Summary
该协议旨在引入使用三倍频谱仪进行临床样本蛋白质的多反应监测 （MRM）。我们提供了系统的工作流程，从样本准备到临床样本数据分析，并采取了所有必要的预防措施。
Abstract
过去十年来对人体脑组织的蛋白体分析极大地增进了我们对大脑的理解。然而，与大脑有关的疾病仍然是全世界死亡的主要原因，因此需要进一步了解其病理生物学。传统的抗体技术，如西式印迹或免疫造血术，除了劳动密集型、定性或半定量外，还具有低通量。即使是传统的基于质谱学的猎枪方法也未能提供确凿的证据来支持某种假设。有针对性的蛋白学方法主要是假设驱动的，与长期使用的常规猎枪蛋白学方法不同。多反应监测就是这样一种有针对性的方法，需要使用称为串联四倍质谱仪或三四倍质谱仪的特殊质谱仪。在目前的研究中，我们系统地强调了利用人脑组织成功实施基于四极谱的四极质谱系蛋白造影工作流程的主要步骤，目的是将这一工作流程引入更广泛的研究社区。
Introduction
在过去十年中，质谱学（MS）的迅速发展，加上对色谱技术的了解增加，极大地促进了基于MS的蛋白造影学的进步。分子生物学技术，如西式印迹和免疫造血术，长期以来一直遭受重复性问题，缓慢的周转时间，观察者间变异性，以及它们无法准确量化蛋白质，仅举几例。为此，高通量蛋白质学方法的优越灵敏度继续为分子生物学家提供一个替代和更可靠的工具，以寻求更好地了解蛋白质在细胞中的作用。然而，猎枪蛋白质学方法（数据依赖获取或DDA）往往不能检测复杂组织中低富含的蛋白质，除了严重依赖仪器的灵敏度和分辨率。在过去的几年里，世界各地的实验室一直在开发数据独立获取 （DIA） 等技术，这些技术需要更大的计算能力和可靠的软件来处理这些高度复杂的数据集。然而，这些技术仍然是一个工作正在进行中，不是很用户友好。有针对性的基于MS的蛋白学方法在MS方法的高吞吐量性质和像ELISA这样的分子生物学方法的敏感性之间提供了完美的平衡。一个有针对性的质谱为基础的蛋白质解毒学实验侧重于检测假说驱动的蛋白质或肽从发现为基础的猎枪蛋白质学实验或通过可用文献1，2。多反应监测 （MRM） 是一种有针对性的 MS 方法，它使用串联四倍体质谱仪从复杂样品中准确检测和量化蛋白质/肽。尽管需要使用低分辨率仪器，但该技术仍具有更高的灵敏度和特异性。
四极体由 4 个平行杆制成，每根杆与对角对角线杆相连。通过应用交替射频和直流电压，在四极杆之间创建一个波动场。四极内离子的轨迹受相反杆上相同电压的存在影响。通过将射频施加到直流电压上，离子的轨迹可以稳定下来。正是这种四倍体的特性，允许它被用作质量过滤器，可以选择性地让特定的离子通过。根据需要，四胞胎可以在静态模式或扫描模式下操作。静态模式只允许指定 m/z 的离子通过，使该模式具有高度选择性和特定于兴趣离子。另一方面，扫描模式允许整个 m/z 范围的离子通过。因此，串联四倍体质谱仪可以以4种可能的方式运行：（i） 第一个四胞胎在静态模式下运行，第二个四极在扫描模式下运行：ii） 第一个四胞胎在扫描模式下运行，而第二个四胞胎在静态模式下操作：iii） 两个四极在扫描模式下工作;和 iv） 两个四极在静态模式3中运行 。在典型的 MRM 实验中，四极两者均以静态模式运行，允许对碎片后的特定前体及其产生的产品进行监控。这使得该技术非常敏感和有选择性，允许精确量化。
对于分子生物学家来说，人类脑组织及其细胞是一个宝库。人体一个有趣的器官的这些显着单位可以提供分子和细胞洞察其功能。对脑组织的蛋白细胞学研究不仅可以帮助我们了解健康大脑的系统性功能，而且可以帮助我们了解某些疾病引起的细胞通路。然而，具有所有异质性的脑组织是一个非常复杂的器官来分析，需要一致的方法来更好地了解分子水平的变化。以下工作描述了整个工作流程，从从脑组织中提取蛋白质、创建和优化 MRM 检测方法到验证目标（图 1）。在这里，我们系统地强调了使用人脑组织进行成功的 MRM 实验的主要步骤，目的是向更广泛的研究社区介绍该技术及其挑战。
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Protocol
这项研究涉及来自人类参与者的脑组织样本，由TMH和IITB IEC审查和批准 - （IITB-IEC/2018/019）。参与者提供了他们知情和书面的同意，以参与这项研究。
1 从脑组织中提取蛋白质
- 重约50毫克的脑组织，用300微升的1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）用微管清洗组织。
注：此步骤旨在去除组织外部表面的任何血液，必要时必须重复。建议从组织中去除尽可能多的血液，因为它会干扰下游蛋白质的估计和处理。 - 用 PBS 洗涤后，在含有组织的管子中加入 300 μL 裂解缓冲器 （缓冲器 A）。缓冲器A包含8M尿素，50 mM Tris pH 8.0，75 mM NaCl，1m M MgCl2 和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（根据制造商的说明）。
注：蛋白质产量因几个因素而异，包括样品的储存条件、起始材料的数量和加工时处理样品的效率。当与低于50毫克的组织量工作时，按比例减少缓冲剂的体积。 - 使用探针声波器对组织进行莱塞，同时将管子放在冰浴上。使用以下参数进行声波：40% 振幅，5 秒打开和关闭周期为 2：30 分钟。
- 继续使用珠子搅拌器进行组织均质化，以完全解合组织。
注：此步骤应以中等速度执行 90 秒，然后在冰上孵育 3-5 分钟。 - 在 4 °C 下将管子内装物在 6，000 x g 下离心 15 分钟。 将超高纳特转移到新鲜的管子中，并同质混合。
注：制作样品，并储存在-80°C，直到进一步使用。
2 蛋白质量化和质量检查
- 使用已知 BSA 浓度的标准图形在消化前对样品进行量化。
注意：确保用于蛋白质估计的检测与用于制造蛋白质解化物的缓冲剂相容。通过运行 SDS-PAGE 凝胶检查蛋白质解剖的质量。
3 蛋白质消化
- 在微型离心机管中加入50微克蛋白质，通过添加Tris 2-碳基磷酸酯（TCEP），最终浓度为20mM来减少蛋白质。在 37 °C 下将内容孵育为 1 小时。
- 孵化后，通过在管中加入碘酰胺（IAA），使其最终浓度达到40mM，从而减少蛋白质的碱性。在黑暗中孵育管子30分钟。
注：在加入管子之前，请准备 IAA。 - 在含有减少和碱化蛋白质的管中加入缓冲B，使管中尿素的最终浓度小于1M。
注：缓冲区 B 由 25 mM Tris（pH 8.0）和 1 mM CaCl2 组成，用于稀释样品。稀释后，确保管内的pH值为8，用于添加试丁类蛋白后的最佳蛋白质消化。 - 在1：30酶中加入试丁酶与蛋白质比，并在37°C下在夜间孵育管子，持续摇晃。
- 消化后，将消化的产品浓缩在真空浓缩器中。在此步骤中，肽可以重组和脱盐，也可以储存在 -80 °C 下供将来使用。
4 脱盐和肽定量
注：在装载LC-MS/MS样品之前，脱盐或肽的清理至关重要。 样品中的盐和其他污染物会堵塞柱子，对仪器造成损害。该过程可以使用市售的 C18 阶段提示或列执行。
- 激活阶段提示与 20 μL 的 50% 丙酮三酯 （ACN） 在 0.1% 的甲基酸 （FA）.将内容以 1，000 x g 离心 1 分钟，并丢弃流过。
注：离心条件相同，直到程序结束。 - 在 0.1% FA 中加入 20 μL 的 100% ACN，并像第 4.1 步一样离心。
注：激活步骤可以重复几次。 - 激活后，通过第 4.1 步执行的舞台尖端和离心机，通过 20 μL 的重组肽样品。
注意：不要丢弃此步骤中的流。 - 重复步骤 4.3，流过至少 5 次，以确保最大肽与舞台尖端结合。
- 通过阶段提示通过 20 μL 的 0.1% FA，并丢弃流过。
注：重复此步骤两次，以获得更好的结果。 - 通过增加 ACN 浓度，即分别达到 40%、60% 和 80%，从而在新鲜微富管中获取约束肽。
- 干燥真空浓缩器中的肽，然后进行肽定量。
- 将干肽重组为 0.1% FA，并使用范围方法5进行量化。
5 最终目标的过渡清单编制
注：在 MRM 实验中，过渡是指前体 （Q1） 与产品 （Q3） m/z 值的对。肽可以具有一到多个过渡，具有相同的第 1 季度值，但具有不同的第 3 季度值。三倍四倍体质谱仪需要检测多肽及其产品过渡的信息。因此，在开始有针对性的实验之前，需要准备一份过渡清单。这可以使用 SRMAtlas6（https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions） 的在线存储库或名为天际线7（https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view） 的开源软件完成。
- 从 UniProt（https://www.uniprot.org/）下载最近的人类蛋白质组 FASTA 文件，并通过将其插入天际线创建一个背景蛋白质组文件。在肽设置中，转到 背景蛋白组 下拉，然后单击人类蛋白类生物的 FASTA 序列文件中的添加。请确保选择此数据库，并在进入下一步之前将允许的缺失值设置为 0 。
- 现在，在肽设置中的过滤器选项卡下，将接受的肽的长度从 8 到 25 氨基酸划定。
- 在 过渡设置中，在 "过滤器 "选项卡下将 前体费用 设置为 2，3，将 离子电荷 设置为 1，并将 离子类型 设置为 y。产品离子可根据用户的选择进行选择。选择 N 端以支持 特殊离子，并将所有其他参数保留为默认值。
注意：肽和过渡设置可能因实验而异。 - 通过单击 "编辑" 并移动到" 插入"，插入感兴趣的肽或蛋白质。要插入蛋白质，复制其加入 ID 并插入特定肽，复制肽序列。该软件将入籍 ID 映射到背景蛋白组，并根据肽和过渡设置创建过渡列表。
- 导出过渡列表。确保在 仪器类型的下拉中，选择正确的仪器。对于优化实验，您可以选择通过在 Skyline 中设置每个文件所需的过渡数来将过渡列表拆分为较小的数字。这将确保仪器不会不堪重负，在一次运行中筛选太多的转换。过渡的数量需要进一步优化，以获得单一的方法 - 我们提到从今以后在方法改进部分。
6 LC 参数
- 使用含有 0.1% FA （溶剂 A） 的二元溶剂系统和含有 80% ACN （溶剂 B） 的有机溶剂。
- 将柱温度设置为 45 °C。
- 设置 10 分钟的 LC 梯度，流量为 450 μL/分钟（如 表 S1所示）。
7 MS 参数
注：已针对 TSQ 阿尔蒂斯三四极质谱仪开发和优化了解释的测定。
- 优化运行参数，如第 1 季度和第 3 季度分辨率、停留时间和周期时间 - 一次一个参数。我们发现第 1 季度和第 3 季度的 0.7 分辨率效果最好。周期时间或停留时间可能需要根据所监测的肽的过渡次数和平均峰值宽度进行调整。
- 使用表 S2 和表S3中的 MS 参数。 方法总持续时间为 10 分钟。
注：除非另有提及，否则方法改进期间和之后的所有运行参数保持不变。对于新的实验，可能需要根据样品的类型和样品处理步骤更改某些参数。
8 运行序列和仪器 QC
- 准备水的混合物：甲醇：二醇：丙酮三醇在1：1：1：1的比例。将此混合物用作空白。
- 为任何标准样品准备肽，这些样品可用于持续监控仪器的性能。这将用作 QC 标准。我们从 BSA 消化中检测出经过优化的肽，并在几天内做出良好和一致的反应（图 2）。
- 要运行样本，序列应从几个空白开始，然后是 QC 标准和临床样本。始终确保连续两个样本之间有一个空白。
- 为了便于比较，请确保每次注射每个样品的等量和体积。
9 方法改进
- 使用天际线分析从汇集样本中获得的初步数据。寻找正确的峰值、过渡和参数（如峰值形状和强度）以选择最佳结果。将文件保存为新的天际线项目。
- 使用库查找最佳匹配峰值，因此建议使用最佳过渡列表。图书馆是一组 MS/MS 峰值，可从文献或内部实验中获取。
- 从新保存的天际线项目中导出新的过渡列表，并使用此过渡列表制作新方法。从创建的新方法获取数据，并重复使用天际线改进过渡的过程。
- 使用天际线进行数据分析后，一旦肽和过渡列表最终确定，请通过尝试周期时间和居住时间的不同排列来微调方法。
注：使用重标签合成肽和索引保留时间 （iRT） 肽使方法改进容易8，9。因此，建议使用这些肽对方法进行微调。 - 使用来自改进实验的保留时间信息，创建计划中的最终方法（具有定义的采集窗口）。
- 为单个受试者准备样本。将使用最终预定方法为这些样本获取数据。
- 获得数据后，可以通过将原始文件导入到天际线进行进一步的下游分析和组式比较。
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Representative Results
我们从10个样本中对3种蛋白质进行了相对量化，从每组大脑异常患者中进行了5个样本。这些蛋白质包括阿波利波蛋白A-I（APOA-I）、维门汀（VIM）和尼古丁胺磷酸转移酶（NAMPT），它们已知在脑细胞中起着不同的作用。数据运行后分析使用天际线日（Ver 20.2.1.286）进行。共监测了10种与3种蛋白质对应的肽。其中包括3个肽用于APOA-I，4个肽用于VIM，3个肽用于NAMPT。这10种肽的转化总数为57种。样本根据属于的条件被分成两组。利用天际线的群对比较特征，比较了这些肽的峰值丰度，并计算了相对量化值（图3）。
