병아리콩에서 건조 루트 썩은 질병 에세이 : 상세한 방법론

Summary

이 연구는 병아리콩의 근간을 연구하는 방법론과 분자 메커니즘을 제시합니다–Rhizoctonia 바타티콜라 상호 작용. 상기 블로팅 종이 방법은 병아리콩 유전자형 반응을 빠르게 연구하는 데 유용하며, 아픈 냄비 기반 방법은 가뭄과 R. 바타티콜라 감염 및 내성 유전자형을 위한 화면을 동시에 부과하는 데 사용될 수 있다.

Abstract

건조 루트 부패 (DRR) 질병은 전 세계 병아리콩 재배에 대한 새로운 생물학적 스트레스 위협입니다. 토양에 의한 곰팡이 병원체인 리조토니아 바타티콜라에의한 것이다. 문헌에서는 질병 분석에 대한 포괄적이고 상세한 단계별 프로토콜은 희소합니다. 이 문서에서는 DRR에 대한 저항성을 위해 유전자형을 신속하게 선별하기 위한 블로팅 용지 기술을 설정하는 데 관련된 단계에 대한 자세한 내용을 제공합니다. 블로팅 페이퍼 기법은 쉽고 저렴합니다. 아픈 냄비 접근법에 근거한 또 다른 방법은 자연 감염의 모방이며 질병 삼각형에 관여하는 식물, 병원균 및 환경과 같은 상호 작용하는 구성 요소를 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다.

또한, 자연에서 DRR은 주로 작물 성장이 진행됨에 따라 토양 수분이 후퇴하는 비가 내린 병아리콩 재배 지역에서 발생합니다. 가뭄 스트레스는 DRR 질병에 병아리콩 식물을 걸리기 쉬운 것으로 알려져 있습니다. 가뭄 스트레스하에서 식물 병원체 상호 작용의 병리학 및 분자 이해는 병아리콩 세균성 수영장에서 엘리트 DRR 내성 품종의 식별을위한 길을 열 수 있습니다. 이 문서는 아픈 냄비와 후속 질병 분석의 준비를위한 단계별 방법론을 제공합니다. 전반적으로, 본 원에 제시된 정보는 연구원이 R. bataticola 곰팡이 무분큐럼을 준비하고, 이 병원체를 유지하고, 블로팅 종이 기술을 설정하고, 아픈 문화와 아픈 냄비를 준비하고, 병아리콩 식물에 있는 병원균 감염을 평가하는 것을 도울 것입니다.

Introduction

건조 루트 부패 (DRR)는 병아리콩^1,2에서경제적으로 중요한 질병 중 하나입니다. 그것은 Rhizoctonia 바타티콜라에 의해 발생 하는 루트 특이 적인 질병 (텔레모프, 거시 포 미나 phaseolina). 감염된 식물은 측면 뿌리가 부족하고 부서지기 쉬운 타뿌리와 노란색 단풍^1,3을가지고 있습니다. 가뭄 스트레스하에서 DRR은 병아리콩재배^1,2,3에대한 새로운 위협으로 보고되었습니다. 더욱이, DRR발생률은^{1, 2,3의}현장^조건하에서 가뭄 스트레스하에서 악화되는 것으로 보고된다. DRR은 관개 필드^4보다비가 많이 내리는 지역에서 더 널리 퍼져 있습니다. 내성 품종의 활용은 질병을 극복하고 살균제 사용^1,13을우회하는 방법입니다. 전 세계적으로 사용할 수있는 병아리 콩 세균은 특성^5에대한 유전 적 변이를 항구하기 때문에, 내성 / 깨지기 쉬운 유전자형의 선별 및 식별은 작물 개선을위한 분자 번식에 매우 중요합니다.

견고하고 쉽고 비용 효율적인 질병 애약은 병아리콩의 R. 바타티콜라 감염 패턴을 조사하는 데 필수적입니다. R. 바타티콜라 감염에 대한 병아리콩 유전자형의 반응을 관찰하는 데 사용되는 1차 질환 분석법은 블로팅 종이 기술^1,4이다. 그것은 간단한 기술이며 액체 곰팡이 접종, 뿌리가있는 모종 및 멸균 얼룩지를 사용하여 실행할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 문헌에서 단계별 프로토콜을 사용할 수 없기 때문에 최대한 활용되지 않았습니다.

