Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Published: October 2, 2020 doi: 10.3791/61775
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Western University, 3Department of Oncology, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את הבידוד של BCSCs מדגימות תאים ורקמות של סרטן השד, כמו גם את מבחני in vitro ו - in vivo שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של BCSC.

Abstract

תאי גזע של סרטן השד (BCSCs) הם תאים סרטניים בעלי מאפיינים תורשתיים או נרכשים דמויי תאי גזע. למרות התדירות הנמוכה שלהם, הם תורמים עיקריים להתחלת סרטן השד, הישנות, גרורות ועמידות לטיפול. חובה להבין את הביולוגיה של תאי גזע מסרטן השד על מנת לזהות מטרות טיפוליות חדשניות לטיפול בסרטן השד. תאי גזע של סרטן השד מבודדים ומאופיינים על סמך ביטוי של סמני פני שטח ייחודיים של תאים כגון CD44, CD24 ופעילות אנזימטית של אלדהיד דהידרוגנאז (ALDH). תאי CD44+CD24גבוהיםאלה של ALDH מהווים את אוכלוסיית ה-BCSC וניתן לבודד אותם באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה (FACS) לצורך מחקרים פונקציונליים במורד הזרם. בהתאם לשאלה המדעית, ניתן להשתמש בשיטות in vitro ו- in vivo שונות כדי להעריך את המאפיינים הפונקציונליים של BCSCs. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניסיוני מפורט לבידוד BCSCs אנושיים הן מאוכלוסיות הטרוגניות של תאי סרטן השד והן מרקמת גידול ראשונית המתקבלת מחולות סרטן השד. בנוסף, אנו מדגישים את הבדיקות הפונקציונליות in vitro ו- in vivo במורד הזרם, כולל מבחנים ליצירת מושבה, מבחני ממוספרה, מודלים של תרביות תלת-ממדיות ומבחני xenograft של גידולים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את תפקוד BCSC.

Introduction

הבנת המנגנונים התאיים והמולקולריים של תאי גזע מסרטן השד האנושי (BCSCs) היא חיונית להתמודדות עם האתגרים המטופלים בטיפול בסרטן השד. הופעתו של מושג BCSC מתוארכת לתחילת המאהה-21, שם אוכלוסייה קטנה של תאי סרטן שד נמוכים מסוג CD44+CD24/Low נמצאה מסוגלת לייצר גידולים הטרוגניים בעכברים 1,2. לאחר מכן, נצפה כי תאי סרטן שד אנושיים עם פעילות אנזימטית גבוהה של אלדהיד דהידרוגנאז (ALDHגבוה) הציגו גם תכונות דומות דמויות תאי גזע3. BCSCs אלה מייצגים אוכלוסייה קטנה של תאים המסוגלים להתחדשות עצמית והתמיינות, ותורמים לאופי ההטרוגני של גידולים בתפזורת 1,2,3. ראיות מצטברות מצביעות על כך ששינויים במסלולי איתות משומרים אבולוציונית מניעים הישרדות ותחזוקה של BCSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . בנוסף, המיקרו-סביבה החיצונית של התא הוכחה כממלאת תפקיד מרכזי בהכתבת פונקציות BCSC שונות15,16,17. מסלולים מולקולריים אלה והגורמים החיצוניים המווסתים את תפקוד BCSC תורמים להישנות סרטן השד, גרורות18 ופיתוח עמידות לטיפולים 19,20,21, כאשר הקיום השיורי של BCSCs לאחר הטיפול מציב אתגר גדול להישרדות הכוללת של חולות סרטן השד22,23 . לפיכך, הערכה פרה-קלינית של גורמים אלה חשובה מאוד לזיהוי טיפולים ממוקדי BCSC שיכולים להועיל להשגת תוצאות טיפול טובות יותר ולשיפור ההישרדות הכוללת בחולות סרטן השד.

מספר מודלים של קו תאי סרטן שד אנושיים במבחנה ומודלים של קסנוגרפט אנושי in vivo שימשו לאפיון BCSCs 24,25,26,27,28,29. היכולת של קווי תאים להתאכלס מחדש ברציפות לאחר כל מעבר עוקב הופכת אותם למערכת מודל אידיאלית לביצוע מחקרים מבוססי אומיקה ופרמקוגנומיה. עם זאת, קווי תאים לעתים קרובות אינם מצליחים לשחזר את ההטרוגניות שנצפתה בדגימות של מטופלים. לפיכך, חשוב להשלים את נתוני קו התא עם דגימות שמקורן בחולה. בידוד של BCSCs בצורתם הטהורה ביותר חשוב כדי לאפשר אפיון מפורט של BCSCs. השגת טוהר זה תלויה בבחירת סמנים פנוטיפיים ספציפיים ל- BCSCs. נכון לעכשיו, הפנוטיפ של תאי CD44+CD24הגבוהשל ALDH משמש בדרך כלל להבחנה ולבידוד של BCSCs אנושיים מאוכלוסיות תאי סרטן שד בתפזורת באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) לטוהר מרבי1, 3,26. יתר על כן, ניתן להעריך את התכונות של BCSCs מבודדים כגון התחדשות עצמית, התפשטות והתמיינות באמצעות טכניקות in vitro ו- in vivo.

לדוגמה, ניתן להשתמש במבחנים ליצירת מושבות חוץ גופיות כדי להעריך את יכולתו של תא בודד לחדש את עצמו וליצור מושבה של 50 תאים או יותר בנוכחות תנאי טיפול שונים30. ניתן להשתמש במבחני ממוספרה גם כדי להעריך את פוטנציאל ההתחדשות העצמית של תאי סרטן השד בתנאים שאינם תלויים בעוגן. בדיקה זו מודדת את יכולתם של תאים בודדים ליצור ולגדול ככדורים (תערובת של BCSCs ושאינם BCSCs) בכל מעבר עוקב בתנאי תרבית ללא סרוםללא דבק 31. בנוסף, ניתן להשתמש במודלים של תרביות תלת-ממדיות (3D) כדי להעריך את תפקוד ה-BCSC, כולל אינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים, אשר מסכמות מקרוב את המיקרו-סביבה in vivo ומאפשרות לחקור את הפעילות של טיפולים פוטנציאליים ממוקדי BCSC32. למרות היישומים המגוונים של מודלים במבחנה, קשה למדל את המורכבות של תנאי in vivo באמצעות מבחני in vitro בלבד. ניתן להתגבר על אתגר זה על ידי שימוש במודלים של xenograft עכבר כדי להעריך את התנהגות BCSC in vivo. בפרט, מודלים אלה משמשים כמערכת אידיאלית להערכת גרורות של סרטן השד33, חקירת אינטראקציות עם המיקרו-סביבה במהלך התקדמות המחלה 34, הדמיה in vivo 35, ולניבוי רעילות ויעילות ספציפיות למטופל של חומרים אנטי-סרטניים34.

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט לבידוד של CD44+CD24- BCSCsגבוהיםשל ALDH אנושי בטוהר מרבי מאוכלוסיות גדולות של תאי סרטן שד הטרוגניים. אנו מספקים גם תיאור מפורט של שלוש טכניקות in vitro (בדיקת יצירת מושבה, בדיקת ממוספרה ומודל תרבית תלת-ממדית) ובדיקת קסנוגרפט גידול in vivo שניתן להשתמש בה כדי להעריך פונקציות שונות של BCSCs. שיטות אלה יתאימו לשימוש על ידי חוקרים המעוניינים לבודד ולאפיין BCSCs מקווי תאי סרטן שד אנושיים או מתאי סרטן שד שמקורם בחולה ראשוני ורקמת הגידול לצורך הבנת הביולוגיה של BCSC ו/או חקירת טיפולים חדשניים המכוונים ל-BCSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

איסוף דגימות כירורגיות או ביופסיות שמקורן במטופלת ישירות מחולות סרטן שד בהסכמה בוצע על פי פרוטוקול אתיקה אנושי מאושר שאושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית. כל העכברים ששימשו לייצור מודלים של קסנוגרפט שמקורם בחולה תוחזקו ושוכנו במתקן לבעלי חיים שאושר על ידי המוסד. רקמת הגידול ממודלים של xenograft שמקורם בחולה באמצעות עכברים נוצרו בהתאם לפרוטוקול אתיקה מאושר שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.

