Name: 마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 학습하세요 마우스 해마 조직 슬라이스 배양에서 흥분성 및 억제성 신경세포에 대한 단세포 전기천공 유전자 전달 기법을. 이 방법은 높은 전달 효율과 낮은 부작용으로 신경생물학 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 건강 보조금의 국가 학회에 의해 지원되었다 (R01NS085215 K.F.에, T32 GM107000 및 F30MH122146 A.C.). 저자들은 숙련된 기술 지원을 해주신 와타나베 나오에 씨에게 감사를 표합니다.

모든 동물 프로토콜은 매사추세츠 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 슬라이스 배양 준비, 플라스미드 제제 및 전기화도 이전에 공표된 방법에 상세하며 추가정보(10)를참조할 수 있다.
1. 슬라이스 문화 준비
<ol><li>이전에설명된바와 같이 마우스 organotypic 해마 슬라이스 배양을 준비하여, 산후 6-7일 된 마우스를 사용하여 어느 성별도 있다.<ol>
<li>(mM) 구성 된 organotypic 슬라이스 문화에 대한 해부 미디어를 준비 ( mM): 238 자당, 2.5 KCl, 1 CaCl2,4 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4,및 11 포도당 분수, 다음 가스 5% CO2/95% O2 에 7.4.</li>
		<li>▲78.8%(v/v) 최소 필수매체이글, 말 세럼 20% (v/v) ▲17.9m 나코3,26.6mMM포도당, 2M CaCl2,M MgSO4,30m HEPES, 인슐린(1μg/mL), 인슐린(1μg/mL), 인슐린(1μg/mL), 0.06m+0.06m+0.06m+0.0으로 구성된 조진형 슬라이스 배양 배지 를 준비한다. 진동계를 사용하여 삼투압을 310-330 osmol로 조정합니다.</li>
		<li>두 개의 주걱을 사용 하 여 전체 뇌에서 해 마 를 해 부, 그리고 슬라이스 (400 μm) 조직 헬기를 사용 하 여. 두 개의 집게를 사용하여 슬라이스를 분리하고 삽입 아래에 배양 매체(950 μL)로 채워진 6웰 플레이트에서 30mm 세포 배양 인서트를 분리한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 배양 인큐베이터(35°C, 5%CO2)에조직 배양물 컬쳐를 저장하고 2일마다 슬라이스 배양 매체를 변경한다.</li>
</ol>2. 플라스미드 준비
<ol><li>관심 유전자에 대한 플라스미드를 준비합니다.<ol>
<li>서브클론은 pCAG 벡터로 녹색 형광 단백질 (EGFP) 유전자를 향상시켰습니다.</li>
		<li>내독소가 없는 정화 키트를 함유한 pCAG-EGFP 플라스미드를 정화하고 140m K-메탄술포네이트, 0.2m MM EGTA, 2m M M MgCl2,10mM HEPES를 함유한 다이틸 파이로카보네이트 처리수로 구성된 내부 용액에 용해되어 7.3m(KOH7.3)로 조정된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 유리 파이펫 준비
<ol><li>마이크로피펫 풀러(그림 1A)에보로실리케이트 유리 파이펫 (4.5 - 8 MΩ)을 당깁니다. 참고: 전세포 패치 클램프 레코딩에 사용되는 유리 파이펫은 전기포공에 이상적입니다.</li>
	<li>200°C에서 밤새 유리 파이펫을 구워 멸균합니다.</li>
	<li>해부 현미경의 피펫 팁의 크기를 확인하여 전기 저항을 대략화하십시오.<ol>
