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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Published: October 2, 2020 doi: 10.3791/61775
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Western University, 3Department of Oncology, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Dieses experimentelle Protokoll beschreibt die Isolierung von BCSCs aus Brustkrebszell- und Gewebeproben sowie die in vitro und in vivo Assays, die zur Beurteilung des BCSC-Phänotyps und der BCSC-Funktion verwendet werden können.

Abstract

Brustkrebsstammzellen (BCSCs) sind Krebszellen mit vererbten oder erworbenen stammzellähnlichen Eigenschaften. Trotz ihrer geringen Häufigkeit tragen sie wesentlich zur Entstehung, zum Rückfall, zur Metastasierung und zur Therapieresistenz von Brustkrebs bei. Es ist unerlässlich, die Biologie von Brustkrebsstammzellen zu verstehen, um neue therapeutische Ziele zur Behandlung von Brustkrebs zu identifizieren. Brustkrebsstammzellen werden isoliert und charakterisiert, basierend auf der Expression einzigartiger Zelloberflächenmarker wie CD44, CD24 und der enzymatischen Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDH). Diese ALDHHighCD44+CD24- Zellen bilden die BCSC-Population und können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) für nachgeschaltete funktionelle Studien isoliert werden. Je nach wissenschaftlicher Fragestellung können unterschiedliche in vitro und in vivo Methoden verwendet werden, um die funktionellen Eigenschaften von BCSCs zu beurteilen. Hier stellen wir ein detailliertes experimentelles Protokoll zur Isolierung von humanen BCSCs sowohl aus heterogenen Populationen von Brustkrebszellen als auch aus primärem Tumorgewebe von Brustkrebspatientinnen zur Verfügung. Darüber hinaus heben wir nachgeschaltete In-vitro - und In-vivo-Funktionstests hervor, einschließlich koloniebildender Assays, Mammosphären-Assays, 3D-Kulturmodelle und Tumor-Xenograft-Assays, die zur Beurteilung der BCSC-Funktion verwendet werden können.

Introduction

Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen menschlicher Brustkrebsstammzellen (BCSCs) ist entscheidend, um die Herausforderungen bei der Brustkrebsbehandlung zu bewältigen. Die Entstehung des BCSC-Konzepts geht auf das frühe 21. Jahrhundert zurück, als eine kleine Population von CD44+CD24-/niedrigen Brustkrebszellen in der Lage war, heterogene Tumore in Mäusen zu erzeugen 1,2. Anschließend wurde beobachtet, dass menschliche Brustkrebszellen mit hoher enzymatischer Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDHhigh) ebenfalls ähnliche stammzellähnliche Eigenschaften aufwiesen3. Diese BCSCs stellen eine kleine Population von Zellen dar, die zur Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind, was zur heterogenen Natur von Massentumoren beiträgt 1,2,3. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen in evolutionär konservierten Signalwegen das Überleben und die Aufrechterhaltung von BCSC vorantreiben 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die extrinsische Mikroumgebung der Zelle eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung verschiedener BCSC-Funktionen spielt15,16,17. Diese molekularen Signalwege und die externen Faktoren, die die BCSC-Funktion regulieren, tragen zum Rückfall von Brustkrebs, zur Metastasierung18 und zur Entwicklung von Therapieresistenzen bei 19,20,21, wobei die Restexistenz von BCSCs nach der Behandlung eine große Herausforderung für das Gesamtüberleben von Brustkrebspatientinnen darstellt22,23 . Die präklinische Bewertung dieser Faktoren ist daher sehr wichtig, um BCSC-zielgerichtete Therapien zu identifizieren, die für bessere Behandlungsergebnisse und ein verbessertes Gesamtüberleben bei Brustkrebspatientinnen von Vorteil sein könnten.

Mehrere in vitro menschliche Brustkrebs-Zelllinienmodelle und in vivo menschliche Xenograft-Modelle wurden verwendet, um BCSCs 24,25,26,27,28,29 zu charakterisieren. Die Fähigkeit von Zelllinien, sich nach jeder nachfolgenden Passage kontinuierlich neu zu besiedeln, macht diese zu einem idealen Modellsystem für die Durchführung von Omics-basierten und pharmakogenomischen Studien. Zelllinien können jedoch die in Patientenproben beobachtete Heterogenität oft nicht rekapitulieren. Daher ist es wichtig, Zellliniendaten mit Patientenproben zu ergänzen. Die Isolierung von BCSCs in ihrer reinsten Form ist wichtig, um eine detaillierte Charakterisierung von BCSCs zu ermöglichen. Das Erreichen dieser Reinheit hängt von der Auswahl der phänotypischen Marker ab, die für BCSCs spezifisch sind. Derzeit wird der ALDH-Zellphänotypmit hohemCD44+CD24-Zellgehalt am häufigsten verwendet, um humane BCSCs aus Massen-Brustkrebszellpopulationen zu unterscheiden und zu isolieren, wobei Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für maximale Reinheit verwendet wird 1, 3,26. Darüber hinaus können die Eigenschaften isolierter BCSCs wie Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung mit in vitro und in vivo Techniken bewertet werden.

Zum Beispiel können In-vitro-Koloniebildungsassays verwendet werden, um die Fähigkeit einer einzelnen Zelle zu beurteilen, sich selbst zu erneuern, um eine Kolonie von 50 Zellen oder mehr bei unterschiedlichen Behandlungsbedingungen zu bilden30. Mammosphären-Assays können auch verwendet werden, um das Selbsterneuerungspotenzial von Brustkrebszellen unter verankerten Bedingungen zu beurteilen. Dieser Assay misst die Fähigkeit einzelner Zellen, bei jeder nachfolgenden Passage unter serumfreien, nicht adhärenten Kulturbedingungen als Kugeln (Mischung aus BCSCs und Nicht-BCSCs) zu erzeugen und zu wachsen31. Darüber hinaus können 3-dimensionale (3D) Kulturmodelle verwendet werden, um die BCSC-Funktion zu bewerten, einschließlich Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, die die In-vivo-Mikroumgebung genau rekapitulieren und die Untersuchung der Aktivität potenzieller BCSC-zielgerichteter Therapien ermöglichen32. Trotz der vielfältigen Anwendungen von In-vitro-Modellen ist es schwierig, die Komplexität von In-vivo-Bedingungen nur mit In-vitro-Assays zu modellieren. Diese Herausforderung kann durch die Verwendung von Maus-Xenograft-Modellen zur Bewertung des BCSC-Verhaltens in vivo überwunden werden. Insbesondere dienen solche Modelle als ideales System zur Beurteilung der Brustkrebsmetastasierung33, zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung während des Krankheitsverlaufs 34, zur In-vivo-Bildgebung 35 und zur Vorhersage der patientenspezifischen Toxizität und Wirksamkeit von Antitumorwirkstoffen 34.

