세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

인간 유방암 줄기 세포 (BCSC)의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 유방암 치료에서 직면하는 문제를 해결하는 데 중요합니다. BCSC 개념의 출현은 21^세기 초로 거슬러 올라가며, CD44⁺CD24^-/저유방암 세포의 작은 집단이 마우스 ^1,2에서 이질적인 종양을 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다. 그 후, 알데히드 탈수소 효소 (ALDH^high)의 높은 효소 활성을 갖는 인간 유방암 세포도 유사한 줄기 세포 유사 특성을 나타내는 것으로 관찰되었다³. 이러한 BCSC는자가 재생 및 분화가 가능한 작은 세포 집단을 나타내며 벌크 종양 ^1,2,3의 이질성에 기여합니다. 축적 된 증거는 진화 적으로 보존 된 신호 전달 경로의 변화가 BCSC 생존 및 유지를 유도한다는 것을 시사합니다 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . 또한, 세포 외인성 미세 환경은 상이한 BCSC 기능을 지시하는데 중추적인 역할을 하는 것으로 나타났다^15,16,17. 이러한 분자 경로와 BCSC 기능을 조절하는 외부 요인은 유방암 재발, 전이¹⁸ 및 치료법에 대한 내성 발달19,20,21에 기여하며, 치료 후 BCSC의 잔류 존재는 유방암 환자의 전체 생존에 큰 도전이 됩니다.^22,23 . 따라서 이러한 요인에 대한 전임상 평가는 유방암 환자의 더 나은 치료 결과와 전체 생존 개선을 달성하는 데 도움이 될 수 있는 BCSC 표적 요법을 식별하는 데 매우 중요합니다.

몇몇 시험관내 인간 유방암 세포주 모델 및 생체내 인간 이종이식 모델은 BCSC 24,25,26,27,28,29를 특성화하기 위해 사용되었다. 모든 연속 계대 후에 지속적으로 다시 채워지는 세포주의 능력은 이러한 세포를 오믹스 기반 및 약물유전체학 연구를 수행하는 이상적인 모델 시스템으로 만듭니다. 그러나 세포주는 종종 환자 샘플에서 관찰된 이질성을 요약하지 못합니다. 따라서 환자 유래 샘플로 세포주 데이터를 보완하는 것이 중요합니다. 가장 순수한 형태의 BCSC를 분리하는 것은 BCSC의 상세한 특성 분석을 가능하게 하는 데 중요합니다. 이러한 순도를 달성하는 것은 BCSC에 특정한 표현형 마커의 선택에 달려 있습니다. 현재, ALDH^높은CD44⁺CD24^- 세포 표현형은 최대 순도¹을 위해 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 벌크 유방암 세포 집단으로부터 인간 BCSC를 구별하고 분리하는 데 가장 일반적으로 사용되며^{, 3,26}. 또한, 자가 갱신, 증식 및 분화와 같은 단리된 BCSC의 특성은 시험관내 및 생체내 기술을 사용하여 평가할 수 있습니다.

예를 들어, 시험관내 콜로니 형성 분석은 상이한 치료 조건(30)의 존재하에⁵⁰개 이상의 세포의 콜로니를 형성하기 위해 자가갱신하는 단일 세포의 능력을 평가하는데 사용될 수 있다. 유방권 분석은 또한 앵커리지 독립적 조건에서 유방암 세포의 자가 재생 잠재력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 무혈청 비부착성 배양 조건³¹에서 각각의 연속 계대에서 구체(BCSC 및 비-BCSC의 혼합물)로서 생성 및 성장하는 단일 세포의 능력을 측정합니다. 추가적으로, 3차원(3D) 배양 모델을 사용하여 생체 내 미세환경을 밀접하게 요약하고 잠재적인 BCSC-표적 요법의 활성을 조사할 수 있는 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 포함하는 BCSC 기능을 평가할 수 있다(³²). 시험관내 모델의 다양한 응용에도 불구하고, 시험관내 분석만을 사용하여 생체내 조건의 복잡성을 모델링하는 것은 어렵다. 이러한 과제는 생체 내에서 BCSC 거동을 평가하기 위해 마우스 이종이식 모델을 사용함으로써 극복할 수 있습니다. 특히, 이러한 모델은 유방암 전이를 평가하고³³, 질병 진행 동안 미세환경과의 상호작용을 조사하고(34), 생체내 영상화(³⁵), 및 항종양제(³⁴)의 환자 특이적 독성 및 효능을 예측하기 위한 이상적인 시스템으로서 기능한다.

