Summary
يقدم هنا بروتوكول للكهرومporation أحادي الخلية التي يمكن أن توفر الجينات في كل من الخلايا العصبية مثير ومثبطة عبر مجموعة من الأعمار ثقافة شريحة فرس النهر في المختبر. يوفر نهجنا تعبيرا دقيقا وفعالا عن الجينات في الخلايا الفردية ، والتي يمكن استخدامها لفحص الوظائف المستقلة للخلايا وبين الخلايا.
Abstract
وقد أثبت الكهربوجين نفسه كطريقة حاسمة لنقل جينات محددة إلى خلايا لفهم وظيفتها. هنا، ونحن نصف تقنية الكهرومporation خلية واحدة أن يزيد من كفاءة (~ 80٪) من العدوى الجينية في المختبر في الخلايا العصبية المثبطة مثير وفئة محددة في ثقافة شريحة فرس النهر الجهازية الماوس. باستخدام أقطاب زجاجية كبيرة، السائل النخاعي الاصطناعي المحتوي على التيترودوتوشين والبقوليات الكهربائية الخفيفة، قدمنا جين ا مهما في الخلايا العصبية الهرمية المثقفة من فرس النهر CA1 والخلايا العصبية المثبطة. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء الكهرومporation في شرائح فرس النهر المستزرعة تصل إلى 21 يوما في المختبر مع عدم وجود انخفاض في كفاءة العدوى، مما يسمح لدراسة مراحل مختلفة زراعة شريحة التنمية. مع تزايد الاهتمام بدراسة الوظائف الجزيئية للجينات عبر مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، توضح طريقتنا نهجا موثوقا ومباشرا لإصابة الجينات المختبرية في أنسجة دماغ الماوس التي يمكن إجراؤها باستخدام معدات وتقنيات الفيزيولوجيا الكهربية الحالية.
Introduction
في البيولوجيا الجزيئية، أحد أهم الاعتبارات للمحقق هو كيفية تقديم جين مهم إلى خلية أو مجموعة من الخلايا لتوضيح وظيفتها. يمكن تصنيف طرق التسليم المختلفة إما بيولوجية (على سبيل المثال، ناقل فيروسي)، أو مادة كيميائية (مثل فوسفات الكالسيوم أو الدهون)، أو فيزيائية (مثل الكهرومporation، أو الميكرويكشن، أو الليسيتيك الحيوي)1،2. الأساليب البيولوجية هي فعالة للغاية ويمكن أن تكون خلية نوع محدد ولكن محدودة من خلال تطوير أدوات وراثية محددة. النهج الكيميائية قوية جدا في المختبر، ولكن الترافيكتوفيكات عشوائية عموما. علاوة على ذلك، يتم حجز هذه النهج في الغالب للخلايا الأساسية فقط. من النهج الفيزيائية ، biolistics هو أبسط وأسهل من وجهة نظر تقنية ، ولكن مرة أخرى تنتج نتائج العدوى العشوائية بكفاءة منخفضة نسبيا. للتطبيقات التي تتطلب نقل إلى خلايا محددة دون الحاجة إلى تطوير الأدوات الوراثية، ونحن نتطلع نحو كهربائية خلية واحدة3،4.
في حين أن الكهرومporation المستخدمة للإشارة فقط إلى الكهرومporation الميداني ، على مدى السنوات العشرين الماضية ، تم تطوير بروتوكولات متعددة في المختبر وفي الجسم الحي للكهرومporation أحادي الخلية لتحسين التحديد والكفاءة5و6و7، مما يدل على أنه يمكن استخدام الكهرومporation لنقل الجينات إلى خلايا فردية ، وبالتالي ، يمكن أن يكون دقيقا للغاية. ومع ذلك، فإن الإجراءات صعبة تقنيا، وتستغرق وقتا طويلا، وغير فعالة نسبيا. في الواقع ، حققت أوراق أحدث في جدوى منصات الكهرومporation الآلية8،9 ، والتي يمكن أن تساعد في إزالة العديد من هذه الحواجز للمحققين المهتمين بتركيب مثل هذهالروبوتات. ولكن بالنسبة لأولئك الذين يبحثون عن وسائل أبسط، فإن مشاكل الصعق الكهربائي، أي موت الخلايا، وفشل العدوى، وانسداد الماصة، لا تزال مصدر قلق.
