마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화
2020년 10월 6일
여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.
유전자 형질주입(transfection)은 신경생물학 연구에서 필수적인 접근법입니다. 당사의 전기천공법(electroporation technology)을 통해 검출 가능한 부작용 없이 유기형 해마 절편 배양에서 관심 유전자 중간뉴런을 transfection할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 단일 세포 프로토콜에 비해 훨씬 높은 형질주입 효율을 갖지만, 여전히 상대적으로 저렴하고 수행이 간단합니다.
이 기술은 세포 자율 메커니즘 및 시냅스 전달 단백질 상호 작용을 포함하여 뉴런의 특정 분자 및 생리학적 기능을 이해하는 데 관심이 있는 연구자에게 유용할 것입니다. 전기천공을 위해 슬라이스 배양물을 준비하려면 관심 배양 삽입물을 900마이크로리터의 배양 배지가 적재된 개별 3cm 페트리 접시에 옮기고 배양물을 탁상용 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다. 다음으로, 3.5cm 페트리 접시에 삽입물당 1ml의 슬라이스 배양 배지로 신선 배양 삽입물을 최소 30분 동안 사전 배양하고 10% 표백제로 전기천공 리그의 라인을 5분 동안 멸균합니다.
관류가 끝나면 0.001 밀리몰 테트로도톡신을 함유한 필터 멸균 ACSF로 관류하기 전에 이온화된 오토클레이브 물로 라인을 최소 30분 동안 헹굽니다. electroporator pulse를 진폭에서 5V를 뺀 값, square pulse, 500밀리초의 train, 50Hz의 주파수 및 500마이크로초의 펄스 폭으로 설정합니다. 유리 피펫에 5마이크로리터의 플라스미드 함유 내부 용액을 채우고 팁을 부드럽게 두드리고 여러 번 두드려 갇힌 기포를 제거합니다.
해부 현미경을 사용하여 팁이 손상되지 않았는지 확인하고 피펫 팁을 전극에 단단히 부착합니다. 팁이 ACSF에 닿으면 electroporator의 피펫 저항 판독값을 기록합니다. 슬라이스 배양을 분리하려면 날카로운 칼날로 배양 삽입 멤브레인을 절단하고 날카로운 각도의 집게를 사용하여 슬라이스 배양을 전기천공실로 조심스럽게 옮깁니다.
그런 다음 슬라이스 앵커로 배양 위치를 고정합니다. 관심 세포의 전기천공을 위해 입으로 피펫에 양압을 가하고 3차원 손잡이 컨트롤을 사용하여 피펫 팁을 슬라이스 배양 표면 근처로 이동합니다. 현미경으로 배양물을 보고 팁으로 표적 세포에 접근하면서 세포 표면에 보조개가 형성될 때까지 양압을 유지합니다.
딤플을 시각화하면 입으로 약한 음압을 빠르게 가하여 피펫 팁과 원형질막 사이에 느슨한 밀봉이 형성되도록 합니다. 멤브레인이 피펫에 약간 들어갑니다. 피펫의 초기 저항이 약 2.5배 증가한 것을 관찰해야 하며, 이는 스피커의 톤 증가로 표시됩니다.
보조개가 개혁되도록 양압을 빠르게 다시 가하십시오. 그런 다음 일시 중지하지 않고 방금 설명한 것처럼 최소 두 번의 압력 사이클을 즉시 완료하십시오. 마지막 압력 펄스 후 음압을 1초 동안 유지합니다.
스피커의 톤이 피치에서 안정적인 정점에 도달하면 풋 페달을 사용하여 전기기에게 빠르게 펄스를 가합니다. 전기천공법 후 압력을 가하지 않고 피펫을 셀에서 약 100미크론 정도 부드럽게 후퇴시키고 양압을 다시 가하여 저항이 다음 셀에 접근하기 전에 기준선 판독값과 유사한지 확인합니다. 관심 세포가 모두 전기천공이 완료되면 절편 배양액을 준비된 신선한 배양 삽입물 중 하나로 옮기고 삽입물을 최대 3일 동안 섭씨 35도에서 놓습니다.
