Summary
Protokollet syftar till att införa användning av en trippel fyrdubbel masspektrometer för multipla reaktionsövervakning (MRM) av proteiner från kliniska prover. Vi har tillhandahållit ett systematiskt arbetsflöde från provberedning till dataanalys för kliniska prover med alla nödvändiga försiktighetsåtgärder som ska vidtas.
Abstract
Den proteomiska analysen av den mänskliga hjärnvävnaden under det senaste decenniet har kraftigt förbättrat vår förståelse av hjärnan. Hjärnrelaterade sjukdomar fortsätter dock att vara en stor bidragande orsak till dödsfall runt om i världen, vilket kräver behovet av ännu större förståelse för deras patobiologi. Traditionella antikroppsbaserade tekniker som western blotting eller immunohistochemistry lider av att vara låggenomströmning förutom att vara arbetsintensiva och kvalitativa eller semikvantitativa. Även konventionella masspektrometribaserade hagelgevärsmetoder misslyckas med att ge avgörande bevis för att stödja en viss hypotes. Riktade proteomics metoder är till stor del hypotesdrivna och skiljer sig från konventionella hagelgevär proteomics metoder som har använts länge. Övervakning av flera reaktioner är en sådan riktad metod som kräver användning av en speciell masspektrometer som kallas tandem fyrdubbel masspektrometer eller trippel fyrdubbel masspektrometer. I den aktuella studien har vi systematiskt lyft fram de viktigaste stegen i att utföra ett framgångsrikt tandem fyrdubbelt masspektrometribaserat proteomikarbetsflöde med hjälp av mänsklig hjärnvävnad i syfte att introducera detta arbetsflöde till en bredare forskargemenskap.
Introduction
Under det senaste decenniet har den snabba utvecklingen inom masspektrometri (MS) i kombination med ökad förståelse för kromatografitekniker i hög grad bidragit till utvecklingen av MS-baserade proteomiker. Molekylärbiologiska tekniker som western blotting och immunohistochemistry har länge lidit av reproducerbarhetsproblem, långsam leveranstid, variabilitet mellan observatörer och deras oförmåga att exakt kvantifiera proteiner, för att nämna några. För detta ändamål fortsätter den överlägsna känsligheten hos proteomiska metoder med hög genomströmning att erbjuda molekylärbiologer ett alternativt och mer tillförlitligt verktyg i sin strävan att bättre förstå proteinernas roller i celler. Hagelgevärsproteomikmetoder (Data dependent Acquisition eller DDA) misslyckas dock ofta med att upptäcka låga rikliga proteiner i komplexa vävnader förutom att vara starkt beroende av instrumentets känslighet och upplösning. Under de senaste åren har labb runt om i världen utvecklat tekniker som Data Independent Acquisition (DIA) som kräver ökad datorkraft och pålitlig programvara som kan hantera dessa mycket komplexa datamängder. Dessa tekniker är dock fortfarande ett pågående arbete och inte särskilt användarvänligt. Riktade MS-baserade proteomikmetoder ger en perfekt balans mellan ms-metodernas höga genomströmningskaraktär och känsligheten hos molekylärbiologiska metoder som ELISA. Ett riktat masspektrometribaserat proteomikexperiment fokuserar på att upptäcka hypotesdrivna proteiner eller peptider från upptäcktsbaserade hagelgevärsproteomiska experiment eller genom tillgänglig litteratur1,2. Multipla reaktionsövervakning (MRM) är en sådan riktad MS-metod som använder en tandem fyrdubbel masspektrometer för korrekt detektion och kvantifiering av proteiner/peptider från komplexa prover. Tekniken ger högre känslighet och specificitet trots att det kräver användning av ett lågupplöst instrument.