لقد طورنا مؤخرا طريقة للتكهربائية تستخدم ماصة زجاجية ذات رؤوس أكبر، معلمات نبض كهربائي أكثر اعتدالا، وخطوة فريدة من نوعها ركوب الدراجات الضغط، والتي ولدت كفاءة العدوى أعلى بكثير في الخلايا العصبية مثير من الأساليب السابقة، ومكننا للمرة الأولى لtransfect الجينات في interneurons المثبطة، بما في ذلك الخلايا الداخلية المثبطة التعبير عن سوماتوستاتين في منطقة CA1 فرس النهر من ثقافة شريحة العضوية الماوس10. ومع ذلك ، لم يتم تناول موثوقية طريقة الكهربوين في أنواع مختلفة من الخلايا العصبية ومراحل نمو الخلايا العصبية. هنا، أثبتنا أن تقنية الكهربوئة هذه قادرة على نقل الجينات إلى كل من الخلايا العصبية المثيرة وفئات مختلفة من الخلايا الداخلية. الأهم من ذلك، كانت كفاءة العدوى عالية بغض النظر عن الأيام في المختبر (DIV) شريحة العمر الثقافة اختبارها. يوصى بشدة بهذه التقنية الراسخة والصديقة للمستخدم لأي محقق مهتم باستخدام الكهرومporation أحادي الخلية لأنواع مختلفة من الخلايا في سياق أنسجة دماغ الماوس المختبري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم مراجعة جميع بروتوكولات الحيوان والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس. إعداد ثقافة شريحة، إعداد البلازميد، والكهرومporation هي أيضا مفصلة في أساليبنا المنشورة سابقا، ويمكن أن يشار إليها للحصول على معلومات إضافية10.
1. إعداد ثقافة شريحة
- إعداد الفئران organotypic فرس النهر شريحة الثقافات كما هو موضح سابقا11, باستخدام الفئران بعد الولادة 6-7 أيام من العمر من أي من الجنسين.
- إعداد وسائل الإعلام تشريح لثقافة شريحة organotypic تتكون من (في mM): 238 السكروز, 2.5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, و 11 الجلوكوز في الماء deionized, ثم الغاز مع 5٪ CO2/95٪ O2 إلى درجة الحموضة من 7.4.
- إعداد شريحة organotypic وسائل الإعلام الثقافية تتكون من: 78.8٪ (v/v) الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسية، 20٪ (v/v) مصل الحصان، 17.9 mM NaHCO3، 26.6 mM الجلوكوز، 2 M CaCl2، 2 M MgSO4، 30 mM HEPES، الأنسولين (1 ميكروغرام / مل)، و 0.06 mM حمض الأسكوربيك، درجة الحموضة المعدلة إلى 7.3. ضبط osmolarity إلى 310-330 osmol باستخدام جهاز قياس التناضح.
- تشريح فرس النهر من الدماغ كله باستخدام ملعقتين، وشريحة (400 ميكرومتر) باستخدام مروحية الأنسجة. شرائح منفصلة باستخدام اثنين من ملقط ونقلها إلى 30 ملم إدراج ثقافة الخلية في لوحة بئر 6 مليئة وسائل الإعلام الثقافة (950 ميكرولتر) تحت إدراج.
- تخزين الثقافات شريحة organotypic في حاضنة زراعة الأنسجة (35 درجة مئوية، 5٪ CO2)وتغيير وسائل الإعلام ثقافة شريحة كل يومين.
2. إعداد بلازميد
- إعداد البلازميد لجين الفائدة.
- سوبكلون تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) الجينات في ناقلات pCAG.