이 프로토콜은 이질적인 유방암 세포의 벌크 집단으로부터 최대 순도로 인간 ALDH^{고 CD44+}CD24^- BCSC의 분리에 대한 자세한 설명을 제공한다. 또한 BCSC의 다양한 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 세 가지 시험관 내 기술(콜로니 형성 분석, 유방권 분석 및 3D 배양 모델)과 생체 내 종양 이종이식 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이러한 방법은 BCSC 생물학을 이해하고 새로운 BCSC 표적 요법을 조사할 목적으로 인간 유방암 세포주 또는 1차 환자 유래 유방암 세포 및 종양 조직으로부터 BCSC를 분리 및 특성화하는 데 관심이 있는 연구자가 사용하기에 적합합니다.

동의한 유방암 환자로부터 직접 환자 유래 수술 또는 생검 샘플의 수집은 기관 윤리 위원회가 승인한 승인된 인간 윤리 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 환자 유래 이종이식 모델을 생성하는데 사용된 모든 마우스는 유지되고 기관 승인 동물 시설에 수용되었다. 마우스를 사용한 환자 유래 이종이식 모델로부터의 종양 조직은 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인된 승인된 윤리 프로토콜에 따라 생성되었다.

1. 세포주의 제조

1. 생물안전 캐비닛의 멸균 조건에서 모든 세포 배양 및 염색 절차를 수행합니다. 멸균 세포 배양 접시/플라스크 및 시약을 사용하십시오.
2. 인간 유방암 세포를 태아 소 혈청(FBS) 및 각 세포주에 특이적인 필요한 성장 인자로 보충된 정의된 배지에서 5%_CO2 로 37°C에서 유지합니다.
3. 마우스 NIH3T3 섬유아세포 배양물(콜로니 형성 분석에 사용)을 10% FBS가 보충된 둘베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 5%_CO2 로 37°C에서 유지합니다.
4. 모든 문화권에서 2-3 일마다 오래된 미디어를 신선한 미디어로 보충하십시오. 배양이 75-80% 컨플루언스에 도달하면 여러 멸균 세포 배양 플라스크로 계대 배양합니다.

2. 유방암 종양조직의 제조

1. 기관 윤리위원회에서 승인 한 인간 윤리 프로토콜에 따라 동의 한 유방암 환자로부터 직접 환자 유래 수술 또는 생검 샘플을 수집합니다.
2. 그 후, 기관 동물 관리 위원회에서 승인한 동물 윤리 프로토콜에 따라 마우스를 사용하여 환자 유래 이종이식 모델에서 종양 조직을 수집하고 생성합니다.
3. 멸균 조건에서 모든 종양 조직을 50mL DMEM:F30 배지가 들어 있는 12mL 멸균 원추형 튜브에 수집하고 얼음 위에 보관하고 수집 후 2시간 이내에 아래 설명된 대로 샘플을 처리합니다.

3. 유방암 세포의 단세포 현탁액 생성

1. 60-80% 합류(선택한 세포주)인 유방암 세포의 단층을 포함하는 플라스크에서 배지를 흡인합니다. 세포를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다. PBS를 흡입하고 적절한 세포 해리 용액(예: 트립신:EDTA, 세포의 단층을 덮을 만큼만)을 추가하고 실온(권장) 또는 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
2. 세포 해리 용액의 활성을 중화하기 위해 5mL의 배양 배지를 추가합니다.
3. 생성된 해리된 세포 용액을 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
4. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 5 mL의 1x PBS에 재현탁시켰다. 혈구 측정기와 현미경을 사용하여 세포를 세십시오.
   알림: 혈구계에서 세포 응집을 관찰하십시오. 단일 세포 현탁액이 형성되지 않은 경우 세포 해리 단계를 반복합니다.
5. 세포 계수 후, 세포 현탁액을 1000 x g 에서 5분 동안 재원심분리하고, 상청액을 버리고, 1 x 10⁶ cells/mL의 농도로 ALDH 기질 완충액에 세포 펠릿을 재현탁한다.

