Summary
Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.
Abstract
A eletroporação estabeleceu-se como um método crítico para transferir genes específicos para as células para entender sua função. Aqui, descrevemos uma técnica de eletroporação unicelular que maximiza a eficiência (~80%) da transfesão genética in vitro em neurônios inibitórios excitatórios e específicos de classe na cultura de fatia hipocampal organotipada do camundongo. Usando grandes eletrodos de vidro, fluido cerebrospinal artificial contendo tetrodotoxina e pulsos elétricos leves, entregamos um gene de interesse em neurônios piramimatais de CA1 hipocampal e interneurônios inibitórios. Além disso, a eletroporação poderia ser realizada em fatias hipocampais cultivadas até 21 dias in vitro sem redução na eficiência da transfecção, permitindo o estudo de diferentes estágios de desenvolvimento da cultura de fatias. Com o interesse crescente em examinar as funções moleculares dos genes em uma variedade diversificada de tipos celulares, nosso método demonstra uma abordagem confiável e direta para a transfecção genética in vitro no tecido cerebral do camundongo que pode ser realizada com equipamentos e técnicas de eletrofisiologia existentes.
Introduction
Na biologia molecular, uma das considerações mais importantes para um pesquisador é como entregar um gene de interesse em uma célula ou população de células para elucidar sua função. Os diferentes métodos de parto podem ser categorizados como biológicos (por exemplo, um vetor viral), químicos (por exemplo, fosfato de cálcio ou lipídico) ou físicos (por exemplo, eletroporação, microinjeção ou biolística)1,2. Os métodos biológicos são altamente eficientes e podem ser específicos do tipo celular, mas são limitados pelo desenvolvimento de ferramentas genéticas específicas. Abordagens químicas são muito poderosas in vitro, mas transfecções são geralmente aleatórias; além disso, essas abordagens são principalmente reservadas apenas para células primárias. Das abordagens físicas, a biolística é a mais simples e fácil do ponto de vista técnico, mas novamente produz resultados aleatórios de transfecção com uma eficiência relativamente baixa. Para aplicações que requerem transferência para células específicas sem a necessidade de desenvolver ferramentas genéticas, buscamos eletroporação unicelular3,4.
Considerando que a eletroporação usada para se referir apenas à eletroporação de campo, nos últimos vinte anos, vários protocolos de eletroporação unicelular in vitro e in vivo foram desenvolvidos para melhorar a especificidade e eficiência5,6,7, demonstrando que a eletroporação pode ser usada para transferir genes para células individuais e pode, portanto, ser extremamente precisa. No entanto, os procedimentos são tecnicamente exigentes, demorados e relativamente ineficientes. De fato, trabalhos mais recentes têm investigado a viabilidade das plataformas de eletroporação mecanizadas8,9, que podem ajudar a eliminar várias dessas barreiras para pesquisadores interessados em instalar tal robótica. Mas para aqueles que procuram meios mais simples, os problemas com eletroporação, ou seja, morte celular, falha de transfecção e entupimento de pipetas, permanecem uma preocupação.
Recentemente desenvolvemos um método de eletroporação que usa pipetas de vidro de ponta maior, parâmetros de pulso elétrico mais suaves e uma etapa de ciclismo de pressão única, que gerou uma eficiência de transfeção muito maior em neurônios excitatórios do que os métodos anteriores, e nos permitiu pela primeira vez transfectar genes em interneurônios inibitórios, incluindo interneurônios inibidores expressivos na região hipocampal ca1 da cultura organotipica do rato10. No entanto, a confiabilidade deste método de eletroporação em diferentes tipos inibitórios e estágios de desenvolvimento neuronal não foi abordada. Aqui, demonstramos que essa técnica de eletroporação é capaz de transfetar genes tanto em neurônios excitatórios quanto em diferentes classes de interneurônios. É importante ressaltar que a eficiência da transfecção foi alta independentemente dos dias in vitro (DIV) da idade da cultura da fatia testada. Esta técnica estabelecida e fácil de usar é altamente recomendada para qualquer investigador interessado em usar eletroporação unicelular para diferentes tipos de células no contexto do tecido cerebral in vitro do rato.