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung für die Isolierung von humanen ALDHhohenCD44+CD24- BCSCs in maximaler Reinheit aus Massenpopulationen heterogener Brustkrebszellen. Wir bieten auch eine detaillierte Beschreibung von drei In-vitro-Techniken (koloniebildender Assay, Mammosphärentest und 3D-Kulturmodell) und einen In-vivo-Tumor-Xenograft-Assay, der zur Beurteilung verschiedener Funktionen von BCSCs verwendet werden kann. Diese Methoden wären für Forscher geeignet, die an der Isolierung und Charakterisierung von BCSCs aus menschlichen Brustkrebszelllinien oder primär von Patienten abgeleiteten Brustkrebszellen und Tumorgewebe interessiert sind, um die BCSC-Biologie zu verstehen und/oder neuartige BCSC-zielgerichtete Therapien zu untersuchen.

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Protocol

Die Entnahme von chirurgischen oder Biopsieproben von Patienten, die direkt von einwilligenden Brustkrebspatientinnen stammten, wurde nach einem genehmigten humanethischen Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Ethic Board genehmigt wurde. Alle Mäuse, die zur Erstellung von von Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen verwendet wurden, wurden gepflegt und in einer von der Institution zugelassenen Tiereinrichtung untergebracht. Das Tumorgewebe aus patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen mit Mäusen wurde gemäß dem genehmigten Ethikprotokoll generiert, das vom institutionellen Tierpflegeausschuss genehmigt wurde.

1. Präparation von Zelllinien

  1. Führen Sie alle Zellkultur- und Färbevorgänge unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank durch. Verwenden Sie sterile Zellkulturschalen/-kolben und Reagenzien.
  2. Halten Sie menschliche Brustkrebszellen bei 37 °C mit 5% CO2 in definierten Medien, ergänzt mit fetalem Rinderserum (FBS) und notwendigen Wachstumsfaktoren, die für jede Zelllinie spezifisch sind.
  3. NIH3T3-Fibroblastenzellkulturen der Maus (zur Verwendung in koloniebildenden Assays) bei 37 °C mit 5%CO2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10% FBS.
  4. Für alle Kulturen, füllen Sie die alten Medien alle 2-3 Tage mit frischen Medien auf. Sobald die Kulturen 75-80% Konfluenz erreicht haben, Subkultur in mehrere sterile Zellkulturkolben.

2. Vorbereitung von Brustkrebs-Tumorgewebe

  1. Sammeln Sie die vom Patienten abgeleiteten chirurgischen oder Biopsieproben direkt von einwilligenden Brustkrebspatientinnen im Rahmen eines vom institutionellen Ethikrat genehmigten Humanethikprotokolls.
  2. Anschließend sammeln und generieren Sie Tumorgewebe aus patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen unter Verwendung von Mäusen unter einem vom institutionellen Tierpflegeausschuss genehmigten Tierethikprotokoll.
  3. Sammeln Sie alle Tumorgewebe unter sterilen Bedingungen in ein 50 ml steriles konisches Röhrchen mit 30 ml DMEM:F12-Medien, halten Sie es auf Eis und verarbeiten Sie die Proben wie unten beschrieben innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme.

3. Erzeugung von Einzelzellsuspensionen von Brustkrebszellen

  1. Asspirieren Sie Medien aus dem Kolben, der eine Monoschicht von Brustkrebszellen enthält, die zu 60-80% konfluent ist (Zelllinien Ihrer Wahl). Waschen Sie die Zellen mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). PBS absaugen und geeignete Zelldissoziationslösung hinzufügen (z. B. Trypsin:EDTA; gerade genug, um die Monoschicht der Zellen zu bedecken) und 5 min bei Raumtemperatur (empfohlen) oder bei 37 °C inkubieren.
  2. Fügen Sie 5 ml Kulturmedien hinzu, um die Aktivität der Zelldissoziationslösung zu neutralisieren.
  3. Die resultierende dissoziierte Zelllösung wird in ein 50 mL konisches Röhrchen überführt und bei 1000 x g für 5 min zentrifugiert.
  4. Überstand verwerfen und das Zellpellet in 5 ml 1x PBS resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und einem Mikroskop.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Zellverklumpung im Hämozytometer. Wiederholen Sie den Zelldissoziationsschritt, wenn sich keine Einzelzellsuspension gebildet hat.
  5. Nach der Zellzählung die Zellsuspension bei 1000 x g für 5 min neu zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Zellpellet im ALDH-Substratpuffer in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen / ml resuspendieren.

4. Erzeugung einer Einzelzellsuspension aus Gewebeproben

  1. Zerkleinern Sie das Tumorgewebe mit chirurgischen Klingen in einer Kreuztechnik, um kleinere Stücke von etwa 1 mm Größe zu erhalten. Die Gewebestücke werden in ein frisches 50 ml konisches Röhrchen mit 10 mL Dissoziationspuffer (1X Kollagenase in DMEM:F12) überführt. Das konische Röhrchen mit Parafilm verschließen und bei 37 °C in einem Schüttelbrutschrank 40 min inkubieren.
    HINWEIS: Wenn kein Shaker-Inkubator vorhanden ist, legen Sie das Röhrchen in ein 37 °C warmes Wasserbad und mischen Sie das Röhrchen alle 5-10 Minuten.
  2. Pelletieren Sie das verdaute Gewebe durch Zentrifugieren der Probe bei 530 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml Trypsin hinzu. Pipettieren Sie mit einer 1-ml-Pipette (eingestellt auf 750 μL), um das Pellet zu stören, und inkubieren Sie 5 Minuten lang in einem 37 °C-Wasserbad. Nach der Inkubation pipetten Sie kräftig auf und ab, um einzelne Zellen freizusetzen.
  3. Das Gesamtvolumen im Röhrchen mit DMEM:F12-Medien auf 25 mL auffüllen und bei 1000 x g für 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Dispase-DNase-Lösung. In einem 37 °C warmen Wasserbad 5 min inkubieren.
  4. Füllen Sie das Gesamtvolumen in der Röhre mit PBS auf 10 ml auf. Mischen Sie durch Pipettieren auf und ab, führen Sie die resultierende Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb, das an einem frischen 50-ml-konischen Röhrchen befestigt ist. Zentrifugieren bei 1000 x g für 5 min.
  5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml 1x PBS. Zählen Sie die Zellen und schließen Sie die Herstellung der Zellsuspension gemäß den Schritten 3.4 und 3.5 ab.

