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Neuroscience

माउस हिप्पोकैम्पल उत्तेजक और कक्षा-विशिष्ट निरोधात्मक न्यूरॉन्स की विभिन्न ऑर्गैग्निक स्लाइस संस्कृति में एकल-सेल इलेक्ट्रोपशन

Published: October 6, 2020 doi: 10.3791/61662
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1
1Brudnick Neuropsychiatric Research Institute, Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School, 2Interdisciplinary Graduate Program, University of Massachusetts Medical School, 3UMMS MD/PhD Program, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत एकल कोशिका इलेक्ट्रोपॉरेशन के लिए एक प्रोटोकॉल है जो इन विट्रो हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृति युगों की एक श्रृंखला में उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स दोनों में जीन प्रदान कर सकता है। हमारा दृष्टिकोण व्यक्तिगत कोशिकाओं में जीन की सटीक और कुशल अभिव्यक्ति प्रदान करता है, जिसका उपयोग कोशिका-स्वायत्त और अंतरकोशिकीय कार्यों की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

इलेक्ट्रोपाउशन ने अपने कार्य को समझने के लिए विशिष्ट जीन को कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि के रूप में खुद को स्थापित किया है। यहां, हम एक एकल-कोशिका इलेक्ट्रोप्यूटेशन तकनीक का वर्णन करते हैं जो माउस ऑर्गेनोटीपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस संस्कृति में उत्तेजक और वर्ग-विशिष्ट निरोधात्मक न्यूरॉन्स में इन विट्रो जीन ट्रांसफेक्शन की दक्षता (~ 80%) को अधिकतम करता है। बड़े ग्लास इलेक्ट्रोड, टेट्रोडोडॉक्सिन युक्त कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ और हल्के विद्युत दालों का उपयोग करके, हमने सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स और निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन्स में रुचि का एक जीन दिया। इसके अलावा, इलेक्ट्रोपॉशन को विट्रो में 21 दिनों तक सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल स्लाइस में किया जा सकता है जिसमें ट्रांसफैक्शन दक्षता में कोई कमी नहीं है, जो अलग-अलग स्लाइस संस्कृति विकासात्मक चरणों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। कोशिका प्रकार की एक विविध रेंज में जीन के आणविक कार्यों की जांच में बढ़ती रुचि के साथ, हमारी विधि माउस मस्तिष्क ऊतक है कि मौजूदा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरण और तकनीकों के साथ किया जा सकता है में विट्रो जीन ट्रांसफेक्शन में एक विश्वसनीय और सीधा दृष्टिकोण दर्शाता है ।

Introduction

आणविक जीव विज्ञान में, एक अन्वेषक के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचारों में से एक यह है कि अपने कार्य को स्पष्ट करने के लिए कोशिकाओं या कोशिकाओं की आबादी में ब्याज के जीन को कैसे वितरित किया जाए। प्रसव के विभिन्न तरीकों को या तो जैविक (जैसे, एक वायरल वेक्टर), रासायनिक (जैसे, कैल्शियम फॉस्फेट या लिपिड), या भौतिक (जैसे, इलेक्ट्रोपॉरेशन, माइक्रोइंजेक्शन, या बायोलिस्टिक्स) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है1,2। जैविक विधियां अत्यधिक कुशल हैं और सेल प्रकार-विशिष्ट हो सकती हैं लेकिन विशिष्ट आनुवंशिक उपकरणों के विकास से सीमित हैं। विट्रो में रासायनिक दृष्टिकोण बहुत शक्तिशाली होते हैं, लेकिन ट्रांसफैक्शन आम तौर पर यादृच्छिक होते हैं; इसके अलावा, ये दृष्टिकोण ज्यादातर प्राथमिक कोशिकाओं के लिए ही आरक्षित हैं। भौतिक दृष्टिकोणों में से, बायोलिस्टिक्स तकनीकी दृष्टिकोण से सबसे सरल और आसान है, लेकिन फिर से अपेक्षाकृत कम दक्षता पर यादृच्छिक ट्रांसफैक्शन परिणाम पैदा करता है। उन अनुप्रयोगों के लिए जिन्हें आनुवंशिक उपकरण विकसित करने की आवश्यकता के बिना विशिष्ट कोशिकाओं में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है, हम एकल-कोशिका इलेक्ट्रोपाउशन3,4की ओर देखते हैं।

जबकि इलेक्ट्रोपॉशन केवल फील्ड इलेक्ट्रोपॉजेशन को संदर्भित करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, पिछले बीस वर्षों में, कई इन विट्रो और वीवो सिंगल-सेल इलेक्ट्रोपाउनेशन प्रोटोकॉल को विशिष्टता और दक्षता में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है5,6,7,यह प्रदर्शित करता है कि इलेक्ट्रोपाउशन का उपयोग जीन को व्यक्तिगत कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है और इसलिए, बेहद सटीक हो सकता है। हालांकि, प्रक्रियाएं तकनीकी रूप से मांग कर रही हैं, समय लेने वाली हैं, और अपेक्षाकृत अक्षम हैं। दरअसल, हाल के कागजात ने मशीनीकृत इलेक्ट्रोपॉइपेशन रिग्स8, 9की व्यवहार्यता की जांच की है, जो इस तरह के रोबोटिक्सको स्थापितकरने में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं के लिए इनमें से कई बाधाओं को खत्म करने में मदद कर सकता है। लेकिन सरल साधनों की तलाश करने वालों के लिए, इलेक्ट्रोपाउशन, अर्थात् सेल डेथ, ट्रांसफैक्शन विफलता और पिपेट क्लोजिंग के साथ समस्याएं चिंता का विषय बनी हुई हैं।