1. הכנת שורות תאים

  1. בצע את כל הליכי תרבית התאים והכתמים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית. השתמש בכלי תרבית תאים סטריליים / צלוחיות וריאגנטים.
  2. שמור על תאי סרטן שד אנושיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במדיה מוגדרת בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) וגורמי גדילה נחוצים ספציפיים לכל קו תאים.
  3. שמור על תרביות תאים פיברובלסטיות של עכבר NIH3T3 (לשימוש במבחנים ליצירת מושבה) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ב-Modified Eagle's Medium (DMEM) של דולבקו, בתוספת 10% FBS.
  4. עבור כל התרבויות, לחדש את התקשורת הישנה כל 2-3 ימים עם מדיה חדשה. ברגע שהתרביות מגיעות למפגש של 75-80%, תת-תרבית למספר צלוחיות של תרביות תאים סטריליות.

2. הכנת רקמת הגידול בסרטן השד

  1. לאסוף את דגימות הניתוח או הביופסיה שמקורן במטופלת ישירות מחולות סרטן שד בהסכמה תחת פרוטוקול אתיקה אנושי שאושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית.
  2. לאחר מכן, לאסוף וליצור רקמת גידול ממודלים של קסנוגרפט שמקורם בחולה באמצעות עכברים תחת פרוטוקול אתיקה של בעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.
  3. אסוף את כל רקמות הגידול בתנאים סטריליים לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל המכיל מדיה DMEM:F12 של 30 מ"ל, שמור על קרח ועבד את הדגימות כמתואר להלן תוך שעתיים מאיסוף.

3. יצירת תרחיפים חד-תאיים של תאי סרטן השד

  1. שאפו מדיה מהבקבוקון המכילה מונולאייר של תאי סרטן השד שהוא 60-80% מפגש (קווי תאים לפי בחירה). לשטוף את התאים עם 1x פוספט חצץ מלח (PBS). שאפו PBS והוסיפו פתרון מתאים לדיסוציאציה של תאים (למשל, טריפסין:EDTA; מספיק כדי לכסות את המונו-שכבה של התאים) ודגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (מומלץ) או ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. הוסף 5 מ"ל של מדיה תרבית כדי לנטרל את הפעילות של תמיסת דיסוציאציה תאית.
  3. העבר את תמיסת התא המנותקת המתקבלת לצינור חרוטי של 50 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 1000 x g למשך 5 דקות.
  4. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהחיות את כדור התא ב-5 מ"ל של PBS אחד. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ומיקרוסקופ.
    הערה: שימו לב להיווצרות גושים בתאים בהמוציטומטר. חזור על שלב הדיסוציאציה של התא אם לא נוצרה השעיה של תא בודד.
  5. לאחר ספירת התאים, סובבו מחדש את תרחיף התא ב-1000 x g למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט והניחו מחדש את כדור התא במאגר מצע ALDH בריכוז של 1 x 106 תאים למ"ל.

4. יצירת תרחיף תא בודד מדגימות רקמה

  1. טחנו את רקמת הגידול עם להבים כירורגיים באמצעות טכניקת crisscross כדי להשיג חתיכות קטנות יותר של כ 1 מ"מ בגודל. העבירו את חלקי הרקמה לצינור חרוטי טרי של 50 מ"ל המכיל חיץ דיסוציאציה של 10 מ"ל (1X קולגן ב-DMEM:F12). אוטמים את הצינור החרוטי עם פרפילם ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר למשך 40 דקות.
    הערה: אם אין אינקובטור שייקר, הנח את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וערבב את הצינור על ידי מערבולת כל 5-10 דקות.
  2. גלולה את הרקמה המעוכלת על ידי דגימת צנטריפוגה ב 530 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 5 מ"ל טריפסין. פיפטה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל (מוגדרת לסימן 750 μL) כדי לשבש את הכדור ולדגור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר הדגירה, פיפטה למעלה ולמטה במרץ כדי לשחרר תאים בודדים.
  3. טען את הנפח הכולל בצינור ל-25 מ"ל עם מדיה DMEM:F12 וצנטריפוגה ב-1000 x g למשך 5 דקות. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולתלות מחדש את הכדור ב-1 מ"ל של תמיסת dispase-DNase. דגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  4. טען את הנפח הכולל בצינור ל -10 מ"ל עם PBS. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה, מעבירים את מתלה התא המתקבל דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר המחוברת לצינור חרוטי טרי של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 5 דקות.
  5. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהשהות את גלולת התא ב-5 מ"ל של PBS אחד. ספור את התאים והשלם את ההכנה של השעיית התא כמתואר בשלבים 3.4 ו-3.5.

5. בידוד תאי גזע של סרטן השד (BCSCs)

  1. צינורות זרימה של תוויות עבור הבקרה הלא מוכתמת, בקרות צביעה של תא בודד (בקרת DEAB, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), צינור הבקרה השלילי (מוכתם ב- DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 ו- 7AAD), בקרת פלואורסצנט מינוס אחד (FMO) וצינור 'מיון' (מוכתם ב- ALDH, CD44, CD24 ו- 7AAD).
  2. העבר 500 μL (0.5 x 106 תאים ) של תרחיף התאים משלב 3.5 או שלב 4.5 לכל צינור המסומן תאים בלבד, CD44, CD24 ו- 7AAD. מניחים את הצינורות על קרח עד לשימוש.
  3. העבר 2 מ"ל של דגימה (2 x 106 תאים ) לצינור 'ALDH' בהתאמה. הוסף 5 μL של DEAB לצינורות 'בקרת DEAB' ו'בקרה שלילית' וכסה אותו בחוזקה. הוסיפו 10 μL של מצע ALDH לצינור 'ALDH', ערבבו היטב על ידי מערבולת, והעבירו מיד 500 μL לצינור 'בקרת DEAB' ו'בקרה שלילית' מתאימים. סכם את 'בקרת DEAB', 'שליטה שלילית' ו'צינורות ALDH ' ודגרה ב 37 °C למשך 30-60 דקות (לא יעלה על 60 דקות).
    הערה: זמן הדגירה האופטימלי עשוי לדרוש מיטוב, בהתאם לקו התא. הגן תמיד על מצע ה-ALDH ועל הצינורות המכילים תאים מוכתמים מפני אור.
  4. לאחר הדגירה, צנטריפוגה כל הדגימות במשך 5 דקות ב 250 x גרם. יש להשעות את התאים ב-500 μL של חיץ מצע ALDH. הוסיפו ריכוז מומלץ על-ידי היצרן או ממוטב למשתמש של קוקטייל נוגדנים נגד CD44-PE ואנטי-CD24-PE-Cy7 ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף נוגדנים נגד CD44-PE ואנטי-CD24-PE-Cy7 לצינורות המסומנים 'CD44' ו-'CD24' בהתאמה.
  5. לאחר הדגירה, צנטריפוגה כל הדגימות ב 250 x גרם במשך 5 דקות. יש להשעות את התאים ב-500 μL של חיץ מצע ALDH. דגירה של צינור 'בקרה שלילית', 'צינור מיון' וצינור '7ADD' עם 7AAD (ריכוז מומלץ: 0.25 מיקרוגרם / 1 x 106 תאים ) במשך 10 דקות על קרח.
    הערה: פעילות ALDH מזוהה בערוץ הפלואורסצנטי הירוק, ולכן יש להשתמש בפלואורוכרום עם ספקטרום פליטה תואם אחר. כאשר חפיפה ספקטרלית נצפית במהלך ציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים, יש להשתמש בפקדי צבע יחיד ובבקרת FMO כמדריך המאפשר פיצוי בין פלואורוכרומים כדי למזער את הזליגה של אות פלואורסצנטי לערוצים אחרים.
  6. הגדר את פרוטוקול הניתוח במכשיר FACS כהכנה לניתוח מדגם. יצירת עלילות פיזור (פיזור קדימה לעומת פיזור צד, פיזור קדימה לעומת ערוצים פלואורסצנטיים).
  7. באמצעות הבקרה הלא מוכתמת, התאם את הפוטומולטיפלייר כדי להפריד פסולת מאוכלוסיית תאים שלמה והתאם את המתח הפלואורסצנטי כדי להזיז את כל אוכלוסיית התאים סביב סולם היומן הראשון (101). באמצעות בקרת DEAB, הזז את כל אוכלוסיית התאים בתוך סולם היומן השני (102) על-ידי התאמת תעלת המתח הפלואורסצנטית הירוקה.
  8. נתחו תחילה את כל פקדי הצביעה הבודדים (ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7) ובקרת 7AAD ו-FMO, תוך התאמת המתח להפרדה בין תאים מוכתמים לתאים לא מוכתמים ולמזעור שפיכת אותות פלואורסצנטיים לערוצים אחרים.
  9. שער על האוכלוסייה החיובית עבור כל דגימת תאים מוכתמת בודדת. שימוש בצינור הבקרה השלילי, שער לכדאיות (7AAD שלילי), ALDHנמוך ואוכלוסיות תאיםגבוהים של ALDH (אסטרטגיית גידור מייצגת המוצגת באיור 1B).
  10. נתח דגימות מוכתמות מולטי-פרמטרים בעלות עניין לבידוד BCSCs. באמצעות השעריםהגבוהים של ALDHנמוך ו-ALDH, בחר עבור אוכלוסיית התאים CD44+CD24- (BCSC) ו-CD44-CD24+ (שאינה BCSC) בהתאמה (איור 1B).
  11. אסוף BCSCs בני קיימא ולא-BCSCs במדיית איסוף בצינורות איסוף סטריליים (אוכלוסיות משני קווי תאים מייצגים המוצגים באיור 2A&B). השתמש בתאים ממוינים עבור מבחני in vitro ו - in vivo במורד הזרם כמתואר להלן.
    הערה: בנוסף למבחני in vitro ו- in vivo המתוארים להלן, ניתן לאמת BCSCs על ידי מדידת הביטוי של סמנים פלוריפוטנטיים כגון SOX2, OCT4 ו- NANOG באמצעות טכניקות אימונובלוטינג סטנדרטיות.

