Summary
Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.
Abstract
Elektroporasyon, işlevlerini anlamak için belirli genleri hücrelere aktarmak için kritik bir yöntem olarak kendini belirlemiştir. Burada, fare organotipik hipokampal dilim kültüründe uyarıcı ve sınıfa özgü inhibitör nöronlarda in vitro gen transfeksiyonunun verimliliğini (~%80) en üst düzeye çıkaran tek hücreli bir elektroporasyon tekniğini açıklıyoruz. Büyük cam elektrotlar, tetrodotoksin içeren yapay beyin omurilik sıvısı ve hafif elektriksel darbeler kullanarak, kültürlü hipokampal CA1 piramidal nöronlarına ve inhibitör internöronlara ilgi çekici bir gen sunduk. Ayrıca, elektroporasyon, transfeksiyon verimliliğinde herhangi bir azalma olmadan 21 güne kadar kültürlü hipokampal dilimlerde gerçekleştirilebilir ve farklı dilim kültürü gelişim aşamalarının incelenmesine olanak sağlar. Çeşitli hücre tiplerinde genlerin moleküler fonksiyonlarını incelemeye olan ilgi artarken, yöntemimiz fare beyin dokusunda mevcut elektrofizyoloji ekipmanı ve teknikleri ile gerçekleştirilebilen in vitro gen transfeksiyonunda güvenilir ve basit bir yaklaşım göstermektedir.
Introduction
Moleküler biyolojide, bir araştırmacının en önemli hususlarından biri, işlevini ortaya çıkarmak için bir hücreye veya hücre popülasyonuna ilgi çekici bir genin nasıl teslimılacağıdır. Farklı teslimat yöntemleri biyolojik (örneğin, viral bir vektör), kimyasal (örneğin, kalsiyum fosfat veya lipit) veya fiziksel (örneğin, elektroporasyon, mikroenjeksiyon veya biyoliztik) olarak kategorize edilebilir1,2. Biyolojik yöntemler oldukça verimlidir ve hücre tipine özgü olabilir, ancak spesifik genetik araçların geliştirilmesi ile sınırlıdır. Kimyasal yaklaşımlar çok güçlü in vitrodur, ancak transeksiyonlar genellikle rastgeledir; ayrıca, bu yaklaşımlar çoğunlukla yalnızca birincil hücreler için ayrılmıştır. Fiziksel yaklaşımlar arasında biyolistik teknik açıdan en basit ve en kolay olanıdır, ancak yine nispeten düşük verimlilikte rastgele transfeksiyon sonuçları üretir. Genetik araçlar geliştirmeye gerek kalmadan belirli hücrelere transfer gerektiren uygulamalar için, tek hücreli elektroporasyon3,4'e bakıyoruz.
Elektroporasyon sadece alan elektroporasyonunu ifade etmek için kullanılırken, son yirmi yıl içinde, özgüllüğü ve verimliliği artırmak için çoklu in vitro ve in vivo tek hücreli elektroporasyon protokolleri geliştirilmiştir5,6,7, elektroporasyonun genleri tek tek hücrelere aktarmak için kullanılabileceğini ve bu nedenle son derece hassas olabileceğini göstermiştir. Ancak, prosedürler teknik olarak zorlu, zaman alıcı ve nispeten verimsizdir. Gerçekten de, daha yeni makaleler mekanize elektroporasyon makinelerinin fizibilitesini araştırdı8,9, bu tür robotikleri kurmakla ilgilenen araştırmacılar için bu engellerin birkaçını ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir. Ancak daha basit araçlar arayanlar için, elektroporasyon, yani hücre ölümü, transfeksiyon yetmezliği ve pipet tıkanması ile ilgili sorunlar bir endişe olmaya devam ediyor.