En fyrdubbel är tillverkad av 4 parallella stavar, med varje stång ansluten till den diagonalt motsatta stången. Ett fluktuerande fält skapas mellan fyrdubbelstavarna genom att använda alternerande RF- och LIKSTRÖMSspänningar. Jonens bana inuti fyrdubbla påverkas av närvaron av samma spänningar över motsatta stavar. Genom att applicera RF på likströmsspänning kan jonens bana stabiliseras. Det är denna egenskap hos fyrdubbla som gör att den kan användas som ett massfilter som selektivt kan låta specifika joner passera igenom. Beroende på behovet kan en fyrdubbel manövreras i antingen statiskt läge eller skanningsläge. Det statiska läget tillåter endast joner med en angiven m/z att passera genom, vilket gör läget mycket selektivt och specifikt för jonen av intresse. Skanningsläget å andra sidan tillåter joner över hela m/z-området att passera igenom. Tandem fyrdubbla masspektrometrar kan således fungera på 4 möjliga sätt: i) den första fyrdubbla som arbetar i statiskt läge medan den andra arbetar i skanningsläge; ii) Den första fyrdubbel som arbetar i skanningsläge medan den andra arbetar i statiskt läge. iii) Båda fyrlingarna i skanningsläge. och iv) båda fyrlingarna i statiskt läge3. I ett typiskt MRM-experiment arbetar båda fyrdubbelerna i statiskt läge så att specifika prekursorer och deras resulterande produkter efter fragmentering kan övervakas. Detta gör tekniken mycket känslig och selektiv och möjliggör noggrann kvantifiering.
För molekylärbiologer är den mänskliga hjärnvävnaden och dess celler en skattkista. Dessa anmärkningsvärda enheter av ett ständigt intressant organ i människokroppen kan ge molekylära och cellulära insikter om dess funktion. Proteomiska undersökningar av hjärnvävnaden kan inte bara hjälpa oss att förstå den systemiska funktionen hos en frisk hjärna utan också de cellulära vägarna som blir dysregulerade när de orsakas av någon sjukdom4. Hjärnvävnaden med all sin heterogenitet är dock ett mycket komplext organ att analysera och kräver ett samordnat tillvägagångssätt för en bättre förståelse av förändringarna på molekylär nivå. Följande arbete beskriver hela arbetsflödet som börjar direkt från att extrahera proteiner från hjärnvävnad, skapa och optimera metoderna för MRM-analys till validering av målen (figur 1). Här har vi systematiskt lyft fram de viktigaste stegen i ett framgångsrikt MRM-baserat experiment med hjälp av mänsklig hjärnvävnad i syfte att introducera tekniken och dess utmaningar för ett bredare forskarsamhälle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie omfattar hjärnvävnadsprover från mänskliga deltagare, granskade och godkända av TMH och IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Deltagarna gav sitt informerade och skriftliga samtycke till att delta i denna studie.
1 Proteinextraktion från hjärnvävnad
- Väg cirka 50 mg hjärnvävnad och tvätta vävnaden med 300 μL 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS) med hjälp av en mikropipett.
OBS: Detta steg utförs för att avlägsna blod på vävnadens yttre yta och måste upprepas vid behov. Det är lämpligt att ta bort så mycket blod från vävnaden som möjligt eftersom det stör nedströms proteinuppskattning och bearbetning. - Efter tvättning med PBS, tillsätt 300 μL lysbuffert (buffert A) till röret som innehåller vävnaden. Buffert A innehåller 8 M urea, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2 och Protease inhibitorcocktail (enligt tillverkarens instruktioner).
OBS: Proteinutbytet varierar beroende på flera faktorer som sträcker sig från de förhållanden under vilka proverna lagras, mängden utgångsmaterial och effektiviteten i hanteringen av proverna under bearbetningen. Minska volymen av buffert A proportionellt vid arbete med mängder vävnad som är lägre än 50 mg. - Lysa vävnaden med hjälp av en sondsonicator samtidigt som röret på ett isbad. Använd följande parametrar för ultraljudsbehandling: 40% amplitud, 5 sekunder på och av cykel i 2:30 min.
- Fortsätt med vävnad homogenisering med en pärlviser för att helt lysa vävnaden.
OBS: Detta steg bör utföras med medelhög hastighet i 90 sekunder följt av inkubation på is i 3-5 minuter. - Centrifugera innehållet i röret vid 6 000 x g i 15 min vid 4 °C. Överför supernaten till ett färskt rör och blanda homogent.