Figure 1
איור 1: אסטרטגיית בדיקה של FACS לבידוד BCSCs מקווי תאים של סרטן השד ומדגימות רקמות. (A) תרשים זרימה המתאר את הליך בידוד BCSC. (B) חלקות FACS מייצגות המציגות את אסטרטגיית המיון המשמשת לבידוד BCSCs בני קיימא ושאינם BCSCs ממאגר הטרוגני של תאים. תאי סרטן השד האנושיים MDA-MB-231 מסומנים במקביל עם 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE ומצע ALDH. תת-קבוצות תאים בודדו באמצעות פרוטוקול של ארבעה צבעים במחשב FACS. התאים נבחרים על סמך פיזור האור הצפוי, ולאחר מכן עבור סינגלטים, והכדאיות מבוססת על אי הכללת 7-AAD. לאחר מכן מנתחים את התאים לפעילות ALDH ו-20% החיוביים ביותר נבחרים כאוכלוסייההגבוהה של ALDH, בעוד ש-20% התחתונים של התאים עם פעילות ה-ALDH הנמוכה ביותר נחשבול-ALDH נמוך. לבסוף, 50% מהתאיםהנמוכים של ALDH נבחרים עוד יותר על סמך פנוטיפ CD44 נמוך/-CD24+,ו-50% מהתאיםהגבוהים של ALDH נבחרים על סמך פנוטיפ CD44+CD24. נתון זה הותאם מתוך Chu et al.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הפרופורציות של BCSCs משתנות בקווי תאים שונים של סרטן השד. תמונה מייצגת המציגה את היחס הדיפרנציאלי של BCSCs ושל תאים שאינם BCSCs ב- (A) SUM159 ו- (B) MDA-MD-468 קווי תאי סרטן שד טריפל נגטיב לאחר תיוג ומיון כמתואר באיור 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

6. מבחן יצירת מושבה

  1. שלח מחדש את התאים המעניינים (תאים ממוינים משלב 5.11 או תאים לא ממוינים משלבים 3.5 או 4.5) במדיה מלאה.
  2. תייג שלוש צינורות זרימהעבור תאים 1 x 10 2, 2 x 102 ו- 5 x 10 2. הוסף 2 מ"ל של מדיה מלאה והעבר את מספר התא המתאים (ממוין משלב 5.11 או תאים לא ממוינים משלבים 3.5 או 4.5) בצינורות המתאימים. ערבבו היטב את תמיסות התאים על-ידי כך שהן מפילות אותו למעלה ולמטה 5 פעמים.
  3. צלחת את התאים בצלחת 6 בארות ולהפיץ את תרחיף התאים על ידי סיבוב עדין של הלוחות כדי לקבל חלוקה אחידה של התאים.
  4. דגירה של הלוחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 עד להופעת מושבות (כאשר מושבות = ≥50 תאים לכל מושבה). יש לחדש בזהירות את המדיה פעמיים בשבוע מבלי להפריע להיווצרות המושבה.
  5. שאפו מדיה ושטפו פעם אחת עם 1 מ"ל PBS. הוסיפו 0.5 מ"ל של תמיסה סגולה גבישית 0.05% לכל באר ודגרה על הצלחת במשך 30 דקות. יש להסיר את עודפי הכתם הסגול הקריסטלי על ידי שטיפה ב-2 מ"ל מים. חזרו על שלב הכביסה עד להסרת כתם הרקע.
  6. באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה של פי 4 ו-10x, ספרו ותעדו את המספר הכולל של מושבות שנוצרו (תמונות מייצגות המוצגות באיור 3A).
  7. חשב את תדירות היווצרות המושבות באופן הבא: תדירות (%) = (# של מושבות שנוצרו / מספר התאים שנזרעו) x 100. לדוגמה, אם 25 מושבות נוצרות מ 1 x 102 תאים , אז התדירות של היווצרות המושבה היא, תדירות = (25/100) x100 = 25%.
  8. לחלופין, החלף את שלבים 6.1 עד 6.4 בשיטה חלופית הכוללת תרבית משותפת עם פיברובלסטים, המספקים תמיכה מיקרו-סביבתית ל- BCSCs באמצעות ייצור גורמי גדילה והישרדות נחוצים.
  9. צלחת תרבית 60 מ"מ של תאי פרווה מראש עם קולגן בקר מסוג I (דילול של 1 מתוך 30 של קולגן 3 מ"ג/מ"ל). אפשרו לקולגן להתפלמר במשך 30 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. שאפו את הקולגן הלא פולימרי ושטפו את הצלחת פעמיים עם PBS אחד. מכסים את הצלחת המצופה קולגן ב-1 מ"ל של PBS ומניחים אותה בצד בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
  10. תייג שלוש צינורות זרימה עבור 1 x 103, 5 x 103 ו 1 x 104 תאים . הוסף 4 מ"ל של מדיית בדיקה יוצרת מושבה והעבר את המספר המתאים של תאים (ממוינים משלב 5.11 או תאים לא ממוינים משלבים 3.5 או 4.5) לתוך הצינורות המתאימים. הוסף פיברובלסטים NIH3T3 של עכבר מוקרן (4 x 104 תאים / מ"ל של מדיה). ערבבו היטב את פתרונות התאים על ידי הקפצתו למעלה ולמטה 5 פעמים.
  11. שאפו את ה-PBS מצלחת התרבית המצופה בקולגן משלב 6.1 וצלחו את תערובת התאים על כל אחת מצלחות תרבית התאים כמתואר בשלב 6.3.
  12. לדגום את הצלחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ולהשאיר אותם ללא הפרעה במשך 7-10 ימים או עד מושבות להיווצר, מבלי לחדש את התקשורת. ספור ורשום את המספר הכולל של מושבות שנוצרו כמתואר בשלבים 6.6 ו- 6.7.