- تنقية pCAG-EGFP plasmid مع مجموعة تنقية خالية من السموم الداخلية وتذوب في محلول داخلي يتكون من المياه المعالجة بالبيروكربونات ديثيل التي تحتوي على 140 mM K-methanesulfonate، 0.2 م م EGTA، 2 م مغ كل2،و10 م م HEPES، معدلة إلى درجة الحموضة 7.3 مع KOH (تركيز البلازميد: 0.1 ميكروغرام/ميكرولتر).
3. إعداد ماصة الزجاج
- سحب ماصة الزجاج borosilicate (4.5 – 8 MΩ) على سحب micropipette (الشكل 1A).
ملاحظة: ماصة الزجاج المستخدمة لتسجيلات المشبك التصحيح كامل الخلية مثالية ل electroporation. - خبز ماصة الزجاج بين عشية وضحاها في 200 درجة مئوية لتعقيم.
- تحقق من حجم طرف ماصة تحت مجهر تشريح لتقريب المقاومة الكهربائية.
- اختياري: تحقق من مقاومة ماصة عن طريق ربط ماصة إلى القطب الكهربائي واستخدام micromanipulator للمناورة طرف ماصة في السائل النخاعي الاصطناعي المعقم تصفية (aCSF) التي تحتوي على (في mM): 119 NaCl، 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 و 11 الجلوكوز في الماء المؤين, الغاز مع 5٪ CO2/95٪ O2 إلى درجة الحموضة من 7.4. تأكيد المقاومة الفعلية باستخدام قراءات على الكهربائي.
ملاحظة: كلما كان طرف المواصة أكثر حدة، كلما كانت المقاومة الكهربائية أكبر. يجب أن تكون مقاومة ماصة أقل من 10 MΩ. ماصة الزجاج مع مقاومة ماصة عالية (الشكل 1B) تسد في كثير من الأحيان في طرف أثناء الكهربائي المتكررة.
- اختياري: تحقق من مقاومة ماصة عن طريق ربط ماصة إلى القطب الكهربائي واستخدام micromanipulator للمناورة طرف ماصة في السائل النخاعي الاصطناعي المعقم تصفية (aCSF) التي تحتوي على (في mM): 119 NaCl، 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 و 11 الجلوكوز في الماء المؤين, الغاز مع 5٪ CO2/95٪ O2 إلى درجة الحموضة من 7.4. تأكيد المقاومة الفعلية باستخدام قراءات على الكهربائي.
4. إعداد جهاز الحفر الكهربائي
- قم بتركيب جهاز الكهروبورتورات على جهاز قياس الفيزيولوجيا الكهربية القياسي للخلايا الكاملة، المجهز بمجهر مستقيم مثبت على طاولة متغيرة مع مضخة ميكرومانيبولاتور وعلانية.
- تثبيت headstage من electroporator على micromanipulator وربط زوج من مكبرات الصوت إلى الكهربائي. توصيل الكهربائي إلى دواسة القدم التي يمكن استخدامها لإرسال نبض عندما تكون جاهزة.
ملاحظة: تنبعث من مكبرات الصوت نغمة عند تشغيلها، وهو مؤشر على المقاومة الكهربائية عند القطب الكهربائي. وهذا يجعل من الممكن تحديد التغيرات النسبية في المقاومة دون سحب الانتباه بعيدا عن الإجراء.
5. إعداد الكهرومبوريشن
- نقل شريحة الثقافة إدراج من 6 لوحات بئر إلى 3 سم أطباق بيتري محملة 900 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة وتخزينها في حاضنة CO2 الطاولة حتى على استعداد لأداء electroporation.
- Preincubate إدراج الثقافة الطازجة مع شريحة الثقافة وسائل الإعلام (1 مل) لمدة 30 دقيقة على الأقل في طبق بيتري 3.5 سم لشرائح الثقافة بعد electroporation.
- تنظيف وإعداد تلاعب ل electroporation.
- Perfuse خطوط مع تبييض 10٪ لمدة 5 دقائق لتعقيم الأنابيب وغرفة قبل بدء التجربة لهذا اليوم.
- Perfuse خطوط مع الماء autoclaved deionized لمدة 30 دقيقة على الأقل لشطف تماما.
- Perfuse خطوط مع مرشح معقمة aCSF تحتوي على 0.001 mM tetrodotoxin (TTX).