5. Isolierung von Brustkrebsstammzellen (BCSCs)

  1. Label-Durchflussröhrchen für die ungefärbte Kontrolle, einzellige Färbekontrollen (DEAB-Kontrolle, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), das Negativkontrollröhrchen (gefärbt mit DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 und 7AAD), fluoreszierende minus eins (FMO) Kontrolle und die Sortierröhre (gefärbt mit ALDH, CD44, CD24 und 7AAD).
  2. Übertragen Sie 500 μL (0,5 x 106 Zellen) der Zellsuspensionen aus Schritt 3.5 oder Schritt 4.5 in jedes Röhrchen, das nur als Zellen gekennzeichnet ist, CD44, CD24 und 7AAD. Legen Sie die Röhrchen bis zum Gebrauch auf Eis.
  3. 2 ml Probe (2 x 106 Zellen) in das entsprechende ALDH-Röhrchen überführen. Fügen Sie 5 μL DEAB in die "DEAB-Kontroll"- und "Negativkontrollröhrchen" hinzu und verschließen Sie sie fest. Fügen Sie 10 μL ALDH-Substrat in die ALDH-Röhre hinzu, mischen Sie gut durch Wirbeln und übertragen Sie sofort 500 μL in die entsprechenden "DEAB-Kontrollröhrchen" und "Negativkontrollröhrchen". Rekapitulieren Sie die "DEAB-Kontrolle", "Negativkontrolle" und "ALDH-Röhrchen" und inkubieren Sie bei 37 °C für 30-60 min (nicht mehr als 60 Minuten).
    HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit kann je nach Zelllinie optimiert werden müssen. Schützen Sie das ALDH-Substrat und die Röhrchen mit gefärbten Zellen immer vor Licht.
  4. Nach der Inkubation alle Proben für 5 min bei 250 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL ALDH-Substratpuffer. Fügen Sie die vom Hersteller empfohlene oder benutzeroptimierte Konzentration des Anti-CD44-PE- und Anti-CD24-PE-Cy7-Antikörpercocktails hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C für 30 min. Fügen Sie Anti-CD44-PE- und Anti-CD24-PE-Cy7-Antikörper zu den jeweils mit "CD44" und "CD24" markierten Röhrchen hinzu.
  5. Nach der Inkubation alle Proben bei 250 x g für 5 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL ALDH-Substratpuffer. Inkubieren Sie das "Negativkontrollröhrchen", das "Sortierröhrchen" und das "7ADD"-Röhrchen mit 7AAD (empfohlene Konzentration: 0,25 μg/1 x 106 Zellen) für 10 min auf Eis.
    HINWEIS: Die ALDH-Aktivität wird im grün fluoreszierenden Kanal nachgewiesen, daher sollte ein Fluorochrom mit einem anderen kompatiblen Emissionsspektrum verwendet werden. Wenn während der Multiparameter-Durchflusszytometrie eine spektrale Überlappung beobachtet wird, sollten Einzelfarbkontrollen und FMO-Steuerung als Leitfaden verwendet werden, um eine Kompensation zwischen Fluorochromen zu ermöglichen, um das Übergreifen des Fluoreszenzsignals in andere Kanäle zu minimieren.
  6. Richten Sie das Analyseprotokoll auf dem FACS-Gerät ein, um die Probenanalyse vorzubereiten. Erstellen Sie Streudiagramme (Vorwärts- vs. Seitenstreuung, Vorwärtsstreuung vs. Fluoreszenzkanäle).
  7. Stellen Sie mit dem ungefärbten Steuerelement den Photomultiplier ein, um Trümmer von der gesamten Zellpopulation zu trennen, und passen Sie die Fluoreszenzspannung an, um die gesamte Zellpopulation um die erste logarithmische Skala zu bewegen (101). Bewegen Sie mit der DEAB-Steuerung die gesamte Zellpopulation innerhalb der zweiten Log-Skala (102), indem Sie den grün fluoreszierenden Spannungskanal anpassen.
  8. Analysieren Sie zuerst alle einzelnen Färbekontrollen (ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7) und 7AAD- und FMO-Steuerung, indem Sie die Spannung anpassen, um gefärbte von nicht gefärbten Zellen zu trennen und das Verschütten von fluoreszierenden Signalen in andere Kanäle zu minimieren.
  9. Gate auf die positive Population für jede einzelne gefärbte Zellprobe. Verwendung des Negativkontrollröhrchens, Gate für Lebensfähigkeit (7AAD negativ), ALDHniedrige und ALDHhohe Zellpopulationen (repräsentative Gating-Strategie in Abbildung 1B gezeigt).
  10. Analysieren Sie gefärbte Proben mit mehreren Parametern, um BCSCs zu isolieren. Wählen Sie unter Verwendung der lebensfähigen ALDHLow und ALDHHigh Gates die Zellpopulation CD44+CD24- (BCSC) bzw. CD44-CD24+ (Nicht-BCSC) aus (Abbildung 1B).
  11. Sammeln Sie lebensfähige BCSCs und Nicht-BCSCs in Sammelmedien in sterilen Sammelröhrchen (Populationen aus zwei repräsentativen Zelllinien, die in Abbildung 2A&B gezeigt sind). Verwenden Sie sortierte Zellen für nachgeschaltete In-vitro- und In-vivo-Assays, wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Zusätzlich zu den unten beschriebenen In-vitro- und In-vivo-Assays können BCSCs durch Messung der Expression pluripotenter Marker wie SOX2, OCT4 und NANOG mittels Standard-Immunoblotting-Techniken validiert werden.

Figure 1
Abbildung 1: FACS-Gating-Strategie zur Isolierung von BCSCs aus Brustkrebszelllinien und Gewebeproben. (A) Flussdiagramm, das das Verfahren der BCSC-Isolierung beschreibt. (B) Repräsentative FACS-Diagramme, die die Sortierstrategie zur Isolierung lebensfähiger BCSCs und Nicht-BCSCs aus einem heterogenen Zellpool zeigen. MDA-MB-231 menschliche Brustkrebszellen werden gleichzeitig mit 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE und dem ALDH-Substrat markiert. Zelluntergruppen wurden unter Verwendung eines Vierfarbprotokolls auf einer FACS-Maschine isoliert. Die Zellen werden basierend auf der erwarteten Lichtstreuung ausgewählt, dann für Singuletts und Lebensfähigkeit basierend auf 7-AAD-Ausschluss. Die Zellen werden dann auf ALDH-Aktivität analysiert und die besten 20% positivsten werden alsALDH-hohe Population ausgewählt, während die unteren 20% der Zellen mit der niedrigsten ALDH-Aktivität als ALDH-niedrig eingestuft wurden. Schließlich werden 50% der ALDH-Low-Zellen basierend auf einem CD44-Low/-CD24+-Phänotyp und 50% der ALDH-High-Zellen basierend auf dem CD44+CD24-Phänotyp ausgewählt. Diese Abbildung wurde von Chu et al.17 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: BCSC-Anteile sind in verschiedenen Brustkrebszelllinien variabel. Repräsentatives Bild, das den unterschiedlichen Anteil von BCSCs und Nicht-BCSCs in (A) SUM159 und (B) MDA-MD-468 dreifach negativen Brustkrebszelllinien nach Markierung und Sortierung wie in Abbildung 1 beschrieben zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

