Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नैदानिक नमूनों से प्रोटीन के मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) के लिए ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग शुरू करना है। हमने सभी आवश्यक सावधानियों के साथ नैदानिक नमूनों के लिए नमूना तैयारी से लेकर डेटा विश्लेषण तक एक व्यवस्थित कार्यप्रवाह प्रदान किया है।
Abstract
पिछले दशक में मानव मस्तिष्क के ऊतकों के प्रोटेओमिक विश्लेषण ने मस्तिष्क के बारे में हमारी समझ को बहुत बढ़ाया है। हालांकि, मस्तिष्क से संबंधित विकारों को दुनिया भर में मौतों का एक प्रमुख योगदानकर्ता बना हुआ है, उनके रोग विज्ञान की और भी अधिक समझ के लिए की जरूरत है । पश्चिमी ब्लॉटिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसी पारंपरिक एंटीबॉडी-आधारित तकनीकें श्रम-प्रधान और गुणात्मक या अर्ध-मात्रात्मक होने के अलावा कम थ्रूपुट होने से पीड़ित हैं। यहां तक कि पारंपरिक जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित शॉटगन दृष्टिकोण एक निश्चित परिकल्पना का समर्थन करने के लिए निर्णायक सबूत प्रदान करने में विफल रहे हैं। लक्षित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण काफी हद तक परिकल्पना से प्रेरित होते हैं और पारंपरिक शॉटगन प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोणों से भिन्न होते हैं जो लंबे समय तक उपयोग में रहे हैं। मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग ऐसा ही एक लक्षित दृष्टिकोण है जिसके लिए एक विशेष मास स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग की आवश्यकता होती है जिसे टैंडेम क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर या ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर कहा जाता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने इस कार्यप्रवाह को व्यापक अनुसंधान समुदाय में पेश करने के उद्देश्य से मानव मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करके एक सफल टैम्परपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो का सफल प्रदर्शन करने में शामिल प्रमुख कदमों पर व्यवस्थित रूप से प्रकाश डाला है।
Introduction
पिछले दशक के दौरान, क्रोमेटोग्राफी तकनीकों की बढ़ती समझ के साथ-साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) में तेजी से विकास ने एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स की उन्नति में बहुत मदद की है। आणविक जीव विज्ञान आधारित तकनीकों जैसे पश्चिमी ब्लॉटिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री लंबे समय से प्रजनन के मुद्दों, धीमी गति से बदलाव के समय, अंतर-पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता और प्रोटीन को सही मात्रा में निर्धारित करने में उनकी असमर्थता से पीड़ित हैं, कुछ नाम हैं। इस उद्देश्य के लिए, उच्च थ्रूपुट प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोणों की बेहतर संवेदनशीलता कोशिकाओं में प्रोटीन की भूमिकाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए आणविक जीवविज्ञानियों को उनकी खोज में एक वैकल्पिक और अधिक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करती रहती है। हालांकि, शॉटगन प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण (डेटा निर्भर अधिग्रहण या डीडीए) अक्सर उपकरण की संवेदनशीलता और संकल्प पर भारी निर्भर होने के अलावा जटिल ऊतकों में कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का पता लगाने में विफल रहते हैं। पिछले कुछ वर्षों में, दुनिया भर की प्रयोगशालाएं डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण (डीआईए) जैसी तकनीकों