Summary
يهدف البروتوكول إلى إدخال استخدام مطياف كتلة رباعي القطب ثلاثي لرصد التفاعل المتعدد (MRM) من البروتينات من العينات السريرية. لقد قدمنا سير عمل منهجي بدءا من إعداد العينات إلى تحليل البيانات للعينات السريرية مع جميع الاحتياطات اللازمة التي يتعين اتخاذها.
Abstract
التحليل البروتيوميكي لأنسجة الدماغ البشري على مدى العقد الماضي قد عزز بشكل كبير فهمنا للدماغ. ومع ذلك، لا تزال الاضطرابات المرتبطة بالدماغ مساهما رئيسيا في الوفيات في جميع أنحاء العالم، مما يستلزم الحاجة إلى فهم أكبر لعلم الأحياء المرضية. التقنيات التقليدية القائمة على الأجسام المضادة مثل النشاف الغربي أو الكيمياء المناعية تعاني من انخفاض الإنتاجية إلى جانب كونها كثيفة العمالة ونوعية أو شبه كمية. حتى النهج التقليدية بندقية الكتلة القائمة على الطيف تفشل في تقديم أدلة قاطعة لدعم فرضية معينة. نهج البروتيوميات المستهدفة هي إلى حد كبير فرضية مدفوعة وتختلف عن النهج التقليدية بروتيوميات البندقية التي كانت طويلة في الاستخدام. رصد رد الفعل المتعدد هو أحد هذه النهج المستهدف الذي يتطلب استخدام مطياف كتلة خاص يسمى مطياف الكتلة الرباعية الترادفية أو مطياف الكتلة الرباعي الثلاثي. في الدراسة الحالية، سلطنا الضوء بشكل منهجي على الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها تنفيذ سير عمل البروتيوميات الكتلي الترادفي الناجح القائم على قياس الطيف باستخدام أنسجة الدماغ البشري بهدف إدخال سير العمل هذا إلى مجتمع بحثي أوسع.
Introduction
خلال العقد الماضي، ساعدت التطورات السريعة في قياس الطيف الكتلي (MS) إلى جانب زيادة فهم تقنيات الكروماتوغرافيا بشكل كبير في النهوض بالبروتيوميات القائمة على التصلب المتعدد. لطالما عانت التقنيات الجزيئية القائمة على البيولوجيا مثل النشاف الغربي والكيمياء المناعية من مشكلات الاستنساخ ، وبطء وقت التحول ، والتباين بين المراقبين وعدم قدرتها على تحديد البروتينات بدقة ، على سبيل المثال لا الحصر. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن الحساسية الفائقة لنهج البروتيوميات عالية الإنتاجية لا تزال توفر لعلماء الأحياء الجزيئية أداة بديلة وأكثر موثوقية في سعيهم لفهم أفضل لأدوار البروتينات في الخلايا. ومع ذلك ، فإن نهج بروتيوميات البنادق (اكتساب البيانات المعتمدة أو DDA) غالبا ما تفشل في اكتشاف البروتينات المنخفضة الوفيرة في الأنسجة المعقدة إلى جانب كونها تعتمد بشكل كبير على حساسية ودقة الأداة. على مدى العامين الماضيين ، وقد تم تطوير مختبرات في جميع أنحاء العالم تقنيات مثل الحصول على البيانات المستقلة (DIA) التي تتطلب زيادة القدرة الحاسوبية والبرمجيات الموثوقة التي يمكن التعامل مع هذه مجموعات البيانات المعقدة للغاية. ومع ذلك، هذه التقنيات لا تزال العمل في التقدم وليس سهل الاستعمال جدا. توفر نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على التصلب المتعدد توازنا مثاليا بين الطبيعة العالية الإنتاجية لنهج التصلب المتعدد وحساسية نهج البيولوجيا الجزيئية مثل ELISA. تركز تجربة البروتيوميات الشاملة المستهدفة المستندة إلى قياس الطيف على اكتشاف البروتينات أو الببتيدات التي تحركها الفرضية من تجارب البروتيوميات القائمة على الاكتشاف أو من خلال الأدب المتاح1،2. رصد التفاعل المتعدد (MRM) هو واحد من هذه النهج التصلب المتعدد المستهدفة التي تستخدم مطياف كتلة رباعية جنبا إلى جنب للكشف الدقيق والتحديد الكمي للبروتينات / الببتيدات من عينات معقدة. توفر هذه التقنية حساسية وخصوصية أعلى على الرغم من أنها تتطلب استخدام أداة منخفضة الدقة.
يتكون رباعي القطب من 4 قضبان متوازية ، مع توصيل كل قضيب بالقضيب المعاكس قطريا. يتم إنشاء حقل متقلب بين قضبان quadrupole عن طريق تطبيق RF بالتناوب والجهد DC. يتأثر مسار الأيونات داخل الكوادروبول بوجود نفس الفولتية عبر قضبان مقابلة. من خلال تطبيق RF على الجهد DC، يمكن تثبيت مسار الأيونات. هذه الخاصية من quadrupole التي تسمح لاستخدامها كمرشح الشامل الذي يمكن أن تسمح انتقائي الأيونات محددة لتمرير من خلال. اعتمادا على الحاجة، يمكن تشغيل رباعي في وضع ثابت أو وضع المسح الضوئي. يسمح الوضع الثابت فقط لأيونات ذات m/z محددة بالمرور ، مما يجعل الوضع انتقائيا للغاية ومحددا لأيون الاهتمام. من ناحية أخرى، يسمح وضع المسح الضوئي لليونات عبر نطاق m/z بأكمله بالمرور. وهكذا، يمكن أن تعمل مطيافات الكتلة الرباعية الترادفية في 4 طرق ممكنة: 1) أول رباعي يعمل في الوضع الثابت بينما يعمل الثاني في وضع المسح الضوئي؛ و(ب) الأعمدة الرباعية الأولى التي تعمل في الوضع الساكن بينما تعمل الثانية في وضع المسح الضوئي؛ و(ب) الأعمدة الرباعية المطيافية للكتلة. ii) رباعية الأولى تعمل في وضع المسح الضوئي في حين أن التشغيل الثاني في وضع ثابت؛ 3) كل من quadrupoles تعمل في وضع المسح الضوئي؛ و4) كل من quadrupoles تعمل في وضع ثابت3. وفي تجربة نموذجية لMM، تعمل الأعمدة الرباعية في الوضع الساكن مما يسمح برصد سلائف محددة ومنتجاتها الناتجة بعد التجزؤ. وهذا يجعل هذه التقنية حساسة جدا وانتقائية مما يسمح للقياس الكمي الدقيق.
بالنسبة لعلماء الأحياء الجزيئية، فإن أنسجة الدماغ البشرية وخلاياها هي كنز. هذه الوحدات الرائعة من جهاز مثير للاهتمام من أي وقت مضى من جسم الإنسان يمكن أن توفر رؤى الجزيئية والخلوية في أدائها. يمكن التحقيقات Proteomic من أنسجة الدماغ لا تساعدنا فقط على فهم الأداء الجهازي للدماغ السليم ولكن أيضا المسارات الخلوية التي تحصل على dysregulated عندما تسببها بعض الأمراض4. ومع ذلك ، فإن أنسجة الدماغ مع كل عدم التجانس هو جهاز معقد جدا لتحليل ويتطلب نهجا منسقا لفهم أفضل للتغيرات على المستوى الجزيئي. يصف العمل التالي سير العمل بأكمله بدءا من استخراج البروتينات من أنسجة الدماغ ، وإنشاء وتحسين طرق فحص MRM ، إلى التحقق من الأهداف(الشكل 1). هنا، سلطنا الضوء بشكل منهجي على الخطوات الرئيسية المشاركة في تجربة ناجحة على أساس MRM باستخدام أنسجة الدماغ البشري بهدف إدخال هذه التقنية وتحدياتها إلى مجتمع بحثي أوسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تتضمن هذه الدراسة عينات من أنسجة الدماغ من المشاركين البشريين، تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل TMH وIITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). وقدم المشاركون موافقتهم المستنيرة والمكتوبة على المشاركة في هذه الدراسة.
1 استخراج البروتين من أنسجة الدماغ
- تزن حوالي 50 ملغ من أنسجة الدماغ وغسل الأنسجة مع 300 ميكروغرام من 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) باستخدام micropipette.
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة أي دم على السطح الخارجي للأنسجة ويجب تكرارها إذا لزم الأمر. من المستحسن إزالة أكبر قدر ممكن من الدم من الأنسجة كما أنه يتعارض مع تقدير البروتين المصب وتجهيزه. - بعد يغسل مع برنامج تلفزيوني، إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل (العازلة A) إلى أنبوب يحتوي على الأنسجة. يحتوي المخزن المؤقت A على 8 M يوريا، 50 مللي متر تريس pH 8.0، 75 mM NaCl، 1 mM MgCl 2 وكوكتيلمثبطات Protease (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة).
ملاحظة: يختلف إنتاج البروتين باختلاف عدة عوامل تتراوح بين الظروف التي يتم فيها تخزين العينات وكمية المواد الأولية وكفاءة التعامل مع العينات أثناء المعالجة. تقليل حجم العازلة A نسبيا عند العمل مع كميات من الأنسجة أقل من 50 ملغ. - Lyse الأنسجة باستخدام سونيكاتور التحقيق مع الحفاظ على أنبوب على حمام الجليد. استخدام المعلمات التالية ل sonication: 40٪ السعة، 5 ثوان على وإيقاف دورة لمدة 2:30 دقيقة.
- الاستمرار في تجانس الأنسجة باستخدام الخافض حبة لتحلل تماما الأنسجة.
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بسرعة متوسطة لمدة 90 ثانية تليها الحضانة على الجليد لمدة 3-5 دقائق. - الطرد المركزي محتويات الأنبوب في 6000 س غ لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل supernatant في أنبوب جديد وتخلط بشكل متجانس.
ملاحظة: جعل aliquots من العينة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
2 تحديد كمي البروتين وفحص الجودة
- قياس العينات قبل الهضم باستخدام رسم بياني قياسي مصنوع بتركيزات معروفة من BSA.
ملاحظة: تأكد من أن المقايسة المستخدمة لتقدير البروتين متوافقة مع العازلة المستخدمة لصنع lysate البروتين. تحقق من جودة البروتين lysate عن طريق تشغيل هلام SDS-PAGE.
3 هضم البروتين
- خذ 50 ميكروغرام من البروتين في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتقليل البروتينات عن طريق إضافة تريس 2-carboxyethyl فوسفين (TCEP) بحيث يكون التركيز النهائي 20 mM. احتضان المحتويات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
- بعد الحضانة، alkylate البروتينات المنخفضة عن طريق إضافة iodoacetamide (IAA) إلى أنبوب بحيث تركيزه النهائي هو 40 mM. احتضان الأنبوب في الظلام لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: إعداد IAA الحق الطازج قبل إضافة إلى الأنبوب. - إضافة العازلة B إلى الأنبوب الذي يحتوي على البروتينات المنخفضة والمقلاة بحيث يكون التركيز النهائي لليوريا في الأنبوب أقل من 1 M.
ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت B من 25 mM Tris (pH 8.0) و 1 mM CaCl2 ويستخدم لتخفيف العينات. عند التخفيف، تأكد من أن محتويات الأنبوب لديها درجة الحموضة من 8 لهضم البروتين الأمثل بعد إضافة تريبسين. - إضافة تريبسين في إنزيم 1:30 إلى نسبة البروتين واحتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر.
- بعد الهضم، ركز المنتج المهضوم في مركز فراغي. في هذه الخطوة، يمكن إعادة تشكيل الببتيدات أو تحلية أو تخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
4 تحلية والببتيد كميا
ملاحظة: إزالة الملح أو تنظيف الببتيد أمر ضروري قبل تحميل عينات لأملاح LC-MS/MS. والملوثات الأخرى في العينة يمكن أن تسد الأعمدة وتسبب تلفا للأداة أيضا. يمكن تنفيذ العملية باستخدام نصائح المرحلة C18 المتوفرة تجاريا أو الأعمدة.
- تنشيط تلميح المرحلة مع 20 ميكرولتر من 50٪ أسيتونيتريل (ACN) في 0.1٪ حمض الفورميك (FA). طرد المحتويات في 1000 x ز لمدة دقيقة واحدة وتجاهل تدفق من خلال.
ملاحظة: شروط الطرد المركزي هي نفسها حتى نهاية الإجراء. - إضافة 20 ميكرولتر من ACN 100٪ في 0.1٪ FA والطرد المركزي محتويات كما هو الحال في الخطوة 4.1.
ملاحظة: يمكن تكرار خطوات التنشيط عدة مرات. - بعد التنشيط، مرر 20 ميكرولتر من عينة الببتيد المعاد تشكيلها من خلال طرف المرحلة والطرد المركزي كما تم إجراؤه في الخطوة 4.1.
ملاحظة: لا تجاهل التدفق خلال في هذه الخطوة. - كرر الخطوة 4.3 مع تدفق من خلال ما لا يقل عن 5 مرات لضمان أقصى حد الببتيد ملزمة لمرحلة تلميح.
- تمرير 20 ميكرولتر من 0.1٪ FA من خلال المرحلة تلميح وتجاهل تدفق من خلال.
ملاحظة: كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين للحصول على نتائج أفضل. - Elute الببتيدات ملزمة في أنبوب الميكروفون الطازجة عن طريق تمرير تركيزات متزايدة من ACN، أي 40٪، 60٪ و 80٪، على التوالي.
- تجفيف الببتيدات في فراغ المكثف والمضي قدما في تحديد كمي الببتيد.
- إعادة تشكيل الببتيدات المجففة في 0.1٪ الاتحاد الإنجليزي وتحديد استخدام طريقة نطاقات5.
5 إعداد قائمة الانتقال للأهداف النهائية
ملاحظة: يشير الانتقال إلى زوج السلائف (Q1) إلى قيم المنتج (Q3) m/z في تجربة MRM. الببتيد يمكن أن يكون واحد إلى العديد من التحولات، مع نفس قيمة Q1 ولكن قيم Q3 مختلفة. يتطلب مطياف الكتلة الرباعي الثلاثي معلومات عن التحولات للببتيدات ومنتجاتها ليتم اكتشافها. ومن ثم، قبل البدء في تجربة مستهدفة، يجب إعداد قائمة انتقالية. ويمكن القيام بذلك باستخدام مستودع على الانترنت من SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) أو برنامج مفتوح المصدر يسمى الأفق7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).
- تحميل ملف FASTA البروتيوم البشرية الأخيرة من UniProt (https://www.uniprot.org/) وإنشاء ملف بروتيوم الخلفية عن طريق إدراجه في الأفق. في إعدادات الببتيد، انتقل إلى الخلفية بروتيوم المنسدلة وانقر على إضافة. تغذية في ملف تسلسل FASTA من البروتيوم الإنسان. تأكد من تحديد قاعدة البيانات هذه وتعيين قيمة الانقسام الفائتة المسموح بها إلى 0 قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- الآن، تحت علامة التبويب تصفية في إعدادات الببتيد تعيين طول الببتيدات المقبولة من 8 إلى 25 الأحماض الأمينية.
- في إعدادات الانتقال، ضمن علامة التبويب تصفية تعيين رسوم السلائف ك 2,3، قم بتعيين رسوم الأيونات ك 1 وتعيين أنواع الأيونات إلى y. يمكن تحديد أيونات المنتجات حسب اختيار المستخدم. حدد N-terminal ل proline للأيونات الخاصة واترك كافة المعلمات الأخرى كإعدادات افتراضية.
ملاحظة: يمكن أن تختلف إعدادات الببتيد والانتقال وفقا للتجربة. - إدراج الببتيدات أو البروتينات ذات الأهمية بالنقر على تحرير والانتقال إلى إدراج. لإدراج البروتينات، نسخ معرفات الانضمام الخاصة بهم وإدراج الببتيدات محددة، نسخ تسلسل الببتيد. يقوم البرنامج بتعيين معرفات الانضمام إلى البروتيوم الخلفي ويتم إنشاء قائمة الانتقال استنادا إلى إعدادات الببتيد والانتقال.
- تصدير قائمة الانتقال. تأكد من أن في القائمة المنسدلة لنوع الصك، يتم تحديد الأداة المناسبة. بالنسبة لتجارب التحسين، قد يختار المرء تقسيم قوائم الانتقال إلى أرقام أصغر عن طريق تعيين العدد المطلوب من الانتقالات لكل ملف في Skyline. وهذا يضمن أن الأداة لا تطغى على الشاشة الكثير من التحولات في تشغيل واحد. عدد التحولات يحتاج إلى مزيد من الأمثل للحصول على طريقة واحدة -- وهذا نذكر من الآن فصاعدا في إطار قسم صقل الأسلوب.
6 معلمات LC
- استخدام نظام المذيبات ثنائي مع المذيب المائي التي تحتوي على 0.1٪ FA (المذيبات A) والمذيب العضوي الذي يحتوي على 80٪ ACN (المذيب B).
- تعيين درجة حرارة العمود إلى 45 درجة مئوية.
- تعيين تدرج LC من 10 دقيقة مع 450 ميكرولتر / دقيقة معدل التدفق (كما هو مبين في الجدول S1).
7 معلمات MS
ملاحظة: تم تطوير المقايسة الموضحة وتحسينها لمطياف كتلة Quadrupole الثلاثي TSQ Altis.
- تحسين تشغيل المعلمات مثل Q1 و Q3 القرار، يسكن الوقت ودورة الوقت - معلمة واحدة في وقت واحد. نجد أن 0.7 القرار للربع الأول وQ3 يعمل بشكل أفضل. قد يحتاج وقت الدورة أو وقت السكن إلى أنب وفقا لعدد الانتقالات ومتوسط عرض الذروة للببتيدات التي يتم مراقبتها.
- استخدم معلمات MS في الجدول S2 و S3 الجدول. مدة الأسلوب الإجمالية هي 10 دقيقة.
ملاحظة: المعلمات تبقى نفسها لكافة أشواط أثناء وبعد أسلوب التحسين، ما لم يذكر خلاف ذلك. لتجربة جديدة، قد تكون هناك حاجة إلى تغيير معلمات معينة اعتمادا على نوع العينة وخطوات معالجة العينة.
8 تشغيل تسلسل ومراقبة الجودة الصك
- إعداد خليط من الماء: الميثانول: الأيزوبروبانول: أسيتونيتريل في 1:1:1:1 نسبة. استخدم هذا الخليط كفراغ.
- إعداد الببتيدات لأي عينة قياسية يمكن استخدامها لمراقبة أداء الجهاز باستمرار. سيتم استخدام هذا كمعيار مراقبة الجودة. نحن الكشف عن الببتيدات من هضمات جيش الخلاصات التي تم تحسينها وإعطاء استجابة جيدة ومتسقة على مدى عدة أيام(الشكل 2).
- لتشغيل العينات، يجب أن يبدأ التسلسل ببضع فراغات، تليها عينات QC القياسية والسريرية. تأكد دائما من وجود فارغة واحدة بين عينتين متتاليتين.
- لسهولة المقارنة، تأكد من حقن كميات متساوية وأحجام كل عينة في كل مرة.
9 طريقة صقل
- تحليل البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من العينات المجمعة باستخدام Skyline. ابحث عن الذروة المناسبة والتحولات والمعلمات مثل شكل الذروة والكثافة لتحديد أفضل النتائج. حفظ الملف كمشروع Skyline جديد.
- استخدام مكتبة للعثور على أفضل مطابقة الذروة وبالتالي ينصح أفضل قائمة الانتقال ممكن. المكتبة هي مجموعة من قمم MS/MS المتاحة من الأدب أو التجارب الداخلية.
- تصدير قائمة انتقال جديدة من مشروع Skyline المحفوظ حديثا واستخدام هذه القائمة الانتقالية لجعل أسلوب جديد. الحصول على البيانات من الأسلوب الجديد الذي تم إنشاؤه وتكرار عملية صقل التحولات باستخدام Skyline.
- بمجرد الانتهاء من قائمة الببتيدات والتحولات بعد تحليل البيانات باستخدام Skyline ، قم بضبط الطريقة عن طريق تجربة التباديل المختلفة لوقت الدورة ووقت الإقامة.
ملاحظة: استخدام الببتيدات الاصطناعية الثقيلة الموسومة والببتيدات المفهرسة (iRT) يجعل تحسين الطريقة سهلا8و9. ومن ثم فمن المستحسن أن يتم ضبط طريقة باستخدام هذه الببتيدات. - باستخدام معلومات وقت الاستبقاء من تجارب التحسين، قم بإنشاء أسلوب نهائي مجدول (وجود إطار استحواذ محدد).
- إعداد عينات للمواضيع الفردية. وسيتم الحصول على بيانات لهذه العينات باستخدام الطريقة النهائية المجدولة.
- بمجرد الحصول على البيانات ، يمكن إجراء مزيد من التحليل النهائي والمقارنة بين المجموعة من خلال استيراد الملفات الخام إلى Skyline.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بإجراء تقدير كمي نسبي ل 3 بروتينات من 10 عينات، 5 عينات من كل مجموعة من المرضى الذين يعانون من تشوهات في الدماغ. وشملت هذه البروتينات Apolipoprotein A-I (APOA-I), فيمينتين (VIM) ونيكوتيناميد فوسفوريبوسيل ترانسفيراز (NAMPT) التي من المعروف أن أداء أدوار متنوعة في خلايا الدماغ. تم إجراء تحليل البيانات بعد التشغيل باستخدام Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). وتم رصد ما مجموعه 10 ببتيدات مقابل 3 بروتينات. وشملت هذه الببتيدات 3 لAPOA-I، 4 الببتيدات لVIM و 3 الببتيدات لNAMPT. وبلغ العدد الإجمالي للانتقالات من هذه الببتيدات العشرة 57. تم تجميع العينات في أي من المجموعتين اعتمادا على الحالة التي تنتمي إليها. باستخدام ميزة مقارنات المجموعة من الأفق ، تمت مقارنة وفرة الذروة من هذه الببتيدات ، وتم حساب قيم القياس الكمي النسبي(الشكل 3).
الشكل 1:نظرة عامة على الخطوات التي تنطوي عليها تجربة مراقبة التفاعل المتعدد. أ. إعداد عينة لتجربة البروتيوميات نموذجي ينطوي على استخراج البروتينات (للتوضيح أظهرنا عينة الأنسجة) تليها الهضم باستخدام التريبسين. يتم تحلية الببتيدات المهضومة في نهاية المطاف وجعل LC-MS جاهزة. باء - ال 20 في المائ وتشمل الخطوات التي تنطوي عليها تجربة MRM اختيار أيونات السلائف والمنتجات استنادا إلى قيمها m/z. ولا ينظر في التحليل إلا في التحولات التي تظهر استجابة جيدة. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن يتضمن تحليل البيانات في تجربة MRM فحصا مفصلا لأشكال الذروة ومناطق الذروة. ويتبع ذلك في نهاية المطاف تحليل إحصائي للنتائج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التناسق استجابة ل BSA باستخدام أسلوب MRM محسنة. أ. يظهر الكروماتوجرام لببتيد تمثيلي من BSA شكل الذروة الثابتة وكثافتها طوال الأيام الخمسة التي أجريت فيها التجربة. باء - ال 20 في المائ الاتساق وقت الاحتفاظ لوحظ للببتيد على جميع الأيام الخمسة للمناطق C. الذروة التجربة للببتيد كما رأينا على مدى خمسة أيام في الأسبوع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:التنظيم التفاضلي لثلاثة بروتينات في مجموعتين من عينات ورم GBM. أ. مخططات لونية تمثيلية ل Apolipoprotein A-I ومنطقة الذروة التراكمية كما رأينا بعد المقارنة بين المجموعات. باء - ال 20 في المائ مخططات لونية تمثيلية ل Vimentin ومنطقة الذروة التراكمية كما رأينا بعد المقارنة بين المجموعات. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن الكروماتوجرامات التمثيلية لنيكوتيناميد فوسفوريبوسيل ترانسفيراز ومنطقة الذروة التراكمية كما رأينا بعد المقارنة بين المجموعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول S1: تفاصيل تدرج LC لمدة 10 دقائق لاستخدامها في جميع العينات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول S2: إعدادات المعلمة لمصدر الأيونات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول S3: إعدادات المعلمة لأسلوب MRM. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واعتبرت تقنيات مثل الكيمياء المناعية والنشاف الغربية كالمعايير الذهبية للتحقق من صحة أهداف البروتين لسنوات عديدة. هذه الأساليب تجد استخدام حتى اليوم مع تعديلات طفيفة في البروتوكول والاعتماد قليلا على التكنولوجيا مما يجعلها مرهقة جدا ومملة. وإلى جانب ذلك، فإنها تنطوي أيضا على استخدام الأجسام المضادة باهظة الثمن التي لا تظهر دائما نفس خصوصية عبر دفعات وتتطلب قدرا كبيرا من الخبرة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جزءا صغيرا فقط من البروتينات التي تم تحديدها باستخدام تقنيات عالية الإنتاجية مثل قياس الطيف الكتلي ، لديها أجسام مضادة متوافقة متاحة ، مما يزيد من تعقيد الإجراء بأكمله. ومن ثم يتم ببطء تناول المقايسات البروتيوميكية المستهدفة كنهج جديد للتحقق من صحة الأهداف10. مع معظم اكتشاف الهدف يحدث على منصات omics عالية الإنتاجية، ويجري النظر أيضا لوحات من الأهداف التحقق من صحة لتطبيقات الفحص السريري11،12،13.
النتائج التمثيلية في هذه المقالة قد صدقت على التعبير التفاضلي للبروتينات Apolipoprotein A-I (APOA-I) وفيمينتين (VIM) ونيكوتيناميد فوسفوريبوسيل ترانسفيراز (NAMPT) في شرطين (الشرط 1 والشرط 2) من أنسجة الدماغ. Apolipoprotein A-I وقد أفيد أن تلعب دورا محوريا في الحفاظ على سلامة الأوعية الدماغية والحد من خطر مرض Alzhiemer. على الرغم من أن ApoA-I لا يتم تصنيعه في الدماغ ، إلا أن قدرته على عبور حاجز الدم في الدماغ (BBB) يجعل وجوده في الدماغ حيويا14. وقد درس بروتين فيمينتين في عدد من الأدوار داخل الدماغ. ومع ذلك، واحدة من الوظائف الرئيسية ل Vimentin هو مشاركتها في تنشيط microglia. ارتبط انخفاض التعبير عن Vimentin بضعف التنشيط الدقيق15. وقد أفيد أن البروتين NAMPT للعب دور رئيسي في الشيخوخة ذات الصلة فقدان الخلايا العصبية والاختلالات البطانية الأوعية الدموية الدماغية16. وقد أفيد أن جميع البروتينات الثلاثة تلعب العديد من الأدوار في خلايا الدماغ الطبيعية والأورام الخبيثة المرتبطة بالدماغ. لذلك ، يمكن التحقق من صحة MRM المستندة إلى هذه البروتينات والببتيدات الخاصة بهم تجد فائدة كبيرة في التشخيص السريري المتعلقة مختلف الاضطرابات المرتبطة الدماغ.
يمكن استخدام المقايسة المستهدفة المحسنة بالكامل بسهولة للكشف عن الإنتاجية العالية وتحديد كمية لوحة الهدف. معدل الحد من الخطوة هي الأمثل الأسلوب الأولي الذي هو مملة ويختلف على أساس نوع العينة، والبروتين / الببتيد الأهداف، أداة المستخدمة والتحيز الكشف عن بعض الببتيدات. ومن الأهمية بمكان تحسين قائمة الانتقال لإجراء فحص قوي. أي مستخدم مهتم في تطوير مثل هذا الفحص لعينات أنسجة الدماغ البشرية سوف تجد أن البروتوكول المذكور أعلاه وأوضح يقلل من هذه العوامل المتغيرة. وهو يصف بروتوكول الأمثل لاستخراج الببتيد من هذا البكتيبين الأنسجة فريدة ومملة والمعلمات المثلى لاستخدامها في الصك مع إيلاء اهتمام خاص لخطوات مراقبة الجودة الحاسمة في نقاط مختلفة من البروتوكول. وكما هو الحال مع أي تكنولوجيا جديدة، قدم الباحثون مجموعة من المبادئ التوجيهية، التي يحتاج المؤلفون إلى تقديمها أو الخطوات التي يتبعونها أثناء التجربة. إلى هذه الجبهة ، في عام 2017 ، تم وضع إرشادات MCP للإبلاغ عن المقايسات والبيانات المستهدفة للبروتيوميات17. وتضمن هذه المبادئ التوجيهية أن تكون الدراسة/المقايسة المبلغ عنها موثوقة وقابلة للاستنساخ، مما يزيد من إمكانية تطبيق هذه الطريقة. من خلال اتخاذ الاحتياطات الصحيحة والاستفادة من الإمكانات الحقيقية لهذا الفحص ، سيتمكن الباحثون قريبا من التوصل إلى فحوصات ذات صلة سريريا مع إمكانات هائلة في التشخيص والعلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وتلقى المؤلفان دعما من ثيرموفيشر مقابل رسوم النشر.
Acknowledgments
نعترف بمشروع MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)، #34_IITB المشروع إلى مرفق SS و MASSFIITB في IIT Bombay بدعم من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR13114/INF/22/206/2015) لإجراء جميع التجارب المتعلقة بالتصلب المتعدد.
ونعرب عن شكرنا الخاص للسيد ريشابه ياداف على إنتاج وتحرير الفيديو بأكمله والسيد نيشانت نيروكار على عمله في تحرير الصوت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC - Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Biochemistry. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