हमने हाल ही में एक इलेक्ट्रोपॉरेशन विधि विकसित की है जो बड़े इत्तला वाले ग्लास पिपेट का उपयोग करती है, मामूली विद्युत पल्स पैरामीटर, और एक अद्वितीय दबाव साइकिलिंग कदम, जिसने पिछले तरीकों की तुलना में उत्तेजक न्यूरॉन्स में बहुत अधिक ट्रांसफेक्शन दक्षता उत्पन्न की, और हमें पहली बार अवरोधक इंटरन्यूरॉन्स में जीन को स्थानांतरित करने में सक्षम बनाया, जिसमें सोमेटोस्टैटिन-एक्सप्रेसिंग अवरोधक इंटरन्यूरॉन्स शामिलहैं। हालांकि, विभिन्न निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन प्रकारों और न्यूरोनल विकासात्मक चरणों में इस इलेक्ट्रोपाउशन विधि की विश्वसनीयता को संबोधित नहीं किया गया है। यहां, हमने दिखा दिया कि यह इलेक्ट्रोप्यूशन तकनीक उत्तेजक न्यूरॉन्स और इंटरन्यूरॉन के विभिन्न वर्गों दोनों में जीन को स्थानांतरित करने में सक्षम है। महत्वपूर्ण बात, विट्रो (DIV) स्लाइस संस्कृति आयु परीक्षण में दिनों की परवाह किए बिना ट्रांसफेक्शन दक्षता उच्च थी। इस स्थापित और उपयोगकर्ता के अनुकूल तकनीक इन विट्रो माउस मस्तिष्क ऊतक के संदर्भ में विभिन्न सेल प्रकारों के लिए एकल सेल इलेक्ट्रोपॉशन का उपयोग करने में रुचि रखने वाले किसी भी अन्वेषक के लिए अत्यधिक अनुशंसित है।

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Protocol

मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा सभी पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा और अनुमोदित किया गया । स्लाइस संस्कृति की तैयारी, प्लाज्मिड तैयारी, और इलेक्ट्रोपाउशन भी हमारे पहले प्रकाशित तरीकों में विस्तृत हैं और अतिरिक्त जानकारी10के लिए संदर्भित किया जा सकता है ।

1. स्लाइस संस्कृति की तैयारी

  1. माउस ऑर्गेनोटिपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस संस्कृतियों को तैयार करें जैसा कि पहले11वर्णित है, पोस्टनेल 6-से 7-या तो सेक्स के पुराने चूहों का उपयोग करके।
    1. ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृति के लिए विच्छेदन मीडिया तैयार करें जिसमें (एमएमए में): 238 सुक्रोज, 2.5 केसीएल, 1 सीएसीएल2,4 एमजीसीएल2, 26नहको3,1 एनएएच2पीओ4,और 11 ग्लूकोज डियोनाइज्ड पानी में, फिर 5% सीओ2/95% ओ2 के साथ गैस 7.4 के पीएच के लिए।
    2. ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस कल्चर मीडिया तैयार करें जिसमें शामिल हैं: 78.8% (v/v) न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल, 20% (v/v) घोड़ा सीरम, 17.9 m M NaHCO3,26.6 m M ग्लूकोज, 2 एम CaCl2, 2M MgSO4,30 m M M HEPES, इंसुलिन (1 μg/mL), और 0.06 m m ascorbic एसिड, पीएच 7.3 को समायोजित किया गया। ऑस्मोमीटर का उपयोग करके ऑस्मोलिटी को 310-330 ऑस्मोल में समायोजित करें।
    3. दो स्पैटुला का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क से हिप्पोकैम्पी को विच्छेदन करें, और एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग करके स्लाइस (400 माइक्रोन) करें। दो संदंश का उपयोग करके अलग स्लाइस और आवेषण के नीचे संस्कृति मीडिया (950 माइक्रोन) से भरे 6 अच्छी तरह से प्लेट में 30 मिमी सेल संस्कृति आवेषण में स्थानांतरित करें।
  2. एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (35 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृतियों को स्टोर करें और हर दो दिनों में स्लाइस कल्चर मीडिया को बदलें।