का विकास कर रही हैं जिनके लिए बढ़ी हुई कंप्यूटिंग शक्ति और विश्वसनीय सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है जो इन अत्यधिक जटिल डेटासेट को संभाल सकते हैं। हालांकि, इन तकनीकों को अभी भी प्रगति में एक काम कर रहे है और बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल नहीं है । लक्षित एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण एमएस दृष्टिकोणों की उच्च थ्रूपुट प्रकृति और एलिसा जैसे आणविक जीव विज्ञान दृष्टिकोणों की संवेदनशीलता के बीच एक आदर्श संतुलन प्रदान करते हैं। एक लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स प्रयोग खोज आधारित शॉटगन प्रोटेओमिक्स प्रयोगों से या उपलब्ध साहित्य1,2के माध्यम से परिकल्पना चालित प्रोटीन या पेप्टाइड्स का पता लगाने पर केंद्रित है। मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) ऐसा ही एक लक्षित एमएस दृष्टिकोण है जो जटिल नमूनों से प्रोटीन/पेप्टाइड्स का सटीक पता लगाने और मात्राकरण के लिए एक मिलकर क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करता है । तकनीक कम संकल्प वाले उपकरण के उपयोग की आवश्यकता के बावजूद उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान करती है।
एक चतुर्भुज 4 समानांतर छड़ से बना है, जिसमें प्रत्येक रॉड तिरछे विपरीत रॉड से जुड़ा होता है। बारी आरएफ और डीसी वोल्टेज लगाने से क्वाड्रपोल छड़ के बीच एक उतार-चढ़ाव वाला क्षेत्र बनाया जाता है। क्वाड्रपोल के अंदर आयनों का प्रक्षेपवक्र विपरीत छड़ों में एक ही वोल्टेज की उपस्थिति से प्रभावित होता है। डीसी वोल्टेज के लिए आरएफ लागू करके, आयनों की गति को स्थिर किया जा सकता है। यह चतुर्भुज की यह संपत्ति है जो इसे एक बड़े पैमाने पर फ़िल्टर के रूप में उपयोग करने की अनुमति देती है जो चुनिंदा विशिष्ट आयनों को पारित करने दे सकती है। आवश्यकता के आधार पर, एक क्वाड्रपोल को या तो स्थिर मोड या स्कैनिंग मोड में संचालित किया जा सकता है। स्थिर मोड केवल एक निर्दिष्ट एम/जेड के साथ आयनों को पारित करने की अनुमति देता है, जिससे मोड अत्यधिक चयनात्मक और ब्याज के आयन के लिए विशिष्ट हो जाता है। दूसरी ओर स्कैनिंग मोड पूरे एम/जेड रेंज में आयनों के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, टैंडेम क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर 4 संभावित तरीकों से काम कर सकते हैं: i) पहला क्वाड्रपोल स्थिर मोड में काम कर रहा है जबकि दूसरा स्कैनिंग मोड में काम कर रहा है; ii) स्कैनिंग मोड में पहला क्वाड्रपोल काम कर रहा है जबकि दूसरा स्थिर मोड में काम कर रहा है; iii) स्कैनिंग मोड में काम करने वाले दोनों क्वाड्रपोल; और iv) स्टेटिक मोड3में काम कर रहे दोनों क्वाड्रपोल्स . एक विशिष्ट एमआरएम प्रयोग में, दोनों क्वाड्रपोल स्थिर मोड में काम करते हैं जो विखंडन के बाद विशिष्ट अग्रदूतों और उनके परिणामस्वरूप उत्पादों की निगरानी करने की अनुमति देते हैं। यह तकनीक को सटीक मात्राकरण की अनुमति देने के लिए बहुत संवेदनशील और चयनात्मक बनाता है।
आणविक जीव विज्ञानियों के लिए, मानव मस्तिष्क ऊतक और इसकी कोशिकाएं एक खजाना निधि हैं। मानव शरीर के एक कभी दिलचस्प अंग की ये उल्लेखनीय इकाइयां अपने कामकाज में आणविक और सेलुलर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं। मस्तिष्क के ऊतकों की प्रोटेओमिक जांच न केवल हमें स्वस्थ मस्तिष्क के प्रणालीगत कामकाज को समझने में मदद कर सकती है बल्कि सेलुलर रास्ते भी जो किसी बीमारी द्वारा दिए जाने परडिसेलेटहो जाते हैं 4 । हालांकि, अपनी सभी विषमता के साथ मस्तिष्क ऊतक विश्लेषण करने के लिए एक बहुत ही जटिल अंग है और आणविक स्तर पर परिवर्तन की बेहतर समझ के