4. 조직 샘플로부터 단세포 현탁액 생성

1. 십자형 기술을 사용하여 수술 블레이드로 종양 조직을 다져 약 1mm 크기의 더 작은 조각을 얻습니다. 조직 조각을 10mL 해리 완충액(DMEM:F12의 1X 콜라게나제)이 들어 있는 새로운 50mL 원추형 튜브에 옮깁니다. 원뿔형 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 셰이커 인큐베이터에서 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
   알림: 셰이커 인큐베이터가 없는 경우 튜브를 37°C 수조에 넣고 5-10분마다 와동하여 튜브를 혼합합니다.
2. 530 x g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리하여 소화된 조직을 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 5mL의 트립신을 첨가하십시오. 1mL 피펫(750μL 표시로 설정)을 사용하여 위아래로 피펫하여 펠릿을 파쇄하고 37°C 수조에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 피펫을 위아래로 격렬하게 움직여 단일 세포를 방출합니다.
3. DMEM:F12 배지를 사용하여 튜브의 총 부피를 25mL로 채우고 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 1mL의 디스파제-DNase 용액에 펠릿을 재현탁합니다. 37°C 수조에서 5분 동안 배양합니다.
4. PBS로 튜브의 총 부피를 10mL로 채웁니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합하고, 생성된 세포 현탁액을 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 부착된 40μm 세포 스트레이너를 통해 통과시킵니다. 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
5. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 5mL의 1x PBS에 재현탁합니다. 세포를 계수하고 단계 3.4 및 3.5에 기재된 바와 같이 세포 현탁액의 제조를 완료한다.

5. 유방암 줄기 세포 (BCSC)의 분리

1. 라벨 유동 튜브는 염색되지 않은 대조군, 단일 세포 염색 대조군 (DEAB 대조군, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), 음성 대조군 튜브 (DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 및 7AAD로 염색됨), 형광 마이너스 원 (FMO) 대조군 및 '정렬' 튜브 (ALDH, CD44, CD24 및 7AAD로 염색됨)를 포함한다.
2. 단계 3.5 또는 단계 4.5로부터의 세포 현탁액 500 μL (0.5 x 10⁶ 세포)를 표지된 세포만, CD44, CD24 및 7AAD로 표지된 각 튜브로 옮긴다. 사용할 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
3. 2mL의 시료(2 x 10⁶ 셀)를 각각의 'ALDH' 튜브로 옮깁니다. 5μL의 DEAB를 'DEAB 대조군' 및 '음성 대조군' 튜브에 추가하고 단단히 캡을 씌웁니다. 10μL의 ALDH 기질을 'ALDH'튜브에 추가하고 vortexing하여 잘 섞은 다음 즉시 500μL를 해당 'DEAB 대조군'및 '음성 대조군'튜브로 옮깁니다. 'DEAB 대조군', '음성 대조군' 및 'ALDH 튜브'를 요약하고 37°C에서 30-60분 동안 배양합니다(60분을 초과하지 않음).
   참고: 최적의 배양 시간은 세포주에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다. 항상 ALDH 기질과 염색 된 세포가 들어있는 튜브를 빛으로부터 보호하십시오.
4. 배양 후 모든 샘플을 250 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 500 μL의 ALDH 기질 완충액에 재현탁시킨다. 제조업체가 권장하거나 사용자가 최적화한 항-CD44-PE 및 항-CD24-PE-Cy7 항체 칵테일을 추가하고 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 항-CD44-PE 및 항-CD24-PE-Cy7 항체를 각각의 'CD44' 및 'CD24' 표지 튜브에 추가합니다.
5. 배양 후 모든 샘플을 250 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 500 μL의 ALDH 기질 완충액에 재현탁시킨다. '음성 대조군' 튜브, '정렬 튜브' 및 '7ADD' 튜브를 7AAD(권장 농도: 0.25μg/1 x 10⁶ 세포)로 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
   참고: ALDH 활성은 녹색 형광 채널에서 감지되므로 호환되는 방출 스펙트럼이 다른 형광 색소를 사용해야 합니다. 다중 파라미터 유세포분석 중에 스펙트럼 중첩이 관찰되는 경우, 형광 신호가 다른 채널로 유출되는 것을 최소화하기 위해 형광 색소 간의 보상을 허용하는 가이드로 단색 제어 및 FMO 제어를 사용해야 합니다.
6. 샘플 분석을 준비하기 위해 FACS 기기에서 분석 프로토콜을 설정합니다. 산점도(전방 vs 측면 산란, 전방 스캐터 vs 형광 채널)를 만듭니다.
7. 염색되지 않은 컨트롤을 사용하여 광전자 증배관을 조정하여 전체 세포 집단에서 파편을 분리하고 형광 전압을 조정하여 전체 세포 집단을 첫 번째 로그 스케일(10¹) 주위로 이동합니다. DEAB 컨트롤을 사용하여, 녹색 형광 전압 채널을 조정함으로써 제2 로그 스케일(10²) 내에서 전체 세포 집단을 이동시킨다.
8. 모든 단일 염색 대조군(ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7)과 7AAD 및 FMO 대조군을 먼저 분석하고, 염색되지 않은 세포로부터 염색된 세포를 분리하고 형광 신호가 다른 채널로 유출되는 것을 최소화하기 위해 전압을 조절한다.
9. 각각의 단일 염색된 세포 샘플에 대한 양성 집단에 대한 게이트. 음성 대조군 튜브를 사용하여, 생존율에 대한 게이트(7AAD 음성), ALDH^낮은 및 ALDH^높은 세포 집단( 도 1B에 도시된 대표적인 게이팅 전략).
10. 관심 있는 다중 파라미터 염색 샘플을 분석하여 BCSC를 분리합니다. 실행 가능한 ALDH^저가 및 ALDH^하이 게이트를 사용하여 각각 CD44⁺CD24-(BCSC) 및 CD44-CD24⁺(비-BCSC) 세포 집단을 선택합니다(그림 1B).
11. 멸균 수집 튜브의 수집 배지에서 생존 가능한 BCSC 및 비 BCSC를 수집합니다 ( 그림 2A & B에 표시된 두 개의 대표적인 세포주의 집단). 아래에 설명된 대로 다운스트림 시험관 내 및 생체내 분석에 분류된 세포를 사용합니다.
    참고: 아래에 설명된 시험관 내 및 생체내 분석 외에도 BCSC는 표준 면역블로팅 기술을 통해 SOX2, OCT4 및 NANOG와 같은 만능 마커의 발현을 측정하여 검증할 수 있습니다.