ملاحظة: TTX يقلل من سمية الخلوية والموت بسبب الإفراط في التحدث الداخلي10.
- تعيين معلمات نبض الكهربائي: سعة -5 V، نبض مربع، قطار 500 مللي ثانية، تردد 50 هرتز، وعرض نبضة 500 ميكرومتر.
- ملء ماصة الزجاج مع 5 ميكرولتر من محلول داخلي يحتوي على البلازميد.
- إزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين من طرف ماصة عن طريق النقر والتنصت بلطف تلميح عدة مرات.
- تحقق من طرف للضرر عن طريق تصور تحت المجهر تشريح أو عن طريق تكرار الخطوة 3.3.1 للتحقق من مقاومة ماصة.
ملاحظة: إذا تلف طرف، يجب تجاهل ماصة الزجاج، ويجب تكرار هذه الخطوة مع ماصة زجاجية جديدة أعدت مسبقا في الخطوة 3.
- قم بتوصيل طرف ماصة إلى القطب الكهربائي بشكل آمن ثم قم بتشغيل السماعات. سجل القراءة (مقاومة المصصة) للمزلق الكهربائي عندما يكون الطرف قد أجرى اتصالا مع وسيط aCSF.
- قطع الثقافة إدراج غشاء باستخدام شفرة حادة وعزل ثقافة شريحة واحدة. نقل بعناية ثقافة شريحة إلى غرفة الكهربوكربوه باستخدام ملقط حاد الزاوية وإصلاح موقفها مع مرساة شريحة.
- لا تبقي ثقافة شريحة خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة في وقت واحد لمنع الآثار الجانبية مثل التغيرات في صحة الخلايا العصبية أووظيفة 12.
6. الخلايا الكهربائية ذات الاهتمام
- تطبيق ضغط إيجابي على ماصة مع الفم أو باستخدام حقنة 1 مل (0.2 - 0.5 مل ضغط) تعلق على الأنابيب.
- استخدام الضوابط مقبض micromanipulator 3 الأبعاد للمناورة طرف ماصة بالقرب من سطح ثقافة شريحة.
- اختر الخلية المستهدفة واقترب منها، مع الحفاظ على الضغط الإيجابي المطبق حتى تتشكل الدمل على سطح الخلية، مرئية على المجهر.
- أداء دورات الضغط.
- تطبيق سريع ضغط سلبي خفيف عن طريق الفم بحيث ختم فضفاضة أشكال بين طرف ماصة وغشاء البلازما، وأشار بصريا من قبل الغشاء الصعود إلى طرف ماصة إلى حد ما. لاحظ زيادة (~ 2.5x المقاومة الأولية) في مقاومة ماصة من خلال الاستماع لزيادة في لهجة قادمة من مكبرات الصوت. بسرعة إعادة تطبيق الضغط الإيجابي بحيث الدمل إعادة تشكيل.
- أكمل فورا دورتين ضغط إضافيتين على الأقل دون توقف، ثم اضغط ضغطا سلبيا لمدة 1 s.
ملاحظة: التوقف بين الدورات، أو ممارسة ضغط أكثر من اللازم، أو الضغط السلبي لفترة طويلة جدا يمكن أن يسبب تلفا كبيرا في الخلايا وربما يتسبب في موت الخلية أثناء الكهرومporation.
- نبض بسرعة الكهربائي مرة واحدة باستخدام دواسة القدم عندما تصل لهجة من مكبرات الصوت قمة مستقرة في الملعب، مما يدل على ذروة المقاومة الكهربائية. لا تنتظر في ذروة المقاومة لأكثر من 1 ثانية قبل إرسال النبض.
ملاحظة: لقد لاحظنا أية electroporation خارج الهدف عند استخدام هذا البروتوكول10. فقط الخلايا التي كانت على اتصال مع ماصة الزجاج خلال دورات الضغط كانت مصابة. وضع ماصة بالقرب من الخلايا العصبية الأخرى لا يؤدي إلى نقل الجينات. - سحب بلطف ماصة ما يقرب من 100 ميكرومتر من الخلية دون تطبيق الضغط.