<li>선택 사항:파이펫을 전기기 전극에 부착하여 파이펫 저항을 확인하고 마이크로 조작기를 사용하여 파이펫 팁을 필터 멸균 된 인공 뇌척수액 (aCSF)으로 기동합니다 (mM에서): 119 NaCl, 2.5KCl, 0.5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 및 11 포도당, 5% CO 2/95% O2 내지 7.4의 pH. 전기포레이터의 판독을 사용하여 실제 저항을 확인합니다. 참고: 파이펫 팁이 날카로워지며 전기 저항이 커집니다. 파이펫 저항은 10 MΩ 미만이어야 합니다. 파이펫 저항성이 높은 유리파이펫(도 1B)은반복된 전기기공 시 팁에서 종종 막힘입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 전기 기공 장비 설정
<ol><li>전기포레이터를 표준 전세포 전기생리학 장비에 설치하여 미세 조작기와 연동 펌프가 장착된 변속 테이블에 수직 현미경을 장착합니다.</li>
	<li>전자포레이터의 헤드스테이지를 미세 조작기에 설치하고 한 쌍의 스피커를 전자포레이터에 연결합니다. 전자포레이터를 풋 페달에 연결하여 준비시 펄스를 보낼 수 있습니다. 참고: 스피커가 켜져 있을 때 톤을 방출하며, 이는 전극의 전기 저항을 나타내는 지표입니다. 이렇게 하면 절차에서 주의를 끌지 않고 저항의 상대적 변화를 결정할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 전기 기공 준비
<ol><li>슬라이스 배양 물자를 6개의 웰 플레이트에서 3cm 페트리 접시로 옮기고 900 μL의 배양 매체를 적재하고 전기포기를 수행할 준비가 될 때까지 TABLEtop CO2 인큐베이터에 보관합니다.<ol>
<li>3.5cm 페트리 접시에서 3.5cm 페트리 접시에서 30분 이상 슬라이스 배양 매체(1mL)를 곁들인 신선한 배양 물자를 전기기 후 배양 슬라이스로 선적한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전기 포이션을 위해 장비를 청소하고 준비하십시오.<ol>
<li>하루에 대한 실험을 시작하기 전에 튜브와 챔버를 살균하기 위해 5 분 동안 10 % 표백제로 라인을 퍼퓨징하십시오.</li>
		<li>탈이온화된 오토클레이브 물로 라인을 30분 이상 분산하여 완전히 헹구는 경우를 대지 않습니다.</li>
		<li>0.001 mM 테트로도톡신(TTX)을 포함하는 필터 멸균 aCSF로 라인을 퍼퓨즈합니다. 참고: TTX는 인터뉴런10의과대 흥분으로 인한 세포 독성 및 사망을 최소화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>-5 V, 정사각형 펄스, 500ms의 훈련, 50Hz 의 주파수 및 500 μs의 펄스 폭 : 전기 포로이터의 펄스 매개 변수를 설정합니다.</li>
	<li>플라스미드 함유 내부 용액5μL로 유리 파이펫을 채웁니다.<ol>
<li>파이펫 끝에서 갇힌 기포를 여러 번 가볍게 두드려 서 제거합니다.</li>
		<li>해부 현미경으로 시각화하거나 파이펫 저항을 확인하기 위해 3.3.1 단계를 반복하여 손상에 대한 팁을 확인하십시오. 참고: 팁이 손상된 경우 유리 파이펫을 폐기해야 하며 이 단계는 이전에 3단계에서 준비된 새 유리 파이펫으로 반복되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파이펫 팁을 전극에 단단히 부착하고 스피커를 켭니다. 팁이 aCSF 매체와 접촉했을 때 전기포레이터의 판독(파이펫 저항)을 기록합니다.</li>
	<li>날카로운 블레이드를 사용하여 배양 인서트 멤브레인을 자르고 하나의 슬라이스 배양을 분리합니다. 날카로운 각진 포셉을 사용하여 슬라이스 배양을 전자기 챔버로 조심스럽게 옮기고 슬라이스 앵커로 위치를 고정합니다.<ol>
<li>신경 건강이나 기능의 변화와 같은 부작용을 방지하기 위해 한 번에 30 분 이상 인큐베이터 외부의 슬라이스 문화를 유지하지마십시오(12)</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 관심있는 전극 세포
<ol><li>입으로 파이펫에 양압을 적용하거나 튜브에 부착된 1mL 주사기(0.2 ~0.5mL 압력)를 사용하여 양압을 적용한다.</li>
	<li>마이크로 조작기의 3차원 노브 컨트롤을 사용하여 슬라이스 배양 표면 근처에서 파이펫 팁을 기동합니다.</li>