Son zamanlarda daha büyük uçlu cam pipetler kullanan bir elektroporasyon yöntemi geliştirdik, daha hafif elektriksel darbe parametreleri ve eksistik nöronlarda önceki yöntemlere göre çok daha yüksek transfeksiyon verimliliği sağlayan ve ilk kez fare organotipik dilim kültürünün hipokampal CA1 bölgesindeki somatostatin ekspresyon inhibitör internöronlar da dahil olmak üzere inhibitör internöronlardaki genleri dönüştürmemizi sağlayan benzersiz bir basınç döngüsü adımı10. Ancak bu elektroporasyon yönteminin farklı inhibitör internöron tiplerinde ve nöronal gelişim evrelerinde güvenilirliği ele alınmamıştır. Burada, bu elektroporasyon tekniğinin genleri hem uyarıcı nöronlara hem de farklı internöron sınıflarına aktarabildiğini gösterdik. Daha da önemlisi, test edilen in vitro (DIV) dilim kültürü yaşı ne olursa olsun transfeksiyon verimliliği yüksekti. Bu yerleşik ve kullanıcı dostu teknik, in vitro fare beyin dokusu bağlamında farklı hücre tipleri için tek hücreli elektroporasyon kullanmak isteyen herhangi bir araştırmacıya şiddetle tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelendi ve onaylandı. Dilim kültürü hazırlama, plazmid hazırlama ve elektroporasyon da daha önce yayınlanan yöntemlerimizde ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve ek bilgi için başvurulabilir10.
1. Dilim kültürü hazırlığı
- Daha önce açıklandığı gibi fare organotipik hipokampal dilim kültürleri hazırlayın11, her iki cinsiyetin doğum sonrası 6 ila 7 günlük farelerini kullanarak.
- Diseksiyon ortamını (mM olarak): 238 sakkarozdan oluşan organotipik dilim kültürü için hazırlayın, 2.5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4ve deiyonize suda 11 glikoz, daha sonra% 5 CO2/ 95% O2 ile 7.4 pH'a gaz.
- Organotipik dilim kültür medyasını hazırlayın: %78,8 (v/v) Minimum Esansiyel Orta Kartal, %20 (v/v) at serumu, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM glikoz, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, insülin (1 μg/mL) ve 0,06 mM askorbik asit, pH 7,3'e ayarlanmıştır. Omometre kullanarak omuzolariteyi 310-330 osmol'e ayarlayın.
- Hipokampiyi iki spatula kullanarak tüm beyinden ayırın ve bir doku helikopteri kullanarak dilimleyin (400 μm). İki ton sesi kullanarak dilimleri ayırın ve kesici uçların altındaki kültür ortamı (950 μL) ile dolu 6 kuyu plakasında 30 mm hücre kültürü kesici uçlarına aktarın.
- Organotipik dilim kültürlerini bir doku kültürü inkübatöründe (%35°C, %5 CO2)saklayın ve dilim kültürü ortamını iki günde bir değiştirin.
2. Plazmid hazırlığı
- Plazmidi ilgi genine hazırlayın.
- Bir pCAG vektörüne yeşil floresan protein (EGFP) geninin alt sıvısı.
- pCAG-EGFP plazmidini endotoksin içermeyen bir arıtma kiti ile arındırın ve 140 mM K-metansülfonat içeren dietil pirokarbonat arıtılmış sudan oluşan bir iç çözeltide çözün, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2ve 10 mM HEPES, KOH ile pH 7,3'e ayarlanmıştır (plazmid konsantrasyonu: 0,1 μg/μL).
3. Cam pipet hazırlama
- Bir mikropipette çekme üzerine borosilikat cam pipetleri (4,5 – 8 MΩ) çekin (Şekil 1A).
NOT: Tüm hücreli yama kelepçe kayıtları için kullanılan cam pipetler elektroporasyon için idealdir. - Sterilize etmek için cam pipetleri 200°C'de geceleyin pişirin.
- Elektrik direncini yaklaşık olarak görmek için pipet ucunun boyutunu diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.
- İsteğe bağlı:Pipeti elektroporasyon elektroduna bağlayarak pipet direncini doğrulayın ve pipet ucunu filtre sterilize edilmiş yapay beyin omurilik sıvısına (aCSF) manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın (mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 ve 11 glikoz deiyonize suda, % 5 CO2 /95O2 ile 7.4 pH'a gazlanır. Elektroporatördeki okumayı kullanarak gerçek direnci onaylayın.
NOT: Pipet ucu ne kadar keskinse, elektrik direnci o kadar büyük olacaktır. Pipet direnci 10 MΩ'nin altında olmalıdır. Yüksek pipet direncine sahip cam pipetler (Şekil 1B) genellikle tekrarlanan elektroporasyon sırasında ucu tıkanır.