한편, 아픈 냄비 기술은 잠재적 인 아픈 문화의 준비와 가뭄 스트레스의 부과를 포함한다. 가뭄 스트레스가 DRR 질환 발생률 을 악화시키는 것을 감안할 때^3,가뭄 스트레스^6,7하에서식물 병원체 상호 작용을 연구하는 것이 필수적이다. 아픈 냄비 기술은 이러한 동시 연구를위한 플랫폼을 제공, 세균 검사를위한 더 나은 가능성을 촉진하고 상호 작용의 기계론적 기초를 이해. DRR 질병에 내재된 루트 길이의 증가 및 측면 루트 수의 감소와 같은 병리학적 변화는 아픈 냄비 기술^1,3,7을사용하여 해결할 수 있다.

본명, 병아리콩과 R. 바타티콜라 와 스크린 병아리콩 세균질 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 종이와 아픈 냄비 기술을 부팅하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 연구에 사용된 재료의 세부 사항은 재료 표에부여됩니다.

Protocol

1. R. 바타티콜라 의 격리 및 저장

1. 병아리콩 유전자형 및 DRR 증상의 세부 사항
   1. 일반적으로 건조, 취성 1 차 뿌리와 같은 전형적인 DRR 증상을 보이는 병아리콩 식물 (유전자형, JG 62)을 사용하여 껍질 아래 와 pith^1,3내부의 측면 뿌리및 미세 경화증이 없는^경우.
2. 수거 및 세척
   1. 표피 층 아래 미세경화증을 가진 마른 짚 색 의 엽및 취성 1 차 뿌리와 같은 현상을 보여주는 뿌리 식물. 뿌리 뽑는 동안, 뿌리의 주요 부분은 감염된 뿌리가 취성이기 때문에 토양 내부에 남아있을 것입니다. 뿌리에 부착된 거친 토양 파편을 제거합니다. 뿌리를 따로 자르고 적절한 라벨로 종이 봉투(27.5cm x 12cm)로 수집하여 샘플 수집 상자에 넣습니다.
   2. 샘플을 실험실로 운반한 후 뿌리를 200mL 비커에 놓고 메쉬(직경 3mm 크기의 나일론 메쉬)로 덮어, 흐르는 수돗물로 뿌리를 철저히 씻어 토양 입자를 제거합니다.
   3. 역삼투압(RO) 물을 사용하여 마지막에 한 번 헹구세요.
3. 표면 살균
   1. 메스 블레이드로 각각 2cm 길이로 뿌리를 4개로 부수고 깨끗한 200mL 비커에 넣습니다.
   2. 라미나르 플로우 챔버 내부에 오토클레이브 RO 물, 2% NaOCl, 폐기 항아리 및 자동 블로팅 용지(5cm^2)를조립합니다.
   3. 50mL의 오토클레이브 RO 워터로 뿌리를 세 번 씻은 다음 50mL의 2% NaOCl으로 10분 간 세척합니다. 뿌리를 RO 물 50mL로 세 번 다시 씻어 NaOCl을 제거합니다.
   4. 블롯은 뿌리를 오토클레이브 블로팅 용지에 놓고 뿌리가 건조될 때까지 그대로 둡니다.
4. 미디어 및 인큐베이션
   1. 멸균 된 메스 블레이드로 뿌리의 가장자리를 제거합니다. 블레이드를 이용하여 뿌리를 분할하고 멸균 된 집게를 사용하여 감자 덱스트로스 천 (PDA) 미디어 페트리 플레이트에 연쇄상 구균 황산염 (50 mg L^-1)및 암피실린 (50 mg L^-1)을함유한다.
   2. 판을 닫고 파라필름으로 밀봉하고 어둠 속에서 이틀 동안 28 °C의 인큐베이터에서 배양하십시오.
5. 최면 팁 방법
   1. 잠복 2 일 후, 라미나르 흐름 챔버에 플레이트를 가져. 스테레오현미경(라이카 EZ4 교육 스테레오현미경)에서 최면 성장^8의 끝을 잘라내고 연쇄상 구균 황산염및 암피실린을 갖춘 신선한 PDA 플레이트로 옮는다.
   2. 어둠 속에서 10 일 동안 28 °C에서 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
6. R. 바타티콜라 곰팡이 무접종의 보관 및 유지 보수
   1. 시험관에서 PDA 경사를 만들고 화염 살균 접종 루프를 사용하여 10 일 된 배양 판에서 곰팡이 천마 플러그를 전송합니다. 파라필름으로 테스트 튜브 캡을 밀봉합니다.
   2. 어둠 속에서 10 일 동안 28 °C에서 경사를 배양하십시오.
   3. 파라필름으로 캡을 다시 밀봉하고 냉장고에 4°C로 보관하여 향후 사용하십시오.
   4. 곰팡이를 유지하기 위해 6 개월마다 하위 문화.
7. 독성 유지 보수
   1. 아픈 냄비 기술^3에서언급 한 대로 준비 된 순수한 곰팡이 무분비로 식물을 감염하십시오. 감염된 식물 (코흐의 추정)^9에서 동일한 곰팡이를 분리하고 추가 실험에 사용합니다.
      참고 : 이 연구에서, 곰팡이의 필드 고립 된 변형이 사용되었다 (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. 종이 기술을 블로팅