	<li>표적 세포를 선택하고 접근하여 현미경에서 볼 수 있는 세포 표면에 보조개가 형성될 때까지 양압이 가해지는 것을 유지합니다.</li>
	<li>압력 주기를 수행합니다.<ol>
<li>입에 의해 가벼운 음압을 빠르게 적용하여 파이펫 팁과 플라즈마 멤브레인 사이에 느슨한 씰이 형성되도록 하며, 피펫 팁으로 올라가는 멤브레인에 의해 시각적으로 표시됩니다. 스피커에서 나오는 음색의 증가를 청취하여 파이펫 저항의 증가(~2.5배 초기 저항)를 관찰한다. 보조가 다시 형성되도록 양압을 신속하게 다시 적용합니다.</li>
		<li>즉시 일시 중지하지 않고 적어도 두 번 더 압력 주기를 완료한 다음 1 s에 대한 음의 압력을 유지합니다. 참고: 주기 사이 를 일시 중지, 너무 많은 압력을 적용, 또는 너무 오래 대 한 부정적인 압력을 유지 상당한 세포 손상을 일으킬 수 있습니다 그리고 아마도 전기 기 공 동안 죽을 세포 원인.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스피커의 톤이 피치의 안정적인 정점에 도달하면 발 페달을 사용하여 전자 포레이터를 빠르게 펄스하여 피크 전기 저항을 나타냅니다. 펄스를 보내기 전에 1 s 이상 피크 저항에서 기다리지 마십시오. 참고: 이프로토콜(10)을사용할 때 오프 타겟 전기기화를 관찰하지 않았습니다. 압력 주기 동안 유리 파이펫과 접촉하는 세포만 은 형감염되었습니다. 다른 뉴런 근처에 파이펫을 배치하면 유전자 이식이 발생하지 않습니다.</li>
	<li>압력을 가하지 않고 셀에서 약 100 μm 의 파이펫을 부드럽게 철회합니다.</li>
	<li>양압을 다시 적용하여 저항이 5.5단계에서 기록된 판독값과 유사하다는 것을 확인한 다음 다음 셀에 접근합니다.<ol>
<li>양압을 적용하여 전기기 후 피펫 저항을 시각적으로 또는 현저하게 증가(>15% 더 높음)에 의해 표시된 잠재적 나막신을 제거합니다. 참고: 눈에 보이는 나막신이 없고 저항성이 여전히 상당히 높으면 파이펫을 버리고 새 것을 사용합니다. 사용자가 주의 할 경우 평균적으로, 파이펫은 최대 20 개의 전기 기화 이벤트에 사용할 수있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전기기화 후, 슬라이스 배양을 신선한 배양 인서트로 옮기고 인큐베이터에서 35°C에서 최대 3일 동안 배양한다.</li>
</ol>7. organotypic 해마 슬라이스 배양의 고정, 염색 및 이미징
<ol><li>전극된 organotypic 슬라이스 배양 2 -3 일 0.01 M 인산염 완충식 식염수 (1 x PBS)로 4 % 파라 포름알데히드 및 4 % 자당으로 실온에서 1.5 h로 전환 후 2 - 3 일.</li>
	<li>2h00m 인산염 버퍼(1x PB)에서 30% 자당에서 고정 및 배양 슬라이스를 제거합니다.</li>
	<li>슬라이스를 슬라이드 유리에 놓고 슬라이드 유리를 분쇄 된 드라이 아이스 위에 올려 놓아 얼립니다. 실온에서 슬라이스를 해동하고 1x PBS로 채워진 6 개의 웰 플레이트로 옮기습니다.</li>
	<li>GDB 버퍼(0.1% 젤라틴, 0.3% 트리톤 X-100, 450mM NaCl, 32% 1x PB, pH 7.4)에서 마우스 안티-GFP 및 토끼 안티-RFP 항체로 슬라이스를 실온에서 2시간 동안 염색한다.</li>
	<li>실온에서 1x PBS로 3회 세척하여 매 세척할 때마다 10분 동안 세척합니다.</li>
	<li>항마우스 알렉사 488-컨쥬게이드 이차 항체 및 항토끼 알렉사 594-공주 보조 항체를 실온에서 1시간 동안 GDB 버퍼로 배양한다. 실온에서 10분 동안 1x PBS에서 DAPI(4 μg/mL)로 슬라이스를 배양합니다.</li>
	<li>실온에서 3분 동안 1x PBS로 슬라이스를 3분 씩 씻는다.</li>
	<li>마운팅 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 슬라이스를 마운트하고 형광 이미징을 수행합니다.</li>
</ol>