- İsteğe bağlı:Pipeti elektroporasyon elektroduna bağlayarak pipet direncini doğrulayın ve pipet ucunu filtre sterilize edilmiş yapay beyin omurilik sıvısına (aCSF) manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın (mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 ve 11 glikoz deiyonize suda, % 5 CO2 /95O2 ile 7.4 pH'a gazlanır. Elektroporatördeki okumayı kullanarak gerçek direnci onaylayın.
4. Elektroporasyon teçhizatı kurulumu
- Elektroporatörü, bir mikromanipülatör ve peristaltik pompa ile değişen bir masaya monte edilmiş dik bir mikroskopla donatılmış standart bir tam hücre elektrofizyoloji makinesine takın.
- Elektroporatörün başlığını bir mikromanipülatöre takın ve bir çift hoparlörü elektroporatöre bağlayın. Elektroporatörü, hazır olduğunda nabız göndermek için kullanılabilecek bir ayak pedalı ile bağlayın.
NOT: Hoparlörler açıldığında bir ton yayar, bu da elektrot üzerindeki elektrik direncinin bir göstergesidir. Bu, dikkatleri prosedürden uzaklaştırmadan dirençteki göreceli değişiklikleri belirlemeyi mümkün kılar.
5. Elektroporasyon hazırlığı
- Dilim kültürü kesici uçlarını 6 kuyu tabağından 900 μL kültür ortamı ile yüklenmiş 3 cm Petri tabaklarına aktarın ve elektroporasyon yapmaya hazır olana kadar bir masa üstü CO2 inkübatörde saklayın.
- Taze kültür eklemelerini, elektrik çarpmasından sonra kültür dilimlerine 3,5 cm Petri kabında en az 30 dakika boyunca dilim kültür ortamı (1 mL) ile ön kuluçkaya yatırın.
- Makineyi temizleyin ve elektroporasyona hazırlayın.
- Gün için deneye başlamadan önce boruyu ve hazneyi sterilize etmek için hatları 5 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu ile perfuse edin.
- Tamamen durulamak için hatları deiyonize otoklavlı suyla en az 30 dakika boyunca perfuse edin.
- Hatları 0.001 mM tetrodotoxin (TTX) içeren filtre sterilize edilmiş aCSF ile destekleyin.
NOT: TTX, internöronların aşırı heyecanlanması nedeniyle hücresel toksisiteyi ve ölümü en aza indirir10.
- Elektroporatörun darbe parametrelerini ayarlayın: –5 V genliği, kare darbe, 500 ms tren, 50 Hz frekans ve 500 μs darbe genişliği.
- Cam pipeti 5 μL plazmid içeren iç çözelti ile doldurun.
- Kıstırılan hava kabarcıklarını pipet ucundan hafifçe dokunarak ve ucuna birden fazla kez dokunarak çıkarın.
- Ucu diseksiyon mikroskobu altında görselleştirerek veya pipet direncini kontrol etmek için 3.3.1 adımını tekrarlayarak hasara karşı kontrol edin.
NOT: Uç hasarlıysa, cam pipet atılmalıdır ve bu adım daha önce 3.
- Pipet ucunu elektrota güvenli bir şekilde takın ve hoparlörleri açın. Uç aCSF ortamıyla temas ettiğinde elektroporatörnün okumasını (pipet direnci) kaydedin.
- Keskin bir bıçak kullanarak kültürün ekleme zarını kesin ve bir dilim kültürünü izole edin. Keskin açılı empepiler kullanarak dilim kültürünü elektroporasyon odasına dikkatlice aktarın ve konumunu bir dilim ankrajı ile sabitleyin.
- Dilim kültürünü, nöronal sağlıktaki değişiklikler veya işlev12gibi yan etkileri önlemek için bir seferde 30 dakikadan fazla inkübatörün dışında tutmayın.
6. İlgi çekici elektroporat hücreleri
- Pipete ağızla veya boruya bağlı 1 mL şırıngar (0,2 - 0,5 mL basınç) kullanarak pozitif basınç uygulayın.