이 대표적인 실험에서 EGFP는 7일, 14일 및 21일 in vitro 절편 배양 연령에 걸쳐 해마 CA1 영역의 5-20개의 피라미드 뉴런으로 형질 주입되었습니다. 파브알부민(Parvalbumin)과 소포성 글루타메이트 3형 중간뉴런(vesicular glutamate type 3 interneuron)도 해마 CA1 영역 내에서 성공적으로 전기천공될 수 있습니다. 흥미롭게도, transfection은 in vitro 절편 배양 연령에 의해 크게 영향을 받지 않으며, CA1 피라미드 뉴런에서 관찰되는 transfection 효율과 다르지 않습니다.
뉴런은 매우 연약합니다. 세포에 접근하여 압력을 순환시키고 피펫 팁을 집어넣어 심각한 손상을 일으킬 때는 매우 신중하고 부드럽게 해야 합니다. 전기천공법 후 세포는 전기생리학 및 이미징을 포함한 다양한 실험 분석을 수행할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 기관 배양 해마 슬라이스 배양물 내의 흥분성 및 억제성 뉴런 모두에 유전자 전달이 가능한 단일 세포 전기천공법 프로토콜을 제시합니다. 이 기술을 통해 유전자 발현을 정밀하게 조절할 수 있어, 다양한 발달 단계에 걸쳐 세포 자율적 메커니즘과 세포 간 상호작용을 모두 조사할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 유전자 도입
- 전기생리학
배경
- 유전자 형질전환은 신경생물학 연구에 있어 매우 중요합니다.
- 전기천공법은 부작용을 최소화하면서도 높은 형질전환 효율을 제공합니다.
- 이 방법은 다른 기술들에 비해 상대적으로 간단하며 비용이 저렴합니다.
- 뉴런의 분자적 및 생리학적 기능을 이해하는 것은 신경생물학의 필수 요소입니다.
연구 목적
- 신경세포군에 유전자를 효율적으로 형질전환하는 방법을 수립한다.
- 흥분성 및 억제성 신경세포 모두에서 특정 분자 기능과 메커니즘을 연구한다.
- 슬라이스 배양의 연령대별 형질전환 효율을 평가한다.
사용된 방법
- 기관배양 해마 슬라이스 배양(organotypic hippocampal slice cultures)에 대해 전기천공법을 수행하였습니다.
- 피라미드 뉴런과 인터뉴런을 주요 생물학적 모델로 사용하였습니다.
- 다양한 배양 기간(in vitro 7, 14, 21일)의 슬라이스를 통해 형질전환 여부를 평가하였습니다.
- 세부 단계에는 준비 과정, 피펫팅 기술 및 저항 변화 모니터링이 포함됩니다.
- 세심한 조작을 통해 과정 중의 세포 손상을 최소화하였습니다.
주요 결과
- 슬라이스 배양 기간에 따른 유의미한 차이 없이, 표적 뉴런에서 높은 유전자 형질전환 효율을 달성하였습니다.
- 전기천공법은 생존율에 부정적인 영향을 미치지 않았으며, 형질전환 후에도 세포의 무결성을 유지하였습니다.
- 본 방법을 통해 뉴런 간의 생리학적 반응과 잠재적인 상호작용 기전에 대한 상세한 연구가 가능해졌습니다.
- 또한 parvalbumin 및 소포성 글루타메이트 type 3 인터뉴런의 성공적인 형질전환이 입증되었습니다.
결론
- 본 연구는 신경세포 배양의 유전자 형질전환을 위한 강력한 프로토콜을 제시하여 신경생물학 연구 역량을 강화합니다.
- 이 방법은 신경세포 기전 및 세포 간 기능에 대한 추가 연구의 기초를 마련합니다.
- 이러한 과정을 이해하는 것은 신경 가소성에 대한 통찰력과 잠재적인 치료 응용 분야를 파악하는 데 필수적입니다.