6. Koloniebildender Assay

  1. Resuspendieren Sie die interessierenden Zellen (sortierte Zellen aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5) in vollständigen Medien.
  2. Beschriften Sie drei Durchflussrohre für 1 x 10 2, 2 x 10 2 und 5 x 102 Zellen. Fügen Sie 2 ml komplettes Medium hinzu und übertragen Sie die entsprechende Zellnummer (sortiert aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5) in die entsprechenden Röhrchen. Mischen Sie die Zelllösungen gründlich, indem Sie sie 5 Mal auf und ab pipettieren.
  3. Platten Sie die Zellen in eine 6-Well-Platte und verteilen Sie die Zellsuspension, indem Sie die Platten vorsichtig schwenken, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erhalten.
  4. Die Platten werden in einem Inkubator mit 5 %CO2 bei 37 °C inkubiert, bis Kolonien entstehen (wobei Kolonien = ≥50 Zellen pro Kolonie) auftreten. Füllen Sie die Medien zweimal pro Woche sorgfältig auf, ohne die Koloniebildung zu stören.
  5. Medien absaugen und einmal mit 1 ml PBS waschen. 0,5 ml 0,05% kristallviolette Lösung in jede Vertiefung geben und die Platte 30 Minuten lang inkubieren. Entfernen Sie überschüssige kristallviolette Flecken, indem Sie sie mit 2 ml Wasser waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt, bis die Hintergrundflecken entfernt wurden.
  6. Zählen und notieren Sie mit einem Mikroskop mit 4-facher und 10-facher Vergrößerung die Gesamtzahl der erzeugten Kolonien (repräsentative Bilder in Abbildung 3A).
  7. Berechnen Sie die Häufigkeit der Koloniebildung wie folgt: Häufigkeit (%) = (# der gebildeten Kolonien/Anzahl der ausgesäten Zellen) x 100. Wenn beispielsweise 25 Kolonien aus 1 x 102 Zellen erzeugt werden, dann ist die Häufigkeit der Koloniebildung, Frequenz = (25/100) x100 = 25%.
  8. Alternativ können die Schritte 6.1 bis 6.4 durch eine alternative Methode ersetzt werden, die eine Kokultur mit Fibroblasten umfasst, die eine mikroökologische Unterstützung für BCSCs durch die Produktion notwendiger Wachstums- und Überlebensfaktoren bieten.
  9. Vorbeschichtung von 60 mm Kulturschalen mit Rinderkollagen Typ I (1 zu 30 Verdünnung von 3 mg/ml Kollagen). Lassen Sie Kollagen 30 Minuten in einem 37 °C Inkubator polymerisieren. Das unpolymerisierte Kollagen absaugen und die Platte zweimal mit 1x PBS waschen. Decken Sie die kollagenbeschichtete Platte mit 1 ml PBS ab und stellen Sie sie bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur beiseite.
  10. Beschriften Sie drei Durchflussrohre für 1 x 10 3, 5 x 103 und 1 x 104 Zellen. Fügen Sie 4 ml koloniebildendes Assay-Medium hinzu und überführen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen (sortiert aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5) in die entsprechenden Röhrchen. Fügen Sie bestrahlte NIH3T3-Fibroblasten der Maus hinzu (4 x 104 Zellen/ml Medien). Mischen Sie Zelllösungen gründlich, indem Sie sie 5 Mal auf und ab pipettieren.
  11. Das PBS wird aus der kollagenbeschichteten Kulturschale aus Schritt 6.1 abgesaugt und die Zellmischung wie in Schritt 6.3 beschrieben auf jede der Zellkulturplatten aufgetragen.
  12. Inkubieren Sie die Platten in einem 37 °C, 5% CO2 -Inkubator und lassen Sie sie 7-10 Tage ungestört oder bis sich Kolonien bilden, ohne das Medium aufzufüllen. Zählen und notieren Sie die Gesamtzahl der generierten Kolonien, wie in den Schritten 6.6 und 6.7 beschrieben.

7. Mammosphären-Assay

  1. Resuspendieren Sie die interessierenden Zellen (sortierte Zellen aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5) in kompletten Mammosphärenmedien und Plattenzellen mit einer Seedingdichte von 5 x 10 2 Zellen/cm2 Fläche in einer 96 Well-Ultra-Low-Attachment-Zellkulturplatte.
    HINWEIS: Die Zellaussaatdichte sollte für verschiedene Zelllinien optimiert werden.
  2. Die Kulturplatten 5-10 Tage in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2 inkubieren. Füllen Sie die Medien zweimal pro Woche vorsichtig auf, ohne die Mammosphärenbildung zu stören.
  3. Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Mammosphären, die in jeder Vertiefung mit einem Mikroskop erzeugt werden. wobei Mammosphären als Brustkrebszellcluster mit einem Durchmesser von mehr als 100 μm definiert sind (repräsentative Bilder in Abbildung 3B).
  4. Berechnen Sie die Mammosphärenbildungseffizienz (MFE) wie folgt: MFE (%) = (Anzahl der Mammosphären pro Vertiefung)/ (Anzahl der pro Vertiefung ausgesäten Zellen) x 100 (d.h. wenn 5 Mammosphären von 1 x 102 Zellen in einem Well erzeugt werden, dann MFE = (5/100) x 100 = 5%).
  5. Um Mammosphären zu subkulturieren, geben Sie die Medien mit Mammosphäreninhalt vorsichtig in ein frisches 50 ml konisches Röhrchen und Zentrifugenmedien bei 1000 x g für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL Trypsin und inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml komplettem Mammosphärenmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und legen Sie die Zellen wie in Schritt 7.1 beschrieben in einer Zellkulturplatte mit extrem niedriger Bindung neu an.
    HINWEIS: Zusätzlich zur Subkulturierung können die aus der Mammosphäre gewonnenen Zellen auch weiter von FACS analysiert werden, um den BCSC-Phänotyp zu bewerten und/oder reine Populationen von BCSCs für andere nachgeschaltete Assays zu erhalten.
  7. Um die Anzahl der Mammosphären-initiierenden Zellen in Ihren Zellpopulationen zu bestimmen, verwenden Sie eine alternative Methode mit kugelbegrenzender Verdünnungsanalyse (SLDA). Plattenzellen in seriellen Verdünnungen von hohen bis niedrigen Zellzahlen in einer 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Zellkulturplatte, wobei die höchste Verdünnung zu weniger als einer Zelle pro Vertiefung führt.
  8. Die Kulturplatte 10-14 Tage in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2 inkubieren und ungestört lassen, um eine Zellaggregation zu vermeiden.
  9. Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Mammosphären, die in jeder Vertiefung mit einem Mikroskop erzeugt werden. wobei Mammosphären als Brustkrebszellcluster mit einem Durchmesser von mehr als 100 μm definiert sind. Berechnen Sie die Häufigkeit und Signifikanz der Kugel mit der Online-Software Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).