7. בדיקת ממוספרה

  1. השהה את התאים המעניינים (תאים ממוינים משלב 5.11 או תאים לא ממוינים משלבים 3.5 או 4.5) במדיית ממוספירה שלמה ותאי צלחת בצפיפות זריעה של 5 x 10 2 תאים / ס"מ2 שטח בצלחת תרביתתאים עם חיבור נמוך במיוחד של 96 באר.
    הערה: צפיפות זריעת התאים צריכה להיות ממוטבת עבור קווי תאים שונים.
  2. לדגום את צלחות התרבית במשך 5-10 ימים בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. בזהירות לחדש את התקשורת פעמיים בשבוע מבלי להפריע היווצרות ממוספרה.
  3. לאחר הדגירה, לספור את מספר ממוספרות שנוצרו בכל באר באמצעות מיקרוסקופ; כאשר ממוספרות מוגדרות כצבירי תאים של סרטן השד בקוטר של יותר מ-100 מיקרומטר (תמונות מייצגות המוצגות באיור 3B).
  4. חשב את יעילות היווצרות הממוספירה (MFE) באופן הבא: MFE (%) = (מספר ממוספרות לבאר)/ (מספר התאים שנזרעו לכל באר) x 100 (כלומר, אם 5 ממוספרות נוצרות על ידי 1 x 102 תאים בבאר, אז MFE = (5/100) x 100 = 5%).
  5. כדי לתת-תרבות ממוספרות, העבירו בזהירות את המדיה המכילה את תוכן הממוספירה לתוך צינור חרוטי טרי של 50 מ"ל ומדיה צנטריפוגה בגודל 1000 x גרם למשך 5 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט, תשהה את כדור התא ב-500 μL של טריפסין, ודגרה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. השליכו את הסופר-נטנט והניחו מחדש את הכדור ב-1 מ"ל של מדיית ממוספירה מלאה. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר וציפו מחדש את התאים בצלחת תרבית תאים בעלת חיבור נמוך במיוחד כמתואר בשלב 7.1.
    הערה: בנוסף לתת-תרבות, ניתן גם לנתח את התאים שמקורם בממוספירה על ידי FACS כדי להעריך את הפנוטיפ של BCSC ו/או להשיג אוכלוסיות טהורות של BCSCs עבור בדיקות אחרות במורד הזרם.
  7. כדי לקבוע את מספר התאים היוזמים ממוספרה הכלולים באוכלוסיות התאים שלך, השתמש בשיטה חלופית הכוללת ניתוח דילול מגביל כדור (SLDA). תאי צלחת בדילולים סדרתיים של מספרי תאים גבוהים עד נמוכים בצלחת תרבית תאים בעלת חיבור נמוך במיוחד של 96 בארות, כאשר הדילול הגבוה ביותר מביא לפחות מתאים אחד לכל באר.
  8. לדגום את צלחת התרבית במשך 10-14 ימים בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ולהשאיר אותם ללא הפרעה כדי למנוע צבירה של תאים.
  9. לאחר הדגירה, לספור את מספר ממוספרות שנוצרו בכל באר באמצעות מיקרוסקופ; כאשר ממוספרות מוגדרות כצבירי תאים של סרטן השד בקוטר של יותר מ-100 מיקרומטר. חשב את התדירות והמשמעות של התחלת הכדור באמצעות תוכנה מקוונת (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/ ELDA) לניתוח דילול מגביל קיצוני (ELDA).

מודל תרבות 8.3D

  1. בהתאם לשאלת הניסוי, השתמש בתמצית קרום מרתף (BME) עם או בלי גורמי גדילה (מופחת). על מנת להעריך את ההשפעה של גורם גדילה בודד על תאים סרטניים, השתמש בגורם גדילה מופחת BME. זה גם עוזר למזער את ההשפעות הלא ספציפיות של גורמי גדילה אנדוגניים הקיימים ב- BME.
    הערה: BME מתמצק מעל 10 °C. שמור תמיד BME על קרח גם במהלך שלב ההפשרה.
  2. הוסיפו בזהירות 50 μL של BME לכל באר בצלחת של 96 בארות מבלי ליצור בועות אוויר ואפשרו לה להתפלמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר 10 דקות של דגירה, להוסיף 100 μL PBS כדי למנוע ייבוש של שכבת הג'ל.
  3. דחה את התאים הממוינים משלב 5.11 או תאים לא ממוינים משלבים 3.5 או 4.5 בריכוז של 5 x 103 עד 5 x 104/200 μL במדיית תרבית תלת-ממדית.
  4. לאחר שה- BME עבר פולימר, הסר PBS, הוסף 200 μL של תרחיף תאים לכל באר ודגרה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. הוסף PBS לבארות שמסביב כדי למנוע אידוי של התקשורת.
    הערה: יש לקבוע את מספר התאים האופטימלי לציפוי לפני קביעת הניסוי. בהתאם לשאלת הניסוי, BCSCs יכולים להיות בתרבית לבד או עם סוגי תאים אחרים (פיברובלסטים / אנדותל / תאי מערכת החיסון וכו ').
  5. הוסיפו מדיה טרייה לצלחות התרבות פעמיים בשבוע. שמרו על תרביות במשך 10-14 ימים לפני ניתוח היווצרות האורגנואידים (תמונות מייצגות המוצגות באיור 3C).
  6. עבור תת-תרבות, שאפו בזהירות את המדיה והוסיפו 200 μL של dispase לכל באר המכילה תאים. דגירה של הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. באמצע תקופת הדגירה (30 דקות), מוציאים את הצלחת, מקטרים בעדינות את תמיסת הפסולת למעלה ולמטה 5 פעמים, ומניחים בחזרה באינקובטור למשך 30 דקות נוספות.
  7. לאחר שעה, העבר את תמיסת התא המנותקת לצינור זרימה. שטפו את הבאר עם 1x PBS המכיל 2% FBS (fPBS) והעבירו אותה לצינור הזרימה. צנטריפוגה את הצינור ב 1000 x גרם במשך 5 דקות. שאפו בזהירות את הסופרנטנט והוסיפו 500 μL של טריפסין, דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השבת טריפסין על ידי הוספת כמות שווה של fPBS וצנטריפוגה ב 1000 x g למשך 5 דקות.
  8. השליכו את ה-supernatant והחזירו את הכדור ב-1 מ"ל של מדיה תלת-ממדית. ספור את התאים ושלח מחדש את מספר התאים הנדרש ב- BME כמו בשלבים 8.2 עד 8.4.
    הערה: ניתן לאגד בארות מרובות כדי להמשיך לנתח או למיין את אוכלוסיית התאים המעניינת.

Figure 3
איור 3: בדיקות במבחנה להערכת תפקוד תאי BCSC.  בדיקות במבחנה בוצעו כמתואר בסעיפים 6.1 עד 6.5 (א), 7.1 עד 7.4 (ב) או 81. עד 8.4 + 8.6 (C). (A) תמונה מייצגת המציגה את המושבות שנוצרו על ידי תאי סרטן שד אנושיים MDA-MB-231; (B) תמונות מייצגות המציגות היווצרות ממוספירה על ידי MCF7, SUM159 או MDA-MB-468 קווי תאים אנושיים, כמו גם תאי סרטן שד LRCP17 שמקורם בחולה. (C) תמונות מייצגות המציגות את המבנים התלת-ממדיים שנוצרו על-ידי תאי סרטן השד MCF7 ו-MDA-MB-231 במודלים של תרביות תלת-ממדיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הערה: בצע ניסויים בבעלי חיים במסגרת פרוטוקול אתיקה בבעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.