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Protocol
Todos os protocolos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Massachusetts. A preparação da cultura de fatias, a preparação plasmida e a eletroporação também estão detalhadas em nossos métodos publicados anteriormente e podem ser encaminhadas para informações adicionais10.
1. Preparação para cultura de fatias
- Prepare culturas de fatias hipocampais organotípicas do rato como descrito anteriormente11, usando camundongos pós-natal de 6 a 7 dias de idade de ambos os sexos.
- Preparar a mídia de dissecção para a cultura de fatia organotipípica composta (em mM): 238 sacarose, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, e 11 glicose em água desionizada, depois gás com 5% DE CO2/95% O2 a um pH de 7,4.
- Prepare a mídia de cultura de fatia organotipípica composta por: 78,8% (v/v) Águia Média Essencial Mínima, 20% (v/v) soro de cavalo, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM de glicose, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4,30 mM HEPES, insulina (1 μg/mL) e 0,06 mM ácido ascórbico, pH ajustado para 7,3. Ajuste a osmolaridade para 310-330 osmol usando um osmômetro.
- Disseque hipocampi de todo o cérebro usando duas espátulas, e corte (400 μm) usando um helicóptero de tecido. Separe as fatias usando duas fórceps e transfira para inserções de cultura celular de 30 mm em uma placa de 6 poços cheia de mídia de cultura (950 μL) sob as pastilhas.
- Armazene culturas de fatias organotipíticas em uma incubadora de cultura de tecidos (35°C, 5% CO2) e mude a mídia de cultura de fatias a cada dois dias.
2. Preparação plasmid
- Prepare o plasmídeo para o gene de interesse.
- Subclone aprimorou o gene da proteína fluorescente verde (EGFP) em um vetor pCAG.
- Purifique o plasmídeo pCAG-EGFP com um kit de purificação livre de endotoxinas e dissolva-se em uma solução interna que consiste em água tratada com pirocarbonato de dietilo contendo 140 mM K-metanosulfonato, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2e 10 mM HEPES, ajustado para pH 7.3 com KOH (concentração plasmida: 0,1 μg/μL).
3. Preparação de pipeta de vidro
- Puxe pipetas de vidro borossilicato (4,5 – 8 MΩ) em um puxador de micropipette(Figura 1A).
NOTA: As pipetas de vidro usadas para gravações de grampos de remendo de células inteiras são ideais para eletroporação. - Asse pipetas de vidro durante a noite a 200°C para esterilizar.
- Verifique o tamanho da ponta da pipeta sob um microscópio de dissecção para aproximar a resistência elétrica.
- Opcional:Verifique a resistência da pipeta anexando a pipeta ao eletrodo de eletroporação e use o micromanipulador para manobrar a ponta da pipeta em fluido cerebrospinal artificial esterilizado por filtro (aCSF) contendo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 e 11 glicose em água desionizada, gaseado com 5% de CO2/95% O2 a um pH de 7,4. Confirme a resistência real usando a leitura no eletroporador.
NOTA: Quanto mais nítida a ponta da pipeta, maior a resistência elétrica. A resistência à pipeta deve estar abaixo de 10 MΩ. Pipetas de vidro com alta resistência à pipeta(Figura 1B) muitas vezes entupem na ponta durante a eletroporação repetida.
- Opcional:Verifique a resistência da pipeta anexando a pipeta ao eletrodo de eletroporação e use o micromanipulador para manobrar a ponta da pipeta em fluido cerebrospinal artificial esterilizado por filtro (aCSF) contendo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 e 11 glicose em água desionizada, gaseado com 5% de CO2/95% O2 a um pH de 7,4. Confirme a resistência real usando a leitura no eletroporador.
4. Configuração da plataforma de eletroporação
- Instale o eletroporador em uma plataforma padrão de eletrofisiologia de células inteiras, equipada com um microscópio vertical montado em uma mesa de mudança com uma bomba micromanipuladora e peristáltica.
- Instale o headstage do eletroporador em um micromanipulador e conecte um par de alto-falantes ao eletroporador. Conecte o eletroporador a um pedal de pé que pode ser usado para enviar um pulso quando estiver pronto.
NOTA: Os alto-falantes emitem um tom quando ligados, que é um indicador da resistência elétrica no eletrodo. Isso permite determinar mudanças relativas na resistência sem afastar a atenção do procedimento.