- Pipet ucunu dilim kültürünün yüzeyine yakın bir yerde manevra yapmak için mikromanipülatör 3 boyutlu düğme kontrollerini kullanın.
- Bir hedef hücre seçin ve mikroskopta görünür olan hücre yüzeyinde bir gamze oluşana kadar uygulanan pozitif basıncı koruyarak ona yaklaşın.
- Basınç döngüleri gerçekleştirin.
- Boru ucu ile plazma zarı arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşur, böylece membran pipet ucuna biraz yukarı çıkar. Hoparlörlerden gelen tonda bir artış dinleyerek pipet direncinde bir artış (~2,5 kat başlangıç direnci) gözlemleyin. Gamzenin yeniden şekillenebilmesi için pozitif basıncı hızlı bir şekilde yeniden uygulayın.
- Duraklatmadan en az iki basınç döngüsünü daha hemen tamamlayın, ardından 1 sn boyunca negatif basınç tutun.
NOT: Döngüler arasında duraklamak, çok fazla basınç uygulamak veya negatif basıncı çok uzun süre tutmak önemli hücre hasarına neden olabilir ve muhtemelen elektroporasyon sırasında hücrenin ölmesine neden olabilir.
- Hoparlörlerden gelen ton perdede sabit bir tepe noktasına ulaştığında ayak pedalını kullanarak elektroporatöre hızlı bir şekilde darbe yapın ve bu da en yüksek elektrik direncini gösterir. Nabzı göndermeden önce 1 s'den fazla tepe direncinde beklemeyin.
NOT: Bu protokolü kullanırken hedef dışı elektroporasyon gözlemlemedik10. Sadece basınç döngüleri sırasında cam pipetle temas eden hücreler transkröme edildi. Pipetin diğer nöronların yakınında konumlandırılması gen transfeksiyonla sonuç vermez. - Pipeti basınç uygulamadan hücreden yaklaşık 100 μm geri çek.
- Direncin 5.5.
- Elektroporasyondan sonra görsel olarak veya önemli ölçüde artmış (%>15 daha yüksek) pipet direnci ile belirtilen potansiyel tıkanıklıkları pozitif basınç uygulayarak çıkarın.
NOT: Görünür bir tıkanıklık yoksa ve direnç hala önemli ölçüde daha yüksekse, pipeti atın ve yeni bir tane kullanın. Ortalama olarak, kullanıcı dikkatli olursa 20 elektroporasyon olayı için bir pipet kullanılabilir10.
- Elektroporasyondan sonra görsel olarak veya önemli ölçüde artmış (%>15 daha yüksek) pipet direnci ile belirtilen potansiyel tıkanıklıkları pozitif basınç uygulayarak çıkarın.
- Elektroporasyondan sonra, dilim kültürünü taze bir kültür kesici ucuna aktarın ve 3 güne kadar inkübatörde 35 ° C'de kuluçkaya yatırın.
7. Organotipik hipokampal dilim kültürlerinin sabitlenmesi, lekelenmesi ve görüntülenmesi
- Elektroporlu organotipik dilim kültürlerini transeksiyondan 2 – 3 gün sonra% 4 paraformaldehit ve% 4 sakkaroz ile 0.01 M fosfat tamponlu salin (1x PBS) oda sıcaklığında 1.5 saat sabitleyin.
- 2 saat boyunca 0,1 M fosfat tamponunda (1x PB) %30 sakkarozda sabitleyici ve kuluçka dilimlerini çıkarın.
- Dilimleri bir slayt camına yerleştirin ve slayt camını ezilmiş kuru buzun üzerine koyarak dondurun. Dilimleri oda sıcaklığında çözün ve 1x PBS ile dolu 6 kuyu plakasına aktarın.
- Dilimleri GDB tamponunda fare anti-GFP ve tavşan anti-RFP antikorları (%0,1 jelatin, %0,3 Triton X-100, 450 mM NaCl ve %32 1x PB, pH 7,4) ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca lekeleyin.
- Her yıkama için oda sıcaklığında üç kez 1x PBS ile dilimleri yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca GDB tamponunda anti-fare Alexa 488 konjuge ikincil antikor ve anti-tavşan Alexa 594 konjuge ikincil antikor ile dilimleri kuluçkaya yatırın. Dapi (4 μg/mL) ile dilimleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1x PBS'de kuluçkaya yatır.
