Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Isolering och funktionell bedömning av mänskliga bröstcancerstamceller från cell- och vävnadsprover

Published: October 2, 2020 doi: 10.3791/61775
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Western University, 3Department of Oncology, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Detta experimentella protokoll beskriver isoleringen av BCSC från bröstcancercell- och vävnadsprover samt in vitro - och in vivo-analyser som kan användas för att bedöma BCSC-fenotyp och funktion.

Abstract

Bröstcancerstamceller (BCSC) är cancerceller med ärvda eller förvärvade stamcellsliknande egenskaper. Trots sin låga frekvens är de starkt bidragande orsaker till bröstcancerinitiering, återfall, metastasering och terapiresistens. Det är absolut nödvändigt att förstå biologin hos bröstcancerstamceller för att identifiera nya terapeutiska mål för att behandla bröstcancer. Bröstcancerstamceller isoleras och karakteriseras baserat på uttryck av unika cellytmarkörer såsom CD44, CD24 och enzymatisk aktivitet av aldehyddehydrogenas (ALDH). DessaALDH-högaCD44 + CD24-celler utgör BCSC-populationen och kan isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för nedströms funktionella studier. Beroende på den vetenskapliga frågan kan olika in vitro - och in vivo-metoder användas för att bedöma BCSC: s funktionella egenskaper. Här tillhandahåller vi ett detaljerat experimentellt protokoll för isolering av humana BCSC från både heterogena populationer av bröstcancerceller såväl som primär tumörvävnad erhållen från bröstcancerpatienter. Dessutom belyser vi nedströms in vitro - och in vivo-funktionella analyser inklusive kolonibildande analyser, mammosfäranalyser, 3D-odlingsmodeller och tumörxenograftanalyser som kan användas för att bedöma BCSC-funktionen.

Introduction

Att förstå de cellulära och molekylära mekanismerna hos mänskliga bröstcancerstamceller (BCSC) är avgörande för att hantera de utmaningar som uppstår vid behandling av bröstcancer. Framväxten av BCSC-konceptet går tillbaka till början av 21-talet, där en liten population av CD44 + CD24- / lågbröstcancerceller visade sig kunna generera heterogena tumörer hos möss 1,2. Därefter observerades att humana bröstcancerceller med hög enzymatisk aktivitet av aldehyddehydrogenas (ALDHhög) också uppvisade liknande stamcellsliknande egenskaper3. Dessa BCSC representerar en liten population av celler som kan självförnyas och differentieras, vilket bidrar till den heterogena naturen hos bulktumörer 1,2,3. Ackumulerande bevis tyder på att förändringar i evolutionärt bevarade signalvägar driver BCSC-överlevnad och underhåll 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Dessutom har cellens yttre mikromiljö visat sig spela en avgörande roll för att diktera olika BCSC-funktioner15,16,17. Dessa molekylära vägar och de yttre faktorer som reglerar BCSC-funktionen bidrar till bröstcanceråterfall, metastaser18 och utveckling av resistens mot terapier 19,20,21, med den återstående förekomsten av BCSC efter behandling som utgör en stor utmaning för den totala överlevnaden för bröstcancerpatienter22,23 . Preklinisk utvärdering av dessa faktorer är därför mycket viktig för att identifiera BCSC-inriktade terapier som kan vara fördelaktiga för att uppnå bättre behandlingsresultat och förbättrad total överlevnad hos bröstcancerpatienter.

Flera in vitro-modeller för human bröstcancercellinje och in vivo humana xenograftmodeller har använts för att karakterisera BCSCs 24,25,26,27,28,29. Cellinjernas förmåga att kontinuerligt återbefolka efter varje successiv passage gör dessa till ett idealiskt modellsystem för att utföra omics-baserade och farmakogenomiska studier. Cellinjer misslyckas emellertid ofta med att rekapitulera den heterogenitet som observerats i patientprover. Därför är det viktigt att komplettera cellinjedata med patient-härledda prover. Isolering av BCSC i sin renaste form är viktigt för att möjliggöra detaljerad karakterisering av BCSC. Att uppnå denna renhet beror på valet av fenotypiska markörer som är specifika för BCSC. För närvarande används ALDHhögCD44 + CD24-cellfenotyp oftast för att skilja och isolera humana BCSC från bulkbröstcancercellpopulationer med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för maximal renhet1, 3,26. Dessutom kan egenskaperna hos isolerade BCSC: er såsom självförnyelse, spridning och differentiering utvärderas med hjälp av in vitro- och in vivo-tekniker.

Till exempel kan in vitro-kolonibildande analyser användas för att bedöma förmågan hos en enda cell att självförnya sig för att bilda en koloni med 50 celler eller mer i närvaro av olika behandlingsförhållanden30. Mammosfäranalyser kan också användas för att bedöma bröstcancercellernas självförnyelsepotential under förankringsoberoende förhållanden. Denna analys mäter enskilda cellers förmåga att generera och växa som sfärer (blandning av BCSC och icke-BCSC) vid varje successiv passage i serumfria icke-vidhäftande odlingsförhållanden31. Dessutom kan 3-dimensionella (3D) odlingsmodeller användas för att bedöma BCSC-funktionen, inklusive cell-cell- och cellmatrisinteraktioner som nära rekapitulerar in vivo-mikromiljön och möjliggör undersökning av aktiviteten hos potentiella BCSC-riktade terapier32. Trots de olika tillämpningarna av in vitro-modeller är det svårt att modellera komplexiteten hos in vivo-förhållanden med endast in vitro-analyser. Denna utmaning kan övervinnas genom att använda musxenograftmodeller för att utvärdera BCSC-beteende in vivo. I synnerhet fungerar sådana modeller som ett idealiskt system för att bedöma bröstcancermetastaser33, undersöka interaktioner med mikromiljön under sjukdomsprogression 34, in vivo-avbildning 35 och för att förutsäga patientspecifik toxicitet och effekt av antitumörmedel34.

Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning för isolering av human ALDHhögCD44 + CD24- BCSC vid maximal renhet från bulkpopulationer av heterogena bröstcancerceller. Vi ger också en detaljerad beskrivning av tre in vitro-tekniker (kolonibildande analys, mammosfäranalys och 3D-odlingsmodell) och en in vivo tumörxenograftanalys som kan användas för att bedöma olika funktioner hos BCSC. Dessa metoder skulle vara lämpliga för användning av utredare som är intresserade av att isolera och karakterisera BCSC från humana bröstcancercellinjer eller primärpatient-härledda bröstcancerceller och tumörvävnad i syfte att förstå BCSC-biologi och / eller undersöka nya BCSC-riktade terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Insamling av patient-härledda kirurgiska eller biopsiprover direkt från samtyckande bröstcancerpatienter utfördes enligt godkänt humant etiskt protokoll godkänt av institutionens etiska nämnd. Alla möss som användes för att generera patient-härledda xenograftmodeller upprätthölls och inrymdes i en institutionsgodkänd djuranläggning. Tumörvävnaden från patient-härledda xenograftmodeller med möss genererades enligt godkänt etikprotokoll godkänt av den institutionella djurvårdskommittén.