2. प्लाज्मिड तैयारी

  1. ब्याज के जीन के लिए प्लाज्मिड तैयार करें।
    1. सबक्लोन ने ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) जीन को पीसीएजी वेक्टर में बढ़ाया।
    2. एक एंडोटॉक्सिन मुक्त शुद्धिकरण किट के साथ पीसीएजी-ईजीएफपी प्लाज्मिड को शुद्ध करें और एक आंतरिक समाधान में भंग करें जिसमें डाइथाइल पाइरोकार्बोनेट-उपचारित पानी होता है जिसमें 140 m K-मीथेनसुलफोनेट होता है, 0.2 m EGTA, 2 m MgCl2,और 10 mM HEPES, कोह के साथ पीएच 7.3 में समायोजित (प्लाज्मिड एकाग्रता: 0.1 μg/μL)।

3. ग्लास पिपेट तैयारी

  1. माइक्रोपिपेट पुलर(चित्रा 1 ए)पर बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट (4.5 - 8 एमΩ) खींचें।
    नोट: पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास पिपेट इलेक्ट्रोपॉशन के लिए आदर्श हैं।
  2. स्टरलाइज करने के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ग्लास पिपेट बेक करें।
  3. विद्युत प्रतिरोध का अनुमान लगाने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत पिपेट टिप के आकार की जांच करें।
    1. वैकल्पिक: इलेक्ट्रोपॉरेशन इलेक्ट्रोड के लिए पिपेट संलग्न करके पिपेट प्रतिरोध सत्यापित करें और पिपलेट टिप को फिल्टर-निष्फल कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (एसीएमएफ) में पैंतरेबाज़ी करने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करें: 119 एनएसीएल, 2.5 केसीएल, 0.5 सीएसीएल2, 5 एमजीसीएल2,26 एनएएचसीओ3,1 एनएएच2पीओ4 और 11 ग्लूकोज डिओनाइज्ड पानी में, 5% सीओ2/95% ओ2 के साथ 7.4 के पीएच तक। इलेक्ट्रोपोरेटर पर रीडआउट का उपयोग करके वास्तविक प्रतिरोध की पुष्टि करें।
      नोट: तेज पिपेट टिप, बड़ा बिजली प्रतिरोध । पिपेट प्रतिरोध 10 एमω से नीचे होना चाहिए। उच्च पिपेट प्रतिरोध(चित्रा 1B)वाले ग्लास पिपेट अक्सर बार-बार इलेक्ट्रोपाउरेशन के दौरान टिप पर रोकते हैं।

4. इलेक्ट्रोपॉरेशन रिग सेटअप

  1. इलेक्ट्रोपोरेटर को एक मानक पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग में स्थापित करें, जो माइक्रोमैनिपलेटर और पेरिस्टाल्टिक पंप के साथ एक स्थानांतरण टेबल पर घुड़सवार एक ईमानदार माइक्रोस्कोप से लैस है।
  2. इलेक्ट्रोपोरेटर के हेडस्टेज को माइक्रोमैनीपुलेटर पर स्थापित करें और स्पीकर्स की एक जोड़ी को इलेक्ट्रोपोरेटर से कनेक्ट करें। इलेक्ट्रोपोरेटर को एक फुट पेडल से कनेक्ट करें जिसका उपयोग तैयार होने पर पल्स भेजने के लिए किया जा सकता है।
    नोट: वक्ताओं एक टोन उत्सर्जन जब चालू है, जो इलेक्ट्रोड पर विद्युत प्रतिरोध का एक संकेतक है । यह प्रक्रिया से दूर ध्यान खींचने के बिना प्रतिरोध में सापेक्ष परिवर्तन निर्धारित करना संभव बनाता है।