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<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

우리는 여기에서 높은 효율성과 정밀도로 흥분성 및 억제 뉴런을 모두 횡단하는 전기 포기 법을 설명합니다. 당사의 최적화된 전기기화 프로토콜에는 매우 효율적인 유전자 이식을 달성하기 위한 세 가지 혁신적인 혁신이 있습니다. 우리의 첫 번째 수정은 이전에 게시 된프로토콜에비해 파이펫 크기를 증가하는 것이었습니다3,5,6. 이러한 변화로 인해 파이펫 막힘 없이 많은 뉴런을 전기화할 수 있었습니다. 또한, 하부 저항 파이펫은 원하는 결과를 달성하면서도 이전 방법에 비해 더 온화한 전기 펄스 파라미터를 사용할 수 있게 할 수있다 3. 다음으로, 전기기전에 반복된 압력 사이클링은 현저하게 감소된 세포사멸(10)이다. 우리는 종종 전기화하기 전에 음압의 단일 펄스를 적용하면서 혈장 막이 파이...

분자 생물학에서, 조사자에게 가장 중요한 고려 사항 중 하나는 그것의 기능을 해명하기 위하여 세포의 세포 또는 인구로 관심있는 유전자를 전달하는 방법입니다. 다른 전달 방법은 생물학적(예를 들어, 바이러스 벡터), 화학(예를 들어, 인산칼슘 또는 지질), 또는 물리적(예를 들어, 전기기화, 미세 주입 또는 생물리스트)1,2로분류될 수 있다. 생물학적 방법은 매우 효율적이며 세포 유형에 특이적일 수 있지만 특정 유전 도구의 개발에 의해 제한됩니다. 화학 적 접근은 시험관 내에서 매우 강력하지만, 형질은 일반적으로 무작위입니다; 추가, 이러한 접근은 주로 기본 셀에 대해서만 예약되어 있습니다. 물리적 접근법 중, 생물학은 기술적 관점에서 가장 간단하고 쉬운 방법이지만, 다시 상대적으로 낮은 효율로 무작위 형질 전환 결과를 생성합니다. 유전적 도구 개발 없이 특정 세포로 전이가 필요한 응용 의 경우, 우리는 단세포 전기기3,4를향해 바라본다.
전기포기는 전분 전기기분기만을 참조하는 데 사용되는 반면, 지난 20년 동안 여러 시험관 내 및 생체 내 단일 세포 전기기 프로토콜이 개발되어 특이성과 효율을 향상시키기 위해 개발되어5,6,7,전기포기는 개별 세포로 유전자를 전송하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 매우 정확할 수 있습니다. 그러나 절차는 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 걸리며 상대적으로 비효율적입니다. 실제로, 최근 논문은 기계화 전기 기공 장비의 타당성을조사했다 8,9,이는 이러한 로봇 공학을 설치에 관심이 조사관을위한 이러한 장벽의 몇 가지를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 더 간단한 수단을 찾는 사람들을 위해, 전기 화, 즉 세포 죽음, 경질 실패 및 파이펫 막힘에 대한 문제는 여전히 우려사항입니다.
최근에는 더 큰 기울어진 유리 파이펫을 사용하는 전기 포기 방법을 개발했습니다. 온화한 전기 펄스 파라미터, 그리고 종신뉴런에서 훨씬 더 높은 형질전환 효율을 생성한 독특한 압력 순환 단계는 마우스 의 해마 CA1 영역에서 소마토스타틴 발현 억제 억제인터뉴런을 포함하여 억제성 인터뉴런에서 유전자를 처음으로 횡단할 수 있게하였다. 그러나, 상이한 억제 인터뉴런 유형 및 뉴런 발달 단계에서 이 전기포기 방법의 신뢰성은 해결되지 않았다. 여기서, 우리는 이 전기기 기술이 흥분성 뉴런과 인터뉴런의 다른 종류 둘 다로 유전자를 이식할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 중요한 것은, 시험관내(DIV) 슬라이스 배양 연령에 관계없이 일체내의 전환 효율이 높았다는 것이다. 이 확립 및 사용자 친화적 인 기술은 생체 외 마우스 뇌 조직의 맥락에서 다른 세포 유형에 대한 단일 세포 전기 포레이션을 사용하는 데 관심이있는 모든 조사자에게 매우 권장됩니다.