- إعادة تطبيق الضغط الإيجابي، والتحقق من أن المقاومة مشابهة للقراءة المسجلة في الخطوة 5.5، ثم الاقتراب من الخلية التالية.
- إزالة القباقيب المحتملة، وأشار بصريا أو من قبل زيادة كبيرة (>15٪ أعلى) مقاومة ماصة بعد الكهربائي، عن طريق تطبيق الضغط الإيجابي.
ملاحظة: إذا لم يكن هناك تسد مرئية والمقاومة لا يزال أعلى بشكل ملحوظ تجاهل ماصة واستخدام واحدة جديدة. في المتوسط ، يمكن استخدام ماصة لأحداث تصل إلى 20 electroporation إذا كان المستخدم حذرا10.
- إزالة القباقيب المحتملة، وأشار بصريا أو من قبل زيادة كبيرة (>15٪ أعلى) مقاومة ماصة بعد الكهربائي، عن طريق تطبيق الضغط الإيجابي.
- بعد الكهربوه، نقل ثقافة شريحة على إدراج ثقافة جديدة، واحتضان في 35 درجة مئوية في الحاضنة لمدة تصل إلى 3 أيام.
7. تثبيت, تلطيخ والتصوير من الثقافات شريحة فرس النهر organotypic
- إصلاح الثقافات شريحة organotypic electroporated 2 - 3 أيام بعد transfection مع 4٪ paraformaldehyde و 4٪ السكروز في 0.01 M فوسفات عازلة المالحة (1x PBS) لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة شرائح مثبتة واحتضان في السكروز 30٪ في 0.1 M الفوسفات العازلة (1x PB) لمدة 2 ساعة.
- وضع شرائح على زجاج الشريحة وتجميدها عن طريق وضع الزجاج الشريحة على رأس الجليد الجاف سحقت. إذابة شرائح في درجة حرارة الغرفة ونقلها إلى لوحة بئر 6 مليئة 1x PBS.
- وصمة عار شرائح مع الماوس المضادة لGFP والأرنب المضادة لل RFP الأجسام المضادة في GDB العازلة (0.1٪ الجيلاتين، 0.3٪ تريتون X-100، 450 mM NaCl، و 32٪ 1x PB، درجة الحموضة 7.4) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الشرائح مع 1x PBS ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لكل غسل.
- حضانة شرائح مع المضادة للفأرة اليكسا 488-المقترنة الأجسام المضادة الثانوية ومكافحة أرنب اليكسا 594-اقتران الأجسام المضادة الثانوية في مخزن GDB العازلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. احتضان شرائح مع DAPI (4 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الشرائح مع 1x PBS ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لكل غسل.
- شرائح جبل على الشرائح الزجاجية باستخدام تركيب المتوسطة وإجراء التصوير مضان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لدينا كهربية خلية واحدة قادرة على تقديم الجينات بدقة في الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة التي تم تحديدها بصريا. نحن electroporated ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في ثلاث نقاط زمنية مختلفة. بارفالبومين (الكهروضوئية) أو الغلوتامات المركبات نوع 3 (VGT3) التعبير عن الخلايا العصبية تم تصورها عن طريق عبورPv cre (JAX #008069) أو VGT3cre (JAX #018147) خطوط مع TdTomato (متغير من البروتين الفلوري الأحمر) خط المراسل (جاكس #007905)، واسمه على التوالي Pv/TdTomato وخطوط VGT3/TdTomato. تم إعداد ثقافات شرائح Organotypic من C57BL/6J ، Pv / TdTomato ، وفوغت 3 / TdTomato الفئران.