5. इलेक्ट्रोपॉरेशन की तैयारी

  1. स्थानांतरण स्लाइस संस्कृति 6 अच्छी तरह से प्लेटों से 3 सेमी पेट्री व्यंजन संस्कृति मीडिया के ९०० μL के साथ भरी हुई व्यंजन और एक टेबलटॉप सीओ2 इनक्यूबेटर में स्टोर जब तक इलेक्ट्रोपाउशन करने के लिए तैयार है ।
    1. इलेक्ट्रोपाउशन के बाद संस्कृति स्लाइस के लिए 3.5 सेमी पेट्री डिश में कम से कम 30 मिनट के लिए स्लाइस कल्चर मीडिया (1 एमएल) के साथ ताजा संस्कृति सम्मिलित करता है।
  2. साफ करें और इलेक्ट्रोपाउनेशन के लिए रिग तैयार करें।
    1. दिन के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले ट्यूबिंग और चैंबर को स्टरलाइज करने के लिए 5 मिनट के लिए 10% ब्लीच के साथ लाइनों को पर्फ्यूज करें।
    2. पूरी तरह से कुल्ला करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए deionized ऑटोक्लेव पानी के साथ लाइनों को प्रेरित करें।
    3. 0.001 m टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) वाले फिल्टर-स्टरलाइज्ड एसीएसएफ के साथ लाइनों को पर्फ्यूज करें।
      नोट: टीटीएक्स इंटरन्यूरॉन्स10के अतिउत्सारण के कारण सेलुलर विषाक्तता और मृत्यु को कम करता है ।
  3. इलेक्ट्रोपोरेटर के पल्स पैरामीटर सेट करें: -5 वी का आयाम, स्क्वायर पल्स, 500 एमएस की ट्रेन, 50 हर्ट्ज की आवृत्ति, और 500 माइक्रोन की पल्स चौड़ाई।
  4. प्लाज्मिड युक्त आंतरिक समाधान के 5 माइक्रोल के साथ ग्लास पिपेट भरें।
    1. पाइप टिप से किसी भी फंसे हुए हवा के बुलबुले को फ्लिकिंग करके हटाएं और धीरे-धीरे टिप को कई बार टैप करें।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत या पिपेट प्रतिरोध की जांच करने के लिए चरण 3.3.1 दोहराकर इसे कल्पना करके नुकसान के लिए टिप की जांच करें।
      नोट: यदि टिप क्षतिग्रस्त हो जाती है, तो ग्लास पिपेट को त्याग दिया जाना चाहिए, और इस चरण को पहले चरण 3 में तैयार एक नए ग्लास पिपेट के साथ दोहराया जाना चाहिए।
  5. सुरक्षित रूप से इलेक्ट्रोड के लिए पिपेट टिप देते हैं और वक्ताओं को चालू करें। जब टिप ने ACSF माध्यम से संपर्क किया है तो इलेक्ट्रोपोरेटर के रीडआउट (पिपेट का प्रतिरोध) रिकॉर्ड करें।
  6. एक तेज ब्लेड का उपयोग करके संस्कृति डालें झिल्ली को काटें और एक स्लाइस संस्कृति को अलग करें। तेज कोण वाले संदंश का उपयोग करके स्लाइस संस्कृति को इलेक्ट्रोपॉनेशन कक्ष में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और स्लाइस एंकर के साथ इसकी स्थिति को ठीक करें।
    1. न्यूरोनल स्वास्थ्य या कार्य12में परिवर्तन जैसे दुष्प्रभावों को रोकने के लिए एक बार में 30 मिनट से अधिक समय तक स्लाइस संस्कृति को इनक्यूबेटर के बाहर न रखें ।

6. ब्याज की इलेक्ट्रोपोरेट कोशिकाएं

  1. मुंह के साथ पिपेट पर सकारात्मक दबाव लागू करें या ट्यूबिंग से जुड़ी 1 मिलील सिरिंज (0.2 - 0.5 एमएल प्रेशर) का उपयोग करके।
  2. स्लाइस संस्कृति की सतह के पास पिपेट टिप को पैंतरेबाज़ी करने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर के 3-आयामी घुंडी नियंत्रण का उपयोग करें।
  3. एक लक्ष्य कोशिका चुनें और यह दृष्टिकोण, सकारात्मक दबाव को रखते हुए जब तक सेल की सतह पर एक डिंपल रूपों, माइक्रोस्कोप पर दिखाई देता है ।
  4. दबाव चक्र प्रदर्शन करते हैं।
    1. जल्दी से मुंह से हल्के नकारात्मक दबाव लागू करें ताकि पिपेट टिप और प्लाज्मा झिल्ली के बीच एक ढीला सील रूपों, झिल्ली द्वारा नेत्रहीन संकेत दिया कुछ हद तक पिपेट टिप में जा रहा है । वक्ताओं से आने वाले स्वर में वृद्धि के लिए सुनकर पिपेट प्रतिरोध में वृद्धि (~ 2.5x प्रारंभिक प्रतिरोध) का निरीक्षण करें। जल्दी से पॉजिटिव प्रेशर को फिर से लागू करें ताकि डिंपल फिर से परफॉर्म करे।
    2. तुरंत बिना रुके कम से कम दो और दबाव चक्र पूरा करें, फिर 1 एस के लिए नकारात्मक दबाव रखें।
      नोट: चक्र के बीच रुके हुए, बहुत अधिक दबाव लागू करना, या बहुत लंबे समय तक नकारात्मक दबाव रखना महत्वपूर्ण कोशिका क्षति का कारण बन सकता है और संभवतः इलेक्ट्रोपॉशन के दौरान कोशिका को मरने का कारण बन सकता है।
  5. जल्दी से इलेक्ट्रोपोरेटर एक बार पैर पेडल का उपयोग कर जब वक्ताओं से टोन पिच में एक स्थिर शीर्ष तक पहुंचता है, पीक विद्युत प्रतिरोध का संकेत है । नाड़ी भेजने से पहले 1 एस से अधिक के लिए चोटी प्रतिरोध पर इंतजार न करें।
    नोट: हमने इस प्रोटोकॉल10का उपयोग करते समय कोई ऑफ-टारगेट इलेक्ट्रोपॉलपेशन नहीं देखा है । दबाव चक्र के दौरान केवल ग्लास पिपेट के संपर्क में आने वाली कोशिकाएं ही संक्रमित थीं। अन्य न्यूरॉन्स के पास पिपेट को पोजिशन करने से जीन ट्रांसफैक्शन नहीं होता है।
  6. धीरे-धीरे दबाव लागू किए बिना कोशिका से लगभग 100 माइक्रोन को वापस लें।
  7. सकारात्मक दबाव को फिर से लागू करें, यह सत्यापित करते हुए कि प्रतिरोध चरण 5.5 में रिकॉर्ड किए गए रीडआउट के समान है, फिर अगले सेल से संपर्क करें।
    1. सकारात्मक दबाव लागू करके, इलेक्ट्रोपाउरेशन के बाद संभावित मोज़री, इंगित नेत्रहीन या काफी वृद्धि (>15% अधिक) पिपेट प्रतिरोध से हटा दें।
      नोट: यदि कोई दिखाई देने वाला रोकना नहीं है और प्रतिरोध अभी भी काफी अधिक है, तो पिपेट को त्यागें और एक नए का उपयोग करें। यदि उपयोगकर्ता सावधान10है तो औसतन, 20 इलेक्ट्रोपॉजेशन घटनाओं के लिए एक पिपेट का उपयोग किया जा सकता है।
  8. इलेक्ट्रोपाउशन के बाद, स्लाइस कल्चर को एक ताजा कल्चर डालने पर स्थानांतरित करें, और इनक्यूबेटर में 35 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों तक इनक्यूबेट करें।