<table><tbody><tr><td>Plasmid preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Organotypic slice culture preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>FST</td><td>#5/45</td><td>유기형 슬라이스 배양 준비를 위한 각진 해부 겸자</td></tr><tr><td>플라스크 필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>SCHVU02RE</td><td>배양 배지의 여과 및 보관</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>바인더</td><td>BD C150-UL</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>10180</td><td>유기형 슬라이스 배양 준비를 위한 조직 다지기</td></tr><tr><td>밀리셀 세포 배양 인서트, 30mm</td><td>Millipore</td><td>PIHP03050</td><td>유기형 슬라이스 배양 인서트</td></tr><tr><td>삼투압 정밀</td><td>시스템</td><td>OSMETTE II</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 코팅 주걱</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-06369-11</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>FST</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>멸균 진공 여과 시스템</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>여과 및 보관 aCSF</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrode preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary Glasses</td><td>Warner Instruments</td><td>640796</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetter Puller</td><td>Sutter 기기</td><td>P-1000</td><td>풀러</td></tr><tr><td>오븐</td><td>바인더</td><td>BD (E2)</td><td></td></tr><tr><td>풀러 필라멘트</td><td>셔터 기기</td><td>FB330B</td><td>풀러</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>단일 세포 전기천공 및 형광 이미징 #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5mm Falcon Petri Dishes</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Airtable</td><td>TMC</td><td>63-7512E</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Q 이미징</td><td>Retiga-2000DC</td><td>카메라</td></tr><tr><td>Electroporation 시스템</td><td>분자 장치</td><td>Axoporator 800A</td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>형광 조명 시스템</td><td>이전</td><td>루멘 200</td><td></td></tr><tr><td>매니퓰레이터</td><td>셔터 기기</td><td>MPC-385</td><td>매니퓰레이터</td></tr><tr><td>Metamorph 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td></td><td>이미지 획득</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Rainin</td><td>Dynamax, RP-2</td><td>관류 펌프</td></tr><tr><td>변속 테이블</td><td>Luigs & Neuman</td><td>240 XY</td><td></td></tr><tr><td>스피커</td><td>알 수 없는</td><td></td><td>스피커, 전기천공기에 연결된 스피커</td></tr>, <tr><td>실체 현미경</td>, <td>Olympus</td><td>SZ30</td><td></td></tr>, <tr><td>탁상용 인큐베이터</td><td>, Thermo Scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr>, <tr><td>정립 현미경</td>, <td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Fluorescence 이미징 #2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-in-One 형광 현미경</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

전기 기화는 그들의 기능을 이해하기 위하여 세포로 특정 유전자를 전송하는 중요한 방법으로 그 자체를 설치했습니다. 여기서, 우리는 마우스 organotypic 해마 슬라이스 배양에서 흥분 및 클래스 별 억제 뉴런에서 체외 유전자 의 효율 (~80%)을 최대화하는 단세포 전기 기법을 설명합니다. 대형 유리 전극, 테트로도톡신 함유 인공 뇌척수액 및 가벼운 전기 펄스를 사용하여 배양 된 해마 CA1 피라미드 뉴런 및 억제 인터뉴런에 관심 유전자를 전달했습니다. 더욱이, 전기기화는 다양한 슬라이스 배양 발달 단계에 대한 연구를 가능하게 하는, 형질 효율의 감소없이 시험관내에서 최대 21일까지 배양 된 해마 슬라이스에서 수행될 수 있었다. 다양한 세포 유형에 걸쳐 유전자의 분자 기능을 검사하는 데 관심이 증가함에 따라, 우리의 방법은 기존의 전기 생리 장비 및 기술로 수행 할 수있는 마우스 뇌 조직에서 체외 유전자 트랜스펙트에 대한 신뢰할 수 있고 간단한 접근 방식을 보여줍니다.

우리의 단세포 전기기는 시각적으로 확인된 흥분성 및 억제 신경으로 유전자를 정확하게 전달할 수 있습니다. 우리는 세 가지 다른 시점에서 세 가지 다른 신경 세포 유형을 전기화. 파브알부민(Pv) 또는 셀란 글루타민3 타입(VGT3)은 각각 Pv/TdTomato 및 VGT3/TdTomato 라인으로 명명된 TdTomato(적색 형광 단백질의 변형) 리포터 라인(Jax #007905)을 통해 Pvcre(JAX #008069) 또는 VGT3cre(JAX #018147) 라인을 횡단하여 뉴런을 표현하여 시각화하였다. Organotypic 슬라이스 배양은 C57BL/6J, Pv/TdTomato 및 VGT3/TdTomato 마우스로부터 제조되었습니다.
첫째, 전기기화는 시험관내(DIV)에서 7, 14 또는 21일에서 CA1 피라미드 뉴런(Py)에서 수행되었다. EGFP는 이러한 슬라이스 배양 연령(그림 2B-D)에걸쳐 해...