그림 1: 유방암 세포주 및 조직 샘플에서 BCSC를 분리하기 위한 FACS 게이팅 전략. (A) BCSC 격리 절차를 설명하는 순서도. (B) 이종 세포 풀에서 생존 가능한 BCSC 및 비 BCSC를 분리하는 데 사용되는 정렬 전략을 보여주는 대표적인 FACS 플롯. MDA-MB-231 인간 유방암 세포는 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE 및 ALDH 기질로 동시에 표지됩니다. 세포 하위 세트는 FACS 기계에서 4색 프로토콜을 사용하여 분리되었습니다. 세포는 예상되는 광 산란에 기초하여 선택되고, 그 다음에 단일항에 대해, 그리고 7-AAD 배제에 기초한 생존력에 기초하여 선택된다. 이어서, 세포는 ALDH 활성에 대해 분석되고, 가장 양성인 상위 20%는 ALDH^높은 집단으로 선택되고, ALDH 활성이 가장 낮은 세포의 하위 20%는 ALDH가^낮은 것으로 간주되었다. 마지막으로, ALDH 저^세포의 50%는 CD44^저/-CD24⁺ 표현형에 기초하여 추가로 선택되고, ALDH^고 세포의 50%는 CD44⁺CD24^- 표현형에 기초하여 선택된다. 이 수치는 Chu et ^al.17에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: BCSC의 비율은 유방암 세포주마다 다릅니다. 그림 1에 설명된 바와 같이 표지 및 분류 후 (A) SUM159 및 (B) MDA-MD-468 삼중음성 유방암 세포주에서 BCSC와 비BCSC의 차등 비율을 보여주는 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 집락 형성 분석