5. Preparação para eletroporação
- Transfira as pastilhas de cultura de fatias de 6 placas de poço para 3 cm de placas de Petri carregadas com 900 μL de mídia cultural e armazene em uma incubadora de CO2 até estar pronta para realizar a eletroporação.
- Pré-inser em que a cultura fresca insira com meios de cultura fatia (1 mL) por pelo menos 30 min em uma placa de Petri de 3,5 cm para fatias de cultura após a eletroporação.
- Limpe e prepare a plataforma para eletroporação.
- Perfunda as linhas com alvejante de 10% por 5 minutos para esterilizar o tubo e a câmara antes de iniciar o experimento para o dia.
- Perfumar as linhas com água autoclavada deionizada por pelo menos 30 minutos para enxaguar completamente.
- Perfunda as linhas com aCSF esterilizado por filtro contendo tetrodotoxina de 0,001 mM (TTX).
NOTA: O TTX minimiza a toxicidade celular e a morte devido à superexcitação dos interneurons10.
- Defina os parâmetros de pulso do eletroporador: amplitude de –5 V, pulso quadrado, trem de 500 ms, frequência de 50 Hz e uma largura de pulso de 500 μs.
- Encha a pipeta de vidro com 5 μL de solução interna contendo plasmídeos.
- Remova quaisquer bolhas de ar presas da ponta da pipeta piscando e tocando suavemente a ponta várias vezes.
- Verifique se há danos na ponta visualizando-a sob um microscópio de dissecção ou repetindo o passo 3.3.1 para verificar a resistência da pipeta.
NOTA: Se a ponta estiver danificada, a pipeta de vidro deve ser descartada, e esta etapa deve ser repetida com uma nova pipeta de vidro previamente preparada na etapa 3.
- Conecte com segurança a ponta da pipeta ao eletrodo e ligue os alto-falantes. Registo a leitura (resistência da pipeta) do eletroporador quando a ponta tiver feito contato com o meio aCSF.
- Corte a membrana de inserção de cultura usando uma lâmina afiada e isole uma cultura de fatia. Transfira cuidadosamente a cultura da fatia para a câmara de eletroporação usando fórceps angulares afiados e fixe sua posição com uma âncora de fatia.
- Não mantenha a cultura da fatia fora da incubadora por mais de 30 minutos de cada vez para evitar efeitos colaterais, como alterações na saúde neuronal ou função12.
6. Células eletroporadas de interesse
- Aplique pressão positiva na pipeta com boca ou usando uma seringa de 1 mL (pressão de 0,2 - 0,5 mL) presa à tubulação.
- Use os controles de botão tridimensional do micromanipulador para manobrar a ponta da pipeta perto da superfície da cultura da fatia.
- Escolha uma célula-alvo e aproxime-a, mantendo a pressão positiva aplicada até que uma covinha se forme na superfície da célula, visível no microscópio.
- Realize ciclos de pressão.
- Aplique rapidamente uma leve pressão negativa pela boca de modo que uma vedação solta se forme entre a ponta da pipeta e a membrana plasmática, indicada visualmente pela membrana subindo um pouco na ponta da pipeta. Observe um aumento (~2,5x a resistência inicial) na resistência à pipeta ouvindo um aumento no tom proveniente dos alto-falantes. Aplice rapidamente a pressão positiva para que a covinha se reeme.
- Imediatamente complete pelo menos mais dois ciclos de pressão sem pausar, em seguida, mantenha pressão negativa para 1 s.
NOTA: Pausar entre ciclos, aplicar muita pressão ou segurar a pressão negativa por muito tempo pode causar danos celulares significativos e possivelmente causar a morte da célula durante a eletroporação.
- Pulso rápido do eletroporador uma vez usando o pedal do pé quando o tom dos alto-falantes atinge um ápice estável no tom, indicando pico de resistência elétrica. Não espere no pico de resistência por mais de 1 s antes de enviar o pulso.
NOTA: Não observamos eletroporação fora do alvo ao usar este protocolo10. Apenas as células em contato com a pipeta de vidro durante os ciclos de pressão foram transfecidas. Posicionar a pipeta perto de outros neurônios não resulta em transfecção genética. - Retire suavemente a pipeta aproximadamente 100 μm da célula sem aplicar pressão.