8.3D Kulturmodell

  1. Je nach experimenteller Fragestellung Basalmembranextrakt (BME) mit oder ohne Wachstumsfaktoren (reduziert) verwenden. Um die Wirkung des individuellen Wachstumsfaktors auf Krebszellen zu bewerten, verwenden Sie einen reduzierten BME. Es hilft auch bei der Minimierung der unspezifischen Auswirkungen endogener Wachstumsfaktoren, die bei BME vorhanden sind.
    HINWEIS: BME erstarrt über 10 °C. Halten Sie BME auch während des Auftauschritts immer auf Eis.
  2. Geben Sie vorsichtig 50 μL BME pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte, ohne Luftblasen zu erzeugen, und lassen Sie sie 1 h lang bei 37 °C polymerisieren. Nach 10 Minuten Inkubation 100 μL PBS hinzufügen, um ein Austrocknen der Gelschicht zu vermeiden.
  3. Resuspendieren Sie die sortierten Zellen aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5 in einer Konzentration von 5 x 103 bis 5 x 104/200 μL in 3D-Kulturmedien.
  4. Sobald der BME polymerisiert ist, entfernen Sie PBS, geben Sie 200 μL Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie im 37 °C Inkubator mit 5%CO2. Fügen Sie PBS zu den umliegenden Bohrlöchern hinzu, um eine Verdunstung der Medien zu vermeiden.
    HINWEIS: Die optimale Anzahl von Zellen für die Beschichtung sollte vor dem Einstellen des Experiments bestimmt werden. Je nach experimenteller Fragestellung können BCSCs allein oder mit anderen Zelltypen (Fibroblasten/Endothel-/Immunzellen etc.) kultiviert werden.
  5. Zweimal wöchentlich frische Medien auf die Kulturteller geben. Pflegen Sie Kulturen für 10-14 Tage, bevor Sie die Bildung von Organoiden analysieren (repräsentative Bilder in Abbildung 3C).
  6. Für die Subkulturierung saugen Sie die Medien vorsichtig ab und fügen Sie 200 μL Dispase in jede Vertiefung enthaltende Zelle hinzu. Die Platte in einem 37 °C Inkubator für 1 h inkubieren. Nach der Hälfte der Inkubationszeit (30 min) nehmen Sie die Platte heraus, pipetten Sie die Dispaselösung vorsichtig 5 Mal auf und ab und legen Sie sie für weitere 30 Minuten wieder in den Inkubator.
  7. Nach 1 h wird die dissoziierte Zelllösung in ein Flussrohr überführt. Waschen Sie den Brunnen mit 1x PBS mit 2% FBS (fPBS) und geben Sie es in das Durchflussrohr. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1000 x g für 5 min. Den Überstand vorsichtig absaugen und 500 μL Trypsin hinzufügen, bei 37 °C 5 min inkubieren. Inaktivieren Sie Trypsin durch Zugabe der gleichen Menge fPBS und Zentrifuge bei 1000 x g für 5 min.
  8. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml 3D-Kulturmedien. Zählen Sie die Zellen und legen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen im BME wie in den Schritten 8.2 bis 8.4 neu an.
    HINWEIS: Mehrere Vertiefungen können zusammengefasst werden, um die interessierende Zellpopulation weiter zu analysieren oder zu sortieren.

Figure 3
Abbildung 3: In-vitro-Assays zur Beurteilung der BCSC-Zellfunktion. In-vitro-Assays wurden wie in den Protokollabschnitten 6.1 bis 6.5 (A), 7.1 bis 7.4 (B) oder 81 beschrieben durchgeführt. auf 8,4 + 8,6 (C). (A) Repräsentatives Bild, das die von menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231 erzeugten Kolonien zeigt; (B) Repräsentative Bilder, die die Mammosphärenbildung durch menschliche MCF7-, SUM159- oder MDA-MB-468-Zelllinien sowie von Patienten abgeleitete LRCP17-Brustkrebszellen zeigen. (C) Repräsentative Bilder, die die 3D-Strukturen zeigen, die von MCF7- und MDA-MB-231-Brustkrebszellen in 3D-Kulturmodellen gebildet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

HINWEIS: Führen Sie Tierversuche unter einem Tierethikprotokoll durch, das vom institutionellen Tierpflegekomitee genehmigt wurde.

9. In vivo Xenograft-Modell

  1. Um die Tumorinitiationskapazität von Brustkrebsstammzellen zu bestimmen, bereiten Sie die Zellen (sortierte Population aus Schritt 5.7 oder unsortierte Populationen aus Schritt 3.5 oder 4.5) unter Verwendung eines begrenzenden Verdünnungsansatzes vor. Zellen in PBS werden seriell mit 1 bis 5 verschiedenen Verdünnungsgruppen verdünnt, mit Dosen von nur 0,01-0,2 x 102 Zellen/100 μL und bis zu 1 x 106 Zellen/100 μL.
    HINWEIS: Unsortierte/ganze Populationszellen können als Kontrolle verwendet werden. Die Anzahl der verwendeten Verdünnungsgruppen hängt vom gewünschten wissenschaftlichen Ergebnis ab (z. B. wenn nur die Tumorgenität getestet wird, kann 1 Gruppe mit einer höheren Zellzahl verwendet werden, während es bei der Berechnung der Tumorinitiierungskapazität optimal ist, 5 limitierende Verdünnungsdosen zu testen).
  2. Um Xenograft-Modelle aus menschlichen Brustkrebszellen zu generieren, verwenden Sie immungeschwächte weibliche Mäuse (athymische nackte [nu/nu], nicht-adipöse Diabetiker/schwere kombinierte immundefiziente [NOD/SCID] oder NOD/SCID IL2γ [NGS] Stämme).
    HINWEIS: Obwohl mindestens 4 Tiere pro Gruppe verwendet werden können, werden 8-12 Tiere pro Gruppe empfohlen, um robuste Ergebnisse zu erhalten, insbesondere zur Begrenzung der Verdünnungsanalyse.
  3. Führen Sie Standard-Brustfettpolster-Injektionen (MFP) mit 100 μl / Maus jeder Zellpräparation unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank durch.
    HINWEIS: Für ein optimales Brusttumorwachstum und spontane Metastasen in entfernte Organe wird der thorakale MFP empfohlen. Alternativ kann auch der Leisten-MFP verwendet werden.
  4. Überwachen Sie die Mäuse nach der Injektion täglich auf den allgemeinen Gesundheitszustand und das Tumorwachstum an der Injektionsstelle. Nach Erkennung eines tastbaren Tumors beginnen Sie mit der Messung der Tumorgröße durch Messschieber in zwei senkrechten Dimensionen und zeichnen Sie wöchentlich bis zum Endpunkt auf.
    HINWEIS: Der experimentelle Endpunkt wird auf der Grundlage der Vorschriften des institutionellen Tierethikprotokolls festgelegt. Typischerweise ist ein Endpunkt durch Euthanasie in der Regel erforderlich, sobald das Tumorvolumen 1500 mm3 erreicht. Bei BCSC-Populationen und/oder höheren Zelldosen (z. B. >1 x 104 Zellen) wird dieser Endpunkt wahrscheinlich innerhalb von 4-8 Wochen nach MFP-Injektion erreicht. Bei sehr niedrigen Zelldosen und/oder Nicht-BCSC-Zellpopulationen sollte das Tumorwachstum bis zu 8 Monate nach der Injektion fortschreiten dürfen.
  5. Aus diesen Messungen berechnen Sie das Tumorvolumen mit der folgenden Formel: Volumen in mm3 = 0,52 x (Breite)2 x Länge. Wenn Sie einen begrenzenden Verdünnungsansatz verwenden, berechnen Sie die tumorinitiierende Kapazität und Signifikanz mit der ELDA-Online-Software (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).
  6. Alternativ, um den Endpunkt human zu erweitern, entfernen Sie chirurgisch Primärtumoren und überwachen Sie weiterhin Mäuse auf Gesundheit und/oder Entwicklung von spontanen Metastasen in entfernten Organen. Verwenden Sie reseziertes Tumorgewebe für die Erzeugung von seriellen Xenotransplantaten.
  7. Am Endpunkt Gewebe von Primärtumoren und entfernten Organen (Lymphknoten, Lunge, Leber, Gehirn, Knochen) entnehmen und histopathologische und/oder immunhistochemische Analysen durchführen oder das Tumorgewebe dissoziieren und in den in den Abschnitten 6-8 beschriebenen In-vitro-Assays verwenden.

