Summary
Wir beschreiben die Vorbereitung von Bändern serieller Schnitte und deren Sammlung auf großen Transferträgern für den Einsatz als Array-Tomographie-Proben sowie automatisierte Bildgebungsverfahren in einem Rasterelektronenmikroskop. Das Protokoll ermöglicht das Screening, den Abruf und die gezielte Bildgebung lokaler, seltener Ereignisse und die Erfassung großer Datenmengen.
Abstract
Die Elektronenmikroskopie wird in der Biologie und Medizin zur Abbildung zellulärer und struktureller Details mit Nanometerauflösung eingesetzt. Historisch gesehen lieferte die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Einen Einblick in die Zellsuperstruktur, aber in den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung moderner Rasterelektronenmikroskope (REM) die Art und Weise, wie in die Zellen geschaut wird, verändert. Obwohl die Auflösung von TEM überlegen ist, wenn strukturelle Details auf Proteinebene benötigt werden, ist die REM-Auflösung für die Mehrheit der zellbiologischen Fragen auf Organellenebene ausreichend. Der technologische Fortschritt ermöglichte automatische Volumenerfassungslösungen wie Serial Block-Face Imaging (SBF-SEM) und Focused Ion Beam SEM (FIB-SEM). Dennoch sind diese Methoden bis heute ineffizient, wenn es auf die Identifizierung und Navigation zu Interessengebieten ankommt. Ohne die Mittel zur präzisen Lokalisierung von Zielbereichen vor der Bildgebung müssen Bediener viel mehr Daten erfassen, als sie benötigen (in SBF-REM), oder, noch schlimmer, viele Gitter vorbereiten und sie alle abbilden (in TEM). Wir schlagen die Strategie des "lateralen Screenings" unter Verwendung der Array-Tomographie im REM vor, die die Lokalisierung von Interessengebieten erleichtert, gefolgt von einer automatisierten Bildgebung des relevanten Anteils des gesamten Probenvolumens. Array-Tomographie-Proben werden während der Bildgebung konserviert und können in Schnittbibliotheken angeordnet werden, die für wiederholte Bildgebung geeignet sind. Es werden mehrere Beispiele gezeigt, in denen das laterale Screening es uns ermöglicht, strukturelle Details zu analysieren, die mit jeder anderen Methode unglaublich schwierig zu erreichen sind.
Introduction
Trotz der Bedeutung von EM-bezogenen Techniken beschränkt sich der Aufwand, um sie zu beherrschen, das gesamte Feld auf eine kleine Anzahl von Spezialisten. Eine wesentliche Schwierigkeit ist die Identifizierung und der Abruf einer Region of Interest (ROI) in den für EM aufbewahrten Proben. Das Aussehen derselben Probe unterscheidet sich erheblich, wenn sie durch optische Mikroskopie und nach der Verarbeitung für die EM-Beobachtung analysiert wird. Die Änderungen für chemisch präparierte Proben umfassen die anisotrope Probenschrumpfung nach den Dehydratisierungsschritten (~ 10% in jeder Dimension) und den Verlust der Fluoreszenz bei Verwendung von Osmium im Fixations- und Färbeprotokoll (Abbildung 1A). Für den ultradünnen Schnitt werden die Proben mit unterschiedlichen Strategien in Epoxid- oder Acrylharze eingebettet (Abbildung 1B). Für erfolgreiche Ergebnisse dieser Vorbereitung muss die gesamte Probe in Stücke fraktioniert werden, die 1 mm x 1 mm nicht überschreiten. Um die Anforderungen der Standardmäßigen Beobachtungsbedingungen der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zu erfüllen, wird dieser winzige Teil der Probe weiter in 50-150 nm dicke Scheiben geschnitten. Die resultierenden Graustufenbilder zeigen Gewebeorganisation und Organellenstruktur eines winzigen Bruchteils der gesamten Probe detaillierter als jede andere Mikroskopietechnik (Abbildung 1C). Ein typischer TEM-Datensatz liefert 2D-Informationen, die theoretisch extrapoliert werden, um die Prozesse zu verstehen, die in einem 3D-Raum in Zellen und Geweben natürlich vorkommen. Abbildung 1D stellt die Herausforderung der erfassung ultrastruktureller Volumina dar: Wenn ein Würfel mit einer Seite von 1.000 μm bei einer Dicke von 50 nm geschnitten wird, werden 20.000 Abschnitte benötigt, um das gesamte Volumen abzudecken; für einen 500 μm Seitenwürfel sind es 10.000 Abschnitte. Um ein Volumen von 50 μm x 50 μm x 50 μm abzudecken, können "nur" 1.000 Schnitte notwendig sein. Dieses Volumen manuell zu erhalten, ist praktisch unmöglich und mit der Automatisierung äußerst schwierig durchzuführen. Wenn wir zusätzlich zur Probentiefe die gesamte Oberfläche solcher hypothetischen Würfel abdecken müssen, wird die Abdeckung von 1 μm2 Oberfläche bei vernünftiger Auflösung zu einem ernsthaften logistischen Problem (Abbildung 1E). Während für die außergewöhnlichen Großprojekte, wie z.B. Connectomics-Ansätze, die große Anzahl von Sektionen entscheidend ist, stellt für die Mehrheit der "profanen" EM-Projekte die Generierung von mehr Für die Beobachtung benötigten Abschnitten einen erheblichen Nachteil dar.
Es gibt mehrere Methoden, um 3D-Ultrastrukturinformationen zu erfassen: serielle Schnitt-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), TEM-Tomographie, Array-Tomographie (AT), Serial Block Face Imaging Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) und Fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-REM). Hauptunterschiede zwischen diesen Methoden sind die Schnittstrategie und ob die Bildaufnahme mit der Schnittgeneration1gekoppelt ist. Beim seriellen Schneiden von TEM werden sequentielle Schnitte auf Slotrastern gesammelt, aus diesen Sequenzen TEM-Bilder generiert und 2,3,4,5ausgerichtet. In der TEM-Tomographie liefern Neigungsreihen von 150-300 nm Schnitten auf einem Gitter und wenn sie an serielle Schnitte gekoppelt sind, eine sehr hohe Auflösung, wenn auch relativ kleineVolumina 6,7,8. Der AT-Ansatz verwendet physische Schnitte mit verschiedenen manuellen und halbautomatischen Arten der Abschnittssammlung auf relativ großen Trägern, wie Glasdeckglas, Siliziumwafern oder einem speziellen Band. Für die Bildaufnahme wird die Unterstützung im REM analysiert, mit diversen Bildaufnahmestrategien stehen9,10,11,12,13,14,15 zur Verfügung . Für SBF-REM wird die physikalische Schnitte unter Verwendung eines Mini-Mikrotoms mit einem Diamantmesser erreicht, das direkt in die REM-Kammer gesetzt ist, wobei das REM-Bild von der Oberfläche des Harzblocks16,17,18,19erzeugt wird . Für FIB-REM entfernt die Ionenquelle dünne Schichten der Probe, gefolgt von einer automatischen Abbildung der belichteten Oberfläche durch das REM20,21. Die TEM-Tomographie und der AT erzeugen physikalische Schnitte, die bei Bedarf neu abgebildet werden können, während FSBF-REM und FIB-REM den Schnitt nach der Bildgebung eliminieren. Eine kürzlich von einem Multi-Beam-REM abgebildete Kombination physikalischer Schnitte bietet eine Kombination von Methoden, die das "Engpassproblem" der Bildaufnahmegeschwindigkeitlösen 22. Jede dieser Techniken hat die Art und Weise revolutioniert, wie EM-Daten gewonnen und analysiert werden können, und jeder Ansatz hat seine praktischen Auswirkungen im Zusammenhang mit einer bestimmten Forschungsfrage.
Angesichts der Art der Herstellung und der Skala der ultrastrukturellen Dimensionen ist es nicht einfach vorherzusagen, wo sich eine bestimmte Zielstruktur im Probenblock befindet (Abbildung1D, E). Eine Lösung für die ROI-Lokalisierung ist die Aufzeichnung der Bilder aus dem gesamten Block in der gewünschten Auflösung von Anfang an. Die interessierenden Strukturen können sich im erfassten Datenvolumen befinden, wenn sie nicht vom Mikroskop entfernt sind. Die mit dieser Strategie verbundene Erfassungszeit und Datenverarbeitung sind problematisch. Es ist wünschenswert, die Menge der aufgezeichneten Daten zu reduzieren, insbesondere wenn die ROIs viel kleiner als der Gewebeblock sind, d.h. wenn die Objekte von Interesse bestimmte Arten von Zellen (nicht ganze Organe) sind. Verschiedene korrelative Licht- und Elektronenmikroskopietechniken (CLEM) können erfolgreich sein, wenn die Fluoreszenz vor oder nach der Vorbereitung innerhalb derselben Probe erhalten und lokalisiert wird23,24,25,26,27,28,29. Dennoch sind viele zelluläre Strukturen auch ohne Fluoreszenzkorrelation erkennbar, nur anhand der bekannten Ultrastruktur. Für diese Fälle glauben wir, dass die laterale Screening-Array-Tomographie einen ausgewogenen Kompromiss zwischen dem aufwand für die ROI-Lokalisierung und der ultrastrukturellen Informationsqualität darstellt. Mit dieser Strategie wird in regelmäßigen Abständen eine Teilmenge von Abschnitten auf dem Wafer gescreent, die anhand der Größe und Art des ROI ermittelt werden kann. Sobald ROIs gefunden sind, wird die Datenerfassung in einer kontinuierlichen Reihe von Abschnitten aufgebaut, die vor und nach dem Ankerabschnitt beginnen und enden, um die relevanten Informationen gezielt zu sammeln.