OBS: Gör alikvoter av provet och förvara vid -80°C tills vidare användning.
2 Protein kvantifiering och kvalitetskontroll
- Kvantifiera proverna före matsmältningen med hjälp av ett standarddiagram gjort med kända koncentrationer av BSA.
OBS: Se till att analysen som används för proteinuppskattning är kompatibel med den buffert som används för att göra proteinet lysat. Kontrollera proteinlyatets kvalitet genom att köra en SDS-PAGE-gel.
3 Protein matsmältning
- Ta 50 μg protein i ett mikrocentrifugrör och minska proteinerna genom att tillsätta Tris 2-carboxyetylfosfin (TCEP) så att den slutliga koncentrationen är 20 mM. Inkubera innehållet vid 37 °C i 1 timme.
- Efter inkubation alkylerar alkylat de reducerade proteinerna genom att tillsätta jodacetamid (IAA) till röret så att dess slutliga koncentration är 40 mM. Inkubera röret i mörker i 30 minuter.
OBS: Förbered IAA ordentligt precis innan det tillförs röret. - Tillsätt buffert B till röret som innehåller de reducerade och alkylerade proteinerna så att den slutliga koncentrationen av karbamid i röret är mindre än 1 M.
OBS: Buffert B består av 25 mM Tris (pH 8.0) och 1 mM CaCl2 och används för utspädning av proverna. Vid utspädning, se till att innehållet i röret har ett pH på 8 för optimal protein matsmältning efter tillsats av trypsin. - Tillsätt trypsin i ett 1:30 enzym till proteinförhållande och inkubera rören över natten vid 37 °C med konstant skakning.
- Efter matsmältningen, koncentrera den smälta produkten i en vakuumkoncentrator. I detta steg kan peptiderna antingen rekonstitueras och avsaltas eller lagras vid -80 °C för framtida användning.
4 Avsaltning och peptidk kvantifiering
OBS: Avsaltning eller peptidrengöring är nödvändig innan proverna för LC-MS/MS lastas. Salter och andra föroreningar i provet kan täppa till kolonnerna och orsaka skador på instrumentet också. Processen kan utföras med hjälp av kommersiellt tillgängliga C18-scentips eller kolumner.
- Aktivera scenspetsen med 20 μL 50% acetonitril (ACN) i 0,1% myrsyra (FA). Centrifugera innehållet vid 1 000 x g i 1 minut och kassera flödet.
OBS: Villkoren för centrifugation är desamma fram till slutet av proceduren. - Tillsätt 20 μL 100% ACN i 0,1% FA och centrifugera innehållet som i steg 4.1.
Obs: Aktiveringssteg kan upprepas ett par gånger. - Efter aktivering, passera 20 μL rekonstituerat peptidprov genom scenspetsen och centrifugen enligt steg 4.1.
OBS: Kasta inte flödet i det här steget. - Upprepa steg 4.3 med flödet igenom minst 5 gånger för att säkerställa maximal peptidbindning till scenspetsen.
- Passera 20 μL 0,1 % FA genom scenspetsen och kassera flödet.
Obs: Upprepa det här steget ytterligare två gånger för bättre resultat. - Eluera de bundna peptiderna i ett färskt mikrofugerör genom att passera ökande koncentrationer av ACN, dvs. 40%, 60% respektive 80%.
- Torka peptiderna i en vakuumkoncentrator och fortsätt för peptidklikantifiering.
- Rekonstruera de torkade peptiderna i 0,1% FA och kvantifiera med hjälp av Scopes-metoden5.
5 Övergångslista förberedelse av slutförd mål
OBS: En övergång avser par prekursorer (Q1) till produktvärden (Q3) m/z i ett MRM-experiment. En peptid kan ha en till många övergångar, med samma Q1-värde men olika Q3-värden. En trippel fyrdubbel masspektrometer kräver information om övergångarna för peptiderna och deras produkter som ska detekteras. Innan ett riktat experiment påbörjas måste därför en övergångslista utarbetas. Detta kan göras med online-lagringsplatsen för SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) eller en programvara med öppen källkod som heter Skyline7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).