1. 관심 있는 셀(5.11단계에서 정렬된 셀 또는 3.5 또는 4.5단계에서 정렬되지 않은 셀)을 전체 미디어에 다시 일시 중단합니다.
2. 1 x 10 2, 2 x 10 2 및 5 x 10² 셀에 대해 3개의 플로우 튜브에 라벨을 붙입니다. 2mL의 전체 배지를 추가하고 적절한 셀 번호(5.11단계에서 정렬된 세포 또는 3.5단계 또는 4.5단계에서 정렬되지 않은 세포)를 각 튜브에 옮깁니다. 세포 용액을 위아래로 5 번 피펫팅하여 완전히 혼합하십시오.
3. 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이치게 하여 세포 현탁액을 분배하여 세포의 균일한 분포를 얻습니다.
4. 플레이트를 콜로니가 나타날 때까지 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한다(여기서, 콜로니 = 콜로니 당 ≥50 세포). 식민지 형성을 방해하지 않고 일주일에 두 번 미디어를 조심스럽게 보충하십시오.
5. 배지를 흡입하고 1mL PBS로 한 번 세척합니다. 0.05% 크리스탈 바이올렛 용액 0.5mL를 각 웰에 넣고 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 2mL의 물로 씻어 과도한 크리스탈 바이올렛 얼룩을 제거하십시오. 배경 얼룩이 제거 될 때까지 세척 단계를 반복하십시오.
6. 4x 및 10x 배율의 현미경을 사용하여 생성된 콜로니의 총 수를 계수하고 기록합니다( 대표 이미지는 그림 3A에 표시됨).
7. 집락 형성 빈도를 다음과 같이 계산하십시오: 빈도(%) = (형성된 콜로니의 #/파종된 세포 수) x 100. 예를 들어, 1 x 10² 셀에서 25개의 콜로니가 생성되는 경우 콜로니 형성 빈도는 빈도 = (25/100) x100 = 25%입니다.
8. 또는 6.1-6.4 단계를 필요한 성장 및 생존 인자의 생산을 통해 BCSC에 대한 미세 환경 지원을 제공하는 섬유 아세포와의 공동 배양을 포함하는 대체 방법으로 대체하십시오.
9. I형 소 콜라겐(3mg/mL 콜라겐 희석액 30분의 1)으로 세포 60mm 배양 접시를 프리코팅합니다. 콜라겐이 37 ° C 인큐베이터에서 30 분 동안 중합되도록합니다. 중합되지 않은 콜라겐을 흡인하고 플레이트를 1x PBS로 2회 세척한다. 콜라겐 코팅 플레이트를 1mL의 PBS로 덮고 사용할 때까지 실온에서 따로 보관하십시오.
10. 1 x 10 3, 5 x 10 3 및 1 x 10⁴ 셀에 대해³개의 플로우 튜브에 라벨을 붙입니다. 콜로니 형성 분석 배지 4mL를 추가하고 적절한 수의 세포(5.11단계에서 정렬 또는 3.5 또는 4.5단계에서 정렬되지 않은 세포)를 각 튜브로 옮깁니다. 방사선 조사된 마우스 NIH3T3 섬유아세포(4 x 10⁴세포/mL의 배지)를 추가합니다. 세포 용액을 위아래로 5번 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
11. 단계 6.1로부터의 콜라겐-코팅된 배양 접시로부터 PBS를 흡인하고, 단계 6.3에 설명된 바와 같이 세포 혼합물을 각각의 세포 배양 접시 상에 플레이트화시킨다.
12. 플레이트를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 배양하고 배지를 보충하지 않고 7-10일 동안 또는 콜로니가 형성될 때까지 방해받지 않고 그대로 두십시오. 6.6 및 6.7단계에서 설명한 바와 같이 생성된 콜로니의 총 수를 계수하고 기록한다.

7. 유방권 분석

1. 관심 세포(5.11단계의 정렬된 세포 또는 3.5단계 또는 4.5단계의 정렬되지 않은 세포)를 완전한 유방권 배지에 재현탁하고 96웰 초저 부착 세포 배양 플레이트에서 5 x 10² cells/^cm2 영역의 파종 밀도로 세포를 플레이트합니다.
   참고: 세포 파종 밀도는 다른 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다.
2. 배양 플레이트를 5%_CO2가 있는 37°C 배양기에서 5-10일 동안 배양한다. 유방권 형성을 방해하지 않고 일주일에 두 번 조심스럽게 미디어를 보충하십시오.
3. 배양 후 현미경을 사용하여 각 웰에서 생성 된 유방 구의 수를 세십시오. 여기서 유방권은 직경이 100μm보다 큰 유방암 세포 클러스터로 정의됩니다 ( 그림 3B에 표시된 대표 이미지).
4. 유방권 형성 효율(MFE)을 다음과 같이 계산하십시오: MFE(%) = (웰당 유방권 수)/ (웰당 파종된 세포 수) x 100(즉, 웰에서 1 x 10² 개의 세포에 의해 5개의 유방권이 생성되는 경우 MFE = (5/100) x 100 = 5%).
5. 유방권을 계대배양하려면 유방권 내용물이 포함된 배지를 새로운 50mL 원추형 튜브와 1000 x g 의 원심분리 배지에 5분 동안 조심스럽게 옮깁니다. 상청액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 500μL의 트립신에 재현탁하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
6. 상청액을 버리고 펠릿을 완전한 유방권 배지 1mL에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 단계 7.1에 설명된 바와 같이 초저 부착 세포 배양 플레이트에 세포를 다시 플레이팅합니다.
   참고: 계대 배양 외에도 유방권 유래 세포를 FACS로 추가로 분석하여 BCSC 표현형을 평가하고/하거나 다른 다운스트림 분석을 위한 BCSC의 순수한 집단을 얻을 수도 있습니다.
7. 세포 집단 내에 포함된 유방권 개시 세포의 수를 확인하려면 구 제한 희석 분석(SLDA)과 관련된 대체 방법을 사용하십시오. 96웰 초저 부착 세포 배양 플레이트에서 높은 세포 수에서 낮은 세포 수의 연속 희석으로 세포를 플레이트화하며, 가장 높은 희석으로 웰당 1개 미만의 세포가 생성됩니다.
8. 배양 플레이트를 5%_CO2 가 있는 37°C 인큐베이터에서 10-14일 동안 배양하고 세포 응집을 피하기 위해 방해받지 않은 상태로 둡니다.
9. 배양 후 현미경을 사용하여 각 웰에서 생성 된 유방 구의 수를 세십시오. 여기서 유방권은 직경이 100μm보다 큰 유방암 세포 클러스터로 정의됩니다. 극한 제한 희석 분석(ELDA) 온라인 소프트웨어(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)를 사용하여 구체 시작 빈도와 유의성을 계산합니다.