7. ऑर्गेनोटिपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस संस्कृतियों का निर्धारण, धुंधला और इमेजिंग

  1. 2 - 4% पैराफॉर्मलडिहाइड और 0.01 एम फॉस्फेट बफर खारा (1x पीबीएस) में 4% सुक्रोज के साथ ट्रांसफैक्शन के 3 दिन बाद इलेक्ट्रोपोटेड ऑर्गेनोटिक स्लाइस संस्कृतियों को ठीक करें।
  2. 2 घंटे के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर (1x पीबी) में 30% सुक्रोज में फिक्सेटिव और इनक्यूबेट स्लाइस निकालें।
  3. एक स्लाइड ग्लास पर स्लाइस रखें और उन्हें कुचल सूखी बर्फ के शीर्ष पर स्लाइड ग्लास डालकर फ्रीज करें। कमरे के तापमान पर स्लाइस गल और उन्हें एक 6 अच्छी तरह से 1x PBS से भरा थाली में स्थानांतरित।
  4. कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए जीडीबी बफर (0.1% जिलेटिन, 0.3% ट्राइटन एक्स-100, 450 एमएल एनएसीएल, और 32% 1x पीबी, पीएच 7.4) में माउस एंटी-जीएफपी और खरगोश एंटी-आरएफपी एंटीबॉडी के साथ स्लाइस को दाग दें।
  5. 10 मिनट प्रत्येक धोने के लिए कमरे के तापमान पर तीन बार 1x PBS के साथ स्लाइस धोएं ।
  6. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए जीडीबी बफर में एंटी-माउस एलेक्सा 488-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और एंटी-खरगोश एलेक्सा 594-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट स्लाइस। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1x PBS में DAPI (4 μg/mL) के साथ इनक्यूबेट स्लाइस ।
  7. 3 मिनट प्रत्येक धोने के लिए कमरे के तापमान पर तीन बार 1x PBS के साथ स्लाइस धोएं ।
  8. बढ़ते माध्यम का उपयोग कर ग्लास स्लाइड पर माउंट स्लाइस और फ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।

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Representative Results

हमारा एकल-कोशिका इलेक्ट्रोपॉन्स्ट्रेशन जीन को नेत्रहीन पहचाने गए उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स में ठीक से वितरित करने में सक्षम है। हमने तीन अलग-अलग समय बिंदुओं पर तीन अलग-अलग न्यूरोनल सेल प्रकारों को विद्युतीकृत किया। परवलबुमिन (पीवी) या वेसिकुलर ग्लूटामेट टाइप 3 (वीजीटी3) को व्यक्त करते हुए न्यूरॉन्स को क्रमशः पीवी/टाटोमैटो और वीजीटी3/टीडीटॉमा लाइनों के साथ पीवीक्रे (जैक्स #008069) या वीजीटी3क्रे (जैक्स #007905 #018147) लाइनों को पार करके कल्पना की गई थी । ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृतियों C57BL/6J, Pv/TdTomato, और VGT3/TdTomato चूहों से तैयार किया गया ।

सबसे पहले, इलेक्ट्रोपाउशन सीए1 पिरामिड न्यूरॉन्स (Py) में या तो 7, 14, या 21 दिनों में विट्रो (DIV) में किया गया था। ईजीएफपी को इन स्लाइस संस्कृति युग (चित्रा 2बी-डी)में हिप्पोकैम्पल CA1 क्षेत्र में5-20पिरामिड न्यूरॉन्स में संक्रमित किया गया था। CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) का उपयोग कर पहचाने गए थे । स्लाइस संस्कृति में पिरामिड न्यूरॉन्स और निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन्स के बीच शारीरिक वितरण और रूपात्मक मतभेदों को प्रदर्शित करने के लिए, CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स को DIV7 Pv/TdTomato माउस में ईजीएफपी के साथ विद्युतीकृत किया गया था और CA1 पिरामिड सेल लेयर(चित्रा 2 ए)में ईजीएफपी-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के विशिष्ट स्थान को प्रदर्शित करने के लिए परमाणु काउंटरदाग किया गया था।