1. Beredning av cellinjer

  1. Utför alla cellodlings- och färgningsprocedurer under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp. Använd sterila cellodlingsskålar/kolvar och reagenser.
  2. Håll humana bröstcancerceller vid 37 ° C med 5%CO2 i definierade medier kompletterat med fetalt bovint serum (FBS) och nödvändiga tillväxtfaktorer som är specifika för varje cellinje.
  3. Behåll musens NIH3T3 fibroblastcellkulturer (för användning i kolonibildande analyser) vid 37 ° C med 5% CO2 i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) kompletterat med 10% FBS.
  4. För alla kulturer, fyll på gamla medier var 2-3: e dag med färska medier. När kulturerna når 75-80% sammanflöde, subkultur i flera sterila cellodlingskolvar.

2. Beredning av bröstcancertumörvävnad

  1. Samla in de patient-härledda kirurgiska eller biopsiproverna direkt från samtyckande bröstcancerpatienter enligt ett humant etiskt protokoll som godkänts av den institutionella etiska nämnden.
  2. Därefter samla in och generera tumörvävnad från patient-härledda xenograftmodeller med möss enligt ett djuretiskt protokoll som godkänts av institutionens djurvårdskommitté.
  3. Samla alla tumörvävnader under sterila förhållanden i ett 50 ml sterilt koniskt rör innehållande 30 ml DMEM: F12-media, håll på is och bearbeta proverna enligt beskrivningen nedan inom 2 timmar efter insamling.

3. Generering av encelliga suspensioner av bröstcancerceller

  1. Aspirera media från kolven som innehåller ett monolager av bröstcancerceller som är 60-80% sammanflytande (celllinjer val). Tvätta cellerna med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Aspirera PBS och tillsätt lämplig celldissociationslösning (t.ex. Trypsin:EDTA; precis tillräckligt för att täcka monolagret av celler) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur (rekommenderas) eller vid 37 °C.
  2. Tillsätt 5 ml odlingsmedia för att neutralisera aktiviteten hos celldissociationslösningen.
  3. Överför den resulterande dissocierade celllösningen till ett 50 ml koniskt rör och centrifugera vid 1000 x g i 5 minuter.
  4. Kassera supernatant och återsuspendera cellpelleten i 5 ml 1x PBS. Räkna cellerna med en hemocytometer och ett mikroskop.
    OBS: Observera för cellklumpning i hemocytometern. Upprepa celldissociationssteget om encellssuspension inte har bildats.
  5. Efter cellräkning, centrifugera cellsuspensionen vid 1000 x g i 5 minuter, kassera supernatant och återsuspendera cellpelleten i ALDH-substratbuffert i en koncentration av 1 x 106 celler / ml.

4. Generering av encellssuspension från vävnadsprover

  1. Hacka tumörvävnaden med kirurgiska blad med hjälp av en korsningsteknik för att få mindre bitar av cirka 1 mm i storlek. Överför vävnadsbitarna till ett nytt 50 ml koniskt rör som innehåller 10 ml dissociationsbuffert (1X kollagenas i DMEM: F12). Förslut det koniska röret med parafilm och inkubera vid 37 °C i en skakinkubator i 40 minuter.
    OBS: Om det inte finns en skakinkubator, placera röret i ett 37 °C vattenbad och blanda röret genom att virvla var 5-10: e minut.
  2. Pelletera den smälta vävnaden genom centrifugering av provet vid 530 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten och tillsätt 5 ml trypsin. Pipettera upp och ner med 1 ml pipett (inställd på 750 μl märke) för att störa pelleten och inkubera i ett 37 ° C vattenbad i 5 minuter. Efter inkubation, pipettera upp och ner kraftigt för att frigöra enstaka celler.
  3. Fyll på den totala volymen i röret till 25 ml med DMEM:F12-media och centrifugera vid 1000 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml dispase-DNas-lösning. Inkubera i ett 37 °C vattenbad i 5 minuter.
  4. Fyll på den totala volymen i röret till 10 ml med PBS. Blanda genom pipettering upp och ner, för den resulterande cellsuspensionen genom en 40 μm cellsil fäst vid ett nytt 50 ml koniskt rör. Centrifugera vid 1000 x g i 5 min.
  5. Kassera supernatant och återsuspendera cellpelleten i 5 ml 1x PBS. Räkna cellerna och fullständig beredning av cellsuspensionen enligt beskrivningen i steg 3.4 och 3.5.

5. Isolering av bröstcancerstamceller (BCSC)

  1. Etikettflödesrör för den ofärgade kontrollen, encellsfärgningskontroller (DEAB-kontroll, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), det negativa kontrollröret (färgat med DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 och 7AAD), fluorescerande minus ett (FMO) -kontroll och "sorteringsröret" (färgat med ALDH, CD44, CD24 och 7AAD).
  2. Överför 500 μl (0,5 x 106 celler) av cellsuspensionerna från steg 3.5 eller steg 4.5 till varje rör som endast är märkt celler, CD44, CD24 och 7AAD. Lägg rören på is tills de används.
  3. Överför 2 ml prov (2 x 106 celler) till respektive "ALDH" -rör. Tillsätt 5 μL DEAB till "DEAB-kontrollrören" och "negativ kontroll" och täck det ordentligt. Tillsätt 10 μl ALDH-substrat till ALDH-röret, blanda väl genom virvel och överför omedelbart 500 μl till motsvarande "DEAB-kontrollrör" och "negativt kontrollrör". Sätt tillbaka "DEAB-kontrollrören", "negativ kontroll" och "ALDH-rören" och inkubera vid 37 °C i 30–60 minuter (överstiga inte 60 minuter).
    OBS: Den optimala inkubationstiden kan kräva optimering beroende på cellinjen. Skydda alltid ALDH-substratet och rören som innehåller färgade celler från ljus.
  4. Efter inkubation, centrifugera alla prover i 5 min vid 250 x g. Återsuspendera cellerna i 500 μL ALDH-substratbuffert. Lägg till tillverkarens rekommenderade eller användaroptimerade koncentration av anti-CD44-PE och anti-CD24-PE-Cy7 antikroppscocktail och inkubera vid 4 °C i 30 minuter. Lägg till anti-CD44-PE- och anti-CD24-PE-Cy7-antikroppar till respektive "CD44" och "CD24" -märkta rör.
  5. Efter inkubation, centrifugera alla prover vid 250 x g i 5 minuter. Återsuspendera cellerna i 500 μL ALDH-substratbuffert. Inkubera "negativt kontrollrör", "Sortera rör" och "7ADD"-röret med 7AAD (föreslagen koncentration: 0,25 μg/1 x 106 celler) i 10 minuter på is.
    OBS: ALDH-aktiviteten detekteras i den gröna fluorescerande kanalen, därför bör en fluorokrom med ett annat kompatibelt emissionsspektrum användas. Om spektral överlappning observeras under flödescytometri med flera parametrar, bör enfärgskontroller och FMO-kontroll användas som vägledning för att möjliggöra kompensation mellan fluorokromer för att minimera spridning av fluorescerande signal till andra kanaler.
  6. Ställ in analysprotokollet på FACS-instrumentet som förberedelse för provanalys. Skapa spridningsdiagram (framåt vs sidospridning, framåtspridning vs fluorescerande kanaler).
  7. Använd den ofärgade kontrollen och justera fotomultiplikatorn för att separera skräp från hela cellpopulationen och justera lysrörsspänningen för att flytta hela cellpopulationen runt den första loggskalan (101). Med hjälp av DEAB-styrningen flyttar du hela cellpopulationen inom den andra logskalan (102) genom att justera den gröna fluorescerande spänningskanalen.
  8. Analysera alla enskilda färgningskontroller först (ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7) och 7AAD och FMO-kontroll, justera spänningen för att separera färgade från ofärgade celler och för att minimera spill av fluorescerande signaler till andra kanaler.
  9. Grind på den positiva populationen för varje enskilt färgat cellprov. Med hjälp av det negativa kontrollröret, grind för viabilitet (7AAD negativ), ALDHlåg och ALDHhögcelliga populationer (representativ grindstrategi visas i figur 1B).
  10. Analysera flerparameterfärgade prover av intresse för att isolera BCSC: er. Använd de livskraftiga ALDH-låga ochALDH-höga grindarna, välj för CD44 + CD24- (BCSC) respektive CD44-CD24 + (icke-BCSC) cellpopulation (Figur 1B).
  11. Samla in livskraftiga BCSC och icke-BCSC i uppsamlingsmedier i sterila uppsamlingsrör (populationer från två representativa cellinjer som visas i figur 2A&B). Använd sorterade celler för nedströms in vitro - och in vivo-analyser enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Förutom in vitro - och in vivo-analyser som beskrivs nedan kan BCSC valideras genom att mäta uttrycket av pluripotenta markörer som SOX2, OCT4 och NANOG via standardimmunoblottningstekniker.