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

유전자 형질주입(transfection)은 신경생물학 연구에서 필수적인 접근법입니다. 당사의 전기천공법(electroporation technology)을 통해 검출 가능한 부작용 없이 유기형 해마 절편 배양에서 관심 유전자 중간뉴런을 transfection할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 단일 세포 프로토콜에 비해 훨씬 높은 형질주입 효율을 갖지만, 여전히 상대적으로 저렴하고 수행이 간단합니다.이 기술은 세포 자율 메커니즘 및 시냅스 전달 단백질 상호 작용을 포함하여 뉴런의 특정 분자 및 생리학적 기능을 이해하는 데 관심이 있는 연구자에게 유용할 것입니다. 전기천공을 위해 슬라이스 배양물을 준비하려면 관심 배양 삽입물을 900마이크로리터의 배양 배지가 적재된 개별 3cm 페트리 접시에 옮기고 배양물을 탁상용 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다. 다음으로, 3.5cm 페트리 접시에 삽입물당 1ml의 슬라이스 배양 배지로 신선 배양 삽입물을 최소 30분 동안 사전 배양하고 10% 표백제로 전기천공 리그의 라인을 5분 동안 멸균합니다.관류가 끝나면 0.001 밀리몰 테트로도톡신을 함유한 필터 멸균 ACSF로 관류하기 전에 이온화된 오토클레이브 물로 라인을 최소 30분 동안 헹굽니다. electroporator pulse를 진폭에서 5V를 뺀 값, square pulse, 500밀리초의 train, 50Hz의 주파수 및 500마이크로초의 펄스 폭으로 설정합니다. 유리 피펫에 5마이크로리터의 플라스미드 함유 내부 용액을 채우고 팁을 부드럽게 두드리고 여러 번 두드려 갇힌 기포를 제거합니다.해부 현미경을 사용하여 팁이 손상되지 않았는지 확인하고 피펫 팁을 전극에 단단히 부착합니다. 팁이 ACSF에 닿으면 electroporator의 피펫 저항 판독값을 기록합니다. 슬라이스 배양을 분리하려면 날카로운 칼날로 배양 삽입 멤브레인을 절단하고 날카로운 각도의 집게를 사용하여 슬라이스 배양을 전기천공실로 조심스럽게 옮깁니다.그런 다음 슬라이스 앵커로 배양 위치를 고정합니다. 관심 세포의 전기천공을 위해 입으로 피펫에 양압을 가하고 3차원 손잡이 컨트롤을 사용하여 피펫 팁을 슬라이스 배양 표면 근처로 이동합니다. 현미경으로 배양물을 보고 팁으로 표적 세포에 접근하면서 세포 표면에 보조개가 형성될 때까지 양압을 유지합니다.딤플을 시각화하면 입으로 약한 음압을 빠르게 가하여 피펫 팁과 원형질막 사이에 느슨한 밀봉이 형성되도록 합니다. 멤브레인이 피펫에 약간 들어갑니다. 피펫의 초기 저항이 약 2.5배 증가한 것을 관찰해야 하며, 이는 스피커의 톤 증가로 표시됩니다.보조개가 개혁되도록 양압을 빠르게 다시 가하십시오. 그런 다음 일시 중지하지 않고 방금 설명한 것처럼 최소 두 번의 압력 사이클을 즉시 완료하십시오. 마지막 압력 펄스 후 음압을 1초 동안 유지합니다.스피커의 톤이 피치에서 안정적인 정점에 도달하면 풋 페달을 사용하여 전기기에게 빠르게 펄스를 가합니다. 전기천공법 후 압력을 가하지 않고 피펫을 셀에서 약 100미크론 정도 부드럽게 후퇴시키고 양압을 다시 가하여 저항이 다음 셀에 접근하기 전에 기준선 판독값과 유사한지 확인합니다. 관심 세포가 모두 전기천공이 완료되면 절편 배양액을 준비된 신선한 배양 삽입물 중 하나로 옮기고 삽입물을 최대 3일 동안 섭씨 35도에서 놓습니다.이 대표적인 실험에서 EGFP는 7일, 14일 및 21일 in vitro 절편 배양 연령에 걸쳐 해마 CA1 영역의 5-20개의 피라미드 뉴런으로 형질 주입되었습니다. 파브알부민(Parvalbumin)과 소포성 글루타메이트 3형 중간뉴런(vesicular glutamate type 3 interneuron)도 해마 CA1 영역 내에서 성공적으로 전기천공될 수 있습니다. 흥미롭게도, transfection은 in vitro 절편 배양 연령에 의해 크게 영향을 받지 않으며, CA1 피라미드 뉴런에서 관찰되는 transfection 효율과 다르지 않습니다.뉴런은 매우 연약합니다. 세포에 접근하여 압력을 순환시키고 피펫 팁을 집어넣어 심각한 손상을 일으킬 때는 매우 신중하고 부드럽게 해야 합니다. 전기천공법 후 세포는 전기생리학 및 이미징을 포함한 다양한 실험 분석을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 쉽게 다른 뇌 영역 적용할 수 있습니다 organotypic hippocampal 조각을 준비하는 방법을 설명합니다. 뇌 조각이 인터페이스를 형성하기 위해 허용되는 구멍이 세포막과 문화 미디어에 누워있다. 이 방법은 최대 문화에 이주하는 해마의 매출 구조를 유지합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을...