참고: 얼룩진 종이 기술은 액체 곰팡이 접종, 모종 준비 및 질병 평가의 준비를 수반합니다.

1. 액체 R. 바타티콜라 접종 준비
   참고: 액체 R. 바타티콜라 곰팡이 접종에는 균증과 미세성 내분이 모두 포함되어 있습니다. 이 두 구조는 기본 무분비로 작용합니다.
   1. 1,000mL 플라스크로 500mL의 PDB 미디어를 준비하고 15분 동안 121파운드에서 오토클레이브를 준비한다.
   2. 미디어가 냉각된 후, 곰팡이 경사 배양에서 곰팡이 가루 플러그로 국물을 접종하고 어둠 속에서 180 rpm에서 셰이커에서 5 일 동안 28 °C에서 배양하십시오.
   3. 테이블에 오토클레이브 유리 또는 플라스틱 깔때기 (10cm), 1 리터 원뿔 플라스크 및 두 층의 메쉬 (10cm² 크기) (직경 3mm의 모공 크기가있는 나일론 메쉬)를 조립합니다. 메쉬를 사용하여 곰팡이 균증과 미세 경화증을 걸러내세요. 블로는 오토클레이브 블로팅 페이퍼로 곰팡이를 말리십시오.
   4. 50% 비수근에 100g 의 mycelia의 무게와 실온에서 유지.
2. 병아리콩 식물의 준비
   1. 50개의 건강한 씨앗을 선택합니다(이 연구에서 DRR에 취약한 유전자형 JG 62가 사용됨), 100mL 비커에 배치하고 메쉬로 덮습니다.
   2. 먼저 수돗물로 씨앗을 씻어 토양 이물질을 제거합니다.
   3. 씨앗이 있는 비커를 라미나르 유량 챔버에 넣고 세척당 1분 동안 50mL의 RO 물로 세척할 수 있습니다.
   4. 50mL의 2% 수성 NaOCl으로 씨앗을 2분 동안 연속 흔들림으로 살균하고 50mL의 멸균수로 씨앗을 1분 동안 5회 세척합니다.
   5. 폴리에틸린 백(47.5cm x 25cm)을 토양라이트(원예 등급의 혼합물)로 채우고, 아이리쉬 피트 이끼, 그리고 동등한 비율로 각질 제거 버미쿨라이트, 1/3:1/3:1/3), 표면 살균 50 씨앗 2cm 깊이를 뿌리고, 28 °C ± 2 °C 온도, 16 h 광기간을 150mol μ m^-2,1 %의 빛 강도로 성장 챔버 / 방에 보관하십시오. RO 물로 물을 뿌리고 파종 후 8 일 동안 식물을 뿌리 뽑습니다.
   6. 수돗물에 뿌리를 씻어 토양당 입자를 제거합니다. 멸균 된 RO 물로 뿌리를 헹구고 1000 mL 비커로 RO 물에 보관하십시오.
3. 트레이에 용지를 얼룩질 준비
   1. 얼룩진 종이를 가져 와서 복제를 충족하기에 충분한 숫자로 조각 (30cm × 23cm)로 잘라냅니다.
   2. 자동 분해성 폴리에틸렌 백에 시트를 포장하고 121 파운드로 15 분 동안 오토 클레이브하고 건조를위한 뜨거운 공기 오븐에 보관하십시오.
   3. 각 얼룩진 용지 시트를 반으로 접습니다.
   4. 그림 2i-iv에표시된 것처럼 깨끗하고 정신이 닦은 플라스틱 트레이에 종이를 놓습니다.
4. 담그면 식물 접종
   1. 200mL 비커에 200mL 오토클레이브 RO 물에 곰팡이 이노쿨럼 100g을 녹여 50% 접종을 합니다.
   2. 간헐적인 상하 운동으로 제조된 접종에 식물 뿌리를 담그고 곰팡이 무분비의 균일한 부착을 보장합니다.
5. 식물을 얼룩진 종이에 넣습니다.
   1. 멸균 된 RO 물로 트레이에 놓인 블로팅 용지의 하단을 적시. 뿌리만 종이로 덮여 있고 싹이 남지 않는 방식으로 종이에 식물을 놓습니다.
   2. 얼룩지는 종이의 상단을 접고 전체 종이를 적시어 식물 성장을 유지하기에 충분한 물을 공급하십시오.
   3. 트레이를 하루에 한 번 물에 담고 트레이를 28°C로 유지합니다. 매일 괴사, 뿌리 부패 및 잎 황색과 같은 증상을 관찰하십시오.