लिए एक ठोस दृष्टिकोण की आवश्यकता है। निम्नलिखित कार्य मस्तिष्क के ऊतकों से प्रोटीन निकालने, एमआरएम परख के तरीकों को बनाने और अनुकूलित करने, लक्ष्यों के सत्यापन(चित्रा 1)से शुरू होने वाले पूरे कार्यप्रवाह का वर्णन करता है। यहां, हमने एक व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए तकनीक और इसकी चुनौतियों को पेश करने के उद्देश्य से मानव मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करके एक सफल एमआरएम आधारित प्रयोग में शामिल प्रमुख कदमों पर व्यवस्थित रूप से प्रकाश डाला है ।
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Protocol
इस अध्ययन में मानव प्रतिभागियों से मस्तिष्क के ऊतकों के नमूने शामिल हैं, टीएमएच और आईआईटीबी आईईसी द्वारा समीक्षा और अनुमोदित -(IITB-IEC/2018/019) । प्रतिभागियों ने इस अध्ययन में भाग लेने के लिए अपनी सूचित और लिखित सहमति प्रदान की ।
1 मस्तिष्क के ऊतकों से प्रोटीन निष्कर्षण
- मस्तिष्क के ऊतकों के लगभग 50 मिलीग्राम वजन और एक माइक्रोपिपेट का उपयोग कर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 300 माइक्रोन के साथ ऊतक धोने।
नोट: यह कदम ऊतक की बाहरी सतह पर किसी भी रक्त को हटाने के लिए किया जाता है और यदि आवश्यक हो तो दोहराया जाना चाहिए। ऊतक से जितना संभव हो उतना रक्त निकालने की सलाह दी जाती है क्योंकि यह डाउनस्ट्रीम प्रोटीन अनुमान और प्रसंस्करण में हस्तक्षेप करता है। - पीबीएस के साथ धोता के बाद, ऊतक युक्त ट्यूब में लाइसिस बफर (बफर ए) के 300 माइक्रोन जोड़ें। बफर ए में 8 एम यूरिया, 50 एमएम ट्रिस पीएच 8.0, 75 एमएमएम एनएसीएल, 1 एमएमएम एमजीसीएल2 और प्रोटेसी अवरोधक कॉकटेल (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) शामिल हैं।
नोट: प्रोटीन उपज कई स्थितियों में नमूनों को संग्रहीत कर रहे है से लेकर कारकों के आधार पर बदलता है, शुरू सामग्री की मात्रा और प्रसंस्करण के दौरान नमूनों को संभालने की दक्षता । बफर की मात्रा को कम करें 50 मिलीग्राम से कम ऊतक की मात्रा के साथ काम करते समय आनुपातिक रूप से। - एक आइस बाथ पर ट्यूब रखते समय एक जांच ध्वनिक का उपयोग कर ऊतक Lyse । सोनीशन के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 40% आयाम, 5 सेकंड पर और 2:30 मिनट के लिए चक्र बंद।
- ऊतक को पूरी तरह से lyse करने के लिए एक मनका डिब्बा का उपयोग कर ऊतक समरूपता के साथ जारी रखें।
नोट: यह चरण 90 सेकंड के लिए मध्यम गति से किया जाना चाहिए और इसके बाद 3-5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेशन। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर ट्यूब की सामग्री को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और सजातीय रूप से मिलाएं।
नोट: नमूने के aliquots बनाओ और आगे का उपयोग करते हुए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2 प्रोटीन मात्राकरण और गुणवत्ता की जांच
- बीएसए की ज्ञात सांद्रता के साथ बने मानक ग्राफ का उपयोग करके पाचन से पहले नमूनों की मात्रा निर्धारित करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि प्रोटीन अनुमान के लिए इस्तेमाल किया जा रहा परख प्रोटीन lysate बनाने के लिए इस्तेमाल बफर के साथ संगत है । एसडीएस-पेज जेल चलाकर प्रोटीन की गुणवत्ता की जांच करें।
3 प्रोटीन पाचन
- माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में 50 माइक्रोग्राम प्रोटीन लें और ट्राइस 2-कार्बोक्साइल फॉस्फिन (टीएमईपी) जोड़कर प्रोटीन को कम करें ताकि अंतिम एकाग्रता 20 एमएम हो। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सामग्री को इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन बाद, ट्यूब में iodoacetamide (आईएए) जोड़कर कम प्रोटीन को एल्किलेट करें ताकि इसकी अंतिम एकाग्रता 40 mM हो। ट्यूब को 30 मिनट तक अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