- 1x PBS'li dilimleri oda sıcaklığında üç kez yıkayın ve her yıkamada 3 dakika yıkayın.
- Montaj ortamını kullanarak dilimleri cam slaytlara monte edin ve floresan görüntüleme gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek hücreli elektroporasyonumuz genleri görsel olarak tanımlanmış uyarıcı ve inhibitör nöronlara tam olarak ulaştırabilir. Üç farklı nöronal hücre tiplerini üç farklı zaman noktasında elektropore ettik. Nöronları ifade eden parvalbumin (Pv) veya veziküler glutamat tip 3 (VGT3), sırasıyla Pv/TdTomato ve VGT3/TdTomato hatları olarak adlandırılan TdTomato (kırmızı floresan proteinin bir çeşidi) muhabir hattı (Jax #007905) ile Pv cre (JAX #008069) veya VGT3cre (JAX #018147) çizgileri aşılarak görselleştirildi. Organotipik dilim kültürleri C57BL/6J, Pv/TdTomato ve VGT3/TdTomato farelerinden hazırlanmıştır.
İlk olarak, CA1 piramidal nöronlarında (Py) 7, 14 veya 21 günlük in vitro (DIV) elektroporasyon yapıldı. EGFP, bu dilim kültürü çağlarında hipokampal CA1 alanında 5-20 piramidal nörona bulaşmıştır (Şekil 2B-D). CA1 piramidal nöronlar diferansiyel girişim kontrastı (DIC) kullanılarak tanımlanmıştır. Dilim kültüründe piramital nöronlar ile inhibitör internöronlar arasındaki anatomik dağılımı ve morfolojik farklılıkları göstermek için, CA1 piramidal nöronlar BIR DIV7 Pv/TdTomato faresinde EGFP ile elektroporize edildi ve CA1 piramidal hücre tabakasında EGFP pozitif nöronların ayrı yerini görüntülemek için nükleer karşıtlık yapıldı (Şekil 2A).
Daha sonra, bu protokol TdTomato pozitif Pv ve VGT3 interneuronlarına da uygulandı. EGFP elektroporasyon 1-10 floresan etiketli internöronda gerçekleştirildi. TdTomato-pozitif Pv (Şekil 3) ve VGT3 (Şekil 4) nöronları hipokampal CA1 alanında başarıyla elektroporlandı. İlginçtir ki, egfp geninin tüm bu inhibitör nöronal tiplerde transfeksiyoni DIV'den önemli ölçüde etkilenmedi ve CA1 piramidal nöronlarında gözlenen transfeksiyon verimliliği (~%80) ile farklılık göstermemedi (Şekil 5).
Şekil 1: İki temsili cam pipet görüntüsü.
(A) Bu protokolde kullanılan daha düşük dirençli (6,5 MΩ) pipetler ve (B) elektroporasyon protokolleri için tipik daha yüksek direnç (10,4 MΩ) pipetler görüntüleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Organotipik hipokampal dilim kültürleri üç farklı zaman noktasında EGFP (yeşil) ile elektroporlandı.
(A) DIV7 Pv/TdTomato faresinde temsili organotipik hipokampal dilim kültürü. CA1 piramidal nöronlar EGFP (yeşil, beyaz ok uçları) ile elektroporlandı ve TdTomato (TdT) pozitif Pv internöronları (kırmızı, sarı ok uçları) ile çakışma göstermedi. DAPI nükleer karşı koyma (mavi) yapıldı. DG: dentate girus. (B-D) CA1 piramidal nöronlar EGFP ile üç farklı zaman noktasında elektroporlandı: (B) DIV7, (C) DIV14 ve (D) DIV21. Organotipik dilim kültürleri %4 sakkaroz, %4 paraformaldehit/ 1x PBS ile sabitlenmiş ve daha fazla kesit olmadan imgelenmiştir. Hipokampal CA1 bölgesinin sol üst, düşük büyütme görüntüleri. Ok uçları, elektroporasyon için hedeflenen tek tek CA1 piramidal nöronları temsil eder. Sarı ok uçlu transfected nöronlar alt panellere yakınlaştırilir. Beyaz ok uçları, yüksek büyütme görünümünün dışında ek elektroporlu nöronları ifade eder. Sağ üst, üst üste bindirilmiş (Sup) floresan ve Nomarski görüntülerinin düşük büyütme görüntüleri. Ölçek çubukları: Sırasıyla 500, 50, 100, 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Pv/TdTomato organotipik hipokampal dilim kültürleri üç farklı zaman noktasında EGFP (yeşil) ile elektroporlandı.