- Ladda ner den senaste mänskliga proteome FASTA-filen från UniProt (https://www.uniprot.org/) och skapa en bakgrundsproteome-fil genom att infoga den i Skyline. I peptidinställningar, gå till Background Proteome dropdown och klicka på Add. Feed i FASTA-sekvensfilen för den mänskliga proteomen. Kontrollera att databasen är markerad och att det tillåtna värdet för missad klyvning är inställt på 0 innan du går vidare till nästa steg.
- Nu, under fliken Filter i Peptidinställningar avgränsa längden på accepterade peptider från 8 till 25 aminosyror.
- Ställ in Jonladdningar som 1 under Fliken Filter under Fliken Filter som 2,3 och ställ in jontyper på y. Produktjoner kan väljas beroende på användarens val. Välj N-terminal för att proline för speciella joner och lämna alla andra parametrar som standard.
OBS: Peptid- och övergångsinställningarna kan variera beroende på experimentet. - Sätt in peptider eller proteiner av intresse genom att klicka på Redigera och flytta till Infoga. För att sätta in proteiner, kopiera deras anslutnings-ID och för att sätta in specifika peptider, kopiera peptidsekvenserna. Programvaran kartlägger anslutnings-ID: t till bakgrundsproteome och övergångslistan skapas baserat på peptid- och övergångsinställningarna.
- Exportera övergångslistan. Se till att rätt instrument väljs i listrutanför instrumenttyp. För optimeringsexperimenten kan man välja att dela upp övergångslistorna i mindre tal genom att ställa in önskat antal övergångar per fil i Skyline. Detta säkerställer att instrumentet inte är överväldigat för att screena för många övergångar i en enda körning. Antalet övergångar måste optimeras ytterligare för att få en enda metod - detta nämner vi hädanefter under avsnittet metodförfining.
6 LC-parametrar
- Använd ett binärt lösningsmedelssystem med vattenhaltigt lösningsmedel som innehåller 0,1 % FA (lösningsmedel A) och det organiska lösningsmedlet som innehåller 80 % ACN (lösningsmedel B).
- Ställ in kolonntemperaturen på 45 °C.
- Ställ in en LC-lutning på 10 min med ett flöde på 450 μL/min (enligt tabell S1).
7 MS-parametrar
OBS: Den förklarade analysen har utvecklats och optimerats för TSQ Altis Triple Quadrupole Mass Spectrometer.
- Optimera körparametrar som Q1- och Q3-upplösning, uppehållstid och cykeltid - en parameter i taget. Vi tycker att 0,7-upplösning för Q1 och Q3 fungerar bäst. Cykeltiden eller uppehållstiden kan behöva justeras beroende på antalet övergångar och den genomsnittliga toppbredden för de peptider som övervakas.
- Använd MS-parametrarna i tabell S2 och tabell S3. Den totala metodlängden är 10 min.
OBS: Parametrarna förblir desamma för alla körningar under och efter metodförfining, om inget annat anges. För ett nytt experiment kan det finnas ett behov av att ändra vissa parametrar beroende på typen av prov- och provbearbetningssteg.
8 Kör sekvens och instrument QC
- Bered en blandning av vatten: metanol: isopropanol: acetonitril i förhållandet 1:1:1:1. Använd blandningen som ett tomrum.
- Förbered peptider för alla standardprover som kan användas för att konsekvent övervaka instrumentets prestanda. Detta kommer att användas som en QC-standard. Vi upptäcker peptider från BSA-röt som har optimerats och ger bra och konsekvent respons under flera dagar (Figur 2).
- För att köra prover bör sekvensen börja med ett par ämnen, följt av QC-standarden och kliniska prover. Se alltid till att det finns ett tomrum mellan två på varandra följande prover.
- För att underlätta jämförelsen, se till att lika stora mängder och volymer av varje prov injiceras varje gång.
9 Metodförfining
- Analysera de preliminära data som erhålls från de poolade exemplen med Skyline. Leta efter rätt topp, övergångar och parametrar som toppform och intensitet för att välja bästa resultat. Spara filen som ett nytt Skyline-projekt.