- Reaplousa a pressão positiva, verificando se a resistência é semelhante à leitura registrada na etapa 5.5 e, em seguida, aproxime-se da célula seguinte.
- Remova os potenciais tamancos, indicados visualmente ou por uma resistência significativa (>15% maior) à pipeta após a eletroporação, aplicando pressão positiva.
NOTA: Se não houver entupimento visível e a resistência ainda for significativamente maior, descarte a pipeta e use uma nova. Em média, uma pipeta pode ser usada para até 20 eventos de eletroporação se o usuário tivercuidado 10.
- Remova os potenciais tamancos, indicados visualmente ou por uma resistência significativa (>15% maior) à pipeta após a eletroporação, aplicando pressão positiva.
- Após a eletroporação, transfira a cultura da fatia para uma inserção de cultura fresca e incubar a 35°C na incubadora por até 3 dias.
7. Fixação, coloração e imagem de culturas de fatias hipocampais organotípicas
- Fixar culturas de fatia organofíspica eletroporada 2 – 3 dias após a transfecção com 4% de paraformaldeído e 4% de sacarose em 0,01 M de salina tamponada de fosfato (1x PBS) por 1,5 h à temperatura ambiente.
- Remova as fatias fixativas e incubadas em 30% de sacarose em 0,1 M tampão fosfato (1x PB) por 2 h.
- Coloque fatias em um copo de slides e congele-as colocando o vidro de deslizamento em cima de gelo seco esmagado. Descongele as fatias em temperatura ambiente e transfira-as para uma placa de 6 poços cheia de 1x PBS.
- Manche as fatias com anticorpos anti-GFP e coelhinho em tampão GDB (0,1% gelatina, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl e 32% 1x PB, pH 7,4) por 2h a temperatura ambiente.
- Lave as fatias com 1x PBS três vezes à temperatura ambiente por 10 minutos cada lavagem.
- Incubar fatias com anticorpo secundário alexa 488 conjugado e anticorpo secundário alexa 594 conjugados em tampão GDB por 1 h à temperatura ambiente. Incubar fatias com DAPI (4 μg/mL) em 1x PBS por 10 min a temperatura ambiente.
- Lave as fatias com 1x PBS três vezes à temperatura ambiente por 3 minutos cada lavagem.
- Monte fatias em lâminas de vidro usando meio de montagem e realize imagens de fluorescência.
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Representative Results
Nossa eletroporação unicelular é capaz de fornecer genes precisamente em neurônios excitatórios e inibitórios visualmente identificados. Eletroporamos três tipos diferentes de células neuronais em três pontos de tempo diferentes. Linhas de glutamato parvalbumin (Pv) ou glutamato vesicular tipo 3 (VGT3) expressando neurônios foram visualizados cruzando linhas decre Pv (JAX #008069) ou VGT3cre (JAX #018147) com linhas repórter TdTomato (uma variante de proteína fluorescente vermelha) (Jax #007905), respectivamente chamada de Linhas Pv/TdTomato e VGT3/TdTomato. Culturas de fatias organotípicas foram preparadas a partir de camundongos C57BL/6J, Pv/TdTomato e VGT3/TdTomato.
Primeiro, a eletroporação foi realizada em neurônios piramimais ca1 (Py) em 7, 14 ou 21 dias in vitro (DIV). O EGFP foi transfectado em 5-20 neurônios piramifecionais na área hipocampal ca1 através dessas idades de cultura de fatia(Figura 2B-D). Os neurônios piramimais ca1 foram identificados utilizando-se contraste de interferência diferencial (DIC). Para demonstrar a distribuição anatômica e as diferenças morfológicas entre neurônios piramimatais e interneurônios inibitórios na cultura de fatias, os neurônios piramifecionais ca1 foram eletroporados com EGFP em um rato DIV7 Pv/TdTomato e contra-retenção nuclear foi realizado para exibir a localização distinta de neurônios egfp-positivos na camada de células piramimáticas CA1(Figura 2A).
Em seguida, este protocolo também foi aplicado aos interneurônios TdTomato-positivos Pv e VGT3. A eletroporação EGFP foi realizada em 1-10 interneurônios fluorescentes rotulados. Os neurônios TdTomato-positivo Pv (Figura 3) e VGT3(Figura 4) foram eletroporados com sucesso na área hipocampal ca1. Curiosamente, a transfecção do gene EGFP de interesse em todos esses tipos neuronais inibitórios não foi significativamente afetada pelo DIV e não difere da eficiência de transfecção (~80%) observada nos neurônios piramifecionais ca1(Figura 5).