Wir stellen Protokolle für AT vor, die die Erfassung von Regionen oder Ereignissen von Interesse in zahlreichen Abschnitten vereinfachen und beschleunigen und besser aufeinander abgestimmte Bildvolumina liefern. Laterales Screening und mehrstufige Erfassung erzeugen Daten mit sehr hoher Auflösung in genau anvisierten Regionen. Das von uns beschriebene Verfahren adressiert mehrere Herausforderungen der 3D-EM-Datenerfassung, da es Folgendes vorsieht: Kompatibilität mit einer breiten Palette von Proben, ohne den Probenvorbereitungsablauf grundlegend zu verändern; gezielte Lokalisierung für Sektionen und SEM-Akquisitionen; reduzierter Zeit- und Arbeitsaufwand während der Einrichtung; Abbildung von Regionen in mehreren Abschnitten mit besserer Ausrichtung der resultierenden Volumina; und ein glattes Stitching- und Ausrichtungsverfahren, um verschiedene Bilder zu einem zusammengefügten Mosaikbild zusammenzustellen. Wir haben uns entschieden, die Stärke unserer Methode mit mehreren Proben aus veröffentlichten und laufenden Projekten zu demonstrieren. Wir glauben, dass dieser Ansatz die Generierung und Erfassung gezielter EM-Daten erheblich erleichtern kann, selbst für Forscher mit begrenzter EM-Erfahrung.
Protocol
ANMERKUNG: Probenvorbereitungsmethoden werden an anderer Stelle beschrieben14,30,31, und werden in dieser Veröffentlichung nicht behandelt. Kurz gesagt, die gezeigten Beispiele wurden chemisch mit Glutaraldehyd fixiert, mit 1%OsO4postfixiert und dann mit 1% wässrigem Uranylacetat behandelt, bevor sie in das Einbettharz eingebettet wurden. Alternativ können Proben durch Hochdruckgefrieren hergestellt, mit 0,1% Uranylacetat in Aceton substituiert und in Acrylharz eingebettet werden. Probenblöcke wurden mit einer flachen Einbettungsmethode hergestellt, die eine klare Sicht auf die Probe ermöglicht und ihre Orientierung für den Schnitt erleichtert (Abbildung 1B).
1. Array-Generierungsverfahren
- Eingebettete Probenorientierung und Trimmung
- Identifizieren und markieren Sie mit dem Fernglas/ Mikroskop den ROI auf der eingebetteten Blockoberfläche, indem Sie die Blockoberfläche mit einer Rasierklinge leicht zerkratzen. Dies hilft, die Probe im Ultramikrotom zu orientieren und reduziert die Schnittfläche.
- Klemmen Sie die Probe auf den Ultramikrotomhalter (Abbildung 2A).
- Schneiden Sie das Harz um die Probe herum, zuerst mit der Rasierklinge (Grobbeschnitt) und fahren Sie mit dem Diamantschneidwerkzeug fort (Feinbesatz; Abbildung 2A). Verwenden Sie Messer mit 20° oder 90° Kantenneigung, um sicherzustellen, dass die Ober- und Unterseite des Blocks parallel zur Schneide des Messers verlaufen.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für das serielle Schneiden und Erfassen von geraden Farbbändern. - Mischen Sie Xylol und Kleber im Verhältnis 3:1. Tragen Sie diese Mischung mit einer Wimper, die an einem Zahnstocher befestigt ist, auf die oberen und unteren Ränder des beschnittenen Blocks auf. Lassen Sie es gründlich trocknen.
- Bereiten Sie die Array-Montageunterstützung A (d. h. Siliziumwafer) vor.
- Schneiden Sie das Waferstück mit einem Wafer-Spaltwerkzeug (EMS) und passen Sie seine Größe an das Projektziel an. 2 cm x 4 cm ist praktisch für licht- und elektronenmikroskopische Beobachtungen.
- Reinigen Sie den Wafer in destilliertem Wasser, um die Ablagerungen zu entfernen.
- Glimmentladung/Plasma reinigen die Oberfläche mit Standardgeräten. Die genauen Parameter hängen von der verwendeten Maschine ab. Beginnen Sie mit den Parametern für die Netzentladung und passen Sie die Zeit empirisch an. Dieser Schritt ist entscheidend für eine gute Verteilung der Abschnitte auf dem Träger während der Trocknung der Abschnitte und sollte nicht weggelassen werden.
- Vorbereiten der Arrays-Montagehalterung B (z. B. Glasabdeckungen)
- Wenn Sie Multiplex-Immunmarkierungsexperimente planen, übertragen Sie die Proben auf einen Deckglas, um das Fluoreszenzsignal besser zu erkennen. Um die Deckglasklebigkeit zu verbessern, verwenden Sie ein detailliertes Gelatine-Beschichtungsverfahren, das zuvor beschrieben wurde9.
- Erhöhen Sie die Leitfähigkeit, indem Sie die Objektträger mit dem Indium-Zinn-Oxid (ITO) oder Gold durch Verdampfung beschichten. Bewahren Sie die vorbereiteten Deckgläser in einer sauberen Umgebung auf. Glühentladung der Proben wie in 1.2.3 beschrieben.
2. Teilung der Stichprobe
- AT Messervorbereitung
HINWEIS: Um die Arrays zu generieren, verwenden Sie ein modifiziertes Messer (ATS), das die Erfassung langer Bänder erleichtern soll. Histo-Jumbo-Messer oder ähnliche Messer, die für die Erzeugung der Profile auf großen Stützen konzipiert sind, können auch für AT-Schnitte dienen.- Befestigen Sie die Nadel mit dem schaumigen Klebeband an der Unterseite des Messers und stechen Sie es durch (Abbildung 2B). Legen Sie das ATS-Messer bei 0° in den Ultramikrotomhalter. Stellen Sie die Schneide des Messers parallel zur Blockoberfläche mit dem Standardverfahren ein.
- Bringen Sie den beschnittenen Block an den Rand des Messers in einer Position, die zum Schneiden bereit ist.
- Legen Sie die Waffel/den Deckglas in das Messerbecken und füllen Sie es mit Wasser auf die gleiche Höhe wie die Messerkante. Lassen Sie die Diamantkante des Messers richtig befeuchten und ziehen Sie gegebenenfalls mit der angebrachten Spritze Wasser ab (Abbildung 2C).
- Array-Schnitt und -Übertragung
- Stellen Sie das Mikrotom auf die gewünschten Schnittparameter ein. Beim ATS-Messer sind der Bereich von 50-100 nm und eine Schnittgeschwindigkeit von 0,6-1 mm/s ratsam. Beginnen Sie mit dem Schneiden (Abbildung 2Di).
- Rufen Sie ein Band mit der Länge ab, das ein Ziel-Z-Volume abdeckt, und beenden Sie die Sammlung. Abhängig von der Blockgröße, der Homogenität des Gewebes und der Art des Harzes ist das Band relativ gerade (Abbildung 2D-ii). Viele Proben erzeugen keine geraden Bänder, trotz des investierten Aufwands und der Art des Verwendeten Messers.
- Machen Sie je nach Endziel ein langes oder mehrere kurze Bänder nebeneinander ausgerichtet. Eine Stütze von 2 cm x 4 cm kann bequem 100 bis 1.000 Abschnitte aufnehmen. Die Anordnung des Bandes auf der Stützstufe ist ein Schritt, der Geschicklichkeit und ruhige Hände erfordert. Die Lernkurve für diese Fähigkeit wird jedoch schnell erworben.
- Lösen Sie das Band von der Messerkante mit einer sauberen, nicht klebrigen Wimpernspitze, die auf den Zahnstocher geklebt ist (Abbildung 2Diii).
- Bewegen Sie das Band mit den Wimpern vorsichtig über die Mitte des Trägermediums. Verwenden Sie an dieser Stelle Chloroform oder einen Heizstift zum Dehnen der Abschnitte, falls erforderlich. Denken Sie jedoch daran, dass diese Manipulation zu Bandbruch und Verformung führen kann.
- Beginnen Sie mit dem Ablassen des Wassers, indem Sie an der Spritze ziehen. Für empfindlichere Bänder oder ein langsameres Zurückziehen des Wassers lassen Sie das Wasser tropfen, indem Sie die Spritze vom Schlauch lösen. Wenn der Wasserstand auf das Waferniveau sinkt, steuern Sie das Band und positionieren Sie es bei Bedarf neu, indem Sie das Band vorsichtig in die Mitte drücken. Nachdem Sie die Bänder auf der Waferoberfläche abgesetzt haben, lassen Sie den Abfluss so lange fortsetzen, bis das restliche Wasser vollständig aus dem Becken zurückgezogen ist.
HINWEIS: Wenn Sie das ATS-Messer mit Bodenwasserrückzug nicht verwenden, reduzieren Sie das Wasser vorsichtig von den Seiten des ATS-Messers, um keine Turbulenzen zu induzieren. - Lassen Sie die Abschnitte auf der Stütze im Bad, um sie vollständig trocknen zu lassen. Abhängig von der Hydrophobie des Trägers und der Umgebungsfeuchtigkeit verdunstet Wasser mit einer unterschiedlichen Geschwindigkeit (Abbildung 2Div). Es ist wichtig, die Probe langsam trocknen zu lassen, um alle Falten auf der Probe zu verringern oder ganz zu vermeiden.