أولا، تم إجراء الكهرومربوهات في الخلايا العصبية الهرمية CA1 (Py) إما في 7 أو 14 أو 21 يوما في المختبر (DIV). تم تحويل EGFP إلى 5-20 الخلايا العصبية الهرمية في منطقة CA1 فرس النهر عبر هذه الأعمار ثقافة شريحة(الشكل 2B-D). تم تحديد الخلايا العصبية الهرمية CA1 باستخدام تباين التداخل التفاضلي (DIC). لإثبات التوزيع التشريحي والاختلافات المورفولوجية بين الخلايا العصبية الهرمية وd interneurons المثبطة في ثقافة الشريحة ، تم كهربية الخلايا العصبية الهرمية CA1 مع EGFP في فأر DIV7 Pv / TdTomato وتم إجراء مكافحة الخلايا النووية لعرض الموقع المتميز للخلايا العصبية الإيجابية EGFP في طبقة الخلية الهرمية CA1 (الشكل 2A).
بعد ذلك ، تم تطبيق هذا البروتوكول أيضا على الخلايا الكهروضوئية الإيجابية TdTomato وVGT3 interneurons. تم إجراء الكهرومporation EGFP في 1-10 interneurons المسمى فلوريا. TdTomato إيجابية الكهروضوئية (الشكل 3) وVGT3 (الشكل 4) تم بنجاح الخلايا العصبية كهربائيا في منطقة CA1 فرس النهر. ومن المثير للاهتمام أن العدوى الجينية ل EGFP ذات الاهتمام في جميع هذه الأنواع العصبية المثبطة لم تتأثر بشكل كبير ب DIV ولم تختلف مع كفاءة العدوى (~80٪) الملاحظة في الخلايا العصبية الهرمية CA1(الشكل 5).
الشكل 1: صورتين ماصة الزجاج ممثل.
(أ) عرض أقل مقاومة (6.5 MΩ) ماصة، وتستخدم في هذا البروتوكول، و (ب) مقاومة أعلى (10.4 MΩ) ماصة نموذجية لبروتوكولات الكهربومايشن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تم كهربية ثقافات شرائح فرس النهر العضوية مع EGFP (أخضر) في ثلاث نقاط زمنية مختلفة.
(أ) ممثل organotypic ثقافة شريحة فرس النهر في DIV7 Pv/ TdTomato الماوس. CA1 الخلايا العصبية الهرمية كانت electroporated مع EGFP (الأخضر، رؤوس الأسهم البيضاء) وأظهرت أي تداخل مع TdTomato (TdT) إيجابية الخلايا الداخلية الكهروضوئية (أحمر، رؤوس الأسهم الصفراء). تم تنفيذ DAPI مكافحة الاحتواء النووي (الأزرق). DG: دنتات جيروس. (B-D) CA1 الخلايا العصبية الهرمية كانت كهربائيا مع EGFP في ثلاث نقاط زمنية مختلفة: (ب) DIV7، (C) DIV14 و (D) DIV21. تم إصلاح ثقافات شريحة Organotypic مع السكروز 4٪ ، 4 ٪ paraformaldehyde / 1x PBS وصورت دون مزيد من الأقسام. أعلى اليسار، صور التكبير منخفضة من منطقة CA1 فرس النهر. تمثل رؤوس الأسهم الخلايا العصبية الهرمية CA1 الفردية المستهدفة للكهرومporation. يتم تكبير الخلايا العصبية المصابة برؤوس أسهم صفراء في الألواح السفلية. رؤوس الأسهم البيضاء تدل على خلايا عصبية كهربائية إضافية خارج عرض التكبير العالي. أعلى اليمين ، وانخفاض التكبير صور فرضه (سوب) الفلورسنت وصور نومارسكي. أشرطة المقياس: 500، 50، 100، 20 ميكرومتر على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تم كهربية ثقافات شرائح فرس النهر Pv/TdTomato organotypic مع EGFP (أخضر) في ثلاث نقاط زمنية مختلفة.
(أ) DIV7، (B) DIV14 و (C) DIV21. لوحظ التداخل مع الخلايا الإيجابية TdTomato (TdT) (الحمراء) المسماة الكهروضوئية في طبقة الخلايا الهرمية CA1 الحصين والأوريدين. في مجموعة التكبير المنخفضة (الصف العلوي)، تمثل رؤوس الأسهم الصفراء interneurons Pv الفردية المستهدفة للكهرومporation. رؤوس الأسهم البيضاء تدل على إضافية TdTomato إيجابية الخلايا الداخلية الكهروضوئية electroporated خارج عرض التكبير عالية. أشرطة المقياس: 50، 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: VGT3/TdTomato organotypic ثقافات شريحة فرس النهر كانت electroporated مع EGFP (الأخضر) في ثلاث نقاط زمنية مختلفة.