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Representative Results

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung humaner BCSCs aus einer heterogenen Population von Brustkrebszellen, entweder aus Zelllinien oder aus dissoziiertem Tumorgewebe. Für jede gegebene Zelllinie oder Gewebeprobe ist es entscheidend, eine einheitliche Einzelzellsuspension zu erzeugen, um BCSCs mit maximaler Reinheit zu isolieren, da die Kontamination von Nicht-BCSC-Populationen zu variablen zellulären Reaktionen führen könnte, insbesondere wenn das Studienziel darin besteht, die Wirksamkeit von Therapeutika zu bewerten, die auf BCSCs abzielen. Die Anwendung einer strengen Sortierstrategie minimiert das Vorhandensein kontaminierender Nicht-BCSCs und führt dazu, dass der Anteil der Brustkrebszellen gesammelt werden kann mit stammzellähnlichen Eigenschaften, die einen zellulären Phänotyp aufweisen, der sie von der Massenpopulation von Krebszellen unterscheidet. Menschliche Brustkrebszellen, die eine erhöhte enzymatische ALDH-Aktivität aufweisen, hohe Konzentrationen des Zelloberflächenmarkers CD44 exprimieren und eine niedrige/negative Expression von CD24 aufweisen, haben einenALDH-hohenCD44+CD24-Phänotyp und können als BCSC klassifiziert werden. Der Anteil der BCSCs innerhalb der Massenpopulation kann zwischen Zelllinien oder Patienten variieren (Abbildung 2) und hängt oft vom Krankheitsstadium ab, wobei aggressiverer Brustkrebs in der Regel einen höheren Anteil an BCSCs aufweist26,36,37.

Isolierte BCSCs können verwendet werden, um verschiedene In-vitro - und In-vivo-Assays durchzuführen, wobei ihr Verhalten und ihre Funktion mit dem der Massen- und/oder Nicht-BCSC-Populationen verglichen werden können. Zum Beispiel kann die Fähigkeit einer einzelnen Brustkrebszelle, sich selbst zu erneuern und Kolonien von 50 Zellen zu erzeugen, durch koloniebildende Assays beurteilt werden (Abbildung 3A). Die Fähigkeit von BCSCs, sich unter verankerungsunabhängigen experimentellen Bedingungen selbst zu erneuern, kann durch Mammosphärentests beurteilt werden, bei denen variable Kugelanzahl, Größe und Kugelinitiierungskapazität analysiert und mit dem Vorhandensein und der Funktion von BCSCs korreliert werden können (Abbildung 3B). Es ist wichtig, die Seeding-Zelldichten für verschiedene Brustkrebszelllinien oder Brusttumorproben zu bestimmen, um optimale Ergebnisse zu erhalten. Dies ist besonders wichtig bei der Durchführung von SLDA, da höhere Zelldichten zu einer Zellaggregation führen können, was zu einer Fehlinterpretation der Zellaktivität führt.

Die Kultivierung von Brustkrebszellen in BME ermöglicht es BCSCs, 3D-Strukturen zu bilden, die unter vivo-Bedingungen rekapitulieren (Abbildung 3C). Die 3D-Kultur von Brustkrebszellen in Gegenwart anderer mikroumweltbedingter Zelltypen wie Fibroblasten, Endothelzellen und/oder Immunzellen hat die zusätzliche Fähigkeit, die Rolle der Mikroumgebung beim 3D-Wachstum von BCSCs zu untersuchen38,39. Die spezifischen Zellzahlen, die zur Erzeugung von 3D-Organoiden erforderlich sind, können je nach Zelllinie oder Tumorquelle des Patienten variieren, daher ist es wichtig, die Kulturbedingungen und Zellzahlen vor groß angelegten Experimenten zu optimieren.

Schließlich können in vivo Maus-Xenograft-Modelle verwendet werden, um die Unterschiede in der Wachstums- (Abbildung 4), Selbsterneuerung, Differenzierung und/oder Tumorinitiierungsfähigkeit von BCSCs in vivo im Vergleich zu Nicht-BCSCs oder Massenzellpopulationen zu verstehen. Häufig sind die in vitro beobachteten zellulären Reaktionen in Gegenwart exogener Faktoren oder therapeutischer Wirkstoffe nicht repräsentativ für die In-vivo-Umgebung, was darauf hindeutet, dass die In-vitro-Beobachtung durch In-vivo-Studien ergänzt werden sollte, wann immer dies möglich ist. Unter Verwendung von in vivo Xenograft-Modellen bleibt die zelluläre Heterogenität und Tumorarchitektur erhalten und somit können diese Modelle als System dienen, das die Mikroumgebung bei menschlichen Patienten genau nachahmt. Im lebenden Organismus LDA kann durchgeführt werden, um den Anteil tumorinitiierender Zellen in einer gegebenen gemischten Population von Krebszellen (BCSCs oder Nicht-BCSCs) zu bestimmen40,41. Der Bereich der verwendeten Zellverdünnungen sollte optimiert werden und hängt von der Häufigkeit der initiierenden Zellen in der interessierenden Zellpopulation ab. Idealerweise sollten diese Verdünnungen Dosen enthalten, die zu 100% Tumorbildung führen, bis hin zu Zelldosen ohne Tumorbildung und einem angemessenen Bereich dazwischen. Die Häufigkeit tumorinitiierender Zellen in Primärproben kann variabel sein, und in Fällen, in denen Brusttumoren eine sehr geringe Anzahl oder heterogene Populationen tumorinitiierender Zellen aufweisen, kann die Durchführung von LDA eine besondere Herausforderung darstellen42. In diesen Fällen wäre die Injektion einer größeren Anzahl von Zellen für das Verständnis der Brustkrebsbiologie besser geeignet.