Figure 1
Figur 1: FACS-gatingstrategi för isolering av BCSC från bröstcancercellinjer och vävnadsprover. A) Flödesschema som beskriver förfarandet för BCSC-isolering. (B) Representativa FACS-diagram som visar den sorteringsstrategi som används för att isolera livskraftiga BCSC och icke-BCSC från en heterogen cellpool. MDA-MB-231 mänskliga bröstcancerceller är samtidigt märkta med 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE och ALDH-substratet. Cellundergrupper isolerades med hjälp av ett fyrfärgsprotokoll på en FACS-maskin. Celler väljs baserat på förväntad ljusspridning, sedan för singlets och viabilitet baserat på 7-AAD-uteslutning. Celler analyseras sedan för ALDH-aktivitet och de översta 20% mest positiva väljs somALDH-högpopulationen, medan de nedre 20% av cellerna med den lägsta ALDH-aktiviteten ansågs varaALDH-låga. Slutligen väljs 50% av ALDH-lågcellerna vidare baserat på en CD44låg / -CD24 + fenotyp, och 50% av ALDH-högcellerna väljs baserat på CD44 + CD24- fenotyp. Denna siffra har anpassats från Chu et al.17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: BCSCs proportioner är varierande i olika bröstcancercellinjer. Representativ bild som visar den differentiella andelen BCSC och icke-BCSC i (A) SUM159 och (B) MDA-MD-468 trippelnegativa bröstcancercellinjer efter märkning och sortering enligt beskrivningen i figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Kolonibildande analys

  1. Återsuspendera cellerna av intresse (sorterade celler från steg 5.11 eller osorterade celler från steg 3.5 eller 4.5) i kompletta medier.
  2. Märk tre flödesrör för 1 x 10 2, 2 x 10 2 och 5 x 102 celler. Lägg till 2 ml komplett media och överför lämpligt cellnummer (sorterat från steg 5.11 eller osorterade celler från steg 3.5 eller 4.5) i respektive rör. Blanda celllösningarna noggrant genom att pipettera den upp och ner 5 gånger.
  3. Plåta cellerna i en 6-brunnsplatta och fördela cellsuspensionen genom att försiktigt virvla plattorna för att få jämn fördelning av celler.
  4. Inkubera plattorna i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator tills kolonier dyker upp (där kolonier = ≥ 50 celler per koloni). Fyll försiktigt på media två gånger i veckan utan att störa kolonibildning.
  5. Aspirera media och tvätta en gång med 1 ml PBS. Tillsätt 0,5 ml 0,05% kristallviolett lösning i varje brunn och inkubera plattan i 30 minuter. Ta bort överflödig kristallviolett fläck genom att tvätta med 2 ml vatten. Upprepa tvättsteget tills bakgrundsfärgningen har tagits bort.
  6. Använd ett mikroskop med 4x och 10x förstoring, räkna och registrera det totala antalet kolonier som genereras (representativa bilder visas i figur 3A).
  7. Beräkna frekvensen för kolonibildning enligt följande: Frekvens (%) = (# av bildade kolonier / antal celler sådda) x 100. Till exempel, om 25 kolonier genereras från 1 x 102 celler, är frekvensen för kolonibildning, Frekvens = (25/100) x100 = 25%.
  8. Alternativt kan du ersätta steg 6.1 till 6.4 med en alternativ metod som involverar samodling med fibroblaster, som ger ett mikromiljöstöd för BCSC genom produktion av nödvändiga tillväxt- och överlevnadsfaktorer.
  9. Förbelägga cell 60 mm odlingsskålar med typ I bovint kollagen (1 på 30 spädning av 3 mg/ml kollagen). Låt kollagen polymerisera i 30 minuter i en 37 °C inkubator. Aspirera det opolymeriserade kollagenet och tvätta plattan två gånger med 1x PBS. Täck den kollagenbelagda plattan med 1 ml PBS och lägg den åt sidan vid rumstemperatur tills den används.
  10. Märk tre flödesrör för 1 x 10 3, 5 x 103 och 1 x 104 celler. Tillsätt 4 ml kolonibildande analysmedium och överför lämpligt antal celler (sorterade från steg 5.11 eller osorterade celler från steg 3.5 eller 4.5) till respektive rör. Lägg till bestrålade NIH3T3-fibroblaster för mus (4 x 104 celler/ml media). Blanda celllösningar noggrant genom att pipettera upp och ner 5 gånger.
  11. Aspirera PBS från den kollagenbelagda odlingsskålen från steg 6.1 och platta cellblandningen på var och en av cellodlingsplattorna enligt beskrivningen i steg 6.3.
  12. Inkubera plattorna i en 37 °C, 5%CO2-inkubator och lämna dem ostörda i 7-10 dagar eller tills kolonier bildas, utan att fylla på media. Räkna och registrera det totala antalet kolonier som genereras enligt beskrivningen i steg 6.6 och 6.7.