(أ) DIV7، (B) DIV14 و (C) DIV21. التداخل مع VGT3 المسمى TdTomato (TdT) الخلايا الإيجابية (الأحمر) لوحظ في طبقة الخلية الهرمية CA1 فرس النهر وoriens. في مجموعة التكبير المنخفضة (الصف العلوي)، تمثل رؤوس الأسهم الصفراء ال داخليات VGT3 الفردية المستهدفة للكهرومporation. رؤوس الأسهم البيضاء تدل على إضافية TdTomato إيجابية VGT3 interneurons electroporated خارج عرض التكبير عالية. أشرطة المقياس: 50، 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مستويات مماثلة من كفاءة العدوى في الخلايا العصبية الهرمية CA1، Pv/TdTomato، وVGT3/TdTomato interneurons في ثلاثة أعمار مختلفة في ثقافة شريحة المختبر.
الرسوم البيانية شريط ملخص من ثلاثة أعمار مختلفة ثقافة شريحة: DIV7 (يسار)، DIV14 (وسط) و DIV21 (يمين). يمثل كل رمز كفاءة العدوى التي تم الحصول عليها من ثقافة شريحة عضوية واحدة CA1 Py: DIV7 (12 ثقافة شرائح من فئران 2) و DIV14 (8/2) و DIV21 (8/2)؛ و DIV14 (8/2) و DIV21 (8/2)؛ و DIV14 (8/2) و DIV21 (8/2)؛ و DIV14 (8/2)؛ و DIV14 (8/2) و DIV21 (8/2)؛ و DIV14 (8/2). الكهروضوئية: DIV7 (5/2)، DIV14 (6/2)، DIV21 (6/2)؛ VGT3: DIV7 (6/2)، DIV14 (7/2)، DIV21 (6/2). ANOVA أحادي الاتجاه; ن. س. (ليست كبيرة). البيانات المعروضة هي متوسط ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نصف هنا طريقة الكهرومporation التي تنقل كل من الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة بكفاءة عالية ودقة. لدينا بروتوكول الكهربوجين الأمثل لديه ثلاثة اختراقات مبتكرة لتحقيق نقل الجينات عالية الكفاءة. وكان التعديل الأول لزيادة حجم ماصة مقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا3،5،6. هذا التغيير مكننا من electroporate العديد من الخلايا العصبية دون انسداد ماصة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أن ماصة المقاومة أقل تسمح لاستخدام المعلمات نبض كهربائي أكثر اعتدالا مقارنة مع الأساليب السابقة في حين لا يزال تحقيق النتيجة المرجوة3. بعد ذلك ، ضغط متكرر ركوب الدراجات قبل electroporation خفضت بشكل ملحوظ موت الخلية10. لاحظنا في كثير من الأحيان أنه مع تطبيق نبضة واحدة من الضغط السلبي قبل الكهروبولاتينج ، تمسك غشاء البلازما إلى داخل طرف ماصة ، مما يضر الخلية. ساعدت دورات الضغط أقل بكثير غشاء البلازما عصا إلى ماصة, التي تحسنت بقاء الخلية والانتعاش خلال الإجراء10. وأخيرا، إضافة TTX إلى aCSF تحسن كبير في نجاح electroporation في الخلايا العصبية المثبطة10. ونحن نعتبر أن الكهرومporation يمكن أن يسبب فرط الخلايا القاتلة التي يمكن منعها عن طريق TTX. قبل كل شيء، هذه التحسينات الحاسمة تقدم معدلات نجاح عالية بشكل ملحوظ في الكهرومporation إلى كل من الخلايا العصبية مثير ومثبط(الشكل 5). على الرغم من أننا لم نجد أي تشوهات كهربية في الخلايا العصبية لدينا بعد العدوى مع هذه الطريقة10 في الخلايا المستهدفة، فقد أفيد أن التغيرات المحلية الرقم الحموضة أثناء الكهرومغناطيسية تقلل من صلاحية الخلية وتحسين معلمات الكهربية يمكن أن تكون صعبة نسبيا بالمقارنة مع غيرها من طرق نقل الجينات13،14. لذلك ، من المهم النظر في الآثار الجانبية غير المتوقعة للكهرومporation وإعادة تحسين المعلمات الكهربائية حسب الحاجة لتحقيق كفاءة عالية في العدوى لأي تطبيق محدد.