- Geben Sie die trockene Probe zum Schutz vor Schmutzverschmutzung in eine fest verschlossene Box und stellen Sie sie für mindestens 30 min in einen 60 °C großen Ofen. Bei Bedarf Gegenschnitte mit Schwermetallen, um den Gesamtkontrast zu verstärken.
- Reinigen Sie das Messer am Ende des Verfahrens vorsichtig nach den Anweisungen des Herstellers
HINWEIS: Die Übertragung mehrerer oder serieller Abschnitte auf einem Wafer (Abbildung 2E) im Vergleich zur Übertragung auf einem Slot-Grid (Abbildung 2F) verändert die EM-Vorbereitungserfahrung vollständig. Das ununterbrochene Schneiden und Sammeln der Abschnitte auf einem einzigen Träger reduziert die Menge an Schnitt- und Abschnittssammlungsfehlern, die bei seriellen Abschnitten häufig auftreten. Das Äquivalent von 100 Abschnitten von 1000 μm x 500 μm, die auf einem Wafer gesammelt werden, entspricht 33 Slot-Grids (Abbildung 2G).
3. Stichprobenbeobachtung
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Workflow-Schritte beschrieben, die mit einer handelsüblichen Software implementiert wurden (siehe Tabelle der Materialien). Jede Bilderfassungssoftware auf jedem REM, das mit den richtigen Detektoren ausgestattet ist, kann verwendet werden, jedoch unterscheiden sich die spezifischen Benutzeraktionen und sind oft manueller.
- Erfassen Sie eine Übersichtskarte der REM-Bilder, die die Abschnittspositionen auf dem Wafer zeigt. Ein integriertes optisches Kamerabild hilft bei der Definition eines REM-Bildmosaiks, das ein Band von Abschnitten oder allen Abschnitten abdeckt. Erstellen Sie das Mosaik per Klick-Schlepp mit der Maus rechts auf das Kamerabild der Probe und starten Sie die automatische Erfassung.
HINWEIS: Sehr grobe Bildgebungseinstellungen, d.h. 1-2 μm Pixelgröße und 1 μs Verweilzeit reichen aus. Dieser Prozess wird in Supplementary Material (Seiten 2-7) veranschaulicht. - Suchen Sie Abschnitte mit der automatischen Erkennungsfunktion des Abschnittsfinders oder manuell. Schnittpositionen und Umrisse werden mit dieser Software basierend auf dem Bildabgleich automatisch abgerufen. Zur Veranschaulichung dieses Prozesses siehe Ergänzendes Material (Seiten 8 - 15).
- Falls die Übersichtsbilder ROIs nicht deutlich zeigen, erfassen Sie Bilder von Abschnitten mit höherer Auflösung. Verwenden Sie die Funktion Abschnittsvorschau, um Bilder automatisch zu erstellen und zu erfassen. Dieser Prozess wird in Supplementary Material,Seiten 16-18, veranschaulicht. Die Imaging-Einstellungen müssen entsprechend der Art und Größe des ROI ausgewählt werden, nach dem der Benutzer sucht.
- Um optimale Einstellungen zu finden, aktivieren Sie das Live Imaging in der Mikroskopsteuerungssoftware und navigieren Sie zu einem ROI. Ändern Sie die Bildgebungseinstellungen, bis die Bilder ROIs deutlich zeigen, aber die Bildaufnahme ist nicht übermäßig lang.
- Definieren von Bildgebungsbereichen
HINWEIS: Es werden verschiedene Strategien vorgeschlagen.- Wenn nur wenige Abschnitte abgebildet werden müssen, verwenden Sie die Bilder der bisher erstellten Abschnitte für die Navigation zu den relevanten Abschnitten und verwenden Sie den zoombaren Viewer, der alle aufgenommenen Bilder an ihren ursprünglichen relativen Positionen anzeigt, um alle Abschnitte anzuzeigen. Sobald ein Abschnitt gefunden wurde, der mit hoher Auflösung abgebildet werden soll, erstellen Sie einen Bildbereich mit Click-Drag. Wählen Sie hochauflösende Imaging-Einstellungen und speichern Sie die Einstellungen in einer Vorlage. Verwenden Sie diese Vorlage für weitere Abschnitte wieder.
- Um besonders kleine oder schwer zu erkennende seltene Ereignisse zu finden, verwenden Sie den Lateral Screening-Ansatz. Erstellen Sie manuell einen Bildbereich mit hochauflösenden Bildgebungseinstellungen für jeden zehnten Abschnitt oder für einen Abschnitt pro Menüband und erfassen Sie die Bilder. Überprüfen Sie die Bilder und markieren Sie Abschnitte, die den ROI in der Software enthalten, oder machen Sie sich eine Notiz.
- Ausgehend von Abschnitten, die den ROI enthalten, navigieren Sie vorwärts und rückwärts durch den Abschnittssatz und erstellen Sie hochauflösende Bildgebungsbereiche an denselben relativen Positionen, solange die Struktur im Abschnitt noch sichtbar ist. Dies kann manuell oder mithilfe des in den nächsten Schritten beschriebenen Verfahrens erfolgen.
- Erfassen Sie Bilder in mehr als zehn aufeinanderfolgenden Abschnitten. Klicken Sie nach dem Zoomen des Bildes auf Positionsverfeinerung starten, um die Genauigkeit der registrierten Abschnittspositionen wie im Handbuch beschrieben zu erhöhen. Dadurch wird die Positionsvariabilität von Bildserien verringert. Das Verfahren wird auf den Seiten 19-21 des Ergänzenden Materials veranschaulicht und erläutert.
- Ziehen Sie mit einem Klick auf einen beliebigen Abschnitt, um einen Bildbereich zu definieren, während Sie die Alt-Taste gedrückt halten, und wählen Sie Im Kontextmenü, das geöffnet wird, wenn die Maustaste losgelassen wird, die Option Kachelsatz-Array erstellen aus. Die Software erstellt dann Bildbereiche an der gleichen relativen Position in allen Abschnitten, die zuvor gefunden oder markiert wurden. Es ist möglich, die Bildgebung mit dem Schieberegler Section Span auf einen bestimmten Bereich von Abschnitten zu beschränken.
HINWEIS: Dieser Vorgang kann mit einer beliebigen Anzahl von Bildbereichen wiederholt werden und ermöglicht daher die Aufnahme vieler kleiner hochauflösender Bilder, anstatt ein einzelnes größeres Bild auf jedem Abschnitt aufzunehmen. - Richten Sie nach der Erstellung in jeder Bildserie nach Bedarf Pixelanzahl, Pixelgröße, Kachellayout, Pixelverweildauer usw. ein. Sobald Imaging-Serien erstellt und eingerichtet sind, werden sie alle in einem Job-Cue aufgelistet.
- Automatische Funktionen konfigurieren und Bildaufnahme starten
- Erstellen Sie eine separate Bildserie für automatische Funktionen mit der gleichen Methode wie im vorherigen Schritt beschrieben. Verschieben Sie die Bildserie an eine Position in dem Abschnitt, der kontrastreiche Strukturen enthält.
- Stellen Sie die Bildserie auf 1024 x 884 Pixel ein und wählen Sie eine Pixelgröße, die der höchsten Auflösung entspricht, die in der in den vorherigen Schritten eingerichteten Bildserie verwendet wird. Aktivieren Sie in der Liste der Autofunktionen Autofokus und Auto Stigmator.
- Wählen Sie in den Steuerelementen für die Erfassungssequenz die Option Nach Abschnitt aus, und stellen Sie sicher, dass das Bild für automatische Funktionen das erste Element in der Liste ist. Starten Sie die Bilderfassung, indem Sie neben dem Auftragshinweis auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Diese Verfahren sind in Ergänzendes Material,Seiten 22-23, dargestellt.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, sich manuell auf jeden Abschnitt zu konzentrieren. Wenn das Mikroskop während der Aufnahmesitzung zu einem neuen Abschnitt vorrückt, werden die Autofunktionen ausgeführt, bevor alle anderen Bilder in diesem Abschnitt aufgezeichnet werden.
4. Datenausrichtung und -analyse
- Datenexport
- Stellen Sie sicher, dass die Daten in .tif Format gespeichert werden, damit keine dedizierte Exportfunktion erforderlich ist. Sortieren Sie Daten in eine Ordnerstruktur, die direkt den Ebenen und Elementen im Ebenenbaum entspricht.
- Sobald Bildmosaike aufgenommen wurden, verwenden Sie die StitchAll-Funktion, um alle Kacheln automatisch zu stitchen.
- Stapelausrichtung und Zuschneiden in Fidschi
ANMERKUNG. Viele Softwarepakete (kostenlos und kommerziell) können verwendet werden, um mit Array Tomography-Daten zu arbeiten. Die folgenden Schritte werden mit dem Open-Source-Programm Fiji32 gezeigt, da es weit verbreitet ist und alle erforderlichen Funktionen enthält.- Importieren Sie einen Stapel von Bildern (oder zusammengefügten Bildern) als virtuellen Stapel nach Fidschi.
- Wenn Kontrast/Helligkeit normalisiert werden muss, wählen Sie Erweiterter Kontrast... aus dem Menü Prozess. Legen Sie Gesättigte Pixel auf 0,1 oder weniger fest und aktivieren Sie Alle Slices verarbeiten.
