마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

유전자 형질주입(transfection)은 신경생물학 연구에서 필수적인 접근법입니다. 당사의 전기천공법(electroporation technology)을 통해 검출 가능한 부작용 없이 유기형 해마 절편 배양에서 관심 유전자 중간뉴런을 transfection할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 단일 세포 프로토콜에 비해 훨씬 높은 형질주입 효율을 갖지만, 여전히 상대적으로 저렴하고 수행이 간단합니다.

이 기술은 세포 자율 메커니즘 및 시냅스 전달 단백질 상호 작용을 포함하여 뉴런의 특정 분자 및 생리학적 기능을 이해하는 데 관심이 있는 연구자에게 유용할 것입니다. 전기천공을 위해 슬라이스 배양물을 준비하려면 관심 배양 삽입물을 900마이크로리터의 배양 배지가 적재된 개별 3cm 페트리 접시에 옮기고 배양물을 탁상용 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다. 다음으로, 3.5cm 페트리 접시에 삽입물당 1ml의 슬라이스 배양 배지로 신선 배양 삽입물을 최소 30분 동안 사전 배양하고 10% 표백제로 전기천공 리그의 라인을 5분 동안 멸균합니다.

관류가 끝나면 0.001 밀리몰 테트로도톡신을 함유한 필터 멸균 ACSF로 관류하기 전에 이온화된 오토클레이브 물로 라인을 최소 30분 동안 헹굽니다. electroporator pulse를 진폭에서 5V를 뺀 값, square pulse, 500밀리초의 train, 50Hz의 주파수 및 500마이크로초의 펄스 폭으로 설정합니다. 유리 피펫에 5마이크로리터의 플라스미드 함유 내부 용액을 채우고 팁을 부드럽게 두드리고 여러 번 두드려 갇힌 기포를 제거합니다.

해부 현미경을 사용하여 팁이 손상되지 않았는지 확인하고 피펫 팁을 전극에 단단히 부착합니다. 팁이 ACSF에 닿으면 electroporator의 피펫 저항 판독값을 기록합니다. 슬라이스 배양을 분리하려면 날카로운 칼날로 배양 삽입 멤브레인을 절단하고 날카로운 각도의 집게를 사용하여 슬라이스 배양을 전기천공실로 조심스럽게 옮깁니다.

그런 다음 슬라이스 앵커로 배양 위치를 고정합니다. 관심 세포의 전기천공을 위해 입으로 피펫에 양압을 가하고 3차원 손잡이 컨트롤을 사용하여 피펫 팁을 슬라이스 배양 표면 근처로 이동합니다. 현미경으로 배양물을 보고 팁으로 표적 세포에 접근하면서 세포 표면에 보조개가 형성될 때까지 양압을 유지합니다.

딤플을 시각화하면 입으로 약한 음압을 빠르게 가하여 피펫 팁과 원형질막 사이에 느슨한 밀봉이 형성되도록 합니다. 멤브레인이 피펫에 약간 들어갑니다. 피펫의 초기 저항이 약 2.5배 증가한 것을 관찰해야 하며, 이는 스피커의 톤 증가로 표시됩니다.

보조개가 개혁되도록 양압을 빠르게 다시 가하십시오. 그런 다음 일시 중지하지 않고 방금 설명한 것처럼 최소 두 번의 압력 사이클을 즉시 완료하십시오. 마지막 압력 펄스 후 음압을 1초 동안 유지합니다.

스피커의 톤이 피치에서 안정적인 정점에 도달하면 풋 페달을 사용하여 전기기에게 빠르게 펄스를 가합니다. 전기천공법 후 압력을 가하지 않고 피펫을 셀에서 약 100미크론 정도 부드럽게 후퇴시키고 양압을 다시 가하여 저항이 다음 셀에 접근하기 전에 기준선 판독값과 유사한지 확인합니다. 관심 세포가 모두 전기천공이 완료되면 절편 배양액을 준비된 신선한 배양 삽입물 중 하나로 옮기고 삽입물을 최대 3일 동안 섭씨 35도에서 놓습니다.

이 대표적인 실험에서 EGFP는 7일, 14일 및 21일 in vitro 절편 배양 연령에 걸쳐 해마 CA1 영역의 5-20개의 피라미드 뉴런으로 형질 주입되었습니다. 파브알부민(Parvalbumin)과 소포성 글루타메이트 3형 중간뉴런(vesicular glutamate type 3 interneuron)도 해마 CA1 영역 내에서 성공적으로 전기천공될 수 있습니다. 흥미롭게도, transfection은 in vitro 절편 배양 연령에 의해 크게 영향을 받지 않으며, CA1 피라미드 뉴런에서 관찰되는 transfection 효율과 다르지 않습니다.

뉴런은 매우 연약합니다. 세포에 접근하여 압력을 순환시키고 피펫 팁을 집어넣어 심각한 손상을 일으킬 때는 매우 신중하고 부드럽게 해야 합니다. 전기천공법 후 세포는 전기생리학 및 이미징을 포함한 다양한 실험 분석을 수행할 수 있습니다.