इसके बाद, इस प्रोटोकॉल को टीडीटोमाटो-पॉजिटिव पीवी और वीजीटी3 इंटरन्यूरॉन्स पर भी लागू किया गया था। ईजीएफपी इलेक्ट्रोपॉलगेशन 1-10 फ्लोरोसेंटी लेबल वाले इंटरन्यूरॉन्स में किया गया था। टीडीटोमाटो-पॉजिटिव पीवी(चित्रा 3)और वीजीटी3(चित्रा 4)न्यूरॉन्स को हिप्पोकैम्पल CA1 क्षेत्र में सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोपोट किया गया। दिलचस्प बात यह है कि इन सभी निरोधात्मक न्यूरोनल प्रकारों में रुचि के ईजीएफपी जीन का ट्रांसफैक्शन DIV से काफी प्रभावित नहीं था और सीए1 पिरामिड न्यूरॉन्स(चित्र 5)में मनाए गए ट्रांसफैक्शन दक्षता (~ 80%) के साथ अलग नहीं था।

Figure 1
चित्रा 1: दो प्रतिनिधि ग्लास पिपेट छवियां।
(A)इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कम प्रतिरोध (6.5 एमΩ) पिपेट, और(बी)उच्च प्रतिरोध (10.4 एमΩ) इलेक्ट्रोपाउनेशन प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट पिपेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ऑर्गेनोटिपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस संस्कृतियों को तीन अलग-अलग समय बिंदुओं पर ईजीएफपी (हरे) के साथ विद्युतीकृत किया गया था।
(A)एक DIV7 Pv/TdTomato माउस में प्रतिनिधि ऑर्गेनोटिपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस संस्कृति । CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स ईजीएफपी (हरे, सफेद तीर) के साथ इलेक्ट्रोपेटेड थे और टीडीटोमाटो (टीडीटी) के साथ कोई ओवरलैप नहीं दिखाया गया- सकारात्मक पीवी इंटरन्यूरॉन्स (लाल, पीले एरोहेड)। DAPI परमाणु प्रतिदाव (नीला) प्रदर्शन किया गया था । डीजी: डेंटेट जायरस। (बी-डी) CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स तीन अलग-अलग समय बिंदुओं पर ईजीएफपी के साथ इलेक्ट्रोपेटेड थे:(B)DIV7,(C)DIV14 और(D)DIV21। ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृतियों को 4% सुक्रोज, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड/1x पीबीएस और आगे की धारा के बिना इमेज्ड के साथ तय किया गया था । शीर्ष बाएं, हिप्पोकैम्पल CA1 क्षेत्र की कम आवर्धन छवियां। एरोहेड इलेक्ट्रोपॉरेशन के लिए लक्षित व्यक्तिगत CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। पीले तीर के साथ संक्रमित न्यूरॉन्स नीचे पैनलों में तेजी से बढ़ी हैं। सफेद एरोहेड उच्च आवर्धन दृश्य के बाहर अतिरिक्त इलेक्ट्रोपेटेड न्यूरॉन्स को दर्शाता है। शीर्ष दाईं ओर, अतिरंजित (सुप) फ्लोरोसेंट और नोमारस्की छवियों की कम आवर्धन छवियां। स्केल बार: क्रमशः 500, 50, 100, 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पीवी/TdTomato ऑर्गेनोथिपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस संस्कृतियों को तीन अलग-अलग समय बिंदुओं पर ईजीएफपी (ग्रीन) के साथ इलेक्ट्रोपेटेड किया गया था।
(A)DIV7, (B)DIV14 और(C)DIV21 । हिप्पोकैम्पस CA1 पिरामिड सेल लेयर और ओरियंस में पीवी-लेबल टीडीटोमाटो (टीडीटी) के साथ ओवरलैप किया गया था- सकारात्मक कोशिकाएं (लाल) देखी गईं। कम आवर्धन इनसेट (शीर्ष पंक्ति) में, पीले एरोहेड इलेक्ट्रोपॉरेशन के लिए लक्षित व्यक्तिगत पीवी इंटरन्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। सफेद एरोहेड उच्च आवर्धन दृश्य के बाहर इलेक्ट्रोपेटेड अतिरिक्त टीडीटोमाटो-पॉजिटिव पीवी इंटरन्यूरॉन्स को दर्शाता है। स्केल बार: 50, 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: VGT3/TdTomato ऑर्गेनोथिपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस संस्कृतियों को तीन अलग-अलग समय बिंदुओं पर ईजीएफपी (ग्रीन) के साथ इलेक्ट्रोपेटेड किया गया था।