- Wählen Sie im Menü Plugins die Option Registrierung | Linear Stack Alignment mit SIFT.
- Wählen Sie im Dropdown-Menü Erwartete Transformation die Option Starr oder Affin aus. Andernfalls behalten Sie die Standardeinstellungen bei. Starten Sie die Ausrichtung, indem Sie auf OKklicken.
HINWEIS: Das Laden der Daten als Virtual Stack ermöglicht es Fidschi, Stacks beliebiger Größe zu verarbeiten. Die Ausgabe der Ausrichtung wird im RAM erstellt. Dies kann jedoch die maximale Größe der Stapel begrenzen, die verarbeitet werden können. Verwenden Sie in diesem Fall Register Virtual Stack Slices, bei dem es sich um eine Ordner-zu-Ordner-Implementierung desselben Registrierungsalgorithmus handelt. Sobald die Registrierung abgeschlossen ist, laden Sie die Ausgabedaten als virtuellen Stack. - Schneiden Sie den Bildstapel zu, indem Sie auf Zuschneiden klicken, sodass er nur den ROI enthält.
- Speichern Sie den Stapel als einzelnes .tif Bild oder eine Reihe von .tif Bildern.
HINWEIS: Kritische Schritte der Array-Tomographie sind in Abbildung 3 dargestellt.
Representative Results
Die folgenden Beispiele sollen die Vielseitigkeit der empfohlenen Workflows demonstrieren. Die Fallstudienillustrationen sind Projekte, bei denen wir Schwierigkeiten hatten, mit anderen Techniken zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Wir haben Uns für Drosophila adult entschieden, um typische Herausforderungen zu veranschaulichen, denen man bei zahlreichen Probentypen begegnen kann. Dieses röhrenförmige Organ von etwa 6 mm Länge, 500-1000 μm Im Querschnitt, ist in verschiedene Regionen mit einer einzigartigen Funktion und zellulären Zusammensetzung unterteilt (Abbildung 4A)33. Je nach Schnittausrichtung variieren die Abmessungen des Darmprofils und sein Aussehen auf dem Abschnitt. Entweder quer oder längs orientierte Abschnitte sind relativ groß, und nur ein Paar kann auf einem einzigen TEM-Gitter platziert werden (Abbildung 2F). Nur ein kleiner Teil des Gewebes kann im FIB abgebildet werden, und für das SBF-REM ist die Schwierigkeit ähnlich wie bei allen inhomogenen Proben. AT bietet einen effizienten Kompromiss für die Analyse solcher Proben und die flache Einbettung erleichtert die ROI-Lokalisierung. Das sorgfältige Trimmen des Harzüberschusses um den ausgewählten Bereich (Abbildung 4B) ist wichtig für die effiziente Sammlung der Arrays aus dem relevanten Bereich (Abbildung 4C). Hunderte von Abschnitten können auf einem einzelnen Wafer nacheinander oder zufällig gesammelt werden (Abbildung 4D). Abhängig von der Forschungsfrage erfordert das Stichprobenscreening und die Probenbeschaffung eine andere Strategie, die wir willkürlich in mehrere Szenarien unterteilt haben. Um verschiedene vorgestellte Szenarien gezielter zu veranschaulichen, wählten wir mehrere Fallstudien aus den verschiedenen Forschungsprojekten aus.
Analyse zahlreicher zufällig verteilter großer Strukturen im Bereich von 1-10 μm (Abbildung 4E)
Häufig werden ultrastrukturelle Daten benötigt, um eine Hypothese zu validieren, die sich aus mehreren experimentellen Ansätzen ergibt und einen Standard- und einen experimentell veränderten Zustand vergleicht. In diesen Fällen werden in der Regel mehrere Abschnitte nach dem Zufallsprinzip auf Rastern gesammelt und überprüft, um die Interessengebiete zu lokalisieren und abzubilden. Diese Taktik ist in der Regel weniger systematisch und auf eine kleine Anzahl von analysierten Abschnitten beschränkt. Wir empfehlen, Übersichten von Dutzenden/ Hunderten von Abschnitten mit mittlerer Auflösung aus einem bestimmten Farbband aufzunehmen (Abbildung 4D). Für typische Abschnitte von 70 nm umfassen 200 Abschnitte etwa 14 μm, die zahlreiche Zellen enthalten, die entweder ganz oder teilweise innerhalb einer halben Stunde abgeschlossen sind. Im ersten Schritt wird die niedrig aufgelöste Übersicht über das gesamte Farbband aufgezeichnet, und die Übersicht hilft, die Abschnitte wegzulassen, die Vorbereitungsartefakte (z. B. Falten, Schmutz) zeigen. Danach kann die Erfassung manuell oder automatisch direkt an ausgewählten Teilen des Schnitts oder einem ganzen Schnitt durchgeführt werden, wobei Einzel- oder Mosaikbildgebung verwendet wird, gefolgt von Stitching (Abbildung 4E). Danach können Bilder aus dem ausgewählten Bereich mit hochauflösenden Parametern aufgenommen werden. Beispielsweise können Mitochondrien, Kerne und Mikrovilli von einer solchen statistisch verbesserten Methode profitieren (Abbildung 4Ei-iii).
Analyse mehrerer kleiner, spärlich verteilter Strukturen im Bereich von 500-1.000 nm (Ergänzender Film 1)
In diesem Szenario kann der ROI nicht einfach in einem Übersichtsscan mit geringer Vergrößerung identifiziert werden, und es werden hochauflösende Bilder benötigt. In herkömmlichen TEM-Proben ist das mühsame Vergrößern und Verkleinern des Abschnitts notwendig, bis das erforderliche Merkmal gefunden ist. Oft ist die Abbildung mehrerer unabhängiger Orte in mehreren Proben statistisch relevanter als die Erzeugung eines einzelnen großen Volumens. In solchen Fällen wächst die Komplexität der manuellen Erfassung exponentiell. Obwohl mehrere TEM-Lösungen die automatische Erfassung oder das Screening mehrerer Gitter ermöglichen, machen die Größe des Netzes und die Herausforderungen bei der seriellen Abschnittierung den Ansatz häufig für viele Stichproben inkompatibel. Für ähnliche Fälle generieren wir eine vollständige Karte mit mittlerer Auflösung eines Gesamt-ROI in mehreren Abschnitten mit einer Auflösung, die ausreicht, um die interessierenden Strukturen zu identifizieren. Während dieses seitlichen Screening-Schritts ist es ratsam, mehrere Abschnitte gleichzeitig zu springen, um bei zufälliger Annäherung zumindest einen Teil der interessierenden Struktur zu treffen. Dies hängt weitgehend von den Gesamtabmessungen der Struktur ab: Wenn z. B. die Gesamtgröße der Struktur 500 nm beträgt und die Abschnitte 50 nm dick sind, enthalten mindestens neun aufeinanderfolgende Abschnitte in einer Reihe wahrscheinlich einen Teil der interessierenden Struktur. Auf diese Weise soll das Überspringen von 6-7 Abschnitten effizient sein, um viele verschiedene Arten von Strukturen in mehreren Bereichen zu finden. Die automatische Erfassung der aufgelösten Mosaikkarten ausgewählter Abschnitte ermöglicht ein sorgfältiges Screening dieser Abschnitte nach ihrer Erfassung. Sobald eine solche hochauflösende Karte erfasst ist, können mehrere ROIs ausgeschnitten oder verwendet werden, um zusätzliche lokale Bildgebungsbereiche auf ROIs zu definieren (Supplementary Movie 1). Golgi, Zentriolen, Verbindungen, Mikrotubuli, verschiedene Arten von Vesikeln sind gute Beispiele für die Strukturen, die von diesem Szenario profitieren könnten (Supplementary Movie 1).
Analyse spärlich verteilter großer ROIs in großen Stichproben (Abbildungen 4F-4H)
Dieses Szenario beinhaltet seltene Ereignisse, die häufig als "eine Nadel im Heuhaufen" beschrieben werden, bei denen das Problem nicht in der ROI-Identifizierung, sondern in seiner Lokalisierung liegt. Für viele Proben ist ein korrelativer Ansatz keine gültige Option, doch häufig hat der ROI eine aufschlussreiche Ultrastruktur und kann, wenn er lokalisiert ist, mit hoher Zuverlässigkeit identifiziert werden. Für diese Proben ist es wichtig, eine mehrstufige Erfassung anzuwenden, beginnend mit den vorgesiebten Proben mit Dutzenden bis Hunderten von Abschnitten mit mittlerer Auflösung. In der hier verwendeten Software gibt es zwei verschiedene Strategien, um Bildsätze aus mehreren Abschnitten zu erhalten: Aufnahme der Vorschaubilder mit höherer Auflösung oder Erfassung eines Array-Kachel-Sets mit geeigneten Einstellungen (Abbildung 4F). Verschiedene spezialisierte Zelltypenim Drosophila-Darm sind zufällig verteilt (z. B. Stammzellen, enteroendokrine Zellen) und bei zufälliger Orientierung dünn geschnitten. Sie können jedoch visuell unterschieden werden, nachdem die mit hochauflösenden Parametern erhaltenen Bilder entweder aus einzelnen Abschnitten oder als Sammlung von Serienbildern gewonnen wurden (Abbildung 4G). Nach der Ausrichtung können die Stacks mit verschiedenen Softwarelösungen gerendert werden (Abbildung 4H, Supplementary Movie 2).