Figura 1: Duas imagens representativas de pipeta de vidro.
(A) Exibir pipetas de menor resistência (6,5 MΩ), usadas neste protocolo, e(B) pipetas de maior resistência (10,4 MΩ) típicas para protocolos de eletroporação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Culturas de fatia hipocampal organotípicas foram eletroporadas com EGFP (verde) em três pontos de tempo diferentes.
(A) Cultura representativa de fatias hipocampais organotípicas em um rato DIV7 Pv/TdTomato. Os neurônios piramimatais ca1 foram eletroporados com EGFP (pontas de flecha verde, branca) e não mostraram sobreposição com interneurônios Pv TdTomato (vermelho, pontas de flecha amarela). A contra-retenção nuclear da DAPI (azul) foi realizada. DG: giro dentado. (B-D) Os neurônios piramicidas ca1 foram eletroporados com EGFP em três pontos de tempo diferentes: (B) DIV7, (C) DIV14 e(D) DIV21. As culturas de fatia organotípica foram fixadas com 4% de sacarose, 4% paraformaldeído/ 1x PBS e imaged sem maiores secções. No canto superior esquerdo, imagens de baixa ampliação da área hipocampal ca1. Pontas de flecha representam neurônios piramimais CA1 individuais destinados à eletroporação. Neurônios transfectados com pontas de flecha amarela são ampliados nos painéis inferiores. Pontas de flecha branca significam neurônios eletroporados adicionais fora da visão de alta ampliação. No canto superior direito, imagens de baixa ampliação de imagens fluorescentes sobrepostas (Sup) e Nomarski. Barras de escala: 500, 50, 100, 20 μm, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: As culturas de fatia hipocampal organotípicas pv/TdTomato foram eletroporadas com EGFP (verde) em três pontos de tempo diferentes.
(A) DIV7, (B) DIV14 e (C) DIV21. A sobreposição com células TdTomato (TdT) positivas (vermelhas) foi observada na camada de células piramicidas ca1 hipocampal e oriens. Nos insets de baixa ampliação (linha superior), as pontas de flecha amarela representam interneurônios fotovoltaicos individuais destinados à eletroporação. Pontas de flecha branca significam interneurônios fotovoltaicos tdTomato positivos eletroporados fora da visão de alta ampliação. Barras de escala: 50, 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: As culturas de fatia hipocampal organotípicas VGT3/TdTomato foram eletroporadas com EGFP (verde) em três pontos de tempo diferentes.
(A) DIV7, (B) DIV14 e (C) DIV21. A sobreposição com células TdTomato (TdT) (vermelhas) foi observada na camada de células piramicidas ca1 hipocampal e oriens. Nos insets de baixa ampliação (linha superior), as pontas de flecha amarela representam interneurônios VGT3 individuais destinados à eletroporação. Pontas de flecha branca significam interneurônios VGT3 adicionais TdTomato-positivos eletroporados fora da visão de alta ampliação. Barras de escala: 50, 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Níveis comparáveis de eficiência de transfecção em neurônios piramifecionais CA1, Pv/TdTomato e interneurônios VGT3/TdTomato em três diferentes idades de cultura de fatia in vitro.