9. מודל קסנוגראפט In vivo

  1. על מנת לקבוע את יכולת התחלת הגידול של תאי גזע מסרטן השד, הכינו תאים (אוכלוסייה ממוינת משלב 5.7 או אוכלוסיות לא ממוינות משלבים 3.5 או 4.5) באמצעות גישת דילול מגביל. דילול סדרתי של תאים ב-PBS באמצעות בין 1 ל-5 קבוצות דילול שונות, עם מינונים נמוכים של 0.01-0.2 x 102 תאים /100 μL וגבוהים עד 1 x 106 תאים /100 μL.
    הערה: ניתן להשתמש בתאי אוכלוסייה לא ממוינים/שלמים כפקד. מספר קבוצות הדילול בהן נעשה שימוש יהיה תלוי בתוצאה המדעית הרצויה (לדוגמה, אם רק בדיקת גידולים אזי ניתן להשתמש בקבוצה אחת במספר תאים גבוה יותר, בעוד שכאשר מחשבים את יכולת ייזום הגידול, מומלץ לבדוק 5 מינוני דילול מגבילים).
  2. כדי ליצור מודלים של קסנוגרפט מתאי סרטן שד אנושיים, השתמשו בעכברות נקבות מדוכאות חיסון (עירום אתימי [nu/nu], זני סוכרת/מדוכאי חיסון משולבים קשים [NOD/SCID] או NOD/SCID IL2γ [NGS]).
    הערה: למרות שניתן להשתמש במינימום של 4 בעלי חיים בכל קבוצה, מומלץ 8-12 בעלי חיים לקבוצה כדי להשיג תוצאות חזקות במיוחד להגבלת ניתוח הדילול.
  3. יש לבצע הזרקות סטנדרטיות של פד שומן החלב (MFP) באמצעות 100 μL/עכבר של כל תכשיר תאים, בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית.
    הערה: לצמיחה מיטבית של גידול השד וגרורות ספונטניות לאיברים מרוחקים, מומלץ להשתמש ב-MFP של בית החזה. לחלופין, ניתן להשתמש גם ב- MFP המפשעתי.
  4. לאחר ההזרקה, עקוב אחר העכברים על בסיס יומי לבריאות כללית וצמיחת הגידול במקום ההזרקה. עם גילוי הגידול המוחשי, יש להתחיל למדוד את גודל הגידול על ידי קליפרים בשני ממדים ניצבים ולרשום מדי שבוע עד לנקודת הקצה.
    הערה: נקודת הסיום של הניסוי נקבעת על סמך התקנות שנקבעו בפרוטוקול האתיקה המוסדי לבעלי חיים; בדרך כלל, נקודת קצה על ידי המתת חסד נדרשת בדרך כלל ברגע שנפחי הגידול מגיעים ל -1500 מ"מ3. עבור אוכלוסיות BCSC ו/או מינוני תאים גבוהים יותר (למשל תאים בגודל >1 x 104), סביר להניח שנקודת קצה זו תושג תוך 4-8 שבועות מהזרקת MFP. עבור מינוני תאים נמוכים מאוד ו/או אוכלוסיות תאים שאינן BCSC, יש לאפשר לצמיחת הגידול להתקדם עד 8 חודשים לאחר ההזרקה.
  5. ממדידות אלה, חשב את נפח הגידול באמצעות הנוסחה הבאה: נפח במ"מ3 = 0.52 x (רוחב)2 x אורך. אם אתה משתמש בגישת דילול מגבילה, חשב את היכולת והמשמעות של ייזום הגידול באמצעות תוכנה מקוונת של ELDA (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).
  6. לחלופין, כדי להרחיב באופן הומני את נקודת הקצה, להסיר בניתוח גידולים ראשוניים ולהמשיך לעקוב אחר עכברים לבריאות ו/או התפתחות גרורות ספונטניות באיברים מרוחקים. השתמש ברקמת גידול כריתה ליצירת קסנוטרנספלנטים סדרתיים.
  7. בנקודת הקצה, יש לקצור רקמה מגידולים ראשוניים ואיברים מרוחקים (בלוטות לימפה, ריאות, כבד, מוח, עצם) ולבצע אנליזה היסטופתולוגית ו/או אימונוהיסטוכימית או לנתק את רקמת הגידול ולהשתמש במבחנים במבחנה המתוארים בסעיפים 6-8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד של BCSCs אנושיים מאוכלוסייה הטרוגנית של תאי סרטן השד, בין אם מקווי תאים או מרקמת גידול מנותקת. עבור כל קו תאים נתון או דגימת רקמה, חיוני ליצור תרחיף חד-תאי אחיד כדי לבודד BCSCs בטוהר מרבי, שכן זיהום אוכלוסיות שאינן BCSC עלול לגרום לתגובות תאיות משתנות, במיוחד אם מטרת המחקר היא להעריך את היעילות של חומרים טיפוליים המכוונים ל-BCSCs. יישום אסטרטגיית מיון מחמירה ימזער את נוכחותם של מזהמים שאינם BCSCs ויביא ליכולת לאסוף את חלקם היחסי של תאי סרטן השד עם מאפיינים דמויי תאי גזע המציגים פנוטיפ תאי המבדיל אותם מאוכלוסיה בתפזורת של תאים סרטניים. תאי סרטן שד אנושיים המציגים פעילות אנזימטית מוגברת של ALDH, מבטאים רמות גבוהות של סמן פני התא CD44, וביטוי נמוך/שלילי של CD24 הם בעלי פנוטיפ CD44+CD24גבוהשל ALDH וניתן לסווגם כ-BCSCs. חלקם של BCSCs באוכלוסייה הגדולה יכול להשתנות בין קווי תאים או חולים (איור 2), ולעתים קרובות תלוי בשלב המחלה, כאשר סרטן שד אגרסיבי יותר בדרך כלל מציג שיעור גבוה יותר שלBCSCs 26,36,37.

ניתן להשתמש ב-BCSCs מבודדים כדי לבצע בדיקות in vitro ו-in vivo שונות שבהן ניתן להשוות את התנהגותם ותפקודם לזה של אוכלוסיות בתפזורת ו/או שאינן BCSC. לדוגמה, היכולת של תא סרטן שד יחיד לחדש את עצמו וליצור מושבות של 50 תאים יכולה להיות מוערכת על-ידי בדיקות יוצרות מושבות (איור 3A). ניתן להעריך את יכולתם של BCSCs לחדש את עצמם בתנאי ניסוי שאינם תלויים בעיגון על ידי מבחני ממוספרה, שבהם ניתן לנתח מספר כדור משתנה, גודל ויכולת ייזום כדור ולתאם אותם עם נוכחותם ותפקודם של BCSCs (איור 3B). חשוב לקבוע את צפיפות תאי הזריעה עבור קווי תאים שונים של סרטן השד או דגימות גידול שד כדי לקבל תוצאות אופטימליות. זה חשוב במיוחד בעת ביצוע SLDA, שכן צפיפות תאים גבוהה יותר עלולה להוביל לצבירת תאים וכתוצאה מכך לפרשנות שגויה של פעילות התאים.

גידול תאי סרטן השד ב-BME מאפשר ל-BCSCs ליצור מבנים תלת-ממדיים שמשחזרים תנאי in vivo (איור 3C). תרבית תלת-ממדית של תאי סרטן השד בנוכחות סוגי תאים מיקרו-סביבתיים אחרים כגון פיברובלסטים, תאי אנדותל ו/או תאי מערכת החיסון היא בעלת יכולת נוספת לחקור את תפקיד המיקרו-סביבה בצמיחה תלת-ממדית של BCSCs38,39. מספרי התאים הספציפיים הנדרשים ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים עשויים להשתנות בהתאם לקו התאים או למקור הגידול של המטופל, ולכן חשוב לייעל את תנאי התרבית ואת מספרי התאים לפני ניסויים בקנה מידה גדול.