图1：多反应监测实验所涉及的步骤概述。A. 典型蛋白质学实验的样本制备涉及蛋白质的提取（例如，我们已经展示了组织样本），然后使用试丁骨素进行消化。消化的肽最终脱盐，使LC-MS做好准备。 B. MRM 实验中涉及的步骤包括基于 m/z 值的前体和产品离子选择。只有显示良好响应的过渡才会考虑进行分析。 C. MRM 实验中的数据分析包括对峰值形状和峰值区域的详细检查。之后是对结果进行统计分析。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：使用优化的MM方法对BSA的响应一致性。A. 在实验进行的五天中，BSA代表肽的色谱图显示出一致的峰值形状和强度。 B. 在实验的所有五天中观察到肽的保留时间一致性 C. 肽的峰值区域，如一周内五天所见。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：两组GBM肿瘤样本中三种蛋白质的微分调节。A. 阿波利波蛋白A-I和累积峰区的代表性色谱图，如下组间比较后所示。 B. 代表色谱为维门汀和累积峰区，如下组间比较后所示。 C. 通过群体间比较，对烟酰胺磷酸转移酶和累积峰值区域进行代表性色谱图。请单击此处查看此图的较大版本。
表 S1：用于所有样品的 10 分钟 LC 梯度的详细信息。请点击这里下载此表。
表 S2：离子源的参数设置。请点击这里下载此表。
表 S3：MRM 方法的参数设置。请点击这里下载此表。
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Discussion
多年来，免疫化学和西式印迹等技术一直被认为是验证蛋白质靶点的黄金标准。即使在今天，这些方法也很少在协议中修改，而且很少依赖技术，这使得它们非常繁琐和乏味。除此之外，它们还涉及使用昂贵的抗体，这些抗体在批次中并不总是表现出相同的特异性，并且需要大量的专业知识。此外，只有一小部分使用质谱仪等高通量技术识别的蛋白质具有相容的抗体，使整个过程更加复杂。因此，有针对性的蛋白化测定正在慢慢被作为验证目标10的新方法。由于大部分目标发现发生在高通量生物平台上，验证目标面板也正在考虑用于临床筛查应用11，12，13。
本文的代表性结果验证了蛋白质阿波利波蛋白A-I（APOA-I）、维门汀（VIM）和尼古丁胺磷酸转移酶（NAMPT）在脑组织两种条件下（条件1和条件2）的微分表达。据报道，阿波利波蛋白A-I在维持脑血管完整性和降低阿尔齐默病风险方面发挥着关键作用。即使ApoA-I在大脑中不是合成的，它跨越血脑屏障（BBB）的能力使得它在大脑中的存在至关重要。维门汀蛋白在大脑中的许多角色中被研究过。然而，维门汀的主要功能之一是它参与微胶质活化。维门汀表达的减少与微胶质活化15的损伤有关。据报道，这种蛋白质在神经元和脑血管内皮功能障碍的老化相关损失中起着关键作用。据报道，这三种蛋白质在正常脑细胞和大脑相关恶性肿瘤中都起着多种作用。因此，基于MM验证这些蛋白质及其肽可以在临床诊断中发现与各种大脑相关的疾病有很大的用处。
完全优化的目标检测可轻松用于高通量检测和目标面板量化。限速步骤是初始方法优化，方法繁琐，根据样品类型、蛋白质/肽靶点、所使用的仪器和某些肽的检测偏差而有所不同。至关重要的是，必须优化过渡列表，以便进行可靠的检测。任何有兴趣为人体脑组织样本开发此类检测的用户都会发现，上述解释的协议将这些可变因素降至最低。它描述了从这种独特而乏味的组织生物刺激物中提取肽的优化协议，以及用于仪器的最佳参数，并特别注意协议各个点的关键质量控制步骤。与任何新技术一样，研究人员提供了一套指南，作者需要提供这些指南，或者他们在实验中遵循哪些步骤。为此，在2017年，MCP指南报告有针对性的蛋白学测定和数据制定了17。这些准则确保报告的研究/分析是可靠和可重复的，从而提高了该方法的适用性。通过采取正确的预防措施，并利用这种检测的真正潜力，研究人员将很快能够拿出具有巨大诊断和治疗潜力的临床相关检测方法。
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Disclosures
作者得到了热鱼公司对出版费的支持。
Acknowledgments
我们承认MHRD-UAY项目（UCHHATAR AVISHKAR YOJANA），该项目#34_IITB在生物技术部的支持下，在孟买国际信息技术研究所（BT/PR13114/INF/206/206/2015）进行所有MS相关实验。
我们特别感谢里沙布·亚达夫先生制作和编辑了整个视频，并感谢尼尚特·内鲁卡尔先生在编辑音频方面的工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC - Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
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