3. 아픈 냄비 기술

참고 : 아픈 냄비 기술은 악성 접종과 아픈 냄비의 준비, 수분 수준의 유지 보수 및 질병 증상의 평가를 수반한다.

1. 기판 준비
   1. 시판되는 병아리콩 씨앗 1kg을 섭취하십시오. 감염된 씨앗을 제거하십시오 (곰팡이 성장, 감염 반점 및 곤충 손상이있는 씨앗). 5 L 플라스틱 비커에 놓고 수돗물로 3-4번 철저히 씻어 주요 이물질을 제거합니다.
   2. 2L의 RO 물로 씨앗을 세 번 씻고 5 L 비커에 1kg 씨앗을 담그고 5 h의 물을 3 배 더 넣습니다.
   3. 씨앗이 물을 뿌리면, 세 번 RO 물로 다시 씻어 씨앗을 제거합니다.
   4. 물을 완전히 제거하고 씨앗을 잼 병(높이 300mL, 높이 12cm, 직경 6cm, 무게 155g)에 약^1/4번째 용량(잼 병 당 100g)으로 포장하고 캡으로 병을 닫습니다. 자동 복제 가능한 비닐 봉지(48cm x 30cm)에 10개의 잼 병을 121파운드로 두 번 포장하여 15분 동안 계속 포장합니다.
   5. 하룻밤 동안 오븐에서 40°C에서 씨앗을 건조하여 병 내부의 물방울을 제거합니다.
2. 아픈 문화의 준비
   1. BSL-2 레벨 라미나르 유량 챔버를 켭니다. 70% 에탄올로 바닥을 철저히 닦고 15분 동안 UV를 켭니다. 그런 다음, 라미나르 흐름 챔버 내부에 씨앗을 유지합니다.
   2. 10일 된 갓 고립 된 R. 바타티콜라 문화 (1 부)를 가져 가라. 그런 다음 멸균 파이펫 팁이나 코르크 보어를 사용하여 3 개의 곰팡이 천 플러그 (직경 4mm)를 가져 가서 무균 잼 병에 넣습니다. 캡으로 병을 덮고 파라필름으로 밀봉합니다.
   3. 병아리콩 씨앗과 곰팡이 디스크를 균일하게 혼합하기 위해 병을 흔들어.
   4. 어둠 속에서 15 일 동안 30 °C에서 병을 배양하십시오.
   5. 검은 곰팡이 성장(그림 4iii)과잼 병을 가지고 멸균 집게를 사용하여 유리 페트리 플레이트에 잼 병에서 아픈 문화 (미세 경화증씨앗)를 전송합니다. 유리 페트리 접시에 이틀 동안 실온에서 그들을 건조.
   6. 모르타르와 유봉을 사용하여 곰팡이 덩어리를 분말화하고 분말을 4 °C에 저장합니다.
   7. 오토클레이브 토양은 15 분 동안 121 파운드에서 두 번.
   8. 자동 음영 으로 자동 토양 을 건조.
   9. 곰팡이 분말을 토양과 50 % w /w로 섞고 냄비를 혼합물로 채우고 하루 동안 실온에서 유지하십시오.
   10. 냄비당 표면 멸균 된 DRR -깨지기 쉬운 병아리콩 씨앗 (10cm 둥근 냄비)(재료 표)을 뿌리고 80%의필드 용량 (FC)의 수분 수준을 유지합니다.
   11. 발아 후 식물을 뿌리 뽑아 괴사 및 뿌리 부패와 같은 증상을 관찰하십시오.
3. 아픈 냄비 효율 평가
   참고: 뿌리가 완전히 썩으면 식물은 노란 잎 증상을 보여줍니다.
   1. 병변(괴사 반점)(보충도2C)및 루트 부패의 중증도에 기초한 질병 점수를 개발한다. 90%의 식물 죽음을 보여주는 아픈 냄비는 더 이상 사용될 수 있습니다.
4. 유전자형 스크리닝
   1. 아픈 문화를 대량으로 준비하고 30cm 높이의 냄비에 멸균 된 토양 또는 필드 토양 (5 % w /w)과 혼합하십시오. 냄비에 물을 주어 표면에 젖어 7 일 동안 방해받지 않고 둡니다.
   2. 둥근 냄비 10cm당 표면 멸균 시드 1개를 뿌리고 30cm 둥근 냄비당 3개의 씨앗을 뿌리고 물을 적절히 뿌릴 수 있습니다.
   3. 노란색 엽서 및 루트 부패 증상을 관찰하십시오.
5. 결합 된 가뭄과 R. 바타티콜라 감염
   1. 신하 등에서 언급 된 프로토콜을 따라 가뭄 스트레스를 부과합니다.(2019).