Szenario 1: Intestinale Organoide (Abbildung 5A)
Organoide entwickeln sich schnell zu einem der modernsten Werkzeuge der modernen Lebenswissenschaften. Dieses nahezu physiologische 3D-Stammzell-abgeleitete Organmodell ermöglicht eine genaue Untersuchung einer Reihe von biologischen In-vivo-Prozessen, einschließlich Gewebeerneuerung, Reaktion auf Medikamente und regenerative Medizin. Die kürzlich eingeführten Mini-Darm-Röhrchen34 eröffnen eine neue Generation der Organoidtechnologie, die der In-vivo-Gewebephysiologie, der Zelltypzusammensetzung und der Homöostase sehr ähnlich ist und breite Perspektiven für die Krankheitsmodellierung, die Wirt-Mikroben-Interaktion und die Wirkstoffforschung ermöglicht. Wenn jedoch eine ultrastrukturelle Charakterisierung erforderlich ist, kann die Lokalisierung verschiedener Zelltypen in so großem Gewebe unter Verwendung von Zufallsproben eine Herausforderung darstellen. Auch bei variablen "Infektionstests" ist es wichtig sicherzustellen, dass die Analyse verschiedene Entwicklungsstadien aufdeckt, die das Gewebe beeinflussen. Für solche Studien ist die statistisch signifikante Abdeckung der Stichprobe von zentraler Bedeutung, aber mit dem traditionellen TEM-On-Grid-Ansatz schwer zu erreichen. AT-Szenario 1 ist in solchen Fällen von Vorteil: Viele sequentielle Abschnitte können auf einem Wafer erzeugt werden (Abbildung 5Aii) und mit Niedrigauflösungsparametern gescreent werden, um die allgemeinen Interessengebiete zu lokalisieren (Abbildung 5Aiii; Pfeile). Diese Bereiche können für weitere Analysen mit erweiterten Erfassungsparametern anvisiert werden (Abbildungen 5Aiv und Abbildung 5Av). Wenn eine relevante Struktur erkannt wird (typischerweise ein Cluster von 5-10 Abschnitten einmal pro 100-300 Abschnitte), ist es einfach, sich auf jede der interessierenden Strukturen zu konzentrieren und einzelne Bilder manuell zu erfassen oder die Automatisierungsfunktionen zu verwenden, um Bildvolumina über mehrere Abschnitte hinweg zu erfassen.
Szenario 2: Drosophila pupal notum ( Abbildung5B)
Die Untersuchung der Zellteilung und der Mechanismen, die die Progression durch den Zellzyklus steuern, ist entscheidend, um sowohl Standard- als auch veränderte Prozesse in mehrzelligen Organismen zu verstehen. Vorhandene Informationen stammen häufig aus einzelligen Systemen; Dieser Lösung fehlt jedoch der kritische Kontext der 3D-Interaktionen zwischen den Zellen in einem Gewebe. Eine einzellige Monoschicht des Notums, des sich entwickelnden Rückens der Drosophila-Larve, ist ein perfektes Modell für die Interaktion zwischen den Epithelzellen im Allgemeinen und der Zellteilung im Besonderen35. Es ist ein etabliertes Modell für molekulare und zelluläre Interaktionsstudien, das die Kombination der durch Fluoreszenzmikroskopie und genetische Manipulationen verfügbaren Daten nutzt. Die Abszission, der letzte Schritt der Zellteilung, gewährleistet die endgültige Trennung zwischen zwei sich teilenden Zellen, und die Charakterisierung der strukturellen Veränderungen, die während der Abszise auftreten, ist für unser Verständnis der Mitose unerlässlich. Allerdings sind mitotische Unterteilungen im Notum auf ultrastruktureller Ebene nicht leicht zu lokalisieren: Die Zellen sind im Vergleich zur Abszischzone relativ groß (Abbildung 5B). Das Verhältnis zwischen der Gesamtgröße der Abszisionszone und der Oberfläche des abzudeckenden Abschnitts ist groß (Abbildung 5Bi). Obwohl es möglich ist, die Abszisionszone mit den Methoden TEM oder SBF-SEM36zu lokalisieren, ist die Aufgabe mühsam. Mit diesem Szenario können die automatischen Übersichtsbilder mittlerer Auflösung der Sprünge von 20-40 Abschnitten zur Lokalisierung der sich teilenden Zellen verwendet werden (Abbildung 5Bii). Wenn solche Zellen identifiziert werden, dienen die Abschnitte als Anker für eine genauere Untersuchung der Abschnitte in der Nähe, und zahlreiche sich teilende Zellen können gefunden und für weitere Analysen ausgewählt werden. Auf diese Weise kann die Abszisionszone in ihrer Gesamtheit lokalisiert und abgebildet werden (Abbildung 5Biii). Je nach Fragestellung können einzelne hochauflösende Bilder oder 3-7 Bildsequenzen gesammelt werden, um die Tiefe der Struktur abzudecken (Abbildung 5Biv).
Szenario 3: Tanyzytenneuronen der Maus (Abbildung 5C)
Die Maus bietet ein gut etabliertes Modell für die Entwicklung des Gehirns und ist auf verschiedenen Ebenen gut dokumentiert, auch durch EM. Obwohl verschiedene automatisierte serielle Block-Face-Methoden ausgiebig verwendet wurden, um Hirngewebe zu untersuchen, gibt es Fälle, in denen AT besser angepasst ist, um die notwendigen Daten zu sammeln. Der Hypothalamus ist ein etabliertes neurowissenschaftliches Modell, ein Teil des Gehirns, der mehrere neuronale Funktionen enthält. Hypothalamische Tanyzyten stellen eine bestimmte Untergruppe von ependymoglialen Zellen dar, die den Boden des dritten Ventrikels auskleiden, mit ungewöhnlich langen Prozessen (bis zu 300 μm) und großen Endfüßen (~ 5 μm)37. Dies macht sie für die Analyse mit TEM- oder FIB-Methoden unpraktisch. Die Aufgabe wird noch komplizierter, wenn mehrere unabhängige Tanyzyten lokalisiert und analysiert werden müssen. Einer der Ansätze, um diese Aufgabe zu erleichtern, kann semi-korrelatives Targeting sein, bei dem die Fluoreszenzkarte aus den fluoreszenzmarkierten Proben erhalten wird, bevor sie für EM fixiert und eingebettet wird. Der Schnitt wird auf der erfassten Fläche durchgeführt, indem die Positionsinformationen aus der Fluoreszenzprobe und der flachen eingebetteten Kunststoffnachbildung kombiniert werden. Danach kann das AT-Szenario 3 verwendet werden: Die high-level Übersichtsmosaikbilder werden generiert, um die Regionen mit Tanyzyten-Endfeetenclustern zu enthüllen. Anschließend werden Automatisierungsfunktionen in der Software verwendet, um die Erfassung von Sequenzen der Bilder aus einem oder mehreren Bereichen in einem einzelnen Bild- oder Kachelmodus einzurichten. Diese Bilder können separat analysiert, als ausgerichtete Stapel oder danach gerendert werden.
Die Leistungsfähigkeit der AT-Methode ermöglicht das relativ mühelose "Upgrade" von Daten von 2D auf 3D: Die Karten sind aus der Primärerfassung verfügbar, und die Volumina können aus dem ausgewählten Gebiet und seiner Umgebung bezogen werden. Der resultierende Stapel kann ausgerichtet und anschließend gerendert werden. Es ist wichtig, im Voraus zu bestimmen, welche Auflösung und Bildqualität erforderlich sind, um ROIs zu finden. Die Bildgebung sollte es ermöglichen, die ROIs zu erkennen, aber nicht über diesen Wert hinaus, da die Erfassungszeit proportional zur Pixelverweilzeit und dem umgekehrten Quadrat der Pixelgröße skaliert wird.