नोट: ट्यूब के लिए अपने अलावा से पहले आईएए हौसले से तैयार करें । - कम और एल्किलेटेड प्रोटीन युक्त ट्यूब में बफर बी जोड़ें ताकि ट्यूब में यूरिया की अंतिम एकाग्रता 1 एम से कम हो।
नोट: बफर बी 25 एमएम ट्रिस (पीएच 8.0) और 1 एमएमएम सीएसीएल 2 से बना है और इसका उपयोग नमूनों को कमजोर करने के लिए कियाजाता है। कमजोर पड़ने पर, यह सुनिश्चित करें कि ट्यूब की सामग्री में ट्राइपसिन के अलावा इष्टतम प्रोटीन पाचन के लिए 8 का पीएच है। - प्रोटीन अनुपात में 1:30 एंजाइम में ट्राइपसिन जोड़ें और लगातार झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
- पाचन के बाद, पचाने वाले उत्पाद को वैक्यूम सांद्रता में केंद्रित करें। इस चरण में, पेप्टाइड्स को भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर या तो पुनर्गठित और विलसल्टेड या संग्रहीत किया जा सकता है।
4 डेसाल्टिंग और पेप्टाइड क्वांटिफिकेशन
नोट: एलसी-एमएस/एमएस साल्ट और नमूने में अन्य संदूषकों के लिए नमूने लोड करने से पहले डेसाल्टिंग या पेप्टाइड क्लीन-अप आवश्यक है, जो कॉलम को रोक सकता है और उपकरण को भी नुकसान पहुंचा सकता है । इस प्रक्रिया को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध C18 चरण-सुझावों या स्तंभों का उपयोग करके किया जा सकता है।
- 0.1% फोर्मिक एसिड (एफए) में 50% एसीटोनिट्रील (एसीएन) के 20 माइक्रोन के साथ चरण टिप को सक्रिय करें। 1 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर सामग्री को अपकेंद्रित्र करें और प्रवाह को त्याग दें।
नोट: अपकेंद्रित्र के लिए शर्तें प्रक्रिया के अंत तक एक ही हैं । - 0.1% एफए में 100% ACN के 20 माइक्रोन जोड़ें और कदम 4.1 में सामग्री अपकेंद्रित्र।
नोट: सक्रियण चरणों को एक-दो बार दोहराया जा सकता है। - सक्रियण के बाद, चरण-टिप और अपकेंद्रित्र के माध्यम से पुनर्गठित पेप्टाइड नमूने के 20 माइक्रोन पास करें जैसा कि चरण 4.1 में किया गया है।
नोट: इस चरण में प्रवाह को न छोड़ें। - चरण-टिप के लिए अधिकतम पेप्टाइड को सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 5 बार प्रवाह के साथ चरण 4.3 दोहराएं।
- स्टेज-टिप के माध्यम से 0.1% एफए के 20 माइक्रोल पास करें और प्रवाह को त्यागें।
नोट: बेहतर परिणामों के लिए इस चरण को दो बार और दोहराएं। - एसीएन की सांद्रता में वृद्धि करके एक ताजा माइक्रोफ्यूज ट्यूब में बाध्य पेप्टाइड्स को क्रमशः 40%, 60% और 80% से एल्यूट करें।
- पेप्टाइड्स को वैक्यूम सांद्रता में सुखाएं और पेप्टाइड क्वांटिफिकेशन के लिए आगे बढ़ें।
- सूखे पेप्टाइड्स को 0.1% एफए में पुनर्गठित करें और स्कोप विधि5का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करें।
5 संक्रमण सूची अंतिम लक्ष्यों की तैयारी
नोट: एक संक्रमण एक MRM प्रयोग में उत्पाद (Q3) m/z मूल्यों के लिए अग्रदूत (Q1) की जोड़ी को संदर्भित करता है । एक पेप्टाइड में कई संक्रमण हो सकते हैं, एक ही Q1 मूल्य लेकिन विभिन्न Q3 मूल्यों के साथ। एक ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर पेप्टाइड्स और उनके उत्पादों का पता लगाने के लिए संक्रमण की जानकारी की आवश्यकता है । इसलिए, एक लक्षित प्रयोग शुरू करने से पहले, एक संक्रमण सूची तैयार करने की आवश्यकता है। यह SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) या एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर क्षितिज7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view) नामक के ऑनलाइन भंडार का उपयोग किया जा सकता है ।