Figure 4
Abbildung 4: In vivo Xenograft-Assays zur Beurteilung der BCSC-Funktion. MDA-MB-231-Brustkrebszellen wurden mittels FACS isoliert, wie in Abbildung 1 beschrieben, und in das rechte Brustfettpolster weiblicher NSG-Mäuse injiziert, wie in den Protokollabschnitten 9.1 bis 9.8 beschrieben (5 x 105 Zellen/Maus; 4 Mäuse/Zellpopulation). Die primäre Brusttumorwachstumskinetik wird für ALDHhiCD44+CD24- (■) versus ALDHniedrigeCD44niedrige/-CD24+ (□) Populationen gezeigt. Daten dargestellt als Mittelwert ± S.E.M. * = signifikant unterschiedliche Tumorgröße als entsprechende ALDHniedrigeCD44niedrige/- Untergruppen zum gleichen Zeitpunkt (P < 0,05). Diese Abbildung wurde von Croker et al.26 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Brustkrebsmetastasen und Therapieresistenzen sind weltweit zu einer Haupttodesursache bei Frauen geworden. Die Existenz einer Subpopulation von Brustkrebsstammzellen (BCSCs) trägt zur verstärkten Metastasierung 26,43,44,45,46 und Therapieresistenz21,47,48 bei. Daher sollte der Schwerpunkt künftiger Behandlungen auf der Tilgung von BCSCs liegen, um bessere Behandlungsergebnisse zu erzielen, und dies erfordert genaue Methoden zur Isolierung und Charakterisierung der funktionellen Merkmale von BCSC sowohl mit In-vitro- als auch mit In-vivo-Methoden.

Immortalisierte Zelllinien, die von verschiedenen Subtypen von Brustkrebs stammen, haben sich als praktikable Modelle zur Untersuchung der Brustkrebsbiologie erwiesen, einschließlich der Isolierung und Charakterisierung von BCSCs 26,49,50. Die hohe Proliferationskapazität und unbegrenzte Expansionsfähigkeit von Zelllinien bietet ein ideales Modellsystem für die Durchführung von Studien, die hochgradig reproduzierbar und technisch einfach sind. Aufgrund des klonalen Ursprungs von Zelllinien können sie jedoch möglicherweise nicht die Heterogenität verschiedener Patienten und/oder von Krebszellen im Tumorgewebe rekapitulieren. Darüber hinaus können genetische Veränderungen während des seriellen Passaging von Zelllinien erworben werden und genotypische oder phänotypische Veränderungen hervorrufen, die experimentelle Ergebnisse verfälschen können51. Im Gegensatz dazu können primäre Patientenzellen trotz ihrer begrenzten Proliferations- und Expansionsfähigkeit ein genaueres Modell als das in vivo beobachtete liefern. Solche Proben können jedoch schwieriger zu beschaffen und technisch schwieriger zu bearbeiten sein. All diese Faktoren sollten bei der Auswahl eines Ausgangsmodellsystems zur Isolierung und Charakterisierung von BCSCs berücksichtigt werden.

FACS ist eine häufig verwendete Technik zur Isolierung von Zellen von Interesse basierend auf der Zelloberflächenmarkerexpression52,53. Basierend auf Zelloberflächenantigenen (CD44 und CD24) und ALDH-Enzymaktivität können humane BCSCs in hoher Reinheit sowohl aus Brustkrebszelllinien als auch aus Tumorgewebe isoliert werden 1,2. Die Sortiereffizienz bestimmt die Reinheit der sortierten Probe, und es wird empfohlen, dass Benutzer einen kleinen Teil der sortierten Probe analysieren, die mit Lebensfähigkeitsfarbstoff inkubiert wurde, um die Effizienz der Sortierungzu überprüfen 53,54. Die Sortiereffizienz kann durch viele Faktoren beeinträchtigt werden, einschließlich des Vorhandenseins von Zellklumpen, einer hohen Anzahl toter oder sterbender Zellen, einer unsachgemäßen Kompensation der Fluorochrome und / oder einer Schädigung der Zelloberflächenantigene aufgrund der Empfindlichkeit gegenüber Trypsin oder Kollagenase während der Dissoziationsschritte vor der Sortierung53,54,55,56 . Daher wird die Erzeugung einer geeigneten Einzelzellsuspension und die Verwendung geeigneter Zelldissoziationstechniken die Sortiereffizienz erhöhen. Bei der Multiparameter-Zellsortierung ist es wichtig, Fluorochrome zu wählen, die die spektrale Überlappung minimieren. In einigen Fällen, in denen eine spektrale Überlappung nicht vermieden werden kann, sollte eine Kontrolle verwendet werden, die alle Fluorochrome außer einem enthält (Fluoreszenz minus eins, FMO), um das Übergreifen von Fluoreszenzsignalen auf andere Kanälezu minimieren 54. Alternativ kann die spektrale Überlappung durch immunmagnetische Isolierung von Zellpopulationen vor der endgültigen FACS-Isolierung von Zellen von Interessereduziert werden 56.