- Använd ett bibliotek för att hitta den bästa matchande toppen och därför rekommenderas den bästa möjliga övergångslistan. Ett bibliotek är en uppsättning MS/MS-toppar som är tillgängliga från litteratur eller interna experiment.
- Exportera en ny övergångslista från det nyligen sparade Skyline-projektet och använd den här övergångslistan för att skapa en ny metod. Hämta data från den nya metoden som skapats och upprepa processen för att förfina övergångarna med Skyline.
- När listan över peptider och övergångar är klar efter dataanalys med Skyline finjusterar du metoden genom att prova olika permutationer av cykeltid och uppehållstid.
OBS: Användningen av tunga märkta syntetiska peptider och indexerade retentionstidspeptider (iRT) gör metodförfining lätt8,9. Det är därför tillrådligt att finjustering av metoden utförs med dessa peptider. - Använd information om kvarhållningstid från förfiningsexperimenten och skapa en slutlig metod som schemaläggs (med ett definierat anskaffningsfönster).
- Förbered prover för enskilda försökspersoner. Data kommer att samlas in för dessa prover med hjälp av den slutliga schemalagda metoden.
- När data har förvärvats kan ytterligare nedströmsanalys och gruppvis jämförelse utföras genom att importera de råa filerna till Skyline.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utförde relativ kvantifiering av 3 proteiner från 10 prover, 5 prover från varje grupp av patienter med avvikelser i hjärnan. Dessa proteiner inkluderade Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) och Nikotinamidfosforibosyltransferas (NAMPT) som är kända för att utföra olika roller i hjärncellerna. Efterkörningsanalys av data utfördes med Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Totalt övervakades 10 peptider motsvarande 3 proteiner. Dessa inkluderade 3 peptider för APOA-I, 4 peptider för VIM och 3 peptider för NAMPT. Det totala antalet övergångar från dessa 10 peptider uppgick till 57. Proverna grupperades i någon av de två grupperna beroende på vilket tillstånd de tillhörde. Med hjälp av gruppjämförelsefunktionen i skyline jämfördes toppförekomsterna för dessa peptider och relativa kvantifieringsvärden beräknades (figur 3).
Figur 1: En översikt över de steg som ingår i ett experiment för övervakning av flera reaktioner. A. Provberedning för ett typiskt proteomikexperiment innebär extraktion av proteiner (för illustration har vi visat vävnadsprov) följt av matsmältning med trypsin. De smälta peptiderna avsaltas i slutändan och görs LC-MS redo. B. Jag är inte så bra på Stegen i ett MRM-experiment inkluderar prekursor- och produktjonval baserat på deras m/z-värden. Endast de övergångar som visar bra svar beaktas för analys. C. Dataanalysen i ett MRM-experiment inkluderar en detaljerad undersökning av toppformer och toppområden. Detta följs slutligen av statistisk analys av resultaten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Konsekvens som svar för BSA med hjälp av en optimerad MRM-metod. A. Kromatogram för en representativ peptid av BSA visar konsekvent toppform och intensitet under de fem dagar experimentet utfördes. B. Jag är inte så bra på Retentionstidskonsistens observerad för peptiden på alla de fem dagarna av experimentet C. Toppområden för peptiden sett under loppet av fem dagar i veckan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Differentiell reglering av tre proteiner i två grupper av GBM tumörprover. A. Representativa kromatogram för Apolipoprotein A-I och kumulativt toppområde sett efter jämförelse mellan grupper. B. Jag är inte så bra på Representativa kromatogram för Vimentin och kumulativt toppområde sett efter jämförelse mellan grupper. C. Representativa kromatogram för nikotinamidfosforibosyltransferas och kumulativt toppområde sett efter jämförelse mellan grupper. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tabell S1: Uppgifter om 10 minuters LC-lutning som ska användas för alla prover. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell S2: Parameterinställningar för jonkällan. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell S3: Parameterinställningar för MRM-metod. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekniker som Immunohistochemistry och Western blotting ansågs vara guldstandarderna för validering av proteinmål i många år. Dessa metoder använder sig än i dag av smärre ändringar i protokollet och litet beroende av teknik, vilket gör dem mycket besvärliga och tråkiga. Utöver detta innebär de också användning av dyra antikroppar som inte alltid visar samma specificitet över partier och kräver en hel del expertis. Dessutom har endast en liten del av proteiner som identifieras med hjälp av tekniker med hög genomströmning som masspektrometri kompatibla antikroppar tillgängliga, vilket ytterligare komplicerar hela proceduren. Därför tas riktade proteomiska analyser långsamt upp som den nya metoden för validering av mål10. Med det mesta av målupptäckten som sker på plattformar för hög genomströmning omics, övervägs också paneler av validerade mål för kliniskascreeningapplikationer 11,12,13.