לבסוף, ניתן להשתמש במודלים של קסנוגרפט של עכבר in vivo כדי להבין את ההבדלים בגדילה (איור 4) בהתחדשות עצמית, בהתמיינות ו/או ביכולת ייזום הגידול של BCSCs in vivo בהשוואה לאוכלוסיות תאים שאינן BCSCs או תאים בתפזורת. לעתים קרובות, התגובות התאיות במבחנה שנצפו בנוכחות גורמים אקסוגניים או סוכנים טיפוליים אינן מייצגות את ההגדרה in vivo, מה שמרמז על כך שיש להשלים עם תצפית in vitro עם מחקרי in vivo במידת האפשר. באמצעות מודלים של in vivo xenograft נשמרת ההטרוגניות התאית וארכיטקטורת הגידול וכך מודלים אלה יכולים לשמש כמערכת המחקה באופן הדוק את המיקרו-סביבה בחולים אנושיים. In vivo ניתן לבצע LDA כדי לקבוע את שיעור התאים יוזמי הגידול באוכלוסייה מעורבת נתונה של תאים סרטניים (BCSCs או שאינם BCSCs)40,41. טווח דילולי התאים המשמשים צריך להיות אופטימלי ויהיה תלוי בתדירות של ייזום תאים באוכלוסיית התאים המעניינים. באופן אידיאלי דילולים אלה צריכים לכלול מינונים שמביאים להיווצרות 100% של גידולים, עד למינוני תאים ללא היווצרות גידול וטווח סביר בין לבין. התדירות של תאים יוזמי גידול בדגימות ראשוניות יכולה להיות משתנה, ובמקרים שבהם לגידולי שד יש מספר נמוך מאוד או אוכלוסיות הטרוגניות של תאים יוזמי גידול, ביצוע LDA יכול להיות מאתגר במיוחד42. במקרים אלה, הזרקת מספר גדול יותר של תאים תהיה מתאימה יותר להבנת הביולוגיה של סרטן השד.

Figure 4
איור 4: מבחני קסנוגרפט in vivo להערכת תפקוד BCSC. תאי סרטן השד MDA-MB-231 בודדו על-ידי FACS כפי שמתואר באיור 1 והוזרקו למשטח שומן החלב הימני של נקבות עכברות NSG, כמתואר בסעיפים 9.1 עד 9.8 (5 x 105 תאים/עכבר; 4 עכברים/אוכלוסיית תאים). קינטיקה של צמיחת גידולי שד ראשוניים מוצגת עבור אוכלוסיות ALDHhiCD44+CD24- (■) לעומת אוכלוסיות נמוכותשלALDH CD44 נמוך/-CD24+ (□). הנתונים המיוצגים כממוצע ± S.E.M. * = גודל גידול שונה באופן משמעותי מאשר ALDHנמוךCD44 נמוך/- תת-קבוצות באותה נקודת זמן (P < 0.05). נתון זה הותאם מתוך Croker et al.26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גרורות בסרטן השד ועמידות לטיפול הפכו לגורם מרכזי לתמותה בקרב נשים ברחבי העולם. קיומה של תת-אוכלוסייה של תאי גזע מסרטן השד (BCSCs) תורם לעלייה בגרורות 26,43,44,45,46 ולעמידות לטיפול21,47,48. לכן, המיקוד של טיפולים עתידיים צריך לשאוף למיגור BCSCs כדי להשיג תוצאות טיפול טובות יותר, וזה דורש שיטות מדויקות לבידוד ואפיון המאפיינים הפונקציונליים של BCSCs באמצעות שיטות in vitro ו- in vivo.

קווי תאים אימורטליים שמקורם בתת-סוגים שונים של סרטן השד הוכיחו את עצמם כמודלים אפשריים לחקר הביולוגיה של סרטן השד, כולל בידוד ואפיון של BCSCs 26,49,50. יכולת ההתרבות הגבוהה ויכולת ההתפשטות הבלתי מוגבלת של קווי התאים מספקת מערכת מודל אידיאלית לביצוע מחקרים הניתנים לשחזור ופשוטים מבחינה טכנית. עם זאת, בשל המקור השבטי של קווי התאים, הם עלולים שלא לשחזר את ההטרוגניות המוצגת על ידי חולים שונים ו / או על ידי תאים סרטניים בתוך רקמת הגידול. בנוסף, שינויים גנטיים יכולים להירכש במהלך מעבר סדרתי של קווי תאים ועלולים לגרום לשינויים גנוטיפיים או פנוטיפיים שיכולים לבלבל את תוצאות הניסוי51. לעומת זאת, תאים שמקורם בחולים ראשוניים, למרות יכולת ההתרבות וההתפשטות המוגבלת שלהם, עשויים לספק מודל מדויק יותר לזה שנצפה in vivo. עם זאת, דגימות כאלה עשויות להיות קשות יותר לרכישה ולהיות מאתגרות יותר מבחינה טכנית לעבוד איתן. כל הגורמים הללו צריכים להילקח בחשבון בעת בחירת מערכת מודל התחלה שבה לבודד ולאפיין BCSCs.

FACS היא טכניקה נפוצה לבידוד תאים בעלי עניין בהתבסס על ביטוי סמן פני התא52,53. בהתבסס על אנטיגנים על פני התא (CD44 ו-CD24) ופעילות אנזימטית של ALDH, ניתן לבודד BCSCs אנושיים בטוהר גבוה הן מקווי התאים של סרטן השד והן מרקמות הגידול 1,2. יעילות המיון קובעת את טוהר הדגימה הממוינת, ומומלץ למשתמשים לנתח חלק קטן מהדגימה הממוינת עם צבע כדאיות כדי לבדוק את יעילות המיון53,54. יעילות המיון יכולה להיות מבולבלת על ידי גורמים רבים, כולל נוכחות של גושי תאים, מספר גבוה של תאים מתים או גוססים, פיצוי לא תקין של הפלואורוכרומים ו / או נזק לאנטיגנים על פני התא עקב רגישות לטריפסין או קולגןאז במהלך שלבי דיסוציאציה לפני מיון53,54,55,56 . לכן, יצירת השעיה נכונה של תא בודד ושימוש בטכניקות מתאימות של דיסוציאציה של תאים יגבירו את יעילות המיון. בעת ביצוע מיון תאים מולטיפרמטרים, חשוב לבחור פלואורוכרום הממזער את החפיפה הספקטרלית. במקרים מסוימים, שבהם לא ניתן להימנע מחפיפה ספקטרלית, יש להשתמש בבקרה המכילה את כל הפלואורוכרומים למעט אחד (פלואורסצנציה מינוס אחד, FMO) כדי למזער את זליגת האותות הפלואורסצנטיים לערוצים אחרים54. לחלופין, החפיפה הספקטרלית יכולה להצטמצם על ידי בידוד אימונומגנטי של אוכלוסיות תאים לפני בידוד FACS סופי של תאים בעלי עניין56.

בדיקות במבחנה כגון מבחני יצירת המושבה והממוספרה המתוארים בפרוטוקול זה שימשו באופן נרחב כדי לחקור את יכולת ההתחדשות העצמית וההתפשטות של BCSCs 57,58,59,60,61,62. בנוסף, ניתן להשתמש במבחנים אלה כדי להעריך את הפעילות של תרופות טיפוליות שונות על תפקוד BCSC. מספר מסלולי איתות משומרים אבולוציונית יושמו בתחזוקת BCSC63, וגם 64,65,66 ובדיקות ממוספרה64,67 שימשו להערכת הערך של הפרעה טיפולית של מסלולים אלה כהתערבות לחסימת איתות פנימי של BCSC ולהפחתת פעילות BCSC והתקדמות המחלה. בדיקת יצירת מושבה באמצעות תאים ראשוניים יכולה להיות מאתגרת בשל צפיפות תאים נמוכה, שונות בין דגימות וחוסר יכולת ההסתגלות שלה לתנאי מבחנה מבודדים. ניתן להתגבר על אתגרים אלה על ידי גידול BCSCs על שכבת אגר רכה או על ידי קולקולציה שלהם עם פיברובלסטים על צלחת תרבית תאים מצופה קולגן68,69,70. בנוסף, תוספת של גורמי גדילה לאמצעי התרבית (כגון FGF771) עשויה גם לשפר את יכולת יצירת המושבה של תאים שבודדו מדגימות רקמות. בנוסף, עיכול יתר של רקמות באמצעות קולגן או טריפסין במהלך שלב יצירת תרחיף של תא בודד יכול לגרום ליכולת יצירת מושבה נמוכה עד אפסית ולהפחית את היעילות ליצירת ממוספרה31. בשני המבחנים, יש להקפיד לדגור על לוחות הבדיקה באין מפריע כדי למנוע הפרעה למבני המושבה או הכדור בזמן שהם נוצרים. כמו כן, מומלץ למשתמשים להאריך את תקופת הדגירה של תאים ראשוניים (יחסית לקווי תאים) מכיוון שייתכן שייקח זמן רב יותר עד שתאים אלה ייצרו מושבות או כדורים.