Gráficos de barras sumárias de três diferentes idades de cultura de fatias: DIV7 (esquerda), DIV14 (médio) e DIV21 (direita). Cada símbolo representa a eficiência de transfecção obtida de uma cultura organotípica de fatias CA1 Py: DIV7 (12 culturas de fatias de 2 camundongos), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Foto: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). ANOVA unidirecional; n.s. (não significativo). Os dados mostrados são ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Descrevemos aqui um método de eletroporação que transfecta neurônios excitatórios e inibitórios com alta eficiência e precisão. Nosso protocolo de eletroporação otimizado tem três avanços inovadores para alcançar transfecção genética altamente eficiente. Nossa primeira modificação foi aumentar o tamanho da pipeta em comparação com os protocolos publicados anteriormente3,5,6. Essa mudança nos permitiu eletroporar muitos neurônios sem entupimento de pipetas. Além disso, é possível que as pipetas de menor resistência permitam o uso de parâmetros de pulso elétrico mais suaves em comparação com os métodos anteriores, ao mesmo tempo em que alcançam o resultado desejado3. Em seguida, repetiu o ciclismo de pressão antes da eletroporação, reduzindo significativamente a morte celular10. Observamos frequentemente que com a aplicação de um único pulso de pressão negativa antes de eletroporar, a membrana plasmática grudou no interior da ponta da pipeta, danificando a célula. Os ciclos de pressão ajudaram muito menos a membrana plasmática a aderir à pipeta, o que melhorou a sobrevivência e a recuperação celular durante o procedimento10. Finalmente, a adição do TTX no aCSF melhorou muito o sucesso da eletroporação nos neurônios inibitórios10. Consideramos que a eletroporação pode causar superexcitação celular letal que pode ser evitada pelo TTX. Acima de tudo, essas melhorias críticas oferecem taxas de sucesso notavelmente altas em eletroporação tanto para neurônios excitatórios quanto inibitórios(Figura 5). Embora não tenhamos encontrado anormalidades eletrofisiológicas em nossos neurônios após a transfecção com este método10 nas células alvo, foi relatado que as alterações locais de pH durante a eletroporação reduzem a viabilidade celular e a otimização dos parâmetros de eletroporação pode ser relativamente difícil em comparação com outros métodos de transfecção genética13,14. Por isso, é importante considerar efeitos colaterais imprevistos da eletroporação e reotimizar os parâmetros elétricos conforme necessário para alcançar uma alta eficiência de transfecção para qualquer aplicação específica.
A tecnologia de microinjeção também tem sido usada como uma abordagem poderosa para fornecer transgenes às células2,15,16. No entanto, essa abordagem geralmente produz um menor rendimento de transfecção e requer um alto nível de habilidade. Em contraste, nosso método pode ser usado com relativa facilidade e a um custo mínimo para laboratórios que realizam rotineiramente estudos de eletrofisiologia de células inteiras.
Recentemente, mostramos que múltiplos genes podem ser transfectados tanto em excitatória quanto em somatostatina expressando neurônios inibitórios sem efeitos colaterais nas propriedades eletrofisiológicas10. Neste estudo, demonstramos que este método de eletroporação é altamente eficiente nos neurônios piramimáticos CA1(Figura 2) e Pv(Figura 3) e VGT3(Figura 4) interneurônios inibitórios. Além disso, essa técnica de eletroporação nos permite transfectar genes de interesse com uma taxa de sucesso de ~80% independentemente do tipo celular ou número de dias in vitro(Figura 5). Embora a técnica tenha sido testada apenas in vitro, culturas de fatias hipocampais organotípicas nos mesmos pontos de tempo DIV que testamos têm sido mostradas para seguir a morfologia e atividade sináptica in vivo, como visto em fatias hipocampais agudamente preparadas17. Além disso, como só testamos esse método em neurônios hipocampais, é possível que possa haver desafios imprevistos na aplicação dessa técnica aos neurônios em outras regiões cerebrais. O método convida à exploração de genes durante o desenvolvimento da cultura de fatias organotipíticas em que a transmissão sináptica e a densidade, entre outras propriedades, mudam ao longo do tempo.
Este protocolo é uma melhoria em relação aos previamente estabelecidos, pois é simultaneamente de baixo custo, menos tecnicamente desafiador e mais eficiente na geração de transfecção genética de um neurônio5,6,7,8,9. Também parece ser uma melhoria em relação aos métodos anteriores em termos de taxas mais baixas de danos celulares ou morte, como observamos que ~80% das células foram transfeminadas com sucesso e saudáveis após o procedimento. Este método, portanto, fornece uma nova oportunidade para examinar os papéis dos genes em múltiplos tipos de células neuronais usando modelos de camundongos fluorescentes. Estudos futuros usando este método podem se concentrar em interações proteína-proteína entre as células para examinar funções moleculares ou fisiológicas específicas, incluindo interações proteicas transsintálicas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Subsídios à Saúde (R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 e F30MH122146 a A.C.). Os autores agradecem à Sra. Naoe Watanabe por assistência técnica hábil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
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