7. Mammosfäranalys

  1. Återsuspendera cellerna av intresse (sorterade celler från steg 5.11 eller osorterade celler från steg 3.5 eller 4.5) i kompletta mammosfärmedier och plattceller med en sådddensitet på 5 x 10 2 celler/cm2 i ett 96 brunns ultralågt fästcellsodlingsplatta.
    OBS: Cellsåddstätheten bör optimeras för olika cellinjer.
  2. Inkubera odlingsplattorna i 5-10 dagar i en 37 °C inkubator med 5%CO2. Fyll försiktigt på media två gånger i veckan utan att störa mammosfärbildning.
  3. Efter inkubation räknar du antalet mammosfärer som genereras i varje brunn med hjälp av ett mikroskop; där mammosfärer definieras som bröstcancercellkluster större än 100 μm i diameter (representativa bilder som visas i figur 3B).
  4. Beräkna mammosfärbildningseffektiviteten (MFE) enligt följande: MFE (%) = (antal mammosfärer per brunn)/ (antal celler sådda per brunn) x 100 (dvs. om 5 mammosfärer genereras av 1 x 102 celler i en brunn, då MFE = (5/100) x 100 = 5%).
  5. För att subkulturera mammosfärer, överför försiktigt mediet som innehåller mammosfärinnehåll till ett nytt 50 ml koniskt rör och centrifugera media vid 1000 x g i 5 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten, återupptäck cellpelleten i 500 μl trypsin och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
  6. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml komplett mammosfärmedium. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och platta om cellerna i en ultralåg bindningscellodlingsplatta enligt beskrivningen i steg 7.1.
    OBS: Förutom subodling kan mammosfär-härledda celler också analyseras ytterligare av FACS för att bedöma BCSC-fenotyp och / eller erhålla rena populationer av BCSC för andra nedströms analyser.
  7. För att bestämma antalet mammosfärinitierande celler som finns i dina cellpopulationer, använd en alternativ metod som involverar sfärbegränsande utspädningsanalys (SLDA). Plattceller i seriella utspädningar med höga till låga cellnummer i en 96-brunns ultralåg fästcellodlingsplatta, med den högsta utspädningen som resulterar i mindre än en cell per brunn.
  8. Inkubera odlingsplattan i 10-14 dagar i en 37 °C inkubator med 5%CO2 och lämna dem ostörda för att undvika cellaggregering.
  9. Efter inkubation räknar du antalet mammosfärer som genereras i varje brunn med hjälp av ett mikroskop; där mammosfärer definieras som bröstcancercellkluster större än 100 μm i diameter. Beräkna den sfärinitierande frekvensen och signifikansen med hjälp av ELDA-programvara (Extreme Limiting Dilution Analysis) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).

8.3D kulturmodell

  1. Beroende på den experimentella frågan, använd källarmembranextrakt (BME) med eller utan tillväxtfaktorer (reducerad). För att utvärdera effekten av individuell tillväxtfaktor på cancerceller, använd tillväxtfaktor reducerad BME. Det hjälper också till att minimera de icke-specifika effekterna av endogena tillväxtfaktorer som finns i BME.
    OBS: BME stelnar över 10 °C. Håll alltid BME på is även under upptiningssteget.
  2. Tillsätt försiktigt 50 μL BME per brunn i en 96-brunnsplatta utan att skapa luftbubblor och låt den polymeriseras vid 37 °C i 1 timme. Efter 10 minuters inkubation, tillsätt 100 μL PBS för att undvika torkning av gelskiktet.
  3. Återsuspendera de sorterade cellerna från steg 5.11 eller osorterade celler från steg 3.5 eller 4.5 i en koncentration av 5 x 103 till 5 x 104/200 μL i 3D-odlingsmedier.
  4. När BME har polymeriserats, avlägsna PBS, tillsätt 200 μL cellsuspension till varje brunn och inkubera i 37 °C inkubator med 5%CO2. Lägg till PBS i de omgivande brunnarna för att undvika avdunstning av mediet.
    OBS: Det optimala antalet celler för plätering bör bestämmas innan experimentet ställs in. Beroende på den experimentella frågan kan BCSC odlas ensamma eller med andra celltyper (fibroblaster / endoteliala / immunceller etc.).
  5. Lägg till färska medier på kulturplattorna två gånger i veckan. Behåll kulturer i 10-14 dagar innan du analyserar bildandet av organoider (representativa bilder som visas i figur 3C).
  6. För subodling, aspirera försiktigt mediet och tillsätt 200 μL dispase till varje brunn som innehåller celler. Inkubera plattan i en 37 °C inkubator i 1 h. Halvvägs genom inkubationsperioden (30 min), ta ut plattan, pipettera försiktigt dispaslösningen upp och ner 5 gånger och placera tillbaka i inkubatorn i ytterligare 30 minuter.
  7. Efter 1 h, överför den dissocierade celllösningen till ett flödesrör. Tvätta brunnen med 1x PBS som innehåller 2% FBS (fPBS) och överför den till flödesröret. Centrifugera röret vid 1000 x g i 5 min. Sug försiktigt supernatanten och tillsätt 500 μl trypsin, inkubera vid 37 °C i 5 minuter. Inaktivera trypsin genom att tillsätta lika mycket fPBS och centrifugera vid 1000 x g i 5 min.
  8. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml 3D-odlingsmedier. Räkna cellerna och återplatta önskat antal celler i BME som i steg 8.2 till 8.4.
    OBS: Flera brunnar kan slås samman för att ytterligare analysera eller sortera cellpopulationen av intresse.

Figure 3
Figur 3: In vitro-analyser för att bedöma BCSC-cellfunktionen. In vitro-analyser utfördes enligt beskrivningen i protokollavsnitten 6.1 till 6.5 (A), 7.1 till 7.4 (B) eller 81. till 8,4 + 8,6 (C). A) Representativ bild som visar de kolonier som genereras av MDA-MB-231 mänskliga bröstcancerceller. (B) Representativa bilder som visar mammosfärbildning av MCF7, SUM159 eller MDA-MB-468 humana cellinjer samt patient-härledda LRCP17 bröstcancerceller. (C) Representativa bilder som visar 3D-strukturerna som bildas av MCF7 och MDA-MB-231 bröstcancerceller i 3D-kulturmodeller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

OBS: Utför djurförsök enligt ett djuretiskt protokoll som godkänts av institutionens djurvårdskommitté.