(A) DIV7, (B) DIV14 ve (C) DIV21. Hipokampal CA1 piramidal hücre tabakasında ve orienslerde Pv etiketli TdTomato (TdT)pozitif hücreler (kırmızı) ile örtüşme gözlendi. Düşük büyütme iç kısımlarında (üst satır), sarı ok uçları elektroporasyon için hedeflenen bireysel Pv internöronlarını temsil eder. Beyaz ok uçları, yüksek büyütme görünümünün dışında elektroporlanmış ek TdTomato pozitif Pv internöronlarını ifade eder. Ölçek çubukları: 50, 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: VGT3/TdTomato organotipik hipokampal dilim kültürleri üç farklı zaman noktasında EGFP (yeşil) ile elektropore edildi.
(A) DIV7, (B) DIV14 ve (C) DIV21. Hipokampal CA1 piramidal hücre tabakasında ve orienslerde VGT3 etiketli TdTomato (TdT)pozitif hücreler (kırmızı) ile örtüşme gözlendi. Düşük büyütme iç kısımlarında (üst sıra), sarı ok uçları elektroporasyon için hedeflenen bireysel VGT3 internöronlarını temsil eder. Beyaz ok uçları, yüksek büyütme görünümünün dışında elektroporlanmış ek TdTomato pozitif VGT3 internöronlarını ifade eder. Ölçek çubukları: 50, 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: CA1 piramidal nöronlarda, Pv/TdTomato'da ve VGT3/TdTomato internöronlarında üç farklı in vitro dilim kültüründe karşılaştırılabilir transfeksiyon verimliliği düzeyleri.
Üç farklı dilim kültür yaşlarının özet çubuk grafikleri: DIV7 (solda), DIV14 (ortada) ve DIV21 (sağda). Her sembol, bir organotipik dilim kültürü CA1 Py'den elde edilen transfeksiyon verimliliğini temsil eder: DIV7 (2 fareden 12 dilim kültürü), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Pv: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). Tek yönlü ANOVA; n.s. (önemli değildir). Gösterilen veriler SEM ± ortalamadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada hem uyarıcı hem de inhibitör nöronları yüksek verimlilik ve hassasiyetle transfect eden bir elektroporasyon yöntemini tarif ediyoruz. Optimize edilmiş elektroporasyon protokolümüz, yüksek verimli gen transfeksiyonunu elde etmek için üç yenilikçi atılım gerçekleştirmektedir. İlk modifikasyonumuz pipet boyutunu daha önce yayınlananprotokollerekıyasla artırmaktı 3,5,6. Bu değişiklik, pipet tıkanmadan birçok nörona elektroporatlamamızı sağladı. Ek olarak, daha düşük direnç pipetlerinin, istenen sonucu elde ederken önceki yöntemlere kıyasla daha hafif elektriksel darbe parametrelerinin kullanılmasına izin vermesi mümkündür3. Daha sonra, elektroporasyondan önce tekrarlanan basınç döngüsü hücre ölümünü belirgin şekilde azalttı10. Elektroporlamadan önce tek bir negatif basınç darbesinin uygulanmasıyla, plazma zarının pipet ucunun içine yapışarak hücreye zarar verdiğini sık sık gözlemledik. Basınç döngüleri, işlem sırasında hücre sağkalımını ve iyileşmesini artıran pipetlere çok daha az plazma zarı yapışmaya yardımcı oldu10. Son olarak, TTX'in aCSF'ye eklenmesi, inhibitör nöronlarda elektroporasyon başarısını büyük ölçüde artırdı10. Elektroporasyonun TTX tarafından önlenebilecek ölümcül hücre aşırı heyecanlanmasına neden olabileceğini düşünüyoruz. Her şeyden önce, bu kritik gelişmeler hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlara elektroporasyonda oldukça yüksek başarı oranları sunmaktadır (Şekil 5). Hedeflenen hücrelerde bu yöntem10 ile transfeksiyon sonrası nöronlarımızda elektrofizyolojik anormalliklere rastlamamış olsak da, elektroporasyon sırasındaki lokal pH değişikliklerinin hücre canlılığını azalttığı ve elektroporasyon parametrelerinin optimizasyonunun diğer gen transfeksiyon yöntemlerine göre nispeten zor olabileceği bildirilmiştir13,14. Bu nedenle, elektroporasyonun öngörülemeyen yan etkilerini göz önünde bulundurmak ve belirli bir uygulama için yüksek transfeksiyon verimliliği elde etmek için elektrik parametrelerini gerektiği gibi yeniden optimize etmek önemlidir.