(A)DIV7, (B)DIV14 और(C)DIV21 । हिप्पोकैम्पस CA1 पिरामिड सेल लेयर और ओरियंस में वीजीटी3-लेबल वाले टीडीटोमाटो (टीडीटी) पॉजिटिव सेल्स (रेड) के साथ ओवरलैप देखा गया। कम आवर्धन इनसेट (शीर्ष पंक्ति) में, पीले एरोहेड इलेक्ट्रोपॉशन के लिए लक्षित व्यक्तिगत वीजीटी3 इंटरन्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। सफेद एरोहेड उच्च आवर्धन दृश्य के बाहर इलेक्ट्रोपेटेड अतिरिक्त टीडीटोमाटो-पॉजिटिव वीजीटी3 इंटरन्यूरॉन्स को दर्शाता है। स्केल बार: 50, 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स, पीवी/TdTomato, और VGT3/TdTomato interneurons में तीन अलग इन विट्रो स्लाइस संस्कृति उंर में ट्रांसफेक्शन दक्षता के तुलनीय स्तर ।
तीन अलग-अलग स्लाइस संस्कृति उम्र के सारांश बार रेखांकन: DIV7 (बाएं), DIV14 (मध्य) और DIV21 (दाएं)। प्रत्येक प्रतीक एक ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृति CA1 Py से प्राप्त ट्रांसफैक्शन दक्षता का प्रतिनिधित्व करता है: DIV7 (2 चूहों से 12 स्लाइस संस्कृतियां), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); पीवी: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2) । वन-वे इनोवा; n.s. (महत्वपूर्ण नहीं) । दिखाए गए डेटा का मतलब है ± SEM। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हम यहां एक इलेक्ट्रोपॉरेशन विधि का वर्णन करते हैं जो उच्च दक्षता और परिशुद्धता के साथ उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स दोनों को स्थानांतरित करता है। हमारे अनुकूलित इलेक्ट्रोपाउशन प्रोटोकॉल में अत्यधिक कुशल जीन ट्रांसफैक्शन प्राप्त करने के लिए तीन अभिनव सफलताएं हैं। हमारा पहला संशोधन पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 3,5,6की तुलना में पिपेट आकारबढ़ानाथा । इस परिवर्तन ने हमें पिपेट क्लोजिंग के बिना कई न्यूरॉन्स को इलेक्ट्रोपोट करने में सक्षम बनाया। इसके अलावा, यह संभव है कि कम प्रतिरोध पिपेट पिछले तरीकों की तुलना में मामूली विद्युत पल्स मापदंडों के उपयोग के लिए अनुमति देते हैं, जबकि अभी भी वांछित परिणाम 3 प्राप्त करतेहैं। इसके बाद, इलेक्ट्रोपाउशन से पहले बार-बार दबाव साइकिल चलाना स्पष्ट रूप से सेल डेथ10कम हो गया । हम अक्सर देखा है कि इलेक्ट्रोपोराटिंग से पहले नकारात्मक दबाव की एक नाड़ी के आवेदन के साथ, प्लाज्मा झिल्ली पिपेट टिप के अंदर करने के लिए अटक गया, सेल को नुकसान पहुंचा । दबाव चक्रों ने पिपेट से बहुत कम प्लाज्मा झिल्ली छड़ी करने में मदद की, जिसने प्रक्रिया10के दौरान सेल अस्तित्व और वसूली में सुधार किया। अंत में, एसीसीएफ में टीटीएक्स के अलावा अवरोधक न्यूरॉन्स10में इलेक्ट्रोपॉशन की सफलता में काफी सुधार हुआ। हम मानते हैं कि इलेक्ट्रोपाउशन घातक सेल ओवरएक्सिटेशन का कारण बन सकता है जिसे टीटीएक्स द्वारा रोका जा सकता है। सबसे बड़ी बात यह है कि ये महत्वपूर्ण सुधार उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स(चित्र 5)दोनों के लिए इलेक्ट्रोपाउशन में उल्लेखनीय रूप से उच्च सफलता दर प्रदान करते हैं। यद्यपि हमें लक्षित कोशिकाओं में इस विधि10 के साथ ट्रांसफैक्शन के बाद हमारे न्यूरॉन्स में कोई इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल असामान्यताएं नहीं मिलीं, यह सूचित किया गया है कि इलेक्ट्रोपॉशन के दौरान स्थानीय पीएच परिवर्तन कोशिका व्यवहार्यता को कम करते हैं और इलेक्ट्रोपॉरेशन मापदंडों का अनुकूलन अन्य जीन ट्रांसफैक्शन विधियों13,14की तुलना में अपेक्षाकृत कठिन हो सकता है। इसलिए, इलेक्ट्रोपाउशन के अप्रत्याशित दुष्प्रभावों पर विचार करना और किसी भी विशिष्ट आवेदन के लिए उच्च ट्रांसफैक्शन दक्षता प्राप्त करने के लिए आवश्यक विद्युत मापदंडों को फिर से अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है।

माइक्रोइंजेक्शन तकनीक का उपयोग 2 , 15,16कोशिकाओं को ट्रांसजीन देने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में भी किया गया है । हालांकि, यह दृष्टिकोण आम तौर पर ट्रांसफैक्शन की कम उपज पैदा करता है और उच्च स्तर के कौशल की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, हमारी विधि का उपयोग सापेक्ष सहजता से और प्रयोगशालाओं के लिए न्यूनतम कीमत पर किया जा सकता है जो नियमित रूप से पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन करते हैं।