9. In vivo xenograft-modell

  1. För att bestämma tumörinitieringskapaciteten hos bröstcancerstamceller, förbered celler (sorterad population från steg 5.7 eller osorterade populationer från steg 3.5 eller 4.5) med hjälp av en begränsande utspädningsmetod. Seriellt utspädda celler i PBS med användning av mellan 1 och 5 olika utspädningsgrupper, med doser så låga som 0,01-0,2 x 102 celler/100 μL och så höga som 1 x 106 celler/100 μL.
    OBS: Osorterade/hela populationsceller kan användas som kontroll. Antalet utspädningsgrupper som används beror på det önskade vetenskapliga resultatet (t.ex. om man bara testar tumörgenicitet kan 1 grupp med ett högre cellantal användas, medan det vid beräkning av tumörinitierande kapacitet är optimalt att testa 5 begränsande utspädningsdoser).
  2. För att generera xenograftmodeller från humana bröstcancerceller, använd immunkomprometterade honmöss (athymisk naken [nu/nu], icke-överviktiga diabetiker/svår kombinerad immunbrist [NOD/SCID] eller NOD/SCID IL2γ [NGS] stammar).
    OBS: Även om minst 4 djur per grupp kan användas, rekommenderas 8-12 djur per grupp för att få robusta resultat, särskilt för att begränsa utspädningsanalysen.
  3. Utför vanliga injektioner av bröstfettkuddar (MFP) med 100 μl/mus av varje cellberedning, under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp.
    OBS: För optimal brösttumörtillväxt och spontan metastasering till avlägsna organ rekommenderas bröstkorgs-MFP. Alternativt kan inguinal MFP också användas.
  4. Efter injektion, övervaka mössen dagligen för allmän hälsa och tumörtillväxt vid injektionsstället. Vid upptäckt av en palpabel tumör, börja mäta tumörstorleken med bromsok i två vinkelräta dimensioner och registrera varje vecka tills slutpunkten.
    OBS: Den experimentella slutpunkten bestäms utifrån de regler som fastställts i det institutionella djuretiska protokollet; Vanligtvis krävs slutpunkt genom eutanasi när tumörvolymerna når 1500 mm3. För BCSC-populationer och/eller högre celldoser (t.ex. >1 x 104 celler) kommer detta effektmått sannolikt att uppnås inom 4-8 veckor efter MFP-injektion. För mycket låga celldoser och/eller icke-BCSC-cellpopulationer bör tumörtillväxt tillåtas fortskrida i upp till 8 månader efter injektionen.
  5. Från dessa mätningar beräknar du tumörvolymen med följande formel: Volym i mm3 = 0,52 x (bredd)2 x längd. Om du använder en begränsande utspädningsmetod, beräkna tumörinitieringskapacitet och signifikans med hjälp av ELDA online-programvara (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).
  6. Alternativt, för att humant förlänga slutpunkten, kirurgiskt avlägsna primära tumörer och fortsätta att övervaka möss för hälsa och / eller utveckling av spontan metastasering i avlägsna organ. Använd resekterad tumörvävnad för generering av seriella xenotransplanter.
  7. Vid slutpunkt, skörda vävnad från primära tumörer och avlägsna organ (lymfkörtlar, lunga, lever, hjärna, ben) och utför histopatologisk och/eller immunohistokemisk analys eller dissocierade tumörvävnaden och använd i de in vitro-analyser som beskrivs i avsnitt 6-8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det beskrivna protokollet möjliggör isolering av humana BCSC från en heterogen population av bröstcancerceller, antingen från cellinjer eller från dissocierad tumörvävnad. För varje given cellinje eller vävnadsprov är det avgörande att generera en enhetlig encellssuspension för att isolera BCSC vid maximal renhet eftersom kontaminerande icke-BCSC-populationer kan resultera i varierande cellulära svar, särskilt om studiens syfte är att utvärdera effekten av terapeutiska medel riktade mot BCSC. Tillämpning av en strikt sorteringsstrategi kommer att minimera förekomsten av förorenande icke-BCSC och resultera i förmågan att samla in andelen bröstcancerceller med stamcellsliknande egenskaper som visar en cellulär fenotyp som skiljer dem från bulkpopulationen av cancerceller. Mänskliga bröstcancerceller som uppvisar förbättrad ALDH-enzymatisk aktivitet, uttrycker höga nivåer av cellytmarkören CD44 och lågt / negativt uttryck av CD24 har en ALDH-hög CD44 + CD24- fenotyp och kan klassificeras som BCSC. Andelen BCSC inom bulkpopulationen kan variera mellan cellinjer eller patienter (figur 2) och beror ofta på sjukdomsstadiet, med mer aggressiv bröstcancer som vanligtvis visar en högre andel BCSC26,36,37.

Isolerade BCSC kan användas för att utföra olika in vitro - och in vivo-analyser där deras beteende och funktion kan jämföras med bulk- och/eller icke-BCSC-populationerna. Till exempel kan förmågan hos en enda bröstcancercell att självförnya och generera kolonier med 50 celler bedömas genom kolonibildande analyser (figur 3A). BCSC: s förmåga att självförnya under förankringsoberoende experimentella förhållanden kan bedömas med mammosfäranalyser, där variabelt sfärantal, storlek och sfärinitierande kapacitet kan analyseras och korreleras med närvaron och funktionen av BCSC (figur 3B). Det är viktigt att bestämma såddcellstätheten för olika bröstcancercellinjer eller brösttumörprover för att få optimala resultat. Detta är särskilt viktigt när du utför SLDA, eftersom högre celltätheter kan leda till cellaggregering som resulterar i misstolkning av cellulär aktivitet.

Odling av bröstcancerceller i BME gör det möjligt för BCSC att bilda 3D-strukturer som rekapitulerar in vivo-förhållanden (figur 3C). 3D-odling av bröstcancerceller i närvaro av andra mikromiljöcelltyper såsom fibroblaster, endotelceller och / eller immunceller har den extra kapaciteten att undersöka mikromiljöns roll i 3D-tillväxt av BCSC38,39. De specifika cellnummer som krävs för att generera 3D-organoider kan variera beroende på cellinjen eller patientens tumörkälla, och därför är det viktigt att optimera odlingsförhållandena och cellnumren före några storskaliga experiment.

Slutligen kan xenograftmodeller för mus in vivo användas för att förstå skillnaderna i tillväxt (figur 4) självförnyelse, differentiering och/eller tumörinitierande förmåga hos BCSC in vivo jämfört med icke-BCSC eller bulkcellpopulationer. Ofta är de cellulära in vitro-svar som observerats i närvaro av exogena faktorer eller terapeutiska medel inte representativa för in vivo-inställningen, vilket tyder på att in vitro-observation bör kompletteras med in vivo-studier när så är möjligt. Med hjälp av in vivo xenograft-modeller bevaras den cellulära heterogeniteten och tumörarkitekturen och därmed kan dessa modeller fungera som ett system som nära efterliknar mikromiljön hos mänskliga patienter. In vivo LDA kan utföras för att bestämma andelen tumörinitierande celler i en given blandad population av cancerceller (BCSC eller icke-BCSC)40,41. Utbudet av cellutspädningar som används bör optimeras och beror på frekvensen av initierande celler i cellpopulationen av intresse. Helst bör dessa utspädningar inkludera doser som resulterar i 100% tumörbildning, ner till celldoser utan tumörbildning och ett rimligt intervall däremellan. Frekvensen av tumörinitierande celler i primära prover kan vara varierande, och i fall där brösttumörer har mycket lågt antal eller heterogena populationer av tumörinitierande celler kan det vara särskilt utmanande42 att utföra LDA. I dessa fall skulle injektion av större antal celler vara mer lämpligt för att förstå bröstcancerbiologi.