- हाल ही में यूनिप्रोट (https://www.uniprot.org/) से मानव प्रोटेम फास्टा फ़ाइल डाउनलोड करें और इसे स्काईलाइन में डालकर एक पृष्ठभूमि प्रोटेम फाइल बनाएं। पेप्टाइड सेटिंग्स में बैकग्राउंड प्रोटेम ड्रॉपडाउन पर जाएं और ऐड पर क्लिक करें ह्यूमन प्रोटेम के फास्टा सीक्वेंस फाइल में फीड करें। सुनिश्चित करें कि इस डेटाबेस का चयन किया गया है और अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले अनुमति प्राप्त मिस क्लीवेज मूल्य 0 पर सेट किया गया है।
- अब, पेप्टाइड सेटिंग्स में फ़िल्टर टैब के तहत 8 से 25 अमीनो एसिड तक स्वीकृत पेप्टाइड्स की लंबाई को सीमित करता है।
- फ़िल्टर टैब सेट अग्रदूत शुल्क के तहत संक्रमण सेटिंग्समें, आयन शुल्क को 1 के रूप में सेट करें और आयन प्रकार को वाई सेट करें। उपयोगकर्ता की पसंद के आधार पर उत्पाद आयनों का चयन किया जा सकता है। विशेष आयनों के लिए प्रोलाइन करने के लिए एन-टर्मिनल का चयन करें और अन्य सभी मापदंडों को डिफ़ॉल्ट रूप में छोड़ दें।
नोट: पेप्टाइड और संक्रमण सेटिंग्स प्रयोग के अनुसार भिन्न हो सकती हैं। - एडिट पर क्लिक करके और डालनेके लिए आगे बढ़ने से पेप्टाइड्स या ब्याज के प्रोटीन डालें । प्रोटीन डालने के लिए, उनके परिग्रहण आईडी की नकल करें और विशिष्ट पेप्टाइड्स डालें, पेप्टाइड दृश्यों को कॉपी करें। सॉफ्टवेयर पृष्ठभूमि प्रोटेम के लिए परिग्रहण आईडी नक्शे और संक्रमण सूची पेप्टाइड और संक्रमण सेटिंग्स के आधार पर बनाया गया है ।
- संक्रमण सूची का निर्यात करें। सुनिश्चित करें कि इंस्ट्रूमेंट टाइपके लिए ड्रॉपडाउन में, सही उपकरण का चयन किया जाता है। अनुकूलन प्रयोगों के लिए, कोई भी स्काईलाइन में प्रति फ़ाइल संक्रमण की वांछित संख्या निर्धारित करके संक्रमण सूचियों को छोटी संख्या में विभाजित करना चुन सकता है। यह सुनिश्चित करेगा कि साधन एक ही रन में बहुत सारे संक्रमणों को स्क्रीन करने के लिए अभिभूत नहीं है। एक ही विधि प्राप्त करने के लिए संक्रमण की संख्या को और अधिक अनुकूलित करने की आवश्यकता है - यह हम अब से विधि शोधन अनुभाग के तहत उल्लेख करते हैं।
6 एलसी पैरामीटर
- 0.1% एफए (सॉल्वेंट ए) और 80% एसीएन (सॉल्वेंट बी) वाले ऑर्गेनिक सॉल्वेंट वाले जलीय सॉल्वेंट के साथ बाइनरी सॉल्वेंट सिस्टम का उपयोग करें।
- कॉलम का तापमान 45 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
- 450 माइक्रोनल/मिन फ्लोरेट के साथ 10 मिनट का एलसी ढाल सेट करें (जैसा कि टेबल S1में दिखाया गया है)।
7 एमएस पैरामीटर
नोट: समझाया परख विकसित किया गया है और TSQ Altis ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए अनुकूलित ।
- एक समय में एक पैरामीटर - Q1 और Q3 रिज़ॉल्यूशन, निवास समय और चक्र समय जैसे पैरामीटर ों को अनुकूलित करें। हम पाते हैं कि Q1 और Q3 के लिए 0.7 रिज़ॉल्यूशन सबसे अच्छा काम करता है। चक्र समय या बसना समय संक्रमण की संख्या और पेप्टाइड्स की औसत पीक चौड़ाई की निगरानी की जा रही है के अनुसार tweaked की आवश्यकता हो सकती है ।
- टेबल S2 और टेबल S3में एमएस मापदंडों का उपयोग करें। कुल विधि अवधि 10 मिनट है।
नोट: पैरामीटर विधि शोधन के दौरान और बाद में सभी रन के लिए समान रहते हैं, जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया जाए। एक नए प्रयोग के लिए, नमूना और नमूना प्रसंस्करण चरणों के प्रकार के आधार पर कुछ मापदंडों को बदलने की आवश्यकता हो सकती है।
8 रन अनुक्रम और इंस्ट्रूमेंट क्यूसी
- पानी का मिश्रण तैयार करें: मेथनॉल: आइसोप्रोपेनॉल: 1:1:1:1 अनुपात में एसीटोनिट्रिल। इस मिश्रण को ब्लैंक की तरह इस्तेमाल करें।