자주 묻는 질문
산업계 관련성 요약
장기 배양 뇌해마 슬라이스 배양물에서의 단일 세포 전기천공법은 흥분성 및 억제성 뉴런에 정밀한 유전자 전달을 가능하게 하여, 신경과학 발견 과정에서 표적 검증 및 메커니즘적 위험 제거를 지원합니다. 이 방법은 발달 단계 전반에 걸쳐 높은 형질전환 효율(~80%)을 제공하여, 경로 조사를 위한 일관된 표현형 스크리닝 및 분석법 개발을 가능하게 합니다. 이러한 접근 방식은 질환 관련 뉴런 시스템에서 재현 가능하고 정량적인 유전자 발현 연구를 가능하게 함으로써, 초기 표적 가설 검증 시의 생물학적 불확실성을 줄여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 해마의 흥분성 뉴런 및 클래스 특이적 억제성 뉴런에서 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 과학적 가치: 온전한 미세회로 내에서 유전자 발현을 생리학적 판독 값과 연결함으로써 기능적 표적 검증을 지원합니다.
- 운용적 가치: 감지 가능한 부작용 없이 높은 형질전환 효율을 달성하여 실험적 변동성을 줄여줍니다.
- 운용적 가치: 다양한 슬라이스 배양 기간(in vitro 7~21일)에 걸쳐 적용 가능하여, 표적 결합의 시간 경과 연구가 가능합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 하위 전기생리학 및 이미징 분석을 위해 검증된 신경세포 시스템을 준비합니다.
- 과학적 가치: 유전자 기능 및 단백질 상호작용에 대한 정량적인 단일 세포 해상도 데이터를 제공합니다.
- 운영적 가치: 표준 전기생리학 장비를 사용하여 기존 워크플로우로의 확장 가능한 통합을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 장기 배양 기간 동안 형질전환 효율을 유지하여 종단적 스크리닝 캠페인을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 병태생리학적 맥락에서 표적 기전을 연구하기 위해 질환 관련 해마 회로를 제공합니다.
- 과학적 가치: 시냅스 간 단백질 상호작용 및 세포 자율적 기전의 평가를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 형질전환 후 신경세포의 건강 상태를 유지함으로써 발견 단계에서 전임상 검증까지의 연속성을 촉진합니다.
- 운영적 가치: 일차 신경세포 배양에서 신뢰할 수 있고 반복 가능한 유전자 전달을 통해 위험 조정된 추진 결정(risk-adjusted advancement decisions)을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 표적 가설 검증부터 리드 화합물 발굴까지의 발견 연속체에 부합하며, 화합물 스크리닝 이전에 메커니즘적 리스크 감소를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 해마 신경세포군에서의 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 화합물 평가를 위해 재현 가능한 형질전환과 정량적 출력물을 갖춘 분석 준비 완료 시스템을 제공합니다.
- 분석: 저항성 기반 모니터링 및 전기생리학적 판독을 가능하게 하여 유전자 발현과 기능적 표현형 간의 상관관계를 분석합니다.
- 중개 연구: 기관형 절편의 안정적 형질전환을 통해 유전자 기능 연구와 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 기존 전기생리학 인프라를 활용하여 본 방법을 신경세포 표적 검증을 위한 재사용 가능한 플랫폼으로 포지셔닝합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 일차 뉴런에서의 고효율, 저독성 유전자 전달을 통해 표적 검증의 예측 신뢰도를 높임.
- 운영적 가치: 일관된 펄스 매개변수와 압력 사이클 프로토콜을 통한 표준화 및 재현성 확보.
- 전략적 가치: 뉴런 표적 결합의 기전적 모호성을 줄여 더욱 정확한 go/no-go 의사결정 가능.
- 포트폴리오 영향: 다양한 뉴런 클래스 및 발달 단계에 걸친 유전자 기능의 신뢰할 수 있는 평가를 통해 리스크가 조정된 우선순위 설정 가능.
실행 시 고려 사항
- 단일 세포 타겟팅을 위해 전기생리학 및 마이크로피펫 조작에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 유리 전극, 전기천공기, 그리고 뉴런의 건강을 위해 테트로도톡신이 포함된 멸균 ACSF가 필요합니다.
- 사용자 간의 압력 펄스 시퀀스 및 저항 모니터링의 표준화가 필수적입니다.
- 적응 고려 사항으로는 뉴런 유형이나 유전자 크기에 따라 플라스미드 농도와 펄스 폭을 조정하는 것이 포함됩니다.
- 실질적인 제한 사항: 뉴런의 취약성으로 인해 압력 사이클링 중 세포막 파열을 방지하기 위한 세심한 기술이 요구됩니다.