Results

이 연구는 가뭄 스트레스하에서 식물 병원체 상호 작용의 병리학 및 분자 이해를 촉진하기 위해 종이와 아픈 냄비 기술을 블로팅과 같은 기술을 입증하는 것을 목표로했습니다. 이를 위해 DRR 증상을 보이는 식물^1,3,4는 병아리콩 밭에서 수집되었고, 곰팡이는 최면 팁 방법^8을사용하여 분리되었다. R. bataticola 곰팡이 문화는 PDA 플레이트에 어두운 회색으로 나타나고 인큐베이션 후 4 일 동안 기울어진(도 1A & C)및 인큐베이션 후 5 일 동안 PDB 배지에서 회색 색으로 어둡게 나타난다(도 1B). R. 바타티콜라는 미셀리아(도

Discussion

얼룩지는 종이 기술은 실험실 조건 하에서 병아리콩 유전자형을 검사하는 간단한 접근 방식을 제공합니다. 딥 접종을 통해 접종부하(보충 도 1)를쉽게 제어하여 현세적 기초에 대한 상호 작용의 조사를 가능하게 하고 체외 검사를 용이하게 합니다. 또한, 심지어 젊은 묘목을 사용할 수 있습니다. 5일 된 곰팡이 배양(도 1B)은식물을 감염시킬 만큼 충분한 접종을 할 수 있습니다. 액체 접종은 균골과 미세 경화증(도 1D & E)을모두 함유하고 있습니다. 루트 부패증상(도 3B)은질병을 점수매기고 내성 유전자형을 식별하는 데 사용될 수 있다. DRR 발생은 주로 가뭄 스트레스^1,3,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
곰팡이- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
	식물 성장을 지원하는 여과지 블로팅 페이	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	10cm 및 30cm 크기의 화분	정기적으로 사용되는 종묘장, 예를 들어,
https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html 감자 포도당 한천 / 육수	배양 및 곰팡이 유지	# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
인큐베이터	배양 곰팡이	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, 인큐베이터 및 셰이커
http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 성장 챔버	통제된 조건에서 식물 성장	모델 번호 A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
층류 기류	무균 운동	수행 Telstar, Bio II advance, Class II 캐비닛, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	곰팡이 균사체 필터링	나일론 모기장	메쉬 0.6-1 mm 직경 기공 크기
오토클레이브	오토클레이브 매체 및 병아리콩 씨앗	오토클레이브	http://www.scientificsystems.in/autoclave
현미경	감염 시각화 곰팡이 균	SMZ25 / SMZ18, 연구 실체 현미경, 라이카 EZ4 교육용 실체 현미경	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
저울	칭량 곰팡이 및 화학 물질 칭량	Sartorius 전자 칭량 저울, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	곰팡이 염색	시그마	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN
아닐린 블루	곰팡이 염색	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901