8.3D 문화 모델

1. 실험 질문에 따라 성장 인자 (환원)가 있거나없는 기저막 추출물 (BME)을 사용하십시오. 암세포에 대한 개별 성장 인자의 효과를 평가하기 위해, 성장 인자 감소 BME를 사용하십시오. 또한 BME에 존재하는 내인성 성장 인자의 비특이적 효과를 최소화하는 데 도움이 됩니다.
   참고: BME는 10°C 이상에서 응고됩니다. 해동 단계에서도 항상 BME를 얼음 위에 두십시오.
2. 기포를 생성하지 않고 96웰 플레이트에 웰당 50μL의 BME를 조심스럽게 추가하고 37°C에서 1시간 동안 중합되도록 합니다. 10분 인큐베이션 후, 겔 층의 건조를 피하기 위해 100 μL PBS를 첨가한다.
3. 5.11단계의 분류된 세포 또는 3.5단계 또는 4.5단계의 분류되지 않은 세포를 3D 배양 배지에 5 x 10³ - 5 x 10⁴/200 μL의 농도로 재현탁합니다.
4. BME가 중합되면 PBS를 제거하고 각 웰에 200μL의 세포 현탁액을 추가하고 5%_CO2가 있는 37°C 인큐베이터에서 배양합니다. 배지의 증발을 방지하기 위해 주변 우물에 PBS를 추가하십시오.
   알림: 도금을 위한 최적의 셀 수는 실험을 설정하기 전에 결정해야 합니다. 실험 질문에 따라 BCSC는 단독으로 또는 다른 세포 유형 (섬유 아세포 / 내피 / 면역 세포 등)과 함께 배양 할 수 있습니다.
5. 매주 두 번 배양 플레이트에 신선한 배지를 추가합니다. 오가노이드의 형성을 분석하기 전에 10-14일 동안 배양물을 유지한다( 대표 이미지는 도 3C에 도시됨).
6. 계대 배양을 위해 배지를 조심스럽게 흡인하고 세포가 포함된 각 웰에 200μL의 디스파제를 추가합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 기간(30분)의 중간에 접시를 꺼내고 디스파제 용액을 위아래로 5회 부드럽게 피펫팅한 다음 인큐베이터에 다시 30분 동안 넣습니다.
7. 1 시간 후, 해리 된 세포 용액을 유동 튜브로 옮깁니다. 2% FBS(fPBS)를 함유하는 1x PBS로 웰을 세척하고 유동 튜브로 옮깁니다. 튜브를 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 흡인하고 500μL의 트립신을 넣고 37 °C에서 5 분 동안 배양합니다. 동일한 양의 fPBS를 추가하고 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 트립신을 비활성화합니다.
8. 상청액을 버리고 펠릿을 1mL의 3D 배양 배지에 재현탁합니다. 세포를 계수하고 단계 8.2 내지 8.4에서와 같이 BME에서 필요한 수의 세포를 다시 플레이트한다.
   참고: 관심 있는 세포 집단을 추가로 분석하거나 정렬하기 위해 여러 웰을 풀링할 수 있습니다.

그림 3: BCSC 세포 기능을 평가하기 위한 시험관 내 분석. 시험관내 분석은 프로토콜 섹션 6.1 내지 6.5(A), 7.1 내지 7.4(B), 또는 81에 기재된 바와 같이 수행하였다. 8.4 + 8.6 (C)로. (a) MDA-MB-231에 의해 생성된 콜로니를 나타내는 대표 이미지 인간 유방암 세포; (B) MCF7, SUM159 또는 MDA-MB-468 인간 세포주 및 환자 유래 LRCP17 유방암 세포에 의한 유방권 형성을 보여주는 대표 이미지. (C) 3D 배양 모델에서 MCF7 및 MDA-MB-231 유방암 세포에 의해 형성된 3D 구조를 보여주는 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

참고: 기관 동물 관리 위원회에서 승인한 동물 윤리 프로토콜에 따라 동물 실험을 수행합니다.