Mikroenjeksiyon teknolojisi,transgenleri hücrelereulaştırmak için güçlü bir yaklaşım olarak da kullanılmıştır 2,15,16. Bununla birlikte, bu yaklaşım genellikle daha düşük bir transfeksiyon verimi üretir ve yüksek düzeyde beceri gerektirir. Buna karşılık, yöntemimiz nispeten kolay ve minimum maliyetle rutin olarak tam hücre elektrofizyoloji çalışmaları yapan laboratuvarlar için kullanılabilir.
Son zamanlarda, elektrofizyolojik özellikler üzerinde hiçbir yan etkisi olmayan inhibitör nöronları ifade eden hem uyarıcı hem de somatostatin içine birden fazla genin bulaşabileceğini gösterdik10. Bu çalışmada, bu elektroporasyon yönteminin CA1 piramidal nöronlarda (Şekil 2) ve Pv ( Şekil 3 ) ve VGT3 (Şekil 4) inhibitör internöronlarda oldukça verimli olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu elektroporasyon tekniği, hücre tipine veya in vitro gün sayısına bakılmaksızın ilgi genlerini ~% 80 başarı oranı ile dönüştürmemizi sağlar (Şekil 5). Teknik sadece in vitro olarak test edilmiş olmasına rağmen, test ettiğimiz div zaman noktalarında organotipik hipokampal dilim kültürlerinin, akut olarak hazırlanmış hipokampal dilimlerde görüldüğü gibi, yaşla eşleştirilen in vivo sinaptik morfoloji ve aktiviteyi takip ettiği gösterilmiştir17. Ayrıca, bu yöntemi sadece hipokampal nöronlarda test ettiğimiz için, bu tekniğin diğer beyin bölgelerindeki nöronlara uygulanmasında beklenmedik zorluklar olabilir. Yöntem, diğer özelliklerin yanı sıra sinaptik iletim ve yoğunluğun zaman içinde değiştiği organotipik dilim kültürü gelişimi sırasında genlerin araştırılmasına davetiye çıkarır.
Bu protokol, aynı anda düşük maliyetli, teknik olarak daha az zorlu ve tek nöron gen transfeksiyonu 5 , 6 ,7,8,9oluşturmada daha verimli olması nedeniyle daha önce kurulmuş olanlara göre bir gelişmedir. Ayrıca, işlemden sonra hücrelerin ~ % 80'inin başarılı bir şekilde trans enfekte olduğunu ve sağlıklı olduğunu gözlemlediğimiz için, daha düşük hücre hasarı veya ölüm oranları açısından önceki yöntemlere göre bir iyileşme gibi görünmektedir. Bu nedenle bu yöntem, floresan fare modellerini kullanarak birden fazla nöronal hücre tipinde genlerin rollerini incelemek için yeni bir fırsat sağlar. Bu yöntemi kullanarak gelecekteki çalışmalar, trans-sinaptik protein etkileşimleri de dahil olmak üzere belirli moleküler veya fizyolojik işlevleri incelemek için hücreler arasındaki protein-protein etkileşimlerine odaklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibe Enstitüleri (R01NS085215 ila K.F., T32 GM107000 ve F30MH122146 ila A.C. ) tarafından desteklendi. Yazarlar, Bayan Naoe Watanabe'ye yetenekli teknik yardım için teşekkür ediyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A.
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F.
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).