Figure 4
Figur 4: In vivo xenograftanalyser för att bedöma BCSC-funktionen. MDA-MB-231 bröstcancerceller isolerades av FACS enligt beskrivningen i figur 1 och injicerades i den högra bröstfettkudden hos kvinnliga NSG-möss enligt beskrivningen i protokollavsnitten 9.1 till 9.8 (5 x 105 celler/mus; 4 möss/cellpopulation). Primär brösttumörtillväxtkinetik visas för ALDHhejCD44 + CD24- (■) jämfört med ALDH låg CD44låg/ -CD24 + (□) populationer. Data representerade som medelvärdet ± S.E.M. * = signifikant annorlunda tumörstorlek än respektive ALDH låg CD44låg / - delmängder vid samma tidpunkt (P < 0,05). Denna siffra har anpassats från Croker et al.26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bröstcancermetastaser och resistens mot terapi har blivit en viktig orsak till dödlighet hos kvinnor över hela världen. Förekomsten av en delpopulation av bröstcancerstamceller (BCSC) bidrar till förbättrad metastasering 26,43,44,45,46 och terapiresistens 21,47,48. Därför bör fokus för framtida behandlingar syfta till att utrota BCSC för att uppnå bättre behandlingsresultat, och detta kräver exakta metoder för att isolera och karakterisera de funktionella egenskaperna hos BCSC med både in vitro- och in vivo-metoder.

Odödliga cellinjer härledda från olika subtyper av bröstcancer har visat sig vara genomförbara modeller för att studera bröstcancerbiologi inklusive isolering och karakterisering av BCSC 26,49,50. Den höga proliferativa kapaciteten och den obegränsade expansionsförmågan hos cellinjer ger ett idealiskt modellsystem för att utföra studier som är mycket reproducerbara och tekniskt enkla. På grund av cellinjernas klonala ursprung kan de dock misslyckas med att rekapitulera den heterogenitet som olika patienter och / eller cancerceller uppvisar i tumörvävnad. Dessutom kan genetiska förändringar förvärvas under seriell passering av cellinjer och kan inducera genotypiska eller fenotypiska förändringar som kan förvirra experimentella resultat51. Däremot kan primära patient-härledda celler, trots deras begränsade proliferativa och expansionsförmåga, ge en mer exakt modell än den som observerats in vivo. Sådana prover kan dock vara svårare att få tag på och vara mer tekniskt utmanande att arbeta med. Alla dessa faktorer bör beaktas vid val av ett startmodellsystem för att isolera och karakterisera BCSC.

FACS är en vanligt förekommande teknik för att isolera celler av intresse baserat på cellytans marköruttryck52,53. Baserat på cellyteantigener (CD44 och CD24) och ALDH-enzymatisk aktivitet kan humana BCSC isoleras med hög renhet från både bröstcancercellinjer och tumörvävnader 1,2. Sorteringseffektiviteten bestämmer renheten hos sorterat prov, och det rekommenderas att användare analyserar en liten del av sorterat prov inkuberat med viabilitetsfärg för att kontrollera effektiviteten vid sortering53,54. Sorteringseffektiviteten kan förvirras av många faktorer, inklusive närvaron av cellklumpar, ett stort antal döda eller döende celler, felaktig kompensation av fluorokromerna och / eller skador på cellyteantigener på grund av känslighet för trypsin eller kollagenas under försortering av dissociationssteg53,54,55,56 . Därför kommer generering av en korrekt encellssuspension och användning av lämpliga celldissociationstekniker att öka sorteringseffektiviteten. När du utför cellsortering med flera parametrar är det viktigt att välja fluorokromer som minimerar spektral överlappning. I vissa fall, där spektral överlappning inte kan undvikas, bör en kontroll som innehåller alla fluorokromer utom en (fluorescens minus en, FMO) användas för att minimera spridning av fluorescerande signaler till andra kanaler54. Alternativt kan spektralöverlappningen minskas genom att immunomagnetiskt isolera cellpopulationer före slutlig FACS-isolering av celler av intresse56.

In vitro-analyser såsom de kolonibildande och mammosfäranalyser som beskrivs i detta protokoll har använts i stor utsträckning för att studera självförnyelse och proliferativ förmåga hos BCSC 57,58,59,60,61,62. Dessutom kan dessa analyser användas för att bedöma aktiviteten hos olika terapeutiska läkemedel på BCSC-funktionen. Flera evolutionärt bevarade signalvägar har implementerats i BCSC-underhåll 63, och både kolonibildande 64,65,66 och mammosfäranalyser64,67 har använts för att bedöma värdet av terapeutisk störning av dessa vägar som ett ingrepp för att blockera BCSC-inneboende signalering och minska BCSC-aktivitet och sjukdomsprogression. Kolonibildande analys med primära celler kan vara utmanande på grund av låg celltäthet, variation mellan prover och brist på dess anpassningsförmåga till isolerade in vitro-förhållanden. Dessa utmaningar kan övervinnas genom att odla BCSC på ett mjukt agarskikt eller genom att cokulturera dem med fibroblaster på en kollagenbelagd cellodlingsskål68,69,70. Dessutom kan komplettering av tillväxtfaktorer i odlingsmediet (såsom FGF771) också förbättra den kolonibildande förmågan hos celler isolerade från vävnadsprover. Dessutom kan översmältning av vävnad med kollagenas eller trypsin under genereringssteget för encellssuspension resultera i låg till noll kolonibildande förmåga och minska mammosfärbildande effektivitet31. I båda analyserna bör man se till att inkubera analysplattorna ostört för att undvika störningar i koloni- eller sfärstrukturer när de bildas. Det rekommenderas också att användare förlänger inkubationsperioden för primära celler (i förhållande till cellinjer) eftersom det kan ta längre tid för dessa celler att bilda kolonier eller sfärer.