- किसी भी मानक नमूने के लिए पेप्टाइड्स तैयार करें जिसका उपयोग उपकरण के प्रदर्शन की लगातार निगरानी करने के लिए किया जा सकता है। यह एक QC मानक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। हम बीएसए डाइजेस्ट से पेप्टाइड्स का पता लगाते हैं जिन्हें अनुकूलित किया गया है और कई दिनों में अच्छी और लगातार प्रतिक्रियादेते हैं (चित्रा 2)।
- नमूनों को चलाने के लिए, अनुक्रम रिक्त स्थान के एक जोड़े के साथ शुरू करना चाहिए, QC मानक और नैदानिक नमूनों के बाद । हमेशा सुनिश्चित करें कि लगातार दो नमूनों के बीच एक खाली है।
- तुलना में आसानी के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूने की समान मात्रा और मात्रा हर बार इंजेक्ट की जाती है।
9 विधि शोधन
- स्काईलाइन का उपयोग करके पूल किए गए नमूनों से प्राप्त प्रारंभिक आंकड़ों का विश्लेषण करें। सबसे अच्छा परिणाम का चयन करने के लिए सही चोटी, संक्रमण, और चोटी के आकार और तीव्रता जैसे मापदंडों के लिए देखो। एक नई क्षितिज परियोजना के रूप में फ़ाइल को सहेजें।
- सबसे अच्छा मिलान चोटी खोजने के लिए एक पुस्तकालय का उपयोग करें और फलस्वरूप सबसे अच्छा संभव संक्रमण सूची की सलाह दी जाती है। एक पुस्तकालय एमएस/एमएस चोटियों का एक सेट है जो साहित्य या इन-हाउस प्रयोगों से उपलब्ध है ।
- नए सहेजे गए स्काईलाइन परियोजना से एक ताजा संक्रमण सूची निर्यात करें और एक ताजा विधि बनाने के लिए इस संक्रमण सूची का उपयोग करें। बनाई गई नई विधि से डेटा प्राप्त करें और स्काईलाइन का उपयोग करके संक्रमण को परिष्कृत करने की प्रक्रिया को दोहराएं।
- एक बार जब पेप्टाइड्स और संक्रमण की सूची को स्काईलाइन का उपयोग करके डेटा विश्लेषण के बाद अंतिम रूप दिया जाता है, तो चक्र समय के विभिन्न क्रमपरिवर्तनों की कोशिश करके विधि को ठीक ट्यून करें और समय का ध्यान केंद्रित करें।
नोट: भारी लेबल वाले सिंथेटिक पेप्टाइड्स और इंडेक्सेड रिटेंशन टाइम (आईआरटी) पेप्टाइड्स का उपयोग विधि शोधन को आसान बनाता है8,9। इसलिए यह सलाह दी जाती है कि इन पेप्टाइड्स का उपयोग करके विधि की ठीक ट्यूनिंग की जाए। - शोधन प्रयोगों से प्रतिधारण समय जानकारी का उपयोग करना, एक अंतिम विधि बनाएं जो निर्धारित है (एक परिभाषित अधिग्रहण विंडो होना)।
- अलग-अलग विषयों के लिए नमूने तैयार करें। अंतिम निर्धारित विधि का उपयोग करके इन नमूनों के लिए डेटा प्राप्त किया जाएगा ।
- एक बार डेटा प्राप्त हो जाने के बाद, स्काईलाइन में कच्ची फाइलों का आयात करके आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और समूहवार तुलना की जा सकती है।
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Representative Results
हमने 10 नमूनों से 3 प्रोटीन, मस्तिष्क में असामान्यताओं वाले रोगियों के प्रत्येक समूह से 5 नमूनों के सापेक्ष मात्राकरण का प्रदर्शन किया। इन प्रोटीनों में एपोलीपोप्रोटीन ए-1 (एपीओए-आई), विमेंटिन (विम) और निकोटिनामाइड फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफरेज (NAMPT) शामिल थे जो मस्तिष्क की कोशिकाओं में विविध भूमिकाओं को करने के लिए जाने जाते हैं । डेटा का पोस्ट-रन विश्लेषण स्काईलाइन-डेली (Ver 20.2.1.286) का उपयोग करके किया गया था। 3 प्रोटीन के अनुरूप कुल 10 पेप्टाइड्स पर नजर रखी गई । इनमें एपीओए-1 के लिए 3 पेप्टाइड्स, विम के लिए 4 पेप्टाइड्स और NAMPT के लिए 3 पेप्टाइड्स शामिल थे । इन 10 पेप्टाइड्स से संक्रमण की कुल संख्या ५७ की राशि है । नमूनों को उन दोनों समूहों में से किसी में भी बांटा गया था जो उनकी स्थिति के आधार पर थी । क्षितिज की समूह तुलना सुविधा का उपयोग करते हुए, इन पेप्टाइड्स की चोटी की बहुतायत की तुलना की गई, और सापेक्ष मात्राकरण मूल्यों की गणना की गई(चित्र 3)।
चित्र 1:एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी प्रयोग में शामिल चरणों का अवलोकन। A. एक विशिष्ट प्रोटेओमिक्स प्रयोग के लिए नमूना तैयारी में प्रोटीन का निष्कर्षण शामिल है (उदाहरण के लिए हमने ऊतक नमूना दिखाया है) इसके बाद ट्राइप्सिन का उपयोग करके पाचन किया जाता है। पचा पेप्टाइड्स अंततः desalted और एलसी एमएस तैयार कर रहे हैं । B. एमआरएम प्रयोग में शामिल कदमों में उनके एम/जेड मूल्यों के आधार पर अग्रदूत और उत्पाद आयन चयन शामिल हैं । केवल अच्छी प्रतिक्रिया दिखाने वाले संक्रमणों को विश्लेषण के लिए माना जाता है। सी. एक एमआरएम प्रयोग में डेटा विश्लेषण में चोटी के आकार और शिखर क्षेत्रों की विस्तृत जांच शामिल है। इसके बाद अंतत परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:एक अनुकूलित एमआरएम विधि का उपयोग करके बीएसए के जवाब में स्थिरता। A. बीएसए के प्रतिनिधि पेप्टाइड के लिए क्रोमाटोग्राम प्रयोग किए गए पांच दिनों में लगातार चोटी के आकार और तीव्रता को दर्शाता है। B. प्रतिधारण समय स्थिरता पेप्टाइड के लिए प्रयोग सी पीक क्षेत्रों के सभी पांच दिनों पर पेप्टाइड के लिए मनाया के रूप में सप्ताह में पांच दिनों के पाठ्यक्रम पर देखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:जीबीएम ट्यूमर नमूनों के दो समूहों में तीन प्रोटीन का अंतर विनियमन। A. अंतर-समूह तुलना के बाद देखा गया एपोलीपोप्रोटीन ए-1 और संचयी शिखर क्षेत्र के लिए प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम। B. अंतर-समूह तुलना के बाद देखा गया Vimentin और संचयी शिखर क्षेत्र के लिए प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम। सी. निकोटिनामाइड फॉस्फोरिबोसाइलट्रांसफेरेज और संचयी पीक क्षेत्र के लिए प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम जैसा कि अंतर-समूह तुलना के बाद देखा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका S1: सभी नमूनों के लिए उपयोग किए जाने वाले 10 मिनट के एलसी ढाल का विवरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका S2: आयन स्रोत के लिए पैरामीटर सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका S3: एमआरएम विधि के लिए पैरामीटर सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और वेस्टर्न ब्लॉटिंग जैसी तकनीकों को कई वर्षों तक प्रोटीन लक्ष्यों के सत्यापन के लिए सोने के मानकों के रूप में माना जाता था। इन तरीकों प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों और प्रौद्योगिकी पर थोड़ी निर्भरता के साथ आज भी उपयोग पाते हैं जिससे उन्हें बहुत बोझिल और थकाऊ बना दिया जाता है। इसके अलावा, वे महंगे एंटीबॉडी का उपयोग भी शामिल करते हैं जो हमेशा बैचों में एक ही विशिष्टता नहीं दिखाते हैं और विशेषज्ञता का एक बड़ा सौदा की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री जैसी उच्च थ्रूपुट तकनीकों का उपयोग करके पहचाने गए प्रोटीन का केवल एक छोटा सा अंश, संगत एंटीबॉडी उपलब्ध है, आगे पूरी प्रक्रिया को जटिल बनाता है। इसलिए लक्षित प्रोटेओमिक परख धीरे - धीरे लक्ष्य10को मान्य करने के लिए नए दृष्टिकोण के रूप में शुरू किया जा रहा है । अधिकांश लक्ष्य खोज उच्च थ्रूपुट ओमिक्स प्लेटफार्मों पर होने के साथ, नैदानिक स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों 11,12,13के लिए मान्य लक्ष्यों के पैनलों पर भी विचार किया जा रहा है।