Abbildung 1: Herausforderungen bei der EM-Probenvorbereitung und Volumenerfassung. (A) Der Verlust von Fluoreszenz und Schrumpfung geschieht aufgrund einer hohen Schwermetallkonzentration und Dehydration während der Probenvorbereitung. (i) Eine schematische Zeichnung einer Probe, die unter LM (ii) beobachtet wurde, dieselbe Für EM vorbereitete Probe, die völlig undurchsichtig wird und etwa 10% ihres Volumens verliert. (B) Die Probeneinbettung erfolgt typischerweise unter Verwendung von Epoxid- oder Acrylharzen. Traditionelle Blöcke (i) können erfolgreich für homogene Proben verwendet werden, die keine bestimmte Ausrichtung erfordern. Flache Blöcke (ii) sind hilfreich, wenn es wichtig ist, unter dem Mikroskop einen präzisen Bereich zu zielen und zu orientieren, der zum Schneiden bestimmt ist, z. B. in inhomogenen Proben oder korrelativen Mikroskopieverfahren. (C) Vom gesamten Probenvolumen wird nur ein begrenzter Bruchteil auf einem einzigen 50-nm-Schnitt dargestellt, der ein 2D-Bild einer 3D-Probe liefert, häufig in einer unbekannten Ausrichtung. (D) Um das Problem der Aufzeichnung zu großer Volumina im Vergleich zum präzisen Targeting zu veranschaulichen, haben wir drei konzentrische Würfel mit den Flächen von 1000, 500 und 50 μm ausgewählt, die so organisiert sind, dass sie eine hypothetische Probe von 1000 x 500 x 500 x μm (dunkel kastanienbraun) enthalten. Wenn solche hypothetischen Probenwürfel gründlich mit 50-nm-Scheiben geschnitten werden, um das gesamte Volumen abzudecken, sind insgesamt 20.000, 10.000 und 1.000 Scheiben sowie 800 TB, 100 TB und 100 GB erforderlich (Abbildungsauflösung 5 nm x 5 nm x 50 nm, 8-Bit-Daten). Dies zeigt, wie wichtig es ist, die Erfassung von EM-Daten nur zu planen, um das erforderliche Mindestvolumen zu erreichen. (E) Die Abdeckung einer großen Probenoberfläche in hoher Auflösung stellt ein ähnliches Problem dar wie bei großen Mengen. Das Kacheln mehrerer hochauflösender Bilder in einem ist eine hilfreiche Lösung für ein solches Problem. Um jedoch eine Fläche von 1 mm x 1 mm mit dem Rahmen 2024 x 1048 in 10.000-facher Vergrößerung abzudecken, ist eine große Anzahl von Fliesen erforderlich, die schwierig zu nähen sein können. Wenn Abschnitte während des Schneidens variabel komprimiert oder verzerrt werden, werden die resultierenden Datenstapel fast unmöglich auszurichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der Arbeitsablauf für die direkte Generierung der Arrays von Abschnitten auf großem Träger. (A) Für das enge Trimmen mit dem Trimmwerkzeug werden Blöcke im Mikrotomhalter befestigt. Dieser Schritt hilft, parallele Seiten eines Blocks sicherzustellen und reduziert auch leeres Harz um die Probe herum. (B) Ein modifiziertes Messer für den Erwerb von AT-Abschnitten. Ein großes Boot erleichtert den Transfer der Abschnitte und deren Manipulation während des Probenschnitts und des Transfers auf dem Träger. Ein großes Becken ermöglicht die Manipulation der Abschnitte; Das Entwässerungssystem begrenzt die Bewegung der Bänder während des Entwässerungsschritts, der flache Boden macht die allmähliche Trocknung des Trägers zuverlässig. (C) Das Messer, bereit zum Schneiden mit einem glühentladungen Wafer am Boden des Beckens und Wasser an den Rändern. Die Konstruktion des Messers hält die Nadel eingebettet, ohne in die Halterung einzugreifen. (D) Array-Generierung, Draufsicht auf den Mikrotomschnittbereich. (i) Die ersten Abschnitte sind in der Regel leicht zu erhalten, da sie aneinander haften und ein regelmäßiges Band bilden. (ii) Wenn dem Menüband weitere Abschnitte hinzugefügt werden und es länger wird, verliert das Band seine Stabilität und krümmt sich häufig. Es ist wichtig, die Sequenzspuren in Vorbereitung auf den Bildaufnahmeschritt nacheinander zu organisieren. (iii) Wenn ein Band aus Abschnitten die gewünschte Länge erreicht, wird es mit einer Wimper vorsichtig von der Messerkante gelöst. iv) Wasser aus dem Becken abgelassen wird; der Wafer bleibt im Inneren, bis er vollständig lufttrocken ist. Dieser Schritt ist wichtig, da er hilft, die Abschnitte zu begradigen und die Bildung der Mikrofalten zu vermeiden. Die Waffel wird bei 60°C für mindestens 30 min in den Ofen gestellt, um die Abschnitte auf dem Träger zu befestigen. (E) Beispiel Wafer mit den übertragenen Abschnitten. Obwohl es bequem ist, gerade und genaue Bänder zu erhalten, verhindern tatsächliche Proben in den meisten Fällen die Bildung solcher idealen Bänder. Dennoch sind selbst "schlampige" Bänder für die große Anzahl von Fällen sehr informativ, und die Bedeutung des "ordentlichen" Bandes hängt von einer Forschungsstrategie ab, für die die Abschnitte gesammelt werden. Maßstabsleiste 1 cm. (F) Beispiel Schlitzraster mit den seriellen Abschnitten. Selbst wenn viele Abschnitte auf einem Gitter gesammelt werden, ist es immer noch ein winziger Bruchteil dessen, was auf einem einzigen Wafer gesammelt werden kann. Die Fähigkeit, die Übertragung der Abschnitte auf einem Gitter (insbesondere Schlitzgitter) zu beherrschen, stellte einen erheblichen Engpass für die Beherrschung der elektronenmikroskopischen Probenvorbereitung dar. Maßstabsbalken 500 μm. (G) Unabhängig davon, welche Schnitterfassungsmethode verwendet wurde, liegt die Stärke des AT-Ansatzes in der relativ einfachen Erzeugung sequenzieller Schnitte im Vergleich zur Netzabscheidung. Betrachtet man einen 1000 μm x 500 μm Probenblock, ist es kein Problem, etwa 100 Schnitte auf einen 2 cm x 4 cm großen Wafer (i) zu montieren. Die Abschnitte gleicher Größe in einem Schlitzraster passen maximal (ii) in nur drei Abschnitte/Raster. Wir stellen ein skaliertes Bild zur Verfügung, um zu zeigen, wie viele Raster erforderlich sind, um die gleiche Anzahl von Abschnitten abzudecken, ohne die Schwierigkeit zu erwähnen, serielle Abschnitte im Raster zu sammeln. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3:Kritische Schritte des Array-Tomographie-Workflows. Schematische Darstellung des Workflows für die unbeaufsichtigte Erfassung von hochauflösenden Bildstapeln. Alle vorbereitenden Schritte sind automatisiert (grüne Zahnradsymbole) und erfordern keine manuellen Aktionen, Abschnitt für Abschnitt. Bildstapel können in jeder Bildanalysesoftware ausgerichtet werden, die eine automatische starre oder affine Ausrichtung ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Drei Akquisitionsszenarien mit Drosophila Adult Gut als Demonstrationsmodell. (A) Zeichnung eines sezierten Drosophila-Mitteldarms mit drei Hauptregionen, die durch verschiedene Farben gekennzeichnet sind: vordere, mittlere und hintere. (B) Getrimmter Flachblock, in dem ein Darm für Querschnitte ausgerichtet ist. Beachten Sie, dass die leere Harzmenge sorgfältig um das Gewebe herum balanciert wird, das den interessierenden Bereich (weißes Rechteck) enthält. (C) Transversale Serielle Abschnitte schwimmen auf der Wasseroberfläche im Becken des AT-Messers. Alle Bilder wurden im Sekundärelektronen-REM-Modus mit dem Spiegeldetektor mit dem inversen Kontrast aufgenommen. (D) Zusammengefügtes Mosaikbild von transversalen seriellen Schnitten auf einem Wafer. Maßstabsbalken ist 1000 μm. (E) Querschnitt durch Drosophila Darm. Maßstabsleiste 20 μm. Das Bild ist ein zusammengefügtes Mosaik aus 7 x 7 Mittelklassebildern. Insets - Bilder mit höherer Vergrößerung und Auflösung der spezifischen Regionen von Interesse: (ii) Kern, (iii) Pinselrand und (i) Mitochondrien. Maßstabsleiste 5 μm für alle. (F) Ein Mittelbereichsbild eines Querschnitts durch den Darm, der auf den Ort der sich entwickelnden Zellen abzielt (quadratisch). Maßstabsbalken ist 20 μm. (G) Das zielgerichtete Array von seriellen Schnitten, die basierend auf der Fläche gesammelt werden, die während der Analyse des in Panel F vorhandenen Abschnitts lokalisiert wurde. Maßstabsbalken beträgt 10 μm. (H) Das 3D-Modell wird basierend auf der 50-Schnitt-Stapelsequenz gerendert, die aus der gezielten seriellen Erfassung in Panel G gewonnen wurde.
Abbildung 5: Fallstudien für die AT-Anwendungsszenarien. (A) Lokalisierung verschiedener Zellstrukturen im Darmorganoid. (i) Eingebetteter Silizium-Mikrochip. Maßstabsleiste = 200 μm. (ii) Ein zusammengefügtes Mosaikbild von 127 Querschnitten durch den zentralen Teil des Chips. Maßstabsbalken = 1500 μm (iii) Vier niedrig aufgelöste Bilder eines kompletten Querschnitts durch den Teil des Darmorganoids. Pfeile zeigen auf den potenziellen Standort von Interesse. Der Maßstabsbalken beträgt 20 μm. (iv) Verschiedene ROIs, die auf niedrig aufgelöste Mikroaufnahmen abzielen, die für weitere Analysen ausgewählt wurden. Maßstabsbalken = 10 μm. (v) Hochauflösendes Bild der infizierten Zelle von Interesse. Die Analyse des gleichen Bereichs in den angrenzenden Abschnitten kann bei Bedarf gezielte 3D-Informationen liefern. Skalenbalken = 5 μm. (B) Mittelkörperlokalisation in Drosophila melanogaster pupal notum. (i) Eine schematische Darstellung einer sezierten Drosophila-Puppe. Notum exponiert für die Dissektion (beige) nach Entfernung des Teils der schützenden Kutikula (braun). Die schwarze Linie bezeichnet die Schnittrichtung (ii) Ein Querschnitt durch den im Diagramm dargestellten Bereich. Das Bild kombiniert 3x7 sequentiell aufgenommene hochauflösende REM-Bilder, die zu einem Mosaikpanel zusammengefügt wurden. Das schwarze Rechteck grenzt den Bereich ab, der eine teilende Zelle enthält. Der Maßstabsbalken beträgt 15 μm. (iii) Ein vergrößertes Bild auf der Trennzelle aus Tafel ii. Bei dieser Vergrößerung und Auflösung ist der Mittelkörper sichtbar (weiße Pfeile). Der gesamte Abschnitt wird analysiert, um die sich teilenden Zellen zu finden. Das Springen zwischen verschiedenen Bändern von Abschnitten in 20-30 Abschnittsintervallen während des lateralen Screening-Schritts ermöglicht es, zahlreiche sich teilende Zellpaare zu lokalisieren. Der Maßstabsbalken beträgt 5 μm (iv), wenn eine sich teilende Zelle lokalisiert ist, sequentielle Bilder des Mittelkörpers, die aus vier Abschnitten um den Mittelkörper gesammelt werden, die durch ein gelbes Quadrat in der Tafel (iii) begrenzt sind. Der Maßstabsbalken beträgt 1 μm. (C) Tanyzyten-Endfeetenlokalisation im Maushypothalamus. (i) Fluoreszenzbild einer Vibratomscheibe. Tanycyten exprimieren tdTomato fluoreszierendes Protein (rot). Ein weißes Rechteck grenzt den interessierenden Bereich ab. Maßstabsbalken 500 μm. (ii) Derselbe für EM vorbereitete Vibratomabschnitt wird sorgfältig um den interessierenden Bereich herum getrimmt - basierend auf der indirekten Korrelation der Fluoreszenzinformationen aus Panel (i). Die gepunktete weiße Linie stellt den Bereich der ultradünnen Schnitte dar. Maßstabsleiste beträgt 50 μm für beide Panels. iii) Querschnitt durch die Vibratomscheibe im interessierenden Bereich. Das SEM-Mosaikbild besteht aus 75 zusammengefügten Bildern. Mehrere Abschnitte werden durch seitliches Screening anvisiert und mit ähnlichen Parametern abgebildet. Die Abschnitte werden "offline" analysiert, um den ROI - die Tanyzytenendfüße - zu finden. Das schwarze Rechteck stellt den Bereich dar, der die Tanyzytenendfüße enthält. Dieser Abschnitt dient als Anker für weitere Analysen. Maßstabsbalken ist 15 μm. (iv) Hochauflösendes, hochvergrößertes Bild von Tanyzyten-Endfüßen, die ein Blutgefäß umgeben. Nach der anfänglichen Lokalisierung des ROI auf einem Abschnitt wird die Z-Sequenz aus den angrenzenden Abschnitten stromaufwärts zum Ankerabschnitt (Panel iii) gesammelt. Maßstabsleiste 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Probleme bei der Ultramikrotomie, Schnittentnahme und Schnittlagerung können zu Artefakten führen. (A) Gehirnprobenschnitte auf einem Wafer. Der größte Teil des leeren Harzes löste sich vom Gewebe und faltete sich auf sich selbst (Sepia). Gestrichelte schwarze Box bezeichnet einen Bereich, der verwendet wird, um den gesamten Abschnitt zu enthalten. Maßstabsbalken 500 μm. (B) Eine kleine, lokale Falte auf der Oberfläche eines 50 nm dicken Zebrafischabschnitts. Maßstabsbalken 1 μm.(C)Messermarkierung auf der Oberfläche eines 70nm Maushirnschnitts. Mensurstab 5 μm. (D) Das Haar (Sternchen) auf der Oberfläche des Wafers, das teilweise einen Zebrafisch-Muskelabschnitt bedeckt. In Gelb wird das Gewebe für die Analyse anvisiert. In Rosa eine Zelle, die als Referenz für die Größe des betroffenen Bereichs dient. Maßstabsleiste 50 μm. (E) Zebrafisch-Notochord mit Falten unten rechts (schwarze Pfeile), wo dichtes Nervengewebe (blau beschattet) an weicheres Muskelgewebe und leeres Harz (schwarze Pfeile) grenzt. Maßstabsleiste 10 μm. (F) Volumensegmentierung eines Stapels von 50 Bildern wie in E, was zeigt, dass dieser Bereich in den meisten Abschnitten Falten aufwies. Gestricheltes Polygon umreißt die Fläche, die in der G. Maßstabsleiste 10 μm angezeigt wird. (G) XY-Ansicht der gleichen Volumensegmentierung wie in F, wobei die Falten als kurze schwarze Striche in der rechten Hälfte des Blocks angezeigt werden. Beachten Sie, dass die Ausrichtung des Stapels in den verbleibenden Teilen des Gewebes nicht durch die Falten beeinflusst wird. Maßstabsleiste 5 μm. (H) XZ Projektion des gleichen Bereichs wie in G, zeigt die Falten in allen 50 Abschnitten. Maßstabsleiste 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzungsfilm 1: Ein hochauflösendes Montagebild eines Querschnitts durch Drosophila anterior middarm. Mosaikbild eines invertierten SE-MD SEM-Bildes. 352 separate Bildkacheln wurden automatisch mit einer Auflösung von 5 nm erfasst und zusammengefügt, um den gesamten Querschnitt darzustellen. Es ist möglich, für weitere Details zu zoomen und eine umfassende Abdeckung der Daten mit demselben Bild zu erhalten. Tight Junctions, Mikrotubuli, verschiedene Arten von Vesikeln können beim Heranzoomen sein. Maßstabsleiste ist 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Ergänzender Film 2: Drosophila Darmzellen Rendering. Fünfzig ausgerichtete Mosaikbilder der Abschnitte im Bereich der sich teilenden Darmzellen. IMOD-Rendering der Zellränder (blau, türkis und orange) und Kerne (weiß). Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Ergänzende Materialien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Die Elektronenmikroskopie gibt Einblick in die Ultrastruktur der Zellen und Organismen, für die es oft wünschenswert ist, interessierende Strukturen in ihrem 3-dimensionalen Kontext abzubilden. Trotz zahlreicher EM-Taktiken für die ultrastrukturelle Analyse gibt es immer noch keine "Goldstandard"-Lösung. Der Hauptgrund ist die große Vielfalt an Proben, viele biologische Fragestellungen, die häufig einen maßgeschneiderten Ansatz erfordern. Der vorgeschlagene AT-Workflow wurde entwickelt, um den Zeitaufwand für die Probenverarbeitung, Datenerfassung, -auswertung und -speicherung zu minimieren. Darüber hinaus bietet das modifizierte Messer ein hilfreiches Werkzeug, um die Array-Erfassung zu vereinfachen. Die kompakte Anordnung der Schnitte auf Wafern ist sowohl für die Beobachtung als auch für die anschließende Lagerung der Proben komfortabel. Diese Anordnung ermöglicht ein "laterales Screening" von Proben, indem horizontal von Band zu Band bewegt wird und jeweils nur ein Abschnitt gescannt wird, wodurch der Zeitaufwand für die Lokalisierung eines ROI erheblich reduziert wird. Vorgeschlagene Datenerfassungsszenarien erleichtern die gezielte Ausrichtung auf kleine und zufällig verteilte Bereiche. Einmal gefunden, beschränkt AT/REM die hochauflösende Bildgebung genau auf das gewünschte Volumen, egal ob manuell oder mit Hilfe der Automatikfunktion. AT für begrenzte Volumina kann manuell ausgefüllt werden, wobei der Bediener durch die Probe navigiert und bildgebende Bereiche nacheinander definiert. Das automatisierte Modul der Software bietet eine flexible Bilderfassungsstrategie für die Abbildung kleiner Flächen auf großen Schnitten. Die Automatisierung in dieser Software ermöglicht die Aufnahme großer hochauflösender Bilder auf Hunderten von Abschnitten und erreicht ähnliche Volumina wie SBFI. Die Aufzeichnung von Übersichtsbildern aller Schnitte vereinfacht die ROI-Lokalisierung und reduziert den Zeitaufwand am Mikroskop. Da die Abschnitte bei der Aufzeichnung von Übersichten und höher aufgelösten Vorschauen nicht beschädigt werden, erlaubt AT/SEM die Wiederverwendung der Probe, um weitere Daten anderer ROIs oder mit einer höheren Auflösung zu sammeln.
Die Bildaufnahmezeit ist einer der wichtigsten (und teuersten) Aspekte der 3D-EM und sollte daher bei der Versuchsplanung berücksichtigt werden. Während es nicht verwunderlich ist, dass die Bildgebung großer Bereiche länger dauert als die Abbildung kleiner Bereiche, ist es leicht, die Auswirkungen zu unterschätzen: Abhängig von den ausgewählten Bildgebungsparametern kann die Erfassungszeit für jeden Abschnitt von Sekunden bis Stunden variieren. Zu den kritischen Bildgebungsparametern gehören die Größe des Sichtfelds, die Auflösung und die Verweildauer. Unter der Annahme einer Zielauflösung von 10 nm pro Pixel und einer Verweilzeit von 1 μs dauert die Aufnahme eines Feldes von 20 μm x 20 μm, 100 μm x 100 μm oder 500 μm x500 μm 4 Sekunden, 100 Sekunden oder 2.500 s. Wir können diese Bildgebungszeiten pro Abschnitt mit der Anzahl der Abschnitte multiplizieren, um die zeitliche Zeit zu schätzen, die für den gesamten Bildgebungsauftrag benötigt wird. Lange Bildgebungszeiten pro Schnitt können akzeptabel sein, wenn die Anzahl der Schnitte klein ist oder wenn die Mikroskopwerkzeugzeit nicht von Belang ist.