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

출처: Keener, D. G., et al. 마우스 해마 흥분성 및 클래스 특이적 억제 뉴런의 다양한 기관형 절편 배양에 걸친 단일 세포 전기천공. J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 마우스 해마 절편 배양 내의 뉴런에 플라스미드 DNA를 도입하는 단일 세포 전기천공 과정을 보여줍니다. 이 절차에는 정확한 피펫 위치 지정, 압력 조정 및 전기천공 펄스가 포함되어 신경막을 일시적으로 투과시켜 유전자 전달을 촉진합니다. 전기천공 후, 슬라이스를 배양하여 도입된 관심 유전자의 발현을 가능하게 합니다.

마우스 해마 절편 배양에서 단일 세포 전기천공법을 통한 유전자 발현

이 비디오는 다양한 체외 해마 절편 배양에서 흥분성 및 억제성 뉴런 모두에 있는 유전자의 단세포 전기천공을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 기술은 세포 자율 메커니즘 및 시냅스 전달 단백질 상호 작용을 포함하여 뉴런의 특정 분자 및 생리학적 기능을 검사하는 데 유용합니다.

Organotypic Brain Slice Cultures의 Single Cell Electroporation: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices(유기형 뇌 슬라이스 배양에서의 단세포 전기천공법: 뇌 해마 슬라이스의 표적 뉴런 내부에 플라스미드를 전달하는 체외 기술)

이 비디오는 형질주입된 쥐 해마 뇌 절편에서 시냅스 상호 작용 및 신경 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 활동 전위를 트리거하기 위해 장거리 감각 뉴런을 조명하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 기록된 뉴런에서 결과로 발생하는 흥분성 시냅스 후 전위를 기록하는 것이 포함됩니다.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

쌍 기록은 시냅스로 연결된 두 개의 뉴런에서 동시에 전체 세포 패치 클램프 기록으로, 개별 뉴런 사이의 시냅스에 대한 정확한 전기생리학적 및 약리학적 특성화를 가능하게 합니다. 여기에서는 전기생리학을 위한 모든 실험실에서 유기형 해마 절편 배양에서 이 기술을 확립하기 위한 자세한 방법론과 요구 사항에 대해 설명합니다.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

여기에서는 해마 발달 중 특정 유전자의 조절 메커니즘을 조사하는 도구를 제공하는 프로토콜을 제시합니다. 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation) 및 유기형 절편 배양을 사용하면 단세포에서 관심 유전자의 발현을 상향 및 하향 조절하고 발달 과정에서 이들의 운명을 따를 수 있습니다.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

학습하세요 마우스 해마 조직 슬라이스 배양에서 흥분성 및 억제성 신경세포에 대한 단세포 전기천공 유전자 전달 기법을. 이 방법은 높은 전달 효율과 낮은 부작용으로 신경생물학 연구에 필수적입니다.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

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