл рекомбинантного человеческого глиального нейротрофического фактора (GDNF) при 5 мкг/250 мкл в PBS/0,1% BSA и 50 мкл рекомбинантного нейротрофического фактора человеческого мозга (BDNF) при 5 мкг/200 мкл в PBS/0,1% BSA и 50 мкл раствора аскорбиновой кислоты 2,9 г/50 мл в PBS. Поместите пластины в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
6. Иммунофлуоресцентный микроскопический анализ нервных клеток крови
- Культивируйте клетки, как описано выше, в течение 16 дней и удалите меа.
- Инкубировать предварительно подогретым фиксатором, состоящим из 75 мл стерильной воды, 4 г параформальдегида. При необходимости добавьте 10 Н NaOH и перемешивайте до тех пор, пока раствор не очистится. Затем добавляют 10 мл 10x PBS, 0,5 мл MgCl2, 2 мл 0,5 M EGTA и 4 г сахарозы. Титруют до рН 7,4 с 6 N HCl и доводят до 100 мл стерильной воды в течение 15 мин, согласно Marchenko et al.7.
- Откажитесь от фиксатора и мойте клетки 3 раза по 5 мин каждый раз. Сразу же добавляют свежеприготовленный 0,3% раствор Тритона Х и проницают клетки в течение 5 мин. Промыть 3 раза PBS и добавить блокирующий раствор, изготовленный PBS и 5% BSA.
- Блокируйте ячейки при комнатной температуре на пластине коромысла на 1 час.
- Готовят соответствующее разведение антител в 1% BSA/PBS и инкубируют клетки с разведением антител на пластине коромысла в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Промыть клетки 3 раза PBS в течение 5 мин каждая, инкубировать клетки с ПОМОЩЬЮ DAPI и смонтировать крышки с монтажными носителями для визуализации на микроскопе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно меченые антитела, используемые в этом эксперименте, перечислены в Таблице материалов.
7. Анализ просвечивающих электронных микроскопий вновь генерируемых клеток
- Засеять ячейки для ТЭМ в 8-скважинных камерных слайдах.
- Зафиксируют клетки в 3,5% глутаровом альдегиде в течение 1 ч при 37 °C, постфиксируют в 2% OsO4 в течение дополнительного часа при комнатной температуре и окрашивают в 2% уранилацетат в темноте при 4 °C в течение 2 ч 30 мин.
- Наконец, промыть клетки в дистиллированной воде, обезвоживать ее в этаноле и встраивать в эпоксидную смолу на ночь. На следующий день переложите образцы в печь с 70 °C в течение 72 ч для затвердевания смолой.
- Отсоедить внедренные клеточные культуры от камерного слайда и клея до аральдитовых блоков.
- Вырежьте последовательные полутонкие срезы (1,5 мкм) с помощью машины, установите на стекло-слайды и слегка окрашивайте 1% толуидиновым синим.
- Приклеиваем выбранные полутонкие срезы к аральдитовым блокам и отделяем их от стеклополки путем многократного замораживания (в жидком азоте) и оттаивания.
- Готовят ультратонкие срезы (0,06-0,08 мкм) с помощью машины и дополнительно контрастируют с цитратом свинца.
- Получение микроснимков с помощью электронного сканирующего микроскопа с цифровой камерой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты свидетельствуют о том, что этот новый метод без ГМО способен возвращать клетки-прародителя крови в их самое примитивное состояние без непосредственного действия на геном человека.
Ранее мы показали, что GPI-связанное белковое специфическое сшивание антител инициирует через PLCγ / IP3K / Akt / mTOR / PTEN регуляцию высоко консервативных генов, имеющих отношение к развитию, таких как WNT, NOTCH и C-Kit, тем самым инициируя процесс дедифференцировки, который приводит к первому шагу к генерации ГСК и второму и заключительному к поколению BD-PSC6,8.
Активированные культуры MNC подвергали иммуномагнитной сортировке с использованием микрошрун CD45. Зрелые клетки крови, которые не могут быть перепрограммированы с помощью этого метода (например, CD45-положительные клетки), были сохранены на колонке, тогда как отрицательная фракция, содержащая перепрограммированные клетки (CD45 отрицательные клетки), использовалась для генерации различных клеток нейронной линии.
Сначала мы изучили морфологические аспекты периферических BD-дедифференцированных клеток с помощью света и ТЭМ. Как показано на рисунке 1,специфическое Сшивание GPI-анкорлептовых антител гликопротеин человеческих ТНК генерирует устойчиво растущую новую популяцию клеток(Рисунок 1А). Мы проанализировали эти клетки с помощью TEM. BD-дедифференцированные клетки имеют небольшие размеры и показывают характеристики незрелых агранулярных клеток, с постепенно уменьшившимися органеллами и большими ядрами с конденсированным хроматином, похожими на ЭСК(рисунок 1В). Необработанные культуры показали тенденцию к постепенному исчезновению.