Flera bevislinjer har visat den kritiska rollen av extracellulär matris (ECM) 15,17,72 och stromala komponenter, såsom fibroblaster, immunceller, endotelceller och adipocyter för att påverka BCSC-funktioner 15. Således kan 3D-odlingsmodellen som vi beskriver i detta protokoll ge ett användbart experimentellt system för att hjälpa till att rekapitulera in vivo-tumörmikromiljön i en in vitro-inställning. Även om 3D-odlingssystemet liknar tumörmikromiljön hos cancerpatienter, kan långsiktigt underhåll av celler som organoider vara svårt. Dessutom är optimering av 3D-odlingsförhållandena och förmågan att exakt undersöka självförnyelse och differentieringsförmåga hos BCSCutmanande 73. Effektiviteten hos organoider som bildas i 3D-odlingssystemet beror på tillväxtfaktorerna som kompletteras i odlingsmediet74. Frånvaro av nyckelkomponenter (till exempel ROCK-hämmare) kan leda till minskad eller ingen organoidbildning74. Media bör fyllas på var 3-4: e dag för att upprätthålla optimal cellulär funktion och kulturens hållbarhet. För att rekapitulera in vivo-förhållanden och svar är det alltid viktigt att låta cellerna bilda organoider före någon form av exogen behandling75. Celler som härrör från patientprover bör ge tillräckligt med tid för att bilda organoider, särskilt om målet är att utvärdera läkemedelssvar75.

Även om dessa in vitro-metoder är attraktiva och tillgängliga experimentella verktyg för att karakterisera BCSC-funktionen, kan tumörheterogenitet och effekten av tumörmikromiljö på BCSC-beteende inte studeras med fullständig effektivitet. Dessa in vitro-tester bör därför kompletteras med in vivo xenograft-modeller när så är möjligt för att ytterligare validera experimentella resultat relaterade till BSCS-biologi och/eller respons på nya terapier. Olika in vivo-modeller har använts för att studera BCSC-tumorigenicitet och metastaser. Ektopiska (subkutana engraftment) och ortotopiska (MFP-engraftment) musmodeller har använts för att generera brösttumörer och bedöma longitudinella förändringar i tumörtillväxt över tid50. Även om båda in vivo-injektionsmetoderna kan användas för att studera BCSC-biologi, möjliggör de inhemska stroma- och vaskulaturrelaterade komponenterna i MFP mer exakt rekapitulation av primär brösttumörprogression som observerats hos patienter, och därmed är MFP-injektion att föredra76,77,78. Slutligen krävs användning av immunkomprometterade möss för engraftment av humana BCSC och tumörtillväxt, och detta förhindrar införlivande av immuncellernas roll i tumorigenes- och metastaseringsstudier79. På senare tid har denna begränsning åtgärdats genom användning av humaniserade möss där ett humant immunsystem rekonstitueras via benmärgstransplantation före initiering av xenograftstudier80,81,82. Dessa modeller är dock dyra och tekniskt utmanande och används därför fortfarande inte vanligtvis83.