كما تم استخدام تكنولوجيا الميكروجينكشن كنهج قوي لتسليم المتحولات إلى الخلايا2،15،16. ومع ذلك، فإن هذا النهج ينتج عموما عائدا أقل من العدوى ويتطلب مستوى عال من المهارة. في المقابل، يمكن استخدام طريقتنا بسهولة نسبية وبأقل تكلفة للمختبرات التي تجري بشكل روتيني دراسات الفيزيولوجيا الكهربية للخلايا الكاملة.
في الآونة الأخيرة، أظهرنا أن جينات متعددة يمكن أن تكون مصابة في كل من مثير وs somatostatin التعبير عن الخلايا العصبية المثبطة مع عدم وجود آثار جانبية على خصائص الفيزيولوجياالكهربائية 10. في هذه الدراسة، ونحن نثبت أن هذه الطريقة electroporation عالية الكفاءة في الخلايا العصبية الهرمية CA1 (الشكل 2) وكهروضوئية (الشكل 3) وVGT3 (الشكل 4) interneurons المثبطة. وعلاوة على ذلك، فإن تقنية الكهربوفيروس هذه تسمح لنا بإصابة الجينات ذات الأهمية بمعدل نجاح 80٪ تقريبا بغض النظر عن نوع الخلية أو عدد الأيام في المختبر(الشكل 5). على الرغم من أن هذه التقنية قد تم اختبارها فقط في المختبر، وقد ثبت الثقافات شريحة فرس النهر organotypic في نفس النقاط الزمنية DIV اختبرنا لمتابعة العمر المتطابقة في مورفولوجيا متشابك الجسم الحي والنشاط، كما رأينا في شرائح فرس النهر المعدة بشكل حاد17. وعلاوة على ذلك، كما قمنا باختبار هذه الطريقة فقط في الخلايا العصبية فرس النهر، فمن الممكن أن يكون هناك تحديات غير متوقعة في تطبيق هذه التقنية على الخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى. وتدعو هذه الطريقة إلى استكشاف الجينات أثناء تطوير ثقافة الشرائح العضوية التي يتغير فيها انتقال التشابك والكثافة، من بين خصائص أخرى، بمرور الوقت.
هذا البروتوكول هو تحسن على تلك التي أنشئت سابقا في أنه في وقت واحد منخفضة التكلفة، وأقل تحديا من الناحية الفنية، وأكثر كفاءة في توليد واحد الخلايا العصبية الجينات transfection5،6،7،8،9. كما يبدو أنه تحسن عن الطرق السابقة من حيث انخفاض معدلات تلف الخلايا أو الوفاة ، حيث لاحظنا أن ~ 80٪ من الخلايا تم تحويلها بنجاح وصحية بعد العملية. ولذلك، توفر هذه الطريقة فرصة جديدة لدراسة أدوار الجينات في أنواع متعددة من الخلايا العصبية باستخدام نماذج الماوس الفلورية. يمكن أن تركز الدراسات المستقبلية باستخدام هذه الطريقة على التفاعلات البروتينية البروتينية بين الخلايا لفحص وظائف جزيئية أو فسيولوجية محددة، بما في ذلك تفاعلات البروتين عبر متشابك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية (R01NS085215 إلى K.F. و T32 GM107000 و F30MH122146 إلى A.C). 11- يشكر أصحاب البلاغ السيدة ناو واتانابي على المساعدة التقنية الماهرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A.
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F.
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).