שורות רבות של ראיות הדגימו את התפקיד הקריטי של מטריצה חוץ-תאית (ECM)15,17,72 ורכיבים סטרומליים, כגון פיברובלסטים, תאי מערכת החיסון, תאי אנדותל ואדיפוציטים בהשפעה על תפקודי BCSC 15. לפיכך, מודל התרבית התלת-ממדית שאנו מתארים בפרוטוקול זה יכול לספק מערכת ניסויית שימושית המסייעת לסכם מחדש את המיקרו-סביבה של הגידול in vivo בסביבה חוץ-גופית. למרות שמערכת התרבית התלת-ממדית דומה מאוד למיקרו-סביבה של הגידול בחולי סרטן, תחזוקה ארוכת טווח של תאים כאורגנואידים יכולה להיות קשה. בנוסף, אופטימיזציה של תנאי התרבות התלת-ממדית והיכולת לחקור במדויק את יכולת ההתחדשות העצמית והבידול של BCSCs היא מאתגרת73. היעילות של אורגנואידים שנוצרו במערכת תרבית תלת-ממדית תלויה בגורמי הצמיחה המשלימים במדיה התרבית74. היעדר רכיבי מפתח (לדוגמה, מעכב ROCK) עלול להוביל להיווצרות אורגנואידית מופחתת או ללא היווצרות74. יש לחדש את המדיה כל 3-4 ימים כדי לשמור על תפקוד תאי אופטימלי ועל קיימות התרבית. על מנת לסכם את התנאים והתגובה in vivo, חשוב תמיד לאפשר לתאים ליצור אורגנואידים לפני כל סוג של טיפול אקסוגני75. תאים שמקורם בדגימות חולים צריכים לתת מספיק זמן ליצירת אורגנואידים, במיוחד אם המטרה היא להעריך את תגובת התרופה75.

בעוד ששיטות in vitro אלה הן כלים ניסיוניים אטרקטיביים ונגישים לאפיון תפקוד BCSC, לא ניתן לחקור ביעילות מלאה את ההטרוגניות של הגידול ואת ההשפעה של מיקרו-סביבה של גידולים על התנהגות BCSC. לפיכך, יש להשלים את המבחנים במבחנה עם מודלים של in vivo xenograft במידת האפשר, על מנת לאמת עוד יותר ממצאים ניסיוניים הקשורים לביולוגיה של BSCS ו/או לתגובה לטיפולים חדשניים. מודלים שונים in vivo שימשו מחקר BCSC גידולים וגרורות. מודלים של עכברים חוץ רחמיים (חריטה תת עורית) ואורתוטופיים (השתלת MFP) שימשו ליצירת גידולי שד ולהערכת שינויים אורכיים בצמיחת הגידול לאורך זמן50. למרות שניתן להשתמש בשתי גישות ההזרקה in vivo כדי לחקור את הביולוגיה של BCSC, המרכיבים המקומיים הקשורים לסטרומלית ולכלי הדם של ה- MFP מאפשרים סיכום מדויק יותר של התקדמות גידול השד הראשוני כפי שנצפה בחולים, ולכן הזרקת MFP עדיפה76,77,78. לבסוף, השימוש בעכברים מדוכאי חיסון נדרש לצורך השתלת BCSCs אנושיים וצמיחת גידולים, וזה מונע שילוב תפקידם של תאי מערכת החיסון במחקרי גידולים וגרורות79. לאחרונה, מגבלה זו טופלה באמצעות שימוש בעכברים אנושיים שבהם מערכת החיסון האנושית משוחזרת באמצעות השתלת מח עצם לפני תחילת מחקרי xenograft80,81,82. עם זאת, דגמים אלה יקרים ומאתגרים מבחינה טכנית, ולכן הם עדיין לא בשימוש נפוץ83.