हाल ही में, हमने दिखाया कि कई जीनों को उत्तेजक और सोमाटोस्टैटिन दोनों में संक्रमित किया जा सकता है जिसमें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों पर कोई दुष्प्रभाव नहींहोताहै । इस अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि यह इलेक्ट्रोपॉरेशन विधि CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स(चित्रा 2)और पीवी(चित्रा 3)और वीजीटी 3(चित्रा 4)निरोधात्मक इंटर्नऑन में अत्यधिक कुशल है। इसके अलावा, यह इलेक्ट्रोपॉशन तकनीक हमें सेल प्रकार या विट्रो(चित्रा 5)में दिनों की संख्या की परवाह किए बिना ~ 80% सफलता दर के साथ ब्याज के जीन को स्थानांतरित करने की अनुमति देती है। यद्यपि तकनीक का परीक्षण केवल विट्रो में किया गया है, फिर भी एक ही DIV समय बिंदुओं पर ऑर्गेनोथिपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस संस्कृतियों का परीक्षण किया गया है, जिसे वीवो सिनैप्टिक आकृति विज्ञान और गतिविधि में उम्र-मिलान का पालन करने के लिए दिखाया गया है, जैसा कि तीव्रता से तैयार हिप्पोकैम्पल स्लाइस17में देखा गया है। इसके अलावा, जैसा कि हमने केवल हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में इस विधि का परीक्षण किया है, यह संभव है कि अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स के लिए इस तकनीक को लागू करने में अप्रत्याशित चुनौतियां हो सकती हैं। विधि ऑर्गेनोइटिक स्लाइस संस्कृति विकास के दौरान जीन की खोज को आमंत्रित करती है जिसमें अन्य गुणों के बीच सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और घनत्व, समय के साथ बदलता है।

यह प्रोटोकॉल पहले से स्थापित लोगों की तुलना में एक सुधार है कि यह एक साथ कम लागत वाला, कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और एकल-न्यूरॉन जीन ट्रांसफैक्शन5,6,7,8,9उत्पन्न करने में अधिक कुशल है। यह भी कोशिका क्षति या मौत की कम दरों के मामले में पिछले तरीकों पर एक सुधार प्रतीत होता है, जैसा कि हमने देखा कि कोशिकाओं के ~ ८०% सफलतापूर्वक संक्रमित और स्वस्थ प्रक्रिया के बाद थे । इसलिए, यह विधि फ्लोरोसेंट माउस मॉडल का उपयोग करके कई न्यूरोनल सेल प्रकारों में जीन की भूमिकाओं की जांच करने का एक नया अवसर प्रदान करती है। इस विधि का उपयोग करके भविष्य के अध्ययन विशिष्ट आणविक या शारीरिक कार्यों की जांच करने के लिए कोशिकाओं के बीच प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं, जिसमें ट्रांस-सिनैप्टिक प्रोटीन इंटरैक्शन शामिल हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थानों (R01NS085215 से K.F., T32 GM107000 और F30MH122146 से A.C.) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों ने कुशल तकनीकी सहायता के लिए सुश्री नाओई वातानाबे को धन्यवाद दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit Qiagen 12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates GREINER BIO-ONE 657160
Dumont #5/45 Forceps FST #5/45 Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit Millipore SCHVU02RE Filtration and storage of culture media
Incubator Binder BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper TED PELLA, INC. 10180 Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm Millipore PIHP03050 Organotypic slice culture inserts
Osmometer Precision Systems OSMETTE II
PTFE coated spatulas Cole-Parmer SK-06369-11
Scissors FST 14958-09
Stereo Microscope Olympus SZ61
Sterile Vacuum Filtration System Millipore SCGPT01RE Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses Warner Instruments 640796
Micropipetter Puller Sutter Instrument P-1000 Puller
Oven Binder BD (E2)
Puller Filament Sutter Instrument FB330B Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes BD Falcon 353001
Airtable TMC 63-7512E
CCD camera Q Imaging Retiga-2000DC Camera
Electroporation System Molecular Devices Axoporator 800A Electroporator
Fluorescence Illumination System Prior Lumen 200
Manipulator Sutter Instrument MPC-385 Manipulator
Metamorph software Molecular Devices Image acquisition
Peristaltic Pump Rainin Dynamax, RP-2 Perfusion pump
Shifting Table Luigs & Neuman 240 XY
Speaker Unknown Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope Olympus SZ30
Table Top Incubator Thermo Scientific MIDI 40
Upright Microscope Olympus BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 164 एकल कोशिका इलेक्ट्रोपॉशन जीन डिलीवरी न्यूरॉन इंटरन्यूरॉन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस कल्चर माउस
माउस हिप्पोकैम्पल उत्तेजक और कक्षा-विशिष्ट निरोधात्मक न्यूरॉन्स की विभिन्न ऑर्गैग्निक स्लाइस संस्कृति में एकल-सेल इलेक्ट्रोपशन
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Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61662, doi:10.3791/61662 (2020).

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