इस लेख में प्रतिनिधि परिणामों ने मस्तिष्क के ऊतकों की दो स्थितियों (शर्त 1 और शर्त 2) में प्रोटीन एपोलीपोप्रोटी ए-आई (एपीओए-I), विमेंटिन (VIM) और निकोटिनामाइड फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफरेज (NAMPT) की अंतर अभिव्यक्ति को मान्य किया है। एपोलीपोप्रोटीन ए-1 को सेरेब्रोवैस्कुलर इंटीग्रिटी के रखरखाव और अल्झीमर की बीमारी के जोखिम को कम करने में अहम भूमिका निभाने की सूचना मिली है । हालांकि ApoA-I मस्तिष्क में संश्लेषित नहीं है, इसकी रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) को पार करने की क्षमता मस्तिष्क में अपनी उपस्थिति महत्वपूर्ण14बनाता है । विमेंटिन प्रोटीन मस्तिष्क के अंदर कई भूमिकाओं में अध्ययन किया गया है। हालांकि, विमेंटिन के प्रमुख कार्यों में से एक माइक्रोग्लिया सक्रियण में इसकी भागीदारी है। विमेंटिन की कम अभिव्यक्ति माइक्रोग्लियल सक्रियण15की हानि से जुड़ी थी । प्रोटीन NAMPT न्यूरॉन्स और मस्तिष्क संवहनी एंडोथेलियलरोगों 16के पुराने संबंधित नुकसान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सूचित किया गया है । तीनों प्रोटीन सामान्य मस्तिष्क कोशिकाओं और मस्तिष्क से संबंधित घातक में भूमिकाओं की एक भीड़ खेलने के लिए सूचित किया गया है । इसलिए, इन प्रोटीन और उनके पेप्टाइड्स के लिए एमआरएम आधारित सत्यापन मस्तिष्क से संबंधित विभिन्न विकारों से संबंधित नैदानिक निदान में महान उपयोग पा सकते हैं।
एक पूरी तरह से अनुकूलित लक्षित परख आसानी से उच्च थ्रूपुट का पता लगाने और एक लक्ष्य पैनल के परिमाणीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दर सीमित कदम प्रारंभिक विधि अनुकूलन है जो थकाऊ है और नमूना प्रकार, प्रोटीन/पेप्टाइड लक्ष्यों, उपकरण का उपयोग किया जा रहा है और कुछ पेप्टाइड्स का पता लगाने पूर्वाग्रह के आधार पर बदलता है । यह महत्वपूर्ण है कि संक्रमण सूची एक मजबूत परख के लिए अनुकूलित है । मानव मस्तिष्क ऊतक नमूनों के लिए इस तरह के एक परख विकसित करने में रुचि रखने वाले किसी भी उपयोगकर्ता को पता चलेगा कि उपरोक्त समझाया गया प्रोटोकॉल इन चर कारकों को कम करता है। यह प्रोटोकॉल के विभिन्न बिंदुओं पर महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण चरणों पर विशेष ध्यान देने के साथ उपकरण में उपयोग किए जाने वाले इस अद्वितीय और थकाऊ ऊतक बायोस्पेसिमेन और इष्टतम मापदंडों से पेप्टाइड निष्कर्षण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। किसी भी नई तकनीक के साथ के रूप में, शोधकर्ताओं ने दिशा निर्देशों का एक सेट प्रदान की है, जो लेखकों को प्रस्तुत करने की जरूरत है या क्या कदम वे प्रयोग के दौरान पालन करें । इस मोर्चे पर, 2017 में, लक्षित प्रोटेओमिक्स परख और डेटा की रिपोर्ट करने के लिए एमसीपी दिशानिर्देश17निर्धारित किए गए थे। ये दिशा-निर्देश यह सुनिश्चित करते हैं कि रिपोर्ट किया गया अध्ययन/परख विश्वसनीय और पुन: उत्पन्न योग्य है, इसलिए विधि की प्रयोज्यता में वृद्धि हो रही है । सही सावधानियों लेने और इस परख की सही क्षमता का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने जल्द ही निदान और चिकित्सा विज्ञान में अपार क्षमता के साथ चिकित्सकीय प्रासंगिक परख के साथ आने में सक्षम हो जाएगा ।
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Disclosures
लेखकों को प्रकाशन शुल्क के लिए थर्मोफिशर से समर्थन मिला ।
Acknowledgments
हम एमएस से संबंधित सभी प्रयोगों को पूरा करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी विभाग (बीटी/PR13114/INF/22/206/2015) द्वारा समर्थित आईआईटी बॉम्बे में एसएस और मासफिट्ब सुविधा के लिए #34_IITB एमएचआरडी-यूएवाई परियोजना (उछतर एविक योजना) को स्वीकार करते हैं ।
हम पूरे वीडियो को बनाने और संपादित करने के लिए श्री ऋषभ यादव और श्री निशांत नेरुरकर को ऑडियो के संपादन में उनके काम के लिए अपना विशेष धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC - Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
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