De representativa resultaten i denna artikel har validerat differentialuttrycket av proteiner Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) och Nikotinamidfosforibosyltransferas (NAMPT) under två förhållanden (tillstånd 1 och tillstånd 2) i hjärnvävnaden. Apolipoprotein A-I har rapporterats spela en central roll i upprätthållandet av cerebrovaskulär integritet och minska risken för Alzhiemers sjukdom. Även om ApoA-I inte syntetiseras i hjärnan, gör dess förmåga att korsa blodhjärnbarriären (BBB) dess närvaro i hjärnan vital14. Vimentinproteinet har studerats i ett antal roller i hjärnan. En av vimentins viktigaste funktioner är dock dess inblandning i mikrogliaaktivering. Minskat uttryck av Vimentin var associerad med nedskrivningar av microglialaktivering 15. Proteinet NAMPT har rapporterats spela en nyckelroll i åldrande relaterade förlust av nervceller och cerebral vaskulär endoteldysfunktioner 16. Alla de tre proteinerna har rapporterats spela en mängd roller i normala hjärnceller och hjärnrelaterade maligniteter. Därför kan MRM-baserad validering för dessa proteiner och deras peptider hitta stor användning vid klinisk diagnos relaterad till olika hjärnrelaterade sjukdomar.
En helt optimerad riktad analys kan enkelt användas för hög data flödes identifiering och kvantifiering av en mål panel. Hastighetsbegränsande steg är den initiala metodoptimeringen som är tråkig och varierar beroende på provtyp, protein/peptidmål, instrument som används och detektionsbiasen hos vissa peptider. Det är viktigt att övergångslistan optimeras för en robust analys. Alla användare som är intresserade av att utveckla en sådan analys för mänskliga hjärnvävnadsprover kommer att upptäcka att ovanstående förklarade protokoll minimerar dessa variabla faktorer. Det beskriver ett optimerat protokoll för peptid utvinning från denna unika och tråkiga vävnad biospecimen och optimala parametrar som ska användas i instrumentet med särskild uppmärksamhet på avgörande kvalitetskontroll steg vid olika punkter i protokollet. Som med all ny teknik har forskarna gett en uppsättning riktlinjer, vilka författare som behöver möblera eller vilka steg de följer under experimentet. I detta område fastställdes 17 riktlinjer för mcp-programmet för rapportering av riktade proteomikanalyser och dataför 2017. Dessa riktlinjer säkerställer att den rapporterade studien/analysen är tillförlitlig och reproducerbar, vilket ökar metodens tillämplighet. Genom att vidta rätt försiktighetsåtgärder och utnyttja den verkliga potentialen i denna analys skulle forskare snart kunna komma med kliniskt relevanta analyser med enorm potential inom diagnos och terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna fick stöd av Thermofisher för publiceringsavgiften.
Acknowledgments
Vi bekräftar MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB till SS och MASSFIITB Facility vid IIT Bombay med stöd av institutionen för bioteknik (BT/PR13114/INF/22/206/2015) för att utföra alla MS-relaterade experiment.
Vi vill särskilt tacka Rishabh Yadav för att han gjorde och redigerade hela videon och Mr. Nishant Nerurkar för hans arbete med att redigera ljudet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC - Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Biochemistry. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