9. 생체 내 이종이식 모델

1. 유방암 줄기 세포의 종양 개시 능력을 결정하기 위해, 제한 희석 접근법을 사용하여 세포 (5.7 단계에서 분류 된 집단 또는 3.5 또는 4.5 단계에서 분류되지 않은 집단)를 준비한다. 1-0.2 x 10² cells/100 μL의 낮은 용량과 1 x 10⁶ cells/100 μL의 높은 용량으로 1-5개의 서로 다른 희석 그룹을 사용하여 PBS에서 세포를 연속 희석합니다.
   참고: 정렬되지 않은/전체 집단 세포를 대조군으로 사용할 수 있습니다. 사용되는 희석 그룹의 수는 원하는 과학적 결과에 따라 달라집니다 (예 : 종양 원성 만 테스트하는 경우 더 높은 세포 수의 1 그룹을 사용할 수 있지만 종양 시작 용량을 계산할 때 5 제한 희석 용량을 테스트하는 것이 가장 좋습니다).
2. 인간 유방암 세포에서 이종이식 모델을 생성하려면 면역이 손상된 암컷 마우스(무흉선 누드[nu/nu], 비비만 당뇨병/중증 복합 면역결핍[NOD/SCID] 또는 NOD/SCID IL2γ[NGS] 균주)를 사용하십시오.
   참고: 그룹당 최소 4마리의 동물을 사용할 수 있지만 특히 희석 분석을 제한하는 경우 강력한 결과를 얻으려면 그룹당 8-12마리를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 생물안전 캐비닛의 멸균 조건에서 각 세포 제제의 100μL/마우스를 사용하여 표준 유방 지방 패드(MFP) 주사를 수행합니다.
   알림: 최적의 유방 종양 성장과 먼 장기로의 자발적인 전이를 위해서는 흉부 MFP를 권장합니다. 대안적으로, 사타구니 MFP가 또한 사용될 수 있다.
4. 주사 후, 주사 부위의 일반적인 건강 및 종양 성장에 대해 매일 마우스를 모니터링합니다. 만져질 수 있는 종양이 발견되면 캘리퍼로 두 개의 수직 치수로 종양 크기를 측정하기 시작하고 종말점까지 매주 기록합니다.
   참고 : 실험 종료점은 제도적 동물 윤리 프로토콜에 명시된 규정에 따라 결정됩니다. 전형적으로, 안락사에 의한 종점은 종양 부피가 1500^mm3에 도달하면 일반적으로 요구된다. BCSC 집단 및/또는 더 높은 세포 용량(예: >1 x 104 세포)의 경우, 이 종점은 MFP 주입 후 4-8주 이내에 도달할 가능성이 높습니다. 매우 낮은 세포 용량 및/또는 비 BCSC 세포 집단의 경우 주사 후 최대 8개월 동안 종양 성장이 진행되도록 해야 합니다.
5. 이러한 측정에서 다음 공식을 사용하여 종양 부피를 계산하십시오 : mm³ 단위의 부피 = 0.52 x (너비)² x 길이. 제한 희석 접근법을 사용하는 경우 ELDA 온라인 소프트웨어(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)를 사용하여 종양 개시 용량과 유의성을 계산합니다.
6. 또는 종점을 인도적으로 확장하기 위해 외과적으로 원발성 종양을 제거하고 마우스의 건강 및/또는 먼 장기의 자발적 전이 발달을 계속 모니터링합니다. 연속 이종 이식의 생성을 위해 절제 된 종양 조직을 사용하십시오.
7. 종말점에서, 원발성 종양 및 먼 장기 (림프절, 폐, 간, 뇌, 뼈)로부터 조직을 채취하고, 조직병리학적 및/또는 면역조직화학적 분석을 수행하거나 종양 조직을 해리시키고, 섹션 6-8에 기술된 시험관내 분석에 사용한다.

설명 된 프로토콜은 세포주 또는 해리 된 종양 조직으로부터 유방암 세포의 이질적인 집단으로부터 인간 BCSC의 분리를 허용한다. 주어진 세포주 또는 조직 샘플에 대해, 특히 연구 목적이 BCSC를 표적으로 하는 치료제의 효능을 평가하는 것이라면 오염된 비 BCSC 집단이 다양한 세포 반응을 유발할 수 있으므로 BCSC를 최대 순도로 분리하기 위해 균일한 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 중요합니다. 엄격한 분류 전략을 적용하면 오염된 비 BCSC의 존재를 최소화하고 유방암 세포의 비율을 수집할 수 있습니다. 암세포의 대량 집단과 구별되는 세포 표현형을 나타내는 줄기 세포와 같은 특성을 가지고 있습니다. 향상된 ALDH 효소 활성을 나타내고, 높은 수준의 세포 표면 마커 CD44를 발현하고, CD24의 낮은/음성 발현을 나타내는 인간 유방암 세포는 ALDH높은CD44+CD24-표현형을 가지며 BCSC로 분류될 수 있습니다. 벌크 집단 내에서 BCSC의 비율은 세포주 또는 환자마다 다를 수 있으며(그림 2), 종종 질병 단계에 따라 달라지며, 더 공격적인 유방암은 일반적으로 BCSC26,36,37의 비율이 더 높습니다.