Sammanfattningsvis har vi här tillhandahållit ett protokoll för isolering av humana BCSC från både bröstcancercellinjer och patientderiverade tumörvävnadsprover. Vi har också beskrivit in vitro - och in vivo-protokoll för nedströmsanalyser som kan användas för att studera BCSC-funktion, med förmågan att optimeras för olika bröstcancercellkällor och flexibiliteten att utföras under olika experimentella förhållanden. Dessa protokoll kommer att vara användbara för utredare som är intresserade av cancerstamceller, bröstcancerbiologi och terapeutisk utveckling, med det slutliga målet att förbättra patientresultaten i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmarna i vårt laboratorium för deras hjälpsamma diskussioner och stöd. Vår forskning om bröstcancerstamceller och tumörmikromiljön finansieras av bidrag från Canadian Cancer Research Society Research Institute och US Army Department of Defense Breast Cancer Program (Grant # BC160912). V.B. stöds av ett Western Postdoctoral Fellowship (Western University), och både A.L.A. och V.B. stöds av Breast Cancer Society of Canada. C.L. stöds av ett Vanier Canada Graduate Scholarship från Kanadas regering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1x106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  2. Shipitsin, M., et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity. Cancer Cell. 11 (3), 259-273 (2007).
  3. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  4. Sulaiman, A., et al. Dual inhibition of Wnt and Yes-associated protein signaling retards the growth of triple-negative breast cancer in both mesenchymal and epithelial states. Molecular Oncology. 12 (4), 423-440 (2018).
  5. Debeb, B. G., et al. Histone deacetylase inhibitors stimulate dedifferentiation of human breast cancer cells through WNT/β-catenin signaling. Stem Cells. 30 (11), 2366-2377 (2012).
  6. Klutzny, S., et al. PDE5 inhibition eliminates cancer stem cells via induction of PKA signaling. Cell Death & Disease. 9 (2), 192 (2018).
  7. DiMeo, T. A., et al. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Research. 69 (13), 5364-5373 (2009).
  8. Liu, C. C., Prior, J., Piwnica-Worms, D., Bu, G. LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (11), 5136-5141 (2010).
  9. Miller-Kleinhenz, J., et al. Dual-targeting Wnt and uPA receptors using peptide conjugated ultra-small nanoparticle drug carriers inhibited cancer stem-cell phenotype in chemo-resistant breast cancer. Biomaterials. 152, 47-62 (2018).
  10. Mamaeva, V., et al. Inhibiting Notch Activity in Breast Cancer Stem Cells by Glucose Functionalized Nanoparticles Carrying γ-secretase Inhibitors. Molecular Therapy. 24 (5), 926-936 (2016).
  11. Ithimakin, S., et al. HER2 drives luminal breast cancer stem cells in the absence of HER2 amplification: implications for efficacy of adjuvant trastuzumab. Cancer Research. 73 (5), 1635-1646 (2013).
  12. Koike, Y., et al. Anti-cell growth and anti-cancer stem cell activities of the non-canonical hedgehog inhibitor GANT61 in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 24 (5), 683-693 (2017).
  13. Sun, Y., et al. Estrogen promotes stemness and invasiveness of ER-positive breast cancer cells through Gli1 activation. Molecular Cancer. 13, 137 (2014).
  14. Colavito, S. A., Zou, M. R., Yan, Q., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) expression in claudin-low breast cancer and crosstalk with the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB) pathway. Breast Cancer Research. 16 (5), 444 (2014).
  15. Bhat, V., Allan, A. L., Raouf, A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stem Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers. 11 (9), (2019).
  16. Pio, G. M., Xia, Y., Piaseczny, M. M., Chu, J. E., Allan, A. L. Soluble bone-derived osteopontin promotes migration and stem-like behavior of breast cancer cells. PloS One. 12 (5), 0177640 (2017).
  17. Chu, J. E., et al. Lung-derived factors mediate breast cancer cell migration through CD44 receptor-ligand interactions in a novel ex vivo system for analysis of organ-specific soluble proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-191 (2014).
  18. McGowan, P. M., et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer. Molecular Cancer Research. 9 (7), 834-844 (2011).
  19. Mao, J., et al. ShRNA targeting Notch1 sensitizes breast cancer stem cell to paclitaxel. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (6), 1064-1073 (2013).
  20. Duru, N., et al. HER2-associated radioresistance of breast cancer stem cells isolated from HER2-negative breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6634-6647 (2012).
  21. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  22. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  23. Calcagno, A. M., et al. Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics. Journal of the National Cancer Institute. 102 (21), 1637-1652 (2010).
  24. Feng, Y., et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 5 (2), 77-106 (2018).
  25. Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5429-5438 (2014).
  26. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8), 2236-2252 (2009).
  27. Morel, A. P., et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PloS One. 3 (8), 2888 (2008).
  28. Muntimadugu, E., Kumar, R., Saladi, S., Rafeeqi, T. A., Khan, W. CD44 targeted chemotherapy for co-eradication of breast cancer stem cells and cancer cells using polymeric nanoparticles of salinomycin and paclitaxel. Colloids Surf B Biointerfaces. 143, 532-546 (2016).
  29. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  30. Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R. E. Clonogenic cell survival assay. Methods in Molecular Medicine. 110, 21-28 (2005).
  31. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  32. Shin, C. S., Kwak, B., Han, B., Park, K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Molecular Pharmaceutics. 10 (6), 2167-2175 (2013).
  33. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  34. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse models of cancer. Annual Review of Pathology. 6, 95-119 (2011).
  35. Lyons, S. K. Advances in imaging mouse tumour models in vivo. Journal of Pathology. 205 (2), 194-205 (2005).
  36. Margaryan, N. V., et al. The Stem Cell Phenotype of Aggressive Breast Cancer Cells. Cancers. 11 (3), (2019).
  37. Ma, F., et al. Enriched CD44(+)/CD24(-) population drives the aggressive phenotypes presented in triple-negative breast cancer (TNBC). Cancer Letters. 353 (2), 153-159 (2014).
  38. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER(+) Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388-401 (2019).
  39. Phan-Lai, V., et al. Three-dimensional scaffolds to evaluate tumor associated fibroblast-mediated suppression of breast tumor specific T cells. Biomacromolecules. 14 (5), 1330-1337 (2013).
  40. O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  41. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  42. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  43. Abraham, B. K., et al. Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis. Clinical Cancer Research. 11 (3), 1154-1159 (2005).
  44. Balic, M., et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype. Clinical Cancer Research. 12 (19), 5615-5621 (2006).
  45. Charafe-Jauffret, E., et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (1), 45-55 (2010).
  46. Marcato, P., et al. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 29 (1), 32-45 (2011).
  47. Lacerda, L., Pusztai, L., Woodward, W. A. The role of tumor initiating cells in drug resistance of breast cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 13 (4-5), 99-108 (2010).
  48. Liu, S., Wicha, M. S. Targeting breast cancer stem cells. Journal of Clinical Oncology. 28 (25), 4006-4012 (2010).
  49. D'Angelo, R. C., et al. Notch reporter activity in breast cancer cell lines identifies a subset of cells with stem cell activity. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (3), 779-787 (2015).
  50. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  51. Forozan, F., et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Cancer Research. 60 (16), 4519-4525 (2000).
  52. Lanier, L. L. Just the FACS. Journal of Immunology. 193 (5), 2043-2044 (2014).
  53. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 19-39 (2007).
  54. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  55. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  56. Sun, C., et al. Immunomagnetic separation of tumor initiating cells by screening two surface markers. Scientific Reports. 7, 40632 (2017).
  57. Rodríguez, C. E., et al. Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the HER2 modulation in 3D culture. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (2), 1381-1391 (2018).
  58. Kim, D. W., Cho, J. Y. NQO1 is Required for β-Lapachone-Mediated Downregulation of Breast-Cancer Stem-Cell Activity. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), (2018).
  59. Xu, L. Z., et al. p62/SQSTM1 enhances breast cancer stem-like properties by stabilizing MYC mRNA. Oncogene. 36 (3), 304-317 (2017).
  60. Huang, X., et al. Breast cancer stem cell selectivity of synthetic nanomolar-active salinomycin analogs. BMC Cancer. 16, 145 (2016).
  61. Liu, T. J., et al. CD133+ cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer. Oncogene. 32 (5), 544-553 (2013).
  62. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  63. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  64. Palomeras, S., Ruiz-Martínez, S., Puig, T. Targeting Breast Cancer Stem Cells to Overcome Treatment Resistance. Molecules. 23 (9), (2018).
  65. McClements, L., et al. Targeting treatment-resistant breast cancer stem cells with FKBPL and its peptide derivative, AD-01, via the CD44 pathway. Clinical Cancer Research. 19 (14), 3881-3893 (2013).
  66. Berger, D. P., Henss, H., Winterhalter, B. R., Fiebig, H. H. The clonogenic assay with human tumor xenografts: evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology. 1 (5), 333-341 (1990).
  67. Tian, J., et al. Dasatinib sensitises triple negative breast cancer cells to chemotherapy by targeting breast cancer stem cells. British Journal of Cancer. 119 (12), 1495-1507 (2018).
  68. Samoszuk, M., Tan, J., Chorn, G. Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Research. 7 (3), 274-283 (2005).
  69. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  70. Xu, Y., Hu, Y. D., Zhou, J., Zhang, M. H. Establishing a lung cancer stem cell culture using autologous intratumoral fibroblasts as feeder cells. Cell Biology International. 35 (5), 509-517 (2011).
  71. Palmieri, C., et al. Fibroblast growth factor 7, secreted by breast fibroblasts, is an interleukin-1beta-induced paracrine growth factor for human breast cells. Journal of Endocrinology. 177 (1), 65-81 (2003).
  72. Bourguignon, L. Y., Peyrollier, K., Xia, W., Gilad, E. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (25), 17635-17651 (2008).
  73. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  74. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  75. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  76. Okano, M., et al. Orthotopic Implantation Achieves Better Engraftment and Faster Growth Than Subcutaneous Implantation in Breast Cancer Patient-Derived Xenografts. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  77. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  78. Zhang, W., et al. Comparative Study of Subcutaneous and Orthotopic Mouse Models of Prostate Cancer: Vascular Perfusion, Vasculature Density, Hypoxic Burden and BB2r-Targeting Efficacy. Scientific Reports. 9 (1), 11117 (2019).
  79. Kim, R., Emi, M., Tanabe, K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology. 121 (1), 1-14 (2007).
  80. Rosato, R. R., et al. Evaluation of anti-PD-1-based therapy against triple-negative breast cancer patient-derived xenograft tumors engrafted in humanized mouse models. Breast Cancer Research. 20 (1), 108 (2018).
  81. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 99 (2018).
  82. Meraz, I. M., et al. An Improved Patient-Derived Xenograft Humanized Mouse Model for Evaluation of Lung Cancer Immune Responses. Cancer Immunol Res. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  83. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. Biodrugs. 32 (3), 245-266 (2018).

Tags

Cancerforskning Utgåva 164 Bröstcancerstamcell (BCSC) fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kolonibildande analys mammosfäranalys 3D-odlingsmodell in vivo tumörmodell
Isolering och funktionell bedömning av mänskliga bröstcancerstamceller från cell- och vävnadsprover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., … More

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter