Summary
Protokollen tar sikte på å introdusere bruken av et trippel quadrupole massespektrometer for multippel reaksjonsovervåking (MRM) av proteiner fra kliniske prøver. Vi har levert en systematisk arbeidsflyt som starter fra prøvepreparering til dataanalyse for kliniske prøver med alle nødvendige forholdsregler som skal tas.
Abstract
Den proteomiske analysen av det menneskelige hjernevevet det siste tiåret har i stor grad forbedret vår forståelse av hjernen. Imidlertid fortsetter hjernerelaterte lidelser å være en stor bidragsyter til dødsfall rundt om i verden, noe som nødvendiggjør behovet for enda større forståelse av deres patobiologi. Tradisjonelle antistoffbaserte teknikker som vestlig blotting eller immunhiistokjemi lider av å være lavgjennomstrømning i tillegg til å være arbeidsintensiv og kvalitativ eller semi-kvantitativ. Selv konvensjonelle massespektrometribaserte hagletilnærminger klarer ikke å gi avgjørende bevis for å støtte en viss hypotese. Målrettede proteomikktilnærminger er i stor grad hypotesedrevne og skiller seg fra de konvensjonelle hagleproteomikktilnærmingene som har vært lenge i bruk. Multippel reaksjonsovervåking er en slik målrettet tilnærming som krever bruk av et spesielt massespektrometer kalt tandem quadrupole massespektrometer eller trippel quadrupole massespektrometer. I den nåværende studien har vi systematisk fremhevet de viktigste trinnene som er involvert i å utføre en vellykket tandem quadrupole massespektrometribasert proteomisk arbeidsflyt ved hjelp av menneskelig hjernevev med sikte på å introdusere denne arbeidsflyten til et bredere forskningsmiljø.
Introduction
I løpet av det siste tiåret har den raske utviklingen innen massespektrometri (MS) kombinert med økt forståelse av kromatografiteknikker i stor grad bidratt til å fremme MS-basert proteomikk. Molekylærbiologibaserte teknikker som vestlig blotting og immunhiistokjemi har lenge lidd av reproduserbarhetsproblemer, langsom behandlingstid, variasjon mellom observatører og deres manglende evne til å kvantifisere proteiner nøyaktig, for å nevne noen. For dette formål fortsetter den overlegne følsomheten til proteomikk med høy gjennomstrømning å tilby molekylærbiologer et alternativt og mer pålitelig verktøy i deres søken etter å bedre forstå rollene til proteiner i celler. Imidlertid klarer hagleproteomikk tilnærminger (Dataavhengig oppkjøp eller DDA) ofte ikke å oppdage lave rikelige proteiner i komplekse vev i tillegg til å være sterkt avhengig av instrumentets følsomhet og oppløsning. I løpet av de siste par årene har laboratorier over hele verden utviklet teknikker som Data Independent Acquisition (DIA) som krever økt datakraft og pålitelig programvare som kan håndtere disse svært komplekse datasettene. Imidlertid er disse teknikkene fortsatt et arbeid som pågår og ikke veldig brukervennlig. Målrettede MS-baserte proteomikktilnærminger gir en perfekt balanse mellom ms-tilnærmingenes høye gjennomstrømning og følsomheten til molekylærbiologiske tilnærminger som ELISA. Et målrettet massespektrometribasert proteomikkeksperiment fokuserer på å oppdage hypotesedrevne proteiner eller peptider fra oppdagelsesbaserte hagleproteomikkeksperimenter eller gjennom tilgjengelig litteratur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) er en slik målrettet MS-tilnærming som bruker et tandem quadrupole massespektrometer for nøyaktig deteksjon og kvantifisering av proteiner / peptider fra komplekse prøver. Teknikken gir høyere følsomhet og spesifisitet til tross for at det kreves bruk av et instrument med lav oppløsning.
En quadrupole er laget av 4 parallelle stenger, med hver stang koblet til den diagonalt motsatte stangen. Et varierende felt opprettes mellom quadrupole stengene ved å bruke vekslende RF- og DC-spenninger. Banen til ionene inne i quadrupole påvirkes av tilstedeværelsen av de samme spenningene over motsatte stenger. Ved å bruke RF på DC-spenning, kan banen til ionene stabiliseres. Det er denne egenskapen til quadrupole som gjør at den kan brukes som et massefilter som selektivt kan la spesifikke ioner passere gjennom. Avhengig av behovet kan en quadrupole betjenes enten i statisk modus eller skannemodus. Den statiske modusen tillater bare ioner med en spesifisert m / z å passere gjennom, noe som gjør modusen svært selektiv og spesifikk for ion av interesse. Skannemodusen derimot gjør at ioner over hele m / z-området kan passere gjennom. Dermed kan tandem quadrupole massespektrometre fungere på 4 mulige måter: i) den første quadrupole som opererer i statisk modus mens den andre opererer i skannemodus; ii) den første quadrupole som opererer i skannemodus mens den andre opererer i statisk modus; iii) begge quadrupoles som opererer i skannemodus; og iv) begge quadrupoles som opererer i statisk modus3. I et typisk MRM-eksperiment opererer begge quadrupoles i statisk modus, slik at spesifikke forløpere og deres resulterende produkter etter fragmentering kan overvåkes. Dette gjør teknikken svært følsom og selektiv, noe som gir nøyaktig kvantifisering.
For molekylærbiologer er det menneskelige hjernevevet og dets celler en skattekiste. Disse bemerkelsesverdige enhetene i et stadig interessant organ i menneskekroppen kan gi molekylær og cellulær innsikt i dens funksjon. Proteomiske undersøkelser av hjernevevet kan ikke bare hjelpe oss med å forstå den systemiske funksjonen til en sunn hjerne, men også de cellulære veiene som blir dysregulert når de påføres av en eller annen sykdom4. Imidlertid er hjernevevet med all sin heterogenitet et svært komplekst organ å analysere og krever en samordnet tilnærming for en bedre forståelse av endringene på molekylært nivå. Følgende arbeid beskriver hele arbeidsflyten som starter helt fra å trekke ut proteiner fra hjernevev, skape og optimalisere metodene for MRM-analyse, til validering av målene (Figur 1). Her har vi systematisk fremhevet de viktigste trinnene som er involvert i et vellykket MRM-basert eksperiment ved hjelp av menneskelig hjernevev med sikte på å introdusere teknikken og dens utfordringer for et bredere forskningsmiljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien involverer hjernevevsprøver fra menneskelige deltakere, gjennomgått og godkjent av TMH og IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Deltakerne ga sitt informerte og skriftlige samtykke til å delta i denne studien.
1 Proteinekstraksjon fra hjernevev
- Vei rundt 50 mg hjernevev og vask vevet med 300 μL 1x fosfatbuffer saltvann (PBS) ved hjelp av en mikropipette.
MERK: Dette trinnet utføres for å fjerne blod på vevets ytre overflate og må gjentas om nødvendig. Det anbefales å fjerne så mye blod fra vev som mulig, da det forstyrrer nedstrøms proteinestimering og behandling. - Etter vask med PBS, tilsett 300 μL lysisbuffer (buffer A) til røret som inneholder vevet. Buffer A inneholder 8 M urea, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2 og Protease inhibitorcocktail (i henhold til produsentens instruksjoner).
MERK: Proteinutbyttet varierer avhengig av flere faktorer som spenner fra forholdene der prøvene er lagret, mengden startmateriale og effektiviteten ved håndtering av prøvene under behandling. Reduser volumet av buffer A proporsjonalt når du arbeider med mengder vev lavere enn 50 mg. - Lyse vevet ved hjelp av en sonde soniker mens du holder røret på et isbad. Bruk følgende parametere for sonikering: 40% amplitude, 5 sekunder på og av syklus i 2:30 min.
- Fortsett med vev homogenisering ved hjelp av en perle beater for å fullstendig lyse vevet.
MERK: Dette trinnet skal utføres med middels hastighet i 90 sekunder etterfulgt av inkubasjon på is i 3-5 minutter. - Sentrifuger innholdet i røret ved 6000 x g i 15 min ved 4 °C. Overfør supernatanten til et friskt rør og bland homogent.
MERK: Lag aliquots av prøven og oppbevar ved -80 °C inntil videre bruk.
2 Protein kvantifisering og kvalitetskontroll
- Kvantifisere prøvene før fordøyelsen ved hjelp av en standard graf laget med kjente konsentrasjoner av BSA.
MERK: Påse at analysen som brukes til proteinestimering er kompatibel med bufferen som brukes til å lage proteinlyset. Kontroller kvaliteten på proteinlyset ved å kjøre en SDS-PAGE gel.
3 Protein fordøyelse
- Ta 50 μg protein i et mikro-sentrifugerør og reduser proteinene ved å tilsette Tris 2-karboksyetylfosfin (TCEP) slik at den endelige konsentrasjonen er 20 mM. Inkuber innholdet ved 37 °C i 1 time.
- Etter inkubasjon, alkylat de reduserte proteinene ved å legge iodoacetamid (IAA) til røret slik at den endelige konsentrasjonen er 40 mM. Inkuber røret i mørket i 30 minutter.
MERK: Forbered IAA ferskt rett før du kommer til røret. - Tilsett buffer B i røret som inneholder de reduserte og alkylerte proteinene slik at den endelige konsentrasjonen av urea i røret er mindre enn 1 M.
MERK: Buffer B består av 25 mM Tris (pH 8.0) og 1 mM CaCl2 og brukes til å fortynne prøvene. Ved fortynning, sørg for at innholdet i røret har en pH på 8 for optimal protein fordøyelse etter tilsetning av trypsin. - Tilsett trypsin i et 1:30 enzym til proteinforhold og inkuber rørene over natten ved 37 °C med konstant risting.
- Konsentrer det fordøyde produktet i en vakuumkonsentrator etter fordøyelsen. På dette trinnet kan peptidene enten rekonstitueres og desalteres eller lagres ved -80 °C for fremtidig bruk.
4 Desalting og peptid kvantifisering
MERK: Desalting eller peptidopprydding er viktig før du laster inn prøvene for LC-MS/MS. Salter og andre forurensninger i prøven kan tette søylene og forårsake skade på instrumentet også. Prosessen kan utføres ved hjelp av kommersielt tilgjengelige C18-trinnstips eller -kolonner.
- Aktiver trinnspissen med 20 μL 50% acetonitril (ACN) i 0,1% maursyre (FA). Sentrifuger innholdet på 1000 x g i 1 minutt og kast gjennomstrømningen.
MERK: Forholdene for sentrifugering er de samme til slutten av prosedyren. - Tilsett 20 μL 100 % ACN i 0,1 % FA og sentrifuger innholdet som i trinn 4.1.
MERK: Aktiveringstrinn kan gjentas et par ganger. - Etter aktivering passerer du 20 μL rekonstituert peptidprøve gjennom trinnspissen og sentrifugen som utført i trinn 4.1.
MERK: Ikke kast gjennomstrømningen i dette trinnet. - Gjenta trinn 4.3 med gjennomstrømningen gjennom minst 5 ganger for å sikre maksimal peptidbinding til trinnspissen.
- Pass 20 μL 0,1% FA gjennom trinnspissen og kast gjennomstrømningen.
MERK: Gjenta dette trinnet to ganger til for å få bedre resultater. - Elute de bundne peptidene i et friskt mikrofugerør ved å passere økende konsentrasjoner av ACN, det vil si henholdsvis 40%, 60% og 80%.
- Tørk peptidene i en vakuumkonsentrator og fortsett med peptid-kvantifisering.
- Rekonstituer de tørkede peptidene i 0,1% FA og kvantifisere ved hjelp av Scopes-metoden5.
5 Klargjøring av ferdigstilte mål for overgangsliste
MERK: En overgang refererer til forløperparet (Q1) til produktverdier (Q3) m/z i et MRM-eksperiment. Et peptid kan ha en til mange overganger, med samme Q1-verdi, men forskjellige Q3-verdier. Et trippel quadrupole massespektrometer krever informasjon om overgangene for peptidene og deres produkter som skal oppdages. Derfor, før du starter et målrettet eksperiment, må en overgangsliste utarbeides. Dette kan gjøres ved hjelp av det elektroniske depotet til SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) eller en åpen kildekode-programvare kalt Skyline7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).
- Last ned den nylige menneskelige proteome FASTA-filen fra UniProt (https://www.uniprot.org/) og opprett en bakgrunnsproteomfil ved å sette den inn i Skyline. I peptidinnstillinger går du til rullegardinmenyen Background Proteome og klikker på Legg til. Feed i FASTA-sekvensfilen til det menneskelige proteomet. Kontroller at denne databasen er valgt, og at verdien for tillatt tapt spalting er satt til 0 før du går videre til neste trinn.
- Nå, under Filter-fanen i Peptide Settings, avgrenser lengden på aksepterte peptider fra 8 til 25 aminosyrer.
- Angi Forløperkostnader som 2,3 under Filter i Kategorien Filter i Overgangsinnstillinger, sett Ion-kostnader som 1 og sett Ion-typer til y. Produktioner kan velges avhengig av brukerens valg. Velg N-terminal for å proline for spesielle ioner og la alle andre parametere være standard.
MERK: Peptid- og overgangsinnstillingene kan variere avhengig av eksperimentet. - Sett inn peptider eller proteiner av interesse ved å klikke på Rediger og flytt til Sett inn. For å sette inn proteiner, kopier tiltredelses-ID-ene og for å sette inn spesifikke peptider, kopier peptidsekvensene. Programvaren tilordner tiltredelses-IDene til bakgrunnsproteomet, og overgangslisten opprettes basert på peptid- og overgangsinnstillingene.
- Eksporter overgangslisten. Kontroller at det riktige instrumentet er valgt i rullegardinlisten for Instrumenttype. For optimaliseringseksperimentene kan man velge å dele overgangslistene i mindre tall ved å angi ønsket antall overganger per fil i Skyline. Dette vil sikre at instrumentet ikke blir overveldet for å screene for mange overganger i en enkelt kjøring. Antall overganger må optimaliseres ytterligere for å få en enkelt metode - dette nevner vi heretter under metodeforbedringsdelen.
6 LC-parametere
- Bruk et binært løsningsmiddelsystem med vandig løsningsmiddel som inneholder 0,1% FA (løsningsmiddel A) og det organiske løsningsmidlet som inneholder 80% ACN (løsningsmiddel B).
- Sett kolonnetemperaturen til 45 °C.
- Still inn en LC-gradient på 10 min med en 450 μL/min strømningshastighet (som vist i tabell S1).
7 MS-parametere
MERK: Den forklarte analysen er utviklet og optimalisert for TSQ Altis Triple Quadrupole Mass Spectrometer.
- Optimaliser kjøreparametere som Q1- og Q3-oppløsning, oppholdstid og syklustid - en parameter om gangen. Vi finner at 0,7 oppløsning for første og tredje kvartal fungerer best. Syklustiden eller oppholdstiden må kanskje justeres i henhold til antall overganger og gjennomsnittlig toppbredde på peptidene som overvåkes.
- Bruk MS -parameterne i Tabell S2 og Tabell S3. Den totale metodevarigheten er 10 min.
MERK: Parametrene forblir de samme for alle kjøringene under og etter metodeforbedring, med mindre annet er nevnt. For et nytt eksperiment kan det være behov for å endre visse parametere avhengig av typen prøve- og prøvebehandlingstrinn.
8 Kjøresekvens og Instrument QC
- Forbered en blanding av vann: metanol: isopropanol: acetonitril i 1:1:1:1-forhold. Bruk denne blandingen som en tom.
- Forbered peptider for enhver standardprøve som kan brukes til konsekvent å overvåke instrumentets ytelse. Dette vil bli brukt som en QC-standard. Vi oppdager peptider fra BSA-sammendrag som er optimalisert og gir god og konsistent respons over flere dager (figur 2).
- For å kjøre prøver, bør sekvensen starte med et par emner, etterfulgt av QC-standarden og kliniske prøver. Kontroller alltid at det er ett mellomrom mellom to påfølgende prøver.
- For enkel sammenligning, sørg for at like mengder og volumer av hver prøve injiseres hver gang.
9 Metodeforbedring
- Analyser de foreløpige dataene som er hentet fra de grupperte eksemplene, ved hjelp av Skyline. Se etter riktig topp, overganger og parametere som toppform og intensitet for å velge de beste resultatene. Lagre filen som et nytt Skyline-prosjekt.
- Bruk et bibliotek for å finne den best samsvarende toppen, og følgelig anbefales den best mulige overgangslisten. Et bibliotek er et sett med MS/MS-topper som er tilgjengelige fra litteratur eller interne eksperimenter.
- Eksporter en ny overgangsliste fra det nylig lagrede Skyline-prosjektet, og bruk denne overgangslisten til å lage en ny metode. Hent data fra den nye metoden som er opprettet, og gjenta prosessen med å finjustere overgangene ved hjelp av Skyline.
- Når listen over peptider og overganger er ferdigstilt etter dataanalyse ved hjelp av Skyline, finjusterer du metoden ved å prøve ut forskjellige permutasjoner av syklustid og oppholdstid.
MERK: Bruk av syntetiske peptider med tung merking og indeksert oppbevaringstid (iRT) gjør metodeforbedring enkelt8,9. Det anbefales derfor at finjustering av metoden utføres ved hjelp av disse peptidene. - Bruk informasjonen om oppbevaringstid fra presiseringseksperimentene til å opprette en endelig metode som er planlagt (med et definert anskaffelsesvindu).
- Forbered prøver for enkeltemner. Data vil bli samlet inn for disse eksemplene ved hjelp av den endelige planlagte metoden.
- Når dataene er samlet inn, kan ytterligere nedstrømsanalyse og gruppemessig sammenligning utføres ved å importere RAW-filene til Skyline.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utførte relativ kvantifisering av 3 proteiner fra 10 prøver, 5 prøver fra hver gruppe pasienter med abnormiteter i hjernen. Disse proteinene inkluderte Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) og Nicotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) som er kjent for å utføre forskjellige roller i hjernecellene. Etterkjøringsanalyse av dataene ble utført ved hjelp av Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Totalt 10 peptider tilsvarende 3 proteiner ble overvåket. Disse inkluderte 3 peptider for APOA-I, 4 peptider for VIM og 3 peptider for NAMPT. Totalt antall overganger fra disse 10 peptidene utgjorde 57. Prøvene ble gruppert i en av de to gruppene avhengig av tilstanden de tilhørte. Ved hjelp av gruppesammenligningsfunksjonen i skyline ble toppoverflodene til disse peptidene sammenlignet, og relative kvantifiseringsverdier ble beregnet (figur 3).
Figur 1: En oversikt over trinn som er involvert i et eksperiment for multippel reaksjonsovervåking. A. Prøvepreparering for et typisk proteomisk eksperiment innebærer utvinning av proteiner (for illustrasjon har vi vist vevsprøve) etterfulgt av fordøyelsen ved hjelp av trypsin. De fordøyde peptidene blir til slutt avsaltet og gjort LC-MS klar. B. Trinnene som er involvert i et MRM-eksperiment inkluderer forløper og valg av produktion basert på m / z-verdiene. Bare overgangene som viser god respons vurderes for analyse. C. Dataanalysen i et MRM-eksperiment inkluderer en detaljert undersøkelse av toppformer og toppområder. Dette etterfølges til syvende og sist av statistisk analyse av resultatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Konsistens som svar for BSA ved hjelp av en optimalisert MRM-metode. A. Kromatogram for et representativt peptid av BSA viser konsistent toppform og intensitet gjennom de fem dagene eksperimentet ble utført. B. Oppbevaringstid konsistens observert for peptid på alle de fem dagene av eksperimentet C. Peak områder for peptid som sett i løpet av fem dager i uken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Differensialregulering av tre proteiner i to grupper av GBM tumorprøver. A. Representative kromatogrammer for Apolipoprotein A-I og kumulativt toppområde sett etter sammenligning mellom grupper. B. Representative kromatogrammer for Vimentin og kumulativt toppområde sett etter sammenligning mellom grupper. C. Representative kromatogrammer for Nikotinamid fosforibosyltransferase og kumulativt toppområde sett etter intergruppesammenligning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell S1: Detaljer om 10-minutters LC-gradient som skal brukes til alle prøver. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell S2: Parameterinnstillinger for ionkilden. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell S3: Parameterinnstillinger for MRM-metode. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikker som immunhiistokjemi og vestlig blotting ble ansett som gullstandardene for validering av proteinmål i mange år. Disse metodene finner bruk selv i dag med mindre modifikasjoner i protokollen og liten avhengighet av teknologi som gjør dem svært tungvinte og kjedelige. Foruten dette innebærer de også bruk av dyre antistoffer som ikke alltid viser samme spesifisitet på tvers av partier og krever mye kompetanse. I tillegg har bare en liten brøkdel av proteiner identifisert ved hjelp av høy gjennomstrømningsteknikker som massespektrometri, kompatible antistoffer tilgjengelig, noe som ytterligere kompliserer hele prosedyren. Derfor blir målrettede proteomiske analyser sakte tatt opp som den nye tilnærmingen for å validere mål10. Med det meste av målfunnet som skjer på høygjennomstrømnings omics-plattformer, vurderes også paneler med validerte mål for kliniske screeningapplikasjoner11,12,13.
De representative resultatene i denne artikkelen har validert differensialuttrykket til proteiner Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) og Nicotinamide fosforibosyltransferase (NAMPT) under to forhold (tilstand 1 og tilstand 2) i hjernevevet. Apolipoprotein A-I har blitt rapportert å spille en sentral rolle i vedlikehold av cerebrovaskulær integritet og redusere risikoen for Alzhiemers sykdom. Selv om ApoA-I ikke syntetiseres i hjernen, gjør dens evne til å krysse blodhjernebarrieren (BBB) sin tilstedeværelse i hjernen vital14. Vimentin-proteinet har blitt studert i en rekke roller inne i hjernen. En av nøkkelfunksjonene til Vimentin er imidlertid dens engasjement i mikrogliaaktivering. Redusert uttrykk for Vimentin var forbundet med svekkelse av mikroglial aktivering15. Proteinet NAMPT har blitt rapportert å spille en nøkkelrolle i aldring relatert tap av nevroner og cerebral vaskulære endotel dysfunksjoner16. Alle de tre proteinene har blitt rapportert å spille en rekke roller i normale hjerneceller og hjernerelaterte maligniteter. Derfor kan MRM-basert validering for disse proteinene og deres peptider finne stor bruk i klinisk diagnose relatert til ulike hjernerelaterte lidelser.
En fullt optimalisert målrettet analyse kan enkelt brukes til deteksjon og kvantifisering av et målpanel med høy gjennomstrømning. Hastighetsbegrensende trinn er den første metodeoptimaliseringen som er kjedelig og varierer basert på prøvetype, protein / peptidmål, instrument som brukes og deteksjonsbias av visse peptider. Det er avgjørende at overgangslisten er optimalisert for en robust analyse. Enhver bruker som er interessert i å utvikle en slik analyse for humane hjernevevsprøver, vil oppdage at den ovennevnte forklarte protokollen minimerer disse variable faktorene. Den beskriver en optimalisert protokoll for peptidutvinning fra denne unike og kjedelige vevs-biospecimen og optimale parametere som skal brukes i instrumentet med spesiell oppmerksomhet på viktige kvalitetskontrolltrinn på ulike punkter i protokollen. Som med all ny teknologi har forskerne gitt et sett med retningslinjer, hvilke forfattere som må innrede eller hvilke skritt de følger under eksperimentet. For denne fronten, i 2017, ble MCP-retningslinjene for rapportering av målrettede proteomikkanalyser og data fastsatt17. Disse retningslinjene sikrer at den rapporterte studien/analysen er pålitelig og reproduserbar, og dermed øker anvendelsen av metoden. Ved å ta de riktige forholdsreglene og utnytte det sanne potensialet i denne analysen, ville forskere snart kunne komme med klinisk relevante analyser med enormt potensial i diagnose og terapeutisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne fikk støtte fra Thermofisher for publiseringsavgiften.
Acknowledgments
Vi anerkjenner MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), prosjekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility ved IIT Bombay støttet av Institutt for bioteknologi (BT/PR13114/INF/22/206/2015) for å utføre alle MS-relaterte eksperimenter.
Vi utvider vår spesielle takk til Mr. Rishabh Yadav for å lage og redigere hele videoen og Mr. Nishant Nerurkar for hans arbeid med å redigere lyden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC - Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Biochemistry. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