In-vitro-Assays wie die in diesem Protokoll beschriebenen koloniebildenden und Mammosphären-Assays wurden ausgiebig verwendet, um die Selbsterneuerung und Proliferationsfähigkeit von BCSCs 57,58,59,60,61,62 zu untersuchen. Darüber hinaus können diese Assays verwendet werden, um die Aktivität verschiedener therapeutischer Medikamente auf die BCSC-Funktion zu beurteilen. Mehrere evolutionär konservierte Signalwege wurden in BCSC-Aufrechterhaltung 63 implementiert, und sowohl koloniebildende 64,65,66- als auch Mammosphären-Assays 64,67 wurden verwendet, um den Wert einer therapeutischen Störung dieser Signalwege als Intervention zur Blockierung der intrinsischen BCSC-Signalübertragung und zur Verringerung der BCSC-Aktivität und des Krankheitsverlaufs zu bewerten. Der Koloniebildungstest mit Primärzellen kann aufgrund der geringen Zelldichte, der Variation zwischen den Proben und der mangelnden Anpassungsfähigkeit an isolierte In-vitro-Bedingungen eine Herausforderung darstellen. Diese Herausforderungen können überwunden werden, indem BCSCs auf einer weichen Agarschicht kultiviert oder mit Fibroblasten auf einer kollagenbeschichteten Zellkulturschale68,69,70 kokultiviert werden. Darüber hinaus könnte die Ergänzung von Wachstumsfaktoren in die Kulturmedien (wie FGF771) auch die Koloniebildungsfähigkeit von Zellen verbessern, die aus Gewebeproben isoliert wurden. Darüber hinaus kann eine Überverdauung von Gewebe unter Verwendung von Kollagenase oder Trypsin während des Generationsschritts der Einzelzellsuspension zu einer geringen bis Null koloniebildenden Fähigkeit führen und die mammosphärenbildende Effizienz verringern31. In beiden Assays sollte darauf geachtet werden, dass die Assayplatten ungestört inkubiert werden, um Störungen der Kolonie- oder Kugelstrukturen während ihrer Bildung zu vermeiden. Es wird auch empfohlen, dass Benutzer die Inkubationszeit für Primärzellen (relativ zu Zelllinien) verlängern, da es länger dauern kann, bis diese Zellen Kolonien oder Kugeln bilden.

Mehrere Evidenzlinien haben die entscheidende Rolle von extrazellulärer Matrix (ECM)15,17,72 und Stromakomponenten wie Fibroblasten, Immunzellen, Endothelzellen und Adipozyten bei der Beeinflussung der BCSC-Funktionen gezeigt 15. Daher kann das 3D-Kulturmodell, das wir in diesem Protokoll beschreiben, ein nützliches experimentelles System bereitstellen, um die In-vivo-Tumormikroumgebung in einer In-vitro-Umgebung zu rekapitulieren. Obwohl das 3D-Kultursystem der Tumormikroumgebung bei Krebspatienten sehr ähnlich ist, kann die langfristige Erhaltung von Zellen als Organoide schwierig sein. Darüber hinaus ist die Optimierung der 3D-Kulturbedingungen und die Fähigkeit, die Selbsterneuerung und Differenzierungsfähigkeit von BCSCs genau zu untersuchen, eine Herausforderung73. Die Effizienz der im 3D-Kultursystem gebildeten Organoide hängt von den Wachstumsfaktoren ab, die in den Kulturmedien74 ergänzt werden. Das Fehlen von Schlüsselkomponenten (z. B. ROCK-Inhibitor) könnte zu einer verminderten oder gar keiner Organoidbildung führen74. Medien sollten alle 3-4 Tage aufgefüllt werden, um eine optimale Zellfunktion und die Nachhaltigkeit der Kultur aufrechtzuerhalten. Um In-vivo-Bedingungen und -Reaktionen zu rekapitulieren, ist es immer wichtig, den Zellen zu erlauben, Organoide vor jeder Art von exogener Behandlung zu bilden75. Zellen, die aus Patientenproben gewonnen werden, sollten ausreichend Zeit für die Bildung von Organoiden geben, insbesondere wenn das Ziel die Bewertung der Arzneimittelreaktion ist75.

Während diese In-vitro-Methoden attraktive und zugängliche experimentelle Werkzeuge zur Charakterisierung der BCSC-Funktion sind, können die Tumorheterogenität und die Wirkung der Tumormikroumgebung auf das BCSC-Verhalten nicht mit vollständiger Wirksamkeit untersucht werden. Diese In-vitro-Assays sollten daher nach Möglichkeit durch In-vivo-Xenograft-Modelle ergänzt werden, um experimentelle Ergebnisse im Zusammenhang mit der BSCS-Biologie und/oder dem Ansprechen auf neuartige Therapeutika weiter zu validieren. Verschiedene In-vivo-Modelle wurden verwendet, um die Tumorigenität und Metastasierung von BCSC zu untersuchen. Ektopische (subkutane Anpflanzung) und orthotope (MFP-Engraftment) Mausmodelle wurden verwendet, um Brusttumore zu erzeugen und longitudinale Veränderungen des Tumorwachstums im Laufe der Zeitzu bewerten 50. Obwohl beide In-vivo-Injektionsansätze zur Untersuchung der BCSC-Biologie verwendet werden können, ermöglichen die nativen stroma- und vaskulaturbezogenen Komponenten des MFP eine genauere Rekapitulation der primären Brusttumorprogression, wie sie bei Patienten beobachtet wurde, und daher wird die MFP-Injektion bevorzugt 76,77,78. Schließlich ist die Verwendung von immungeschwächten Mäusen für die Anpflanzung menschlicher BCSCs und das Tumorwachstum erforderlich, was die Einbeziehung der Rolle von Immunzellen in Tumorgenese- und Metastasenstudien verhindert79. In jüngerer Zeit wurde diese Einschränkung durch die Verwendung humanisierter Mäuse behoben, bei denen ein menschliches Immunsystem durch Knochenmarktransplantation vor Beginn der Xenograft-Studien rekonstituiert wird80,81,82. Diese Modelle sind jedoch teuer und technisch anspruchsvoll und werden daher immer noch nicht häufig verwendet83.

Zusammenfassend haben wir hier ein Protokoll für die Isolierung von humanen BCSCs sowohl aus Brustkrebszelllinien als auch aus von Patienten stammenden Tumorgewebeproben bereitgestellt. Wir haben auch In-vitro- und In-vivo-Protokolle für nachgeschaltete Assays beschrieben, die zur Untersuchung der BCSC-Funktion verwendet werden können, mit der Fähigkeit, für verschiedene Brustkrebszellquellen optimiert zu werden, und der Flexibilität, unter verschiedenen experimentellen Bedingungen durchgeführt zu werden. Diese Protokolle werden für Forscher nützlich sein, die sich für Krebsstammzellen, Brustkrebsbiologie und therapeutische Entwicklung interessieren, mit dem ultimativen Ziel, die Patientenergebnisse in Zukunft zu verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für ihre hilfreichen Gespräche und Unterstützung. Unsere Forschung zu Brustkrebsstammzellen und der Tumormikroumgebung wird durch Zuschüsse des Canadian Cancer Research Society Research Institute und des Brustkrebsprogramms des US-Verteidigungsministeriums (Grant # BC160912) finanziert. V.B. wird durch ein Western Postdoctoral Fellowship (Western University) unterstützt, und sowohl A.L.A. als auch V.B. werden von der Breast Cancer Society of Canada unterstützt. C.L. wird durch ein Vanier Canada Graduate Scholarship der kanadischen Regierung unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1x106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM

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References

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Cancer Research Ausgabe 164 Brustkrebsstammzellen (BCSC) fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) koloniebildender Assay Mammosphärentest 3D-Kulturmodell in vivo Tumormodell
Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben
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Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., … More

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).

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