Отрицательные клетки BD-CD45 подвергали нейронной дифференцировки в два этапа. Мы начали дифференцировку в сторону нейронных линий, посеяв CD45 отрицательные клетки на поли-L-орнитин/ламининовые пластины культуры в течение 2 дней в среде N2 после культивирования в среде дифференцировки нейронов. Снимки Брайтфилда были получены на 4, 8, 10, 14 и 30 днях соответственно после начала нейронной дифференцировки стволовых клеток, генерируемых BD.
Уже через 4 дня после начала целенаправленной дифференцировки вновь генерируемых клеток удалось обнаружить первые нейроноподобные клетки с длинными ветвящимися структурами. Мы наблюдаем морфологические изменения от D2 до D30 с более сложной структурой, включая разветвление, подразумевающее активный процесс дифференцировки к нейронным линиям на протяжении всего периода времени культивирования(рисунок 2). Для подтверждения нейронных особенностей редифференцированных клеток после культивирования их в нейронной среде в течение 16 дней клетки фиксировали по предыдущему протоколу7,а иммуноцитохимию (ICC) проводили с использованием обнаружения антител к нестину, глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), микротрубоче-ассоциированному белку 2 (MAP2) и нейрон-специфическому бета-тубулину III класса (Tuj1).
GFAP - это белок, который составляет часть цитоскелета в астроцитах, представляющих собой основную промежуточную нить зрелых астроцитов. Как показано на рисунке 3,антитело к GFAP распознает эти структуры во вновь генерируемых нейронных клетках, подтверждая, что BD-PSC способны к редифференцировке в сторону астроцитов человека9.
MAP2 представляет собой белок цитоскелета, который связывается с тубулами и стабилизирует микротрубочки. Он экспрессируется в аксонах, дендритах и клеточных телах, и эта экспрессия специфична для тканей и развития. Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии подтверждают экспрессию этого белка в редифференцированных клетках10.
Tuj1 является типичным маркером нейрональных клеток. Его функция заключается в стабилизации микротубилов в теле нейрональных клеток и аксонах. Он также участвует в аксональном транспорте11. Недавно редифференцированные клетки четко подтвердили экспрессию этого белка при D16 при запуске дифференцировки нейронов при условии, описанном здесь.
Нестин был впервые охарактеризован в НСК и представляет собой белок нейроэпителиальных стволовых клеток, который принадлежит к белку промежуточной нити (IF)12, отличающему нейрональные клетки-прародители от более дифференцированных нейрональных клеток. Эти белки IF экспрессируются в основном в нервных клетках, где они участвуют в радиальном росте аксона, но они также присутствуют в ряде дополнительных тканей. Нестин как маркер преимущественно НСК слабо экспрессируется в клетках, уже на пути к дифференцировке в специфические нейронные линии, как это происходит с BD-редифференцированными клетками в D16.
Рисунок 1:Генерация дедифференцированных (плюрипотентных) стволовых клеток. (A) Мононуклеарные клетки, выделенные Фиколлом, выращивали в среде Iscove, дополненной 10% FBS. Микроснимки активированных культивируемых клеток были сделаны на 1, 5 и 10 день соответственно. Неактивированные ТНК изучались в качестве контроля. Шкала: 50 мкм. (B) Анализ TEM вновь генерируемых клеток на протяжении всего времени культивирования показывает, что органеллы зрелых клеток (D1) постепенно исчезают (D8), что приводит к генерации полностью дедифференцированных клеток, напоминающих ESCs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Нейроредифференциация BD-PSC. (A) BD-дедифференцированные клетки помещали в культуральные тарелки, покрытые орнитином/ламинином, и культивировали в течение 30 дней, как описано в протоколе. Микроснимки делаются на 4, 8, 10, 14 и 30 днях соответственно, после роста в условиях дифференцировки нейронов. Большинство клеток в культуре изменили свою морфологию с небольших сферических форм на более крупные, вытянутые формы и в некоторых случаях разветвленные клетки. Шкала: 100 мкм. (B) BD-дедифференцированные клетки выращивали в течение 16 дней в нейронной среде, фиксировали в глутаровом альдегиде и ЭМ-анализе, выполненном, как описано в разделе протокола. Клеточное тело и процессы этих клеток показали более высокую сложность, чем у недифференцированных клеток с точки зрения органелл и цитоскелетов, представляющих высокую плотность сложенных цистерн грубого эндоплазматического ретикулума и обильных пучков актиновых нитей (a, b). В отличие от недифференцированных BD-клеток, клетки, растущие в дифференцировочных средах, часто устанавливали межклеточные контакты. Некоторые из этих специализированных контактов включали клеточное тело (c), в то время как другие включали клеточные процессы нейритоподобным образом (d). Шкала стержней: а) 20 мкм; (б-д), 500 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Иммунофенотипирование вновь генерируемых нейрональных клеток. BD-дедифференцированные клетки культивировали, как описано в протоколе, в течение 16 дней, а иммуноцитохимический анализ проводили с использованием антител к нейронным маркерам нестина, GFAP, MAP2 и Tuj1. Показаны яркополевые микроснимки редифференцированных клеток, сопровождающиеся иммунофлуоресцентными снимками с DAPI в качестве ядерного окрашивания, а также окрашивания соответствующими антителами. Изображены поля, показывающие конкретную популяцию, которая выражает один из конкретных нейронных маркеров, характерных для определенных линий. Шкала: 100 мкм. Элемент управления представлен на дополнительном рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Контроль BD-дедифференцированных клеток. Недифференцированные БД-производные клеток культивировали в модифицированной среде Dulbecco Iscove, дополненной 10% FBS в течение 16 дней, как описано в протоколе, и окрашивали антителом к гнездованию GFAP, Tuj1 и MAP2. DAPI использовался для ядерного окрашивания. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Не-ГМ-метод перепрограммирования клеток человека, описанный в этой работе, основан на активации мембраны в ядро сигнального механизма (механизмов) за гликопротеином человеческой мембраны, связанным с GPI, который инициирует процесс дедифференцировки, приводящий к генерации ex vivo и расширению самообновляющихся PSC, полученных из не манипулируемой периферической крови человека. Эти клетки при культивировании в соответствующих средах способны к редифференцировки в клетки, принадлежащие к различным зародышовым слоям6.
Данные, представленные в этой работе, показывают, что ГМ-свободные генерируемые BD-PSC клетки при культивировании в нейронной дифференцированной среде приобретали совершенно другой фенотип, с вытянутыми формами, более высоким развитием их органелл и установленными более сложными взаимодействиями между клетками. Более того, редифференцировка с использованием условия, описанного здесь, подразумевает дифференцировку нейронов по отношению к различным нейронным линиям.
Для получения оптимального количества и наилучшего качества перепрограммированных клеток для их использования в исследованиях редифференцировки, свежие препараты MNC могут быть выгодными по сравнению с замороженными препаратами MNC. Метод иммуномагнитной сортировки, отделяющий BD-PSC от терминально дифференцированных клеток, которые не могут быть перепрограммированы этим методом, может быть неполным, требуя повторения процедуры, что очень стрессово для клеток и приводит к их преждевременной гибели.
Критический этап в рамках протокола связан с количеством и качеством ТНК, которые могут быть получены с помощью описанного метода. Модификация среды нейронной дифференцировки, а также времени культивации может улучшить потенциал дифференцировки BD-PSC, что приводит к генерации определенных типов нейронных клеток.
Ограничением этого метода является нетератогенная природа этих перепрограммированных клеток, поскольку с помощью этого метода невозможно генерировать клеточные линии. Как только дедифференцированные клетки достигают заключительной стадии плюрипотентности, они становятся в основном покоя, и новая часть ТНК должна быть снова дедифференцирована, чтобы получить большее количество BD-PSC.
Перепрограммирование, описанное здесь, опирается на активацию сшивки антител на поверхности клеток-прогениторов крови. Эта парадигма обеспечивает многочисленные потенциальные преимущества в отношении клинической безопасности по сравнению с ГМ-методами. Цель достижения аутологичности стволовых клеток для генерации нервной ткани (тканей) может быть достигнута путем минимальной манипуляции ex vivo; поэтому настоятельно рекомендуется, чтобы эта клеточная терапия могла быть многообещающим кандидатом на эффективный и безопасный клинический подход в неврологии.
Болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и ишемия головного мозга относятся к числу заболеваний с самым высоким социально-экономическим бременем для общества в Европе и во всем мире. Ожидается, что бремя нейродегенеративных расстройств будет увеличиваться со старением населения, становясь важной социально-экономической проблемой и создавая отчаянную потребность в ответе на проблему. Представленный метод открывает новый путь для неинвазивных терапевтических стратегий, используя простую и экономически эффективную процедуру для создания подходящих популяций аутологичных стволовых клеток, дающих надежду на излечение в настоящее время трудноизлечимых неврологических заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Соответствующий автор заявляет, что она является патентообладателем, связанным с новым человеческим GPI-связанным белком, а также соучредителем и работает в ACA CELL Biotech. Другие авторы заявляют, что у них нет никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Посвящается памяти доктора Райнера Заффриха.
Авторы особенно благодарны Хосе Мануэлю Гарсиа-Вердуго и Висенте Эррансу-Пересу за проведение экспериментов и анализа ЭМ в Лаборатории сравнительной нейробиологии Института биоразнообразия и эволюционной биологии Каванильеса, Университет Валенсии, CIBERNED, Валенсия, Испания, который был поддержан финансированием исследований из Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Остальная часть этой работы была поддержана ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Германия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