לסיכום, כאן סיפקנו פרוטוקול לבידוד של BCSCs אנושיים הן מקווי תאי סרטן השד והן מדגימות רקמת גידול שמקורן בחולה. תיארנו גם פרוטוקולי in vitro ו-in vivo עבור מבחנים במורד הזרם שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את תפקוד BCSC, עם היכולת להיות מותאמים למקורות שונים של תאי סרטן השד והגמישות להתבצע בתנאי ניסוי שונים. פרוטוקולים אלה יהיו שימושיים עבור חוקרים המתעניינים בתאי גזע סרטניים, ביולוגיה של סרטן השד ופיתוח טיפולי, במטרה הסופית לשפר את תוצאות המטופלות בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על הדיונים המועילים והתמיכה שלהם. המחקר שלנו על תאי גזע של סרטן השד ומיקרו-סביבה של הגידול ממומן על ידי מענקים ממכון המחקר של האגודה הקנדית לחקר הסרטן ומתוכנית סרטן השד של משרד ההגנה האמריקאי (מענק # BC160912). V.B. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מערבית (אוניברסיטת ווסטרן), וגם A.L.A. וגם V.B. נתמכים על ידי האגודה לסרטן השד של קנדה. C.L. נתמכת על ידי מלגת בוגר ונייר קנדה מממשלת קנדה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1x106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  2. Shipitsin, M., et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity. Cancer Cell. 11 (3), 259-273 (2007).
  3. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  4. Sulaiman, A., et al. Dual inhibition of Wnt and Yes-associated protein signaling retards the growth of triple-negative breast cancer in both mesenchymal and epithelial states. Molecular Oncology. 12 (4), 423-440 (2018).
  5. Debeb, B. G., et al. Histone deacetylase inhibitors stimulate dedifferentiation of human breast cancer cells through WNT/β-catenin signaling. Stem Cells. 30 (11), 2366-2377 (2012).
  6. Klutzny, S., et al. PDE5 inhibition eliminates cancer stem cells via induction of PKA signaling. Cell Death & Disease. 9 (2), 192 (2018).
  7. DiMeo, T. A., et al. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Research. 69 (13), 5364-5373 (2009).
  8. Liu, C. C., Prior, J., Piwnica-Worms, D., Bu, G. LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (11), 5136-5141 (2010).
  9. Miller-Kleinhenz, J., et al. Dual-targeting Wnt and uPA receptors using peptide conjugated ultra-small nanoparticle drug carriers inhibited cancer stem-cell phenotype in chemo-resistant breast cancer. Biomaterials. 152, 47-62 (2018).
  10. Mamaeva, V., et al. Inhibiting Notch Activity in Breast Cancer Stem Cells by Glucose Functionalized Nanoparticles Carrying γ-secretase Inhibitors. Molecular Therapy. 24 (5), 926-936 (2016).
  11. Ithimakin, S., et al. HER2 drives luminal breast cancer stem cells in the absence of HER2 amplification: implications for efficacy of adjuvant trastuzumab. Cancer Research. 73 (5), 1635-1646 (2013).
  12. Koike, Y., et al. Anti-cell growth and anti-cancer stem cell activities of the non-canonical hedgehog inhibitor GANT61 in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 24 (5), 683-693 (2017).
  13. Sun, Y., et al. Estrogen promotes stemness and invasiveness of ER-positive breast cancer cells through Gli1 activation. Molecular Cancer. 13, 137 (2014).
  14. Colavito, S. A., Zou, M. R., Yan, Q., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) expression in claudin-low breast cancer and crosstalk with the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB) pathway. Breast Cancer Research. 16 (5), 444 (2014).
  15. Bhat, V., Allan, A. L., Raouf, A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stem Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers. 11 (9), (2019).
  16. Pio, G. M., Xia, Y., Piaseczny, M. M., Chu, J. E., Allan, A. L. Soluble bone-derived osteopontin promotes migration and stem-like behavior of breast cancer cells. PloS One. 12 (5), 0177640 (2017).
  17. Chu, J. E., et al. Lung-derived factors mediate breast cancer cell migration through CD44 receptor-ligand interactions in a novel ex vivo system for analysis of organ-specific soluble proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-191 (2014).
  18. McGowan, P. M., et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer. Molecular Cancer Research. 9 (7), 834-844 (2011).
  19. Mao, J., et al. ShRNA targeting Notch1 sensitizes breast cancer stem cell to paclitaxel. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (6), 1064-1073 (2013).
  20. Duru, N., et al. HER2-associated radioresistance of breast cancer stem cells isolated from HER2-negative breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6634-6647 (2012).
  21. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  22. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  23. Calcagno, A. M., et al. Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics. Journal of the National Cancer Institute. 102 (21), 1637-1652 (2010).
  24. Feng, Y., et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 5 (2), 77-106 (2018).
  25. Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5429-5438 (2014).
  26. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8), 2236-2252 (2009).
  27. Morel, A. P., et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PloS One. 3 (8), 2888 (2008).
  28. Muntimadugu, E., Kumar, R., Saladi, S., Rafeeqi, T. A., Khan, W. CD44 targeted chemotherapy for co-eradication of breast cancer stem cells and cancer cells using polymeric nanoparticles of salinomycin and paclitaxel. Colloids Surf B Biointerfaces. 143, 532-546 (2016).
  29. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  30. Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R. E. Clonogenic cell survival assay. Methods in Molecular Medicine. 110, 21-28 (2005).
  31. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  32. Shin, C. S., Kwak, B., Han, B., Park, K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Molecular Pharmaceutics. 10 (6), 2167-2175 (2013).
  33. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  34. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse models of cancer. Annual Review of Pathology. 6, 95-119 (2011).
  35. Lyons, S. K. Advances in imaging mouse tumour models in vivo. Journal of Pathology. 205 (2), 194-205 (2005).
  36. Margaryan, N. V., et al. The Stem Cell Phenotype of Aggressive Breast Cancer Cells. Cancers. 11 (3), (2019).
  37. Ma, F., et al. Enriched CD44(+)/CD24(-) population drives the aggressive phenotypes presented in triple-negative breast cancer (TNBC). Cancer Letters. 353 (2), 153-159 (2014).
  38. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER(+) Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388-401 (2019).
  39. Phan-Lai, V., et al. Three-dimensional scaffolds to evaluate tumor associated fibroblast-mediated suppression of breast tumor specific T cells. Biomacromolecules. 14 (5), 1330-1337 (2013).
  40. O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  41. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  42. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  43. Abraham, B. K., et al. Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis. Clinical Cancer Research. 11 (3), 1154-1159 (2005).
  44. Balic, M., et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype. Clinical Cancer Research. 12 (19), 5615-5621 (2006).
  45. Charafe-Jauffret, E., et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (1), 45-55 (2010).
  46. Marcato, P., et al. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 29 (1), 32-45 (2011).
  47. Lacerda, L., Pusztai, L., Woodward, W. A. The role of tumor initiating cells in drug resistance of breast cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 13 (4-5), 99-108 (2010).
  48. Liu, S., Wicha, M. S. Targeting breast cancer stem cells. Journal of Clinical Oncology. 28 (25), 4006-4012 (2010).
  49. D'Angelo, R. C., et al. Notch reporter activity in breast cancer cell lines identifies a subset of cells with stem cell activity. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (3), 779-787 (2015).
  50. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  51. Forozan, F., et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Cancer Research. 60 (16), 4519-4525 (2000).
  52. Lanier, L. L. Just the FACS. Journal of Immunology. 193 (5), 2043-2044 (2014).
  53. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 19-39 (2007).
  54. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  55. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  56. Sun, C., et al. Immunomagnetic separation of tumor initiating cells by screening two surface markers. Scientific Reports. 7, 40632 (2017).
  57. Rodríguez, C. E., et al. Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the HER2 modulation in 3D culture. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (2), 1381-1391 (2018).
  58. Kim, D. W., Cho, J. Y. NQO1 is Required for β-Lapachone-Mediated Downregulation of Breast-Cancer Stem-Cell Activity. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), (2018).
  59. Xu, L. Z., et al. p62/SQSTM1 enhances breast cancer stem-like properties by stabilizing MYC mRNA. Oncogene. 36 (3), 304-317 (2017).
  60. Huang, X., et al. Breast cancer stem cell selectivity of synthetic nanomolar-active salinomycin analogs. BMC Cancer. 16, 145 (2016).
  61. Liu, T. J., et al. CD133+ cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer. Oncogene. 32 (5), 544-553 (2013).
  62. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  63. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  64. Palomeras, S., Ruiz-Martínez, S., Puig, T. Targeting Breast Cancer Stem Cells to Overcome Treatment Resistance. Molecules. 23 (9), (2018).
  65. McClements, L., et al. Targeting treatment-resistant breast cancer stem cells with FKBPL and its peptide derivative, AD-01, via the CD44 pathway. Clinical Cancer Research. 19 (14), 3881-3893 (2013).
  66. Berger, D. P., Henss, H., Winterhalter, B. R., Fiebig, H. H. The clonogenic assay with human tumor xenografts: evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology. 1 (5), 333-341 (1990).
  67. Tian, J., et al. Dasatinib sensitises triple negative breast cancer cells to chemotherapy by targeting breast cancer stem cells. British Journal of Cancer. 119 (12), 1495-1507 (2018).
  68. Samoszuk, M., Tan, J., Chorn, G. Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Research. 7 (3), 274-283 (2005).
  69. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  70. Xu, Y., Hu, Y. D., Zhou, J., Zhang, M. H. Establishing a lung cancer stem cell culture using autologous intratumoral fibroblasts as feeder cells. Cell Biology International. 35 (5), 509-517 (2011).
  71. Palmieri, C., et al. Fibroblast growth factor 7, secreted by breast fibroblasts, is an interleukin-1beta-induced paracrine growth factor for human breast cells. Journal of Endocrinology. 177 (1), 65-81 (2003).
  72. Bourguignon, L. Y., Peyrollier, K., Xia, W., Gilad, E. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (25), 17635-17651 (2008).
  73. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  74. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  75. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  76. Okano, M., et al. Orthotopic Implantation Achieves Better Engraftment and Faster Growth Than Subcutaneous Implantation in Breast Cancer Patient-Derived Xenografts. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  77. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  78. Zhang, W., et al. Comparative Study of Subcutaneous and Orthotopic Mouse Models of Prostate Cancer: Vascular Perfusion, Vasculature Density, Hypoxic Burden and BB2r-Targeting Efficacy. Scientific Reports. 9 (1), 11117 (2019).
  79. Kim, R., Emi, M., Tanabe, K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology. 121 (1), 1-14 (2007).
  80. Rosato, R. R., et al. Evaluation of anti-PD-1-based therapy against triple-negative breast cancer patient-derived xenograft tumors engrafted in humanized mouse models. Breast Cancer Research. 20 (1), 108 (2018).
  81. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 99 (2018).
  82. Meraz, I. M., et al. An Improved Patient-Derived Xenograft Humanized Mouse Model for Evaluation of Lung Cancer Immune Responses. Cancer Immunol Res. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  83. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. Biodrugs. 32 (3), 245-266 (2018).

Tags

חקר הסרטן גיליון 164 תאי גזע של סרטן השד (BCSC) מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) בדיקה יוצרת מושבה בדיקת ממוספרה מודל תרבית תלת-ממדית מודל גידול in vivo
בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., … More

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter