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Biology

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वॉल्यूम जानकारी के लक्षित अधिग्रहण के लिए सरणी टोमोग्राफी वर्कफ़्लो

Published: July 15, 2021 doi: 10.3791/61847
Automatic Translation
1, 2
1Thermo Fisher, 2Universite de Lausanne

Summary

हम एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में स्वचालित इमेजिंग प्रक्रियाओं के साथ-साथ सरणी टोमोग्राफी नमूनों के रूप में उपयोग के लिए बड़े हस्तांतरण समर्थन पर धारावाहिक वर्गों के रिबन और उनके संग्रह की तैयारी का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल स्थानीय, दुर्लभ घटनाओं की स्क्रीनिंग, पुनर्प्राप्ति और लक्षित इमेजिंग और बड़े डेटा वॉल्यूम के अधिग्रहण की अनुमति देता है।

Abstract

नैनोमीटर संकल्प पर सेलुलर और संरचनात्मक विवरणों की इमेजिंग के लिए जीव विज्ञान और दवा में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लागू की जाती है। ऐतिहासिक रूप से, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) ने सेल अल्ट्रास्ट्रक्चर में अंतर्दृष्टि प्रदान की, लेकिन हाल के दशक में, आधुनिक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) के विकास ने कोशिकाओं के अंदर देखने का तरीका बदल दिया है। हालांकि TEM के संकल्प बेहतर है जब प्रोटीन स्तर संरचनात्मक विवरण की जरूरत है, SEM-संकल्प ऑर्गेनेल स्तर के सेल जीव विज्ञान से संबंधित सवालों के बहुमत के लिए पर्याप्त है । प्रौद्योगिकी में उन्नति ने सीरियल ब्लॉक-फेस इमेजिंग (एसबीएफ-एसईएम) और फोकस्ड आयन बीम एसईएम (एफईबी-एसईएम) जैसे स्वचालित वॉल्यूम अधिग्रहण समाधानों को सक्षम किया। फिर भी, इस दिन के लिए, इन तरीकों अक्षम रहते है जब पहचान और ब्याज के क्षेत्रों के लिए नेविगेशन महत्वपूर्ण हैं । इमेजिंग से पहले लक्षित क्षेत्रों के सटीक स्थानीयकरण के साधनों के बिना, ऑपरेटरों को (एसबीएफ-एसईएम में) की आवश्यकता से अधिक डेटा प्राप्त करने की आवश्यकता होती है, या इससे भी बदतर, कई ग्रिड तैयार करते हैं और उन सभी (TEM में) छवि बनाते हैं। हम एसईएम में सरणी टोमोग्राफी का उपयोग करके "पार्श्व स्क्रीनिंग" की रणनीति का प्रस्ताव करते हैं, जो ब्याज के क्षेत्रों के स्थानीयकरण की सुविधा प्रदान करता है, जिसके बाद कुल नमूना मात्रा के प्रासंगिक अंश की स्वचालित इमेजिंग होती है। इमेजिंग के दौरान सरणी टोमोग्राफी नमूनों को संरक्षित किया जाता है, और उन्हें बार-बार इमेजिंग के लिए तैयार अनुभाग पुस्तकालयों में व्यवस्थित किया जा सकता है। कई उदाहरण दिखाए जाते हैं जिनमें पार्श्व स्क्रीनिंग हमें संरचनात्मक विवरणों का विश्लेषण करने में सक्षम बनाती है जो किसी अन्य विधि के साथ उपयोग करने के लिए अविश्वसनीय रूप से चुनौतीपूर्ण हैं।

Introduction

EM से संबंधित तकनीकों के महत्व के बावजूद, उन्हें महारत हासिल करने के लिए आवश्यक प्रयास पूरे क्षेत्र विशेषज्ञों की एक छोटी संख्या तक ही सीमित रहता है । एक महत्वपूर्ण कठिनाई EM के लिए संरक्षित नमूनों में ब्याज के एक क्षेत्र (आरओआई) की पहचान और पुनर्प्राप्ति है। ऑप्टिक माइक्रोस्कोपी द्वारा और ईएम अवलोकन के लिए प्रसंस्करण के बाद विश्लेषण किए जाने पर एक ही नमूने की उपस्थिति काफी अलग होती है। रासायनिक रूप से तैयार नमूनों के लिए परिवर्तन निर्जलीकरण चरणों के बाद एनिसोट्रोपिक नमूना सिकुड़न (प्रत्येक आयाम में ~ 10%) और निर्धारण और धुंधला प्रोटोकॉल(चित्रा 1A)में ऑस्मियम का उपयोग करते समय फ्लोरेसेंस की हानि शामिल है। अल्ट्राथिन सेक्शनिंग के लिए, नमूने विभिन्न रणनीतियों(चित्रा 1B)का उपयोग करके एपॉक्सी या एक्रेलिक रेजिन में एम्बेडेड होते हैं। इस तैयारी के सफल परिणामों के लिए, पूरे नमूने को टुकड़ों में विभाजित किया जाना चाहिए जो 1 मिमी x 1 मिमी से अधिक नहीं हैं। मानक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) अवलोकन शर्तों की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, नमूने के इस छोटे से हिस्से को आगे 50-150 एनएम मोटी स्लाइस तक विभाजित किया जाता है। परिणामस्वरूप ग्रेस्केल छवियां किसी भी अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक(चित्रा 1C)की तुलना में अधिक विस्तार से पूरे नमूने के एक मिनट के अंश के ऊतक संगठन और ऑर्गेनेल संरचना दिखाती हैं। एक विशिष्ट TEM डेटासेट कोशिकाओं और ऊतकों में 3डी स्थान में स्वाभाविक रूप से होने वाली प्रक्रियाओं को समझने के लिए सैद्धांतिक रूप से एक्सपेरिमेंट किया गया 2D जानकारी प्रदान करता है। चित्रा 1D अल्ट्रास्ट्रक्चरल वॉल्यूम अधिग्रहण की चुनौती प्रस्तुत करता है: यदि 50 एनएम मोटाई पर पक्ष 1,000 माइक्रोन का घन अनुभागित किया जाता है, तो पूरे वॉल्यूम को कवर करने के लिए 20,000 वर्गों की आवश्यकता होगी; एक 500 माइक्रोन साइड क्यूब के लिए, यह 10,000 वर्गों होगा। 50 माइक्रोन x 50 माइक्रोन x 50 माइक्रोन वॉल्यूम को कवर करने के लिए, 1,000 अनुभाग "केवल" आवश्यक हो सकते हैं। इस मात्रा को मैन्युअल रूप से प्राप्त करना व्यावहारिक रूप से असंभव है और स्वचालन के साथ प्रदर्शन करना बेहद चुनौतीपूर्ण है। यदि, नमूना गहराई के अलावा, हमें ऐसे काल्पनिक क्यूब्स की पूरी सतह को कवर करने की आवश्यकता है, तो उचित संकल्प पर 1 माइक्रोन2 सतह का कवरेज एक गंभीर रसद मुद्दा(चित्रा 1E) बन जाता है। जबकि असाधारण बड़े पैमाने पर परियोजनाओं के लिए, जैसे कनेक्टोमिक्स दृष्टिकोण, बड़ी संख्या में वर्ग महत्वपूर्ण हैं, अधिकांश "सांसारिक" ईएम परियोजनाओं के लिए, अवलोकन के लिए आवश्यक अधिक वर्गों का उत्पादन एक महत्वपूर्ण नुकसान प्रस्तुत करता है।

3डी अल्ट्रास्ट्रक्चरल जानकारी प्राप्त करने के लिए कई तरीके हैं: सीरियल सेक्शनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टेम), टेम टोमोग्राफी, ऐरे टोमोग्राफी (एटी), सीरियल ब्लॉक फेस इमेजिंग स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम), और फोकस्ड आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (FIB-SEM)। इन तरीकों के बीच मुख्य अंतर खंड रणनीति है और क्या छवि अधिग्रहण धारा पीढ़ी1के साथ मिलकर है । सीरियल सेक्शनिंग टेम में, स्लॉट ग्रिड पर अनुक्रमिक खंड एकत्र किए जाते हैं, तेम छवियां इन दृश्यों से उत्पन्न होती हैं और2,3,4,5गठबंधन होती हैं। टेम टोमोग्राफी में, ग्रिड पर 150-300 एनएम वर्गों से झुकाव श्रृंखला, और जब धारावाहिक अनुभागिंग के साथ मिलकर, एक बहुत ही उच्च संकल्प प्रदान करते हैं, हालांकि अपेक्षाकृत छोटी मात्रा6,7,8। एटी दृष्टिकोण अपेक्षाकृत बड़े समर्थन पर अनुभागों के विविध मैनुअल और अर्ध-स्वचालित शिष्टाचार के साथ भौतिक अनुभागिंग का उपयोग करता है, जैसे ग्लास कवरलिप, सिलिकॉन वेफर्स या एक विशेष टेप। छवि अधिग्रहण के लिए, एसईएम में समर्थन का विश्लेषण किया जाता है, विविध छवि अधिग्रहण रणनीतियों के साथ9,10, 11,12,13,14, 15 उपलब्ध हैं। एसबीएफ-एसईएम के लिए, एसईएम चैंबर के अंदर सीधे सेट एक हीरे के चाकू के साथ एक मिनी-माइक्रोटॉम का उपयोग करके भौतिक खंड प्राप्त किया जाता है, जिसमेंराल ब्लॉक16, 17, 18,19की सतह से उत्पन्न एसईएम छवि होती है। FIB-SEM के लिए, आयन स्रोत नमूने की पतली परतों को हटा देता है, जिसके बाद एसईएम20, 21द्वारा उजागर सतह की स्वचालित इमेजिंग होती है। TEM-टोमोग्राफी और एटी भौतिक वर्गों को उत्पन्न करता है, जिसे आवश्यक होने पर फिर से इमेज किया जा सकता है, जबकि एफएसबीएफ-एसईएम और एफआईबी-एसईएम इमेजिंग के बाद अनुभाग को खत्म करते हैं। मल्टी-बीम एसईएम द्वारा इमेज किए गए भौतिक वर्गों का हाल ही में संयोजन उन तरीकों का संयोजन प्रदान करता है जो छवि अधिग्रहण22की गति के "अड़चन" मुद्दे को हल करते हैं। इन तकनीकों में से प्रत्येक जिस तरह से EM डेटा प्राप्त किया जा सकता है और विश्लेषण में क्रांतिकारी बदलाव आया है, और प्रत्येक दृष्टिकोण अपने व्यावहारिक एक दिए गए अनुसंधान सवाल से संबंधित प्रभावों है ।

तैयारी की प्रकृति और अल्ट्रास्ट्रक्चरल आयामों के पैमाने को देखते हुए, यह भविष्यवाणी करना सीधा नहीं है कि नमूना ब्लॉक(Figure1D,E)में एक विशिष्ट लक्ष्य संरचना कहां स्थित है। आरओआई स्थानीयकरण के लिए एक समाधान शुरू से ही वांछित संकल्प पर पूरे ब्लॉक से छवियों को रिकॉर्ड कर रहा है। ब्याज की संरचनाएं माइक्रोस्कोप से दूर होने पर अधिग्रहीत डेटा वॉल्यूम में हो सकती हैं। अधिग्रहण समय और इस रणनीति से जुड़े डेटा हैंडलिंग समस्याग्रस्त हैं। रिकॉर्ड किए गए डेटा की मात्रा को कम करना वांछनीय है, खासकर यदि आरओआई ऊतक ब्लॉक की तुलना में बहुत छोटे हैं, यानी, यदि ब्याज की वस्तुएं विशिष्ट प्रकार की कोशिकाएं हैं (पूरे अंग नहीं)। एक ही नमूने 23 , 24 , 25 , 26 ,27 , 28 , 28,29केभीतर तैयार होने से पहले या बाद में फ्लोरेसेंस को संरक्षित और स्थानीयकृत किए जाने पर विभिन्न सहसंबद्ध प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक (पीएनएम) सफल हो सकती हैं । फिर भी, कई सेलुलर संरचनाएं केवल ज्ञात अल्ट्रास्ट्रक्चर के आधार पर फ्लोरेसेंस सहसंबंध के बिना भी पहचानने योग्य हैं। इन मामलों के लिए, हमारा मानना है कि पार्श्व स्क्रीनिंग ऐरे टोमोग्राफी आरओआई स्थानीयकरण और अल्ट्रास्ट्रस्ट्रक्चरल सूचना गुणवत्ता में निवेश किए गए प्रयास के बीच एक संतुलन ट्रेडऑफ प्रदान करता है। इस रणनीति का उपयोग करके, वेफर पर अनुभागों के एक उप-सेट को नियमित अंतराल के भीतर जांचा जाता है, जिसे आरओआई के आकार और प्रकृति के आधार पर स्थापित किया जा सकता है। एक बार ROIs मिल जाने के बाद, डेटा अधिग्रहण को एंकर अनुभाग के बाद शुरू होने और समाप्त होने वाले अनुभागों की एक सतत श्रृंखला में स्थापित किया जाता है, जो संबंधित जानकारी को लक्षित तरीके से एकत्र करता है।

हम उस समय के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो कई वर्गों में क्षेत्रों या रुचि की घटनाओं के अधिग्रहण को सरल और तेज करता है और बेहतर-गठबंधन छवि मात्रा प्राप्त करता है। पार्श्व स्क्रीनिंग और मल्टीस्टेप अधिग्रहण ठीक लक्षित क्षेत्रों में बहुत उच्च संकल्प के साथ डेटा का उत्पादन करते हैं । हम जिस प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, वह 3D EM डेटा अधिग्रहण की कई चुनौतियों का वर्णन करती है, जैसा कि यह प्रदान करता है: नमूना तैयारी वर्कफ़्लो को मौलिक रूप से बदले बिना नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ अनुकूलता; खंड और एसईएम अधिग्रहण के लिए लक्षित स्थानीयकरण; सेटअप के दौरान कम समय और प्रयास; परिणामस्वरूप मात्रा के बेहतर संरेखण के साथ कई वर्गों में क्षेत्रों की इमेजिंग; और एक सिले मोज़ेक चित्र में विभिन्न छवियों को संकलित करने के लिए एक चिकनी सिलाई और संरेखण प्रक्रिया। हम प्रकाशित और चल रहे परियोजनाओं से कई नमूनों के साथ हमारी विधि की ताकत प्रदर्शित करने के लिए चुना है । हमारा मानना है कि यह दृष्टिकोण सीमित ईएम अनुभव वाले जांचकर्ताओं के लिए भी लक्षित ईएम डेटा की पीढ़ी और अधिग्रहण को काफी हद तक सुविधाजनक बना सकता है।

Protocol

नोट: नमूना तैयार करने के तरीकों को कहीं और14,30,31वर्णित किया गया है, और इस प्रकाशन में शामिल नहीं हैं। संक्षेप में, दिखाए गए उदाहरणों को ग्लूटारल्डिहाइड के साथ रासायनिक रूप से तय किया गया था, 1% ओसो4के साथ पोस्ट-फिक्स्ड, फिर एम्बेड राल में एम्बेड करने से पहले 1% जलीय यूरेसिल एसीटेट के साथ इलाज किया गया। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को उच्च दबाव ठंड का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है, एसीटोन में 0.1% यूरेसिल एसीटेट के साथ प्रतिस्थापित फ्रीज, और एक्रेलिक राल में एम्बेडेड। नमूना ब्लॉक एक फ्लैट एम्बेडिंग विधि का उपयोग करके तैयार किए गए थे जो नमूने के स्पष्ट दृश्य की अनुमति देता है, जिससे सेक्शनिंग(चित्रा 1B)के लिए इसके अभिविन्यास को सुविधाजनक बनाया जाता है।

1. सरणी उत्पादन प्रक्रिया

  1. एम्बेडेड नमूना अभिविन्यास और ट्रिमिंग
    1. दूरबीन/माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, रेजर ब्लेड के साथ ब्लॉक की सतह को हल्के से खरोंच करके एम्बेडेड ब्लॉक सतह पर आरओआई की पहचान और चिह्नित करें। यह अल्ट्रामाइक्रोटोम के अंदर नमूने को उन्मुख करने में मदद करेगा और खंडित सतह को कम करेगा।
    2. अल्ट्रामाइक्रोटोम धारक(चित्रा 2 ए)पर नमूना क्लैंप करना।
    3. नमूने के चारों ओर राल ट्रिम करें, पहले रेजर ब्लेड (रफ ट्रिमिंग) के साथ और डायमंड ट्रिमिंग टूल (ठीक ट्रिमिंग) के साथ जारी रखें; चित्रा 2A)। यह सुनिश्चित करने के लिए 20 डिग्री या 90 डिग्री किनारे झुकाव के साथ चाकू का उपयोग करें कि ब्लॉक की ऊपर और नीचे की सतहें चाकू के अत्याधुनिक के समानांतर हैं।
      नोट: यह कदम धारावाहिक अनुभागिंग और सीधे रिबन के अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण है।
    4. 3:1 अनुपात में जाइलीन और गोंद मिलाएं। टूथपिक से जुड़ी एक बरौनी के साथ, इस मिश्रण को छंटनी किए गए ब्लॉक के ऊपर और नीचे के किनारों पर लागू करें। इसे अच्छी तरह सूखने दें।
  2. सरणी माउंटिंग सपोर्ट ए (यानी सिलिकॉन वेफर्स) तैयार करें।
    1. परियोजना लक्ष्य के लिए अपने आकार को समायोजित करते हुए, एक वेफर क्लीविंग टूल (ईएमएस) का उपयोग करके वेफर टुकड़ा काटें। 2 सेमी x 4 सेमी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों दोनों के लिए सुविधाजनक है।
    2. मलबे से निजात पाने के लिए आसुत पानी में वेफर को साफ करें।
    3. ग्लो डिस्चार्ज/प्लाज्मा मानक उपकरणों का उपयोग करके सतह को साफ करता है। सटीक पैरामीटर इस्तेमाल की गई मशीन पर निर्भर करेंगे। ग्रिड निर्वहन के लिए मापदंडों के साथ शुरू करें और अनुभवजन्य रूप से समय को समायोजित करें। यह कदम समर्थन पर वर्गों के एक अच्छे प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि वर्गों सूख रहे है और नहीं छोड़ा जाना चाहिए ।
  3. व्यूज बढ़ते सपोर्ट बी (यानी ग्लास कवरस्लिप) तैयार करें
    1. यदि मल्टीप्लेक्स इम्यूनो-लेबलिंग प्रयोगों की योजना बना रहे हैं, तो फ्लोरेसेंस सिग्नल का बेहतर पता लगाने के लिए नमूनों को कवरलिप पर स्थानांतरित करें। कवरलिप चिपकने की क्षमता में सुधार करने के लिए, एक विस्तृत जिलेटिन-कोटिंग प्रक्रिया का उपयोग पहले9वर्णित है।
    2. वाष्पीकरण द्वारा इंडियम-टिन-ऑक्साइड (आईटीओ) या सोने के साथ स्लाइड को लेप करके चालकता बढ़ाएं। तैयार कवर्लिप्स को साफ-सुथरे वातावरण में रखें। ग्लो 1.2.3 में वर्णित नमूनों का निर्वहन करें।

2. नमूने की धारा

  1. चाकू की तैयारी में
    नोट: सरणी उत्पन्न करने के लिए, लंबे रिबन के अधिग्रहण को सुविधाजनक बनाने के लिए डिज़ाइन किए गए एक संशोधित चाकू (एटीएस) का उपयोग करें। हिस्टो-जंबो चाकू या इसी तरह के बड़े समर्थन पर वर्गों की पीढ़ी के लिए कल्पना चाकू के रूप में अच्छी तरह से खंड में के लिए सेवा कर सकते हैं ।
    1. झागदार चिपचिपा टेप का उपयोग कर चाकू के नीचे सुई संलग्न करें और इसेछेदना (चित्रा 2B)। एटीएस चाकू को अल्ट्रामाइक्रोटोम होल्डर में 0 डिग्री पर रखें। मानक प्रक्रिया का उपयोग कर ब्लॉक सतह के समानांतर चाकू के किनारे को समायोजित करें।
    2. खंड के लिए तैयार स्थिति में चाकू के किनारे पर छंटनी ब्लॉक लाओ।
    3. चाकू बेसिन के अंदर वेफर/कवरलिप रखें और इसे पानी से चाकू की धार के समान स्तर तक भरें । चाकू के हीरे के किनारे को ठीक से आर्द्र होने दें और यदि आवश्यक हो, तो संलग्न सिरिंज(चित्रा 2 सी)का उपयोग करके पानी वापस लें।
  2. सरणी अनुभाग और स्थानांतरण
    1. वांछित काटने के मापदंडों के लिए माइक्रोटॉम सेट करें। एटीएस चाकू के साथ, 50-100 एनएम की सीमा और 0.6-1 मिमी की कटिंग स्पीड की सलाह दी जाती है। सेक्शनिंग शुरू करें(चित्रा 2Di)।
    2. लंबाई का एक रिबन प्राप्त करें जो एक लक्षित जेड-वॉल्यूम को कवर करेगा और संग्रह को रोक देगा। ब्लॉक आकार, ऊतक की एकरूपता, और राल के प्रकार के आधार पर, रिबन अपेक्षाकृत सीधे होगा(चित्रा 2D-ii)। कई नमूनों सीधे रिबन का उत्पादन नहीं होगा, निवेश के प्रयास के बावजूद और चाकू के प्रकार का उपयोग किया जाता है ।
    3. अंतिम लक्ष्य के आधार पर, एक लंबे या कई छोटे रिबन को साथ-साथ गठबंधन करें। 2 सेमी x 4 सेमी समर्थन आसानी