Es ist jedoch notwendig, die Aufnahmezeit in den meisten Fällen auf einen Übernachtjob oder einen Wochenendjob zu beschränken. Ein ebenso kritischer Aspekt der 3D-EM, der berücksichtigt werden sollte, ist die Menge und Struktur der resultierenden Bilddaten. Die Aufzeichnung der oben genannten Abbildungsfelder in 100 Abschnitten erzeugt 400 MB, 10 GB bzw. 250 GB Bilddaten; Die 500 μm x 500 μm großen Bilder werfen das zusätzliche Problem auf, dass sie jeweils größer als 2 GB sind. Viele der Softwareprogramme, die für die Datenauswertung verwendet werden, können Bilder dieser Größe nicht öffnen.
Um die Bildgebungszeit zu verkürzen, ist es wichtig, die Pixelverweilzeit zu wählen, um die Anforderungen an das Signal-Rausch-Verhältnis für die anschließende Datenauswertung (z. B. Rekonstruktion, Tracing) zu erfüllen und die Aufzeichnungen auf definierte ROIs zu beschränken. Die AT-Erweiterung der Software erleichtert die Bildaufnahme in kleinen Bereichen in seriellen Abschnitten. Die Software unterstützt manuelle und automatische Arbeitsabläufe und viele halbautomatische Varianten: Bildbereiche können manuell positioniert und auf jeden Abschnitt fokussiert werden, oder der Benutzer kann den automatischen Schnittfinder und die Positionsausrichtungsfunktionen verwenden. Abhängig von der gewählten und unterstützten Automatisierungsstufe durch den Probentyp oder die Bildgebungsziele kann die Zeit, die für die Einrichtung der Bildaufnahme in Hunderten von Abschnitten erforderlich ist, einen ganzen Arbeitstag (manuell) oder nur wenige Minuten dauern. Im Prinzip macht es die Array-Tomographie schwieriger als andere 3D-EM-Methoden, kleine ROIs zu erfassen. ungenaue Regionsplatzierungen auf aufeinanderfolgenden Abschnitten müssen durch den Erwerb größerer Flächen kompensiert werden. Wenn der ROI beispielsweise 20 μm x 20 μm groß ist und die Positionsvariabilität der Bildgebungsfelder von Abschnitt zu Schnitt 10 μm beträgt, muss man 40 μm x 40 μm Bilder aufnehmen, um sicherzustellen, dass der ROI in jedem Bild und in jedem Abschnitt vollständig erfasst wird. Die reale Bildpositionsvariabilität reicht von 100 μm bis <10 μm, abhängig von der Verfügbarkeit oder Qualität der Softwarefunktionen für die Positionsausrichtung oder der Geduld des Benutzers. Mit dieser Software können 10 μm ohne zu viel manuellen Eingriff in den meisten Proben erreicht werden.
Wie jede Technik hat der AT mehrere Schwachstellen, die die erfolgreiche Datenerfassung beeinflussen können, und viele ähneln anderen abschnittsbasierten Methoden. Das Fehlen einer homogenen Verteilung von leerem Harz im Vergleich zu Gewebe kann zu gekrümmten oder gebrochenen Arrays führen. Im Extremfall können sich Abschnitte von der Stütze lösen (Abbildung 6A). Variable Kompression oder Dehnung während des Schneidprozesses kann Falten erzeugen, die die Probe in variablen Bereichen auf nachfolgenden Abschnitten stören können (Abbildung 6B). Messerspuren können auf der Oberfläche der gesammelten Abschnitte mit einem beschädigten Messer erscheinen (Abbildung 6C). Unterschiede in den Schnittbedingungen können gelegentliche Querschnittskompression und Dickenunterschiede verursachen. Staub- oder Schmutzpartikel können auf einem Abschnitt landen und die interessierende Zone teilweise verdecken (Abbildung 6D). Die Bildaufnahme kann aufgrund unvollkommener Autokontrast-, Autofokus- und Auto-Stigmator-Funktionen fehlschlagen. Die Positionierung von automatisch erstellten Bildgebungsbereichen kann variabel sein und den ROI möglicherweise nicht in allen Abschnitten erfassen.
Mehrere Probleme können in der Phase des Nähens und Ausrichtens auftreten. Das automatische Nähen von Mosaikfliesenakquisitionen kann beispielsweise aufgrund des großen leeren Raums in der Probe fehlschlagen. Aufgrund einer drastischen Formänderung in 3D können Bildstapel schwierig zu registrieren sein. Speziell entwickelte Programme (z.B. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB oder MAPS-AT) können die halbautomatische Ausrichtung32,38,39,40ermöglichen. Anspruchsvollere Abschnitte können manuell mit einer Fotobearbeitungssoftware ausgerichtet werden. Leider können einige Datensätze möglicherweise nicht korrekt ausgerichtet werden.
Große Proben sind eine Herausforderung für TEM-Serienschnitte, die auf Gitter passen; Auf der anderen Seite rechtfertigen viele Projekte keine lange automatische Erfassung mit FIB/SEM oder SBF-SEM. Der AT ist eine einfache Alternative zu einem mühsamen seriellen Schnitt-TEM, bei dem das Sammeln und Manipulieren von seriellen Abschnitten auf einem Wafer einfacher ist als bei den Slot-Grids. Mehrere Strategien wurden entwickelt, um die Sammlung der Arrays zu erleichtern, und wir teilen unsere Methode, um das bestehende Toolkit zu erweitern. In Fällen, in denen die Identifizierung des ROI eine Herausforderung darstellt, bietet AT-SEM einen grundlegenden Vorteil, nämlich das effiziente Screening der Proben, bei denen eine Auflösung im Organellenmaßstab über 50 bis 500 Abschnitte erforderlich ist. Für größere Volumina können die automatischen Erfassungsstrategien AT effizient gesammelt werden, wenn mehr Abschnitte benötigt werden. AT-Proben können mehrfach neu abgebildet werden, was eine gezielte Abbildung von hochauflösenden Bereichen auf der Grundlage zuvor aufgenommener Übersichtsbilder ermöglicht. Wir glauben, dass die hier vorgeschlagene gezielte Analyse und reduziertes Oversampling durch AT/SEM die Anforderungen an Arbeit und Datenspeicherung verringert. Letztendlich können Sektionsbibliotheken gesammelt und für die spätere Wiederverwendung und Konsultation gepflegt werden. Für die Volumenerfassung bieten FIB- oder SBF-SEM-Ansätze eine hervorragende Lösung, wenn der ROI auf der Blockfläche leicht zu identifizieren ist oder wenn große 3D-Volumina für die Analyse benötigt werden. WENIGER effizient sind FIB/SBF-SEM jedoch, wenn das hochauflösende Stack-Bild aus einem definierten ROI gezielt erhoben werden muss. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgeschlagenen Methoden für das Screening von AT-Proben und die Verwendung von Übersichtsbildern mit mittlerer Auflösung es ermöglichen, die Bildaufnahme auf die relevanten Teile des Abschnittsarrays zu beschränken. Die präzise Ausrichtung von Abbildungsbereichen beschleunigt die Zeit bis zur Dateneingabe und vereinfacht die Datenauswertung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Konzept des AT/SEM zwar nicht neu ist, seine Verwendung jedoch immer noch nicht so weit verbreitet ist, wie seine Vorzüge vermuten lassen. Insgesamt bietet es ein ergänzendes Verfahren zu anderen bestehenden EM-Methoden. AT/REM ist mit den unterschiedlichsten Probenvorbereitungsprotokollen und Bildgebungs-Workflows kompatibel und kann auf jedem FIB/REM- oder SBF-REM-Mikroskop als begleitende Technik durchgeführt werden. In diesem Artikel haben wir uns auf AT konzentriert, um ultrastrukturelle Daten von Proben aufzuzeichnen, die mit anderen Methoden weniger wahrscheinlich erfolgreich behandelt werden. Wir hoffen, dass das beschriebene Verfahren zur bequemen Erfassung von Abschnitten und erheblich automatisierten Akquisitionsstrategien bei den ersten Versuchen für diejenigen, die der Methode noch nie begegnet sind, helfen und dazu beitragen wird, sie für diejenigen, die bereits etwas Erfahrung haben, zu perfektionieren.
Disclosures
Der Autor Tilman Franke ist ein Mitarbeiter von Thermo Fisher, der Elektronenmikroskope und Pilotprogramme herstellt, die in dem Artikel verwendet werden.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern der EM-Einrichtung der Universität Lausanne für ihre Unterstützung bei dieser Entwicklung verschiedener Schritte des AT-Verfahrens. Wir danken Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien und Lindsay Lewellyn für die Gespräche während der Vorbereitung des Manuskripts und der kritischen Lesung. Wir möchten den Gruppen danken, die die Proben zur Demonstration der verschiedenen Szenarien beigetragen haben: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat und Fanny Langlet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting | |||
| AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
| Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
| Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
| Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
| Image acquisition | |||
| FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
| Image analysis | |||
| Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |
References
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Mulcahy, B., et al. A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system. Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. Electron tomography of molecules and cells. Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).
- Hoog, J. L., et al. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
- Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography. Cells. 8 (1), 57 (2019).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Kubota, Y., et al. A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure. Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).
- Wacker, I. U., et al. Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Templier, T. MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy. Elife. 8, 45696 (2019).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb. Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).
- Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
- Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M.
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 25916 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution. Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).
- Maco, B., et al. Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons. PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).
- Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
- Markert, S. M., et al. 3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species. Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).
- Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms. Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).
- Kolotuev, I. Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production. Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).
- Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Daniel, E., et al. Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues. Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).
- Pasquettaz, R., et al. Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma. Journal of Comparative Neurology. , (2020).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