단리된 BCSC는 그들의 행동 및 기능이 벌크 및/또는 비-BCSC 집단의 그것과 비교될 수 있는 상이한 시험관 내 및 생체내 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 유방암 세포가 자가 재생하고 50개 세포의 콜로니를 생성하는 능력은 콜로니 형성 분석에 의해 평가할 수 있습니다(그림 3A). 앵커리지 독립적 실험 조건에서 BCSC가 자가 재생되는 능력은 유방권 분석으로 평가할 수 있으며, 여기서 가변 구 수, 크기 및 구 개시 용량을 분석하고 BCSC의 존재 및 기능과 상관시킬 수 있습니다(그림 3B). 최적의 결과를 얻으려면 다양한 유방암 세포주 또는 유방 종양 샘플에 대한 파종 세포 밀도를 결정하는 것이 중요합니다. SLDA를 수행할 때 세포 밀도가 높을수록 세포 응집이 발생하여 세포 활동을 잘못 해석할 수 있으므로 이는 특히 중요합니다.

BME에서 유방암 세포를 배양하면 BCSC가 생체 내 조건을 재현하는 3D 구조를 형성 할 수 있습니다 (그림 3C). 섬유아세포, 내피 세포 및/또는 면역 세포와 같은 다른 미세환경 세포 유형의 존재 하에 유방암 세포의 3D 배양은 BCSC 38,39의3D 성장에서 미세환경의 역할을 조사하기 위한 추가 능력을 갖는다. 3D 오가노이드를 생성하는 데 필요한 특정 세포 수는 세포주 또는 환자 종양 공급원에 따라 다를 수 있으므로 대규모 실험 전에 배양 조건과 세포 수를 최적화하는 것이 중요합니다.

마지막으로, 생체내 마우스 이종이식 모델을 사용하여 비-BCSC 또는 벌크 세포 집단과 비교하여 생체내 BCSC의 성장(그림 4) 자가 재생, 분화 및/또는 종양 개시 능력의 차이를 이해할 수 있습니다. 종종, 외인성 인자 또는 치료제의 존재 하에서 관찰된 시험관내 세포 반응은 생체내 설정을 대표하지 않으며, 이는 시험관내 관찰이 가능할 때마다 생체내 연구로 보완되어야 함을 시사 한다. 생체내 이종이식 모델을 사용하여, 세포 이질성 및 종양 구조가 보존되고, 따라서 이들 모델은 인간 환자의 미세환경을 밀접하게 모방하는 시스템으로서 기능할 수 있다. 생체 내 LDA는 주어진 혼합 암세포 집단(BCSC 또는 비-BCSC)에서 종양 개시 세포의 비율을 결정하기 위해 수행될 수 있습니다40,41. 사용되는 세포 희석의 범위는 최적화되어야 하며 관심 세포 집단에서 세포를 시작하는 빈도에 따라 달라집니다. 이상적으로 이러한 희석에는 100% 종양 형성을 초래하는 용량, 종양 형성이 없는 세포 용량 및 그 사이의 합리적인 범위가 포함되어야 합니다. 1차 샘플에서 종양 개시 세포의 빈도는 가변적일 수 있으며, 유방 종양의 수가 매우 적거나 종양 개시 세포의 이질적인 집단이 있는 경우 LDA를 수행하는 것이 특히 어려울 수 있습니다42. 이러한 경우 더 많은 수의 세포를 주입하는 것이 유방암 생물학을 이해하는 데 더 적합합니다.

그림 4: BCSC 기능을 평가하기 위한 생체 내 이종이식 분석. MDA-MB-231 유방암 세포를 도 1에 기재된 바와 같이 FACS에 의해 분리하고, 프로토콜 섹션 9.1 내지 9.8(5 x 105 세포/마우스; 4 마우스/세포 집단)에 기재된 바와 같이 암컷 NSG 마우스의 오른쪽 흉부 유방 지방 패드에 주사하였다. 원발성 유방 종양 성장 동역학은 ALDHhiCD44+CD24-(■) 대 ALDH 저CD44저/-CD24+(□) 집단에 대해 나타난다. 데이터는 동일한 시점에서 각각의 ALDH 저±CD44저/- 하위세트보다 유의하게 상이한 종양 크기 평균으로 표현된다 (P<0.05). 이 수치는 Croker et al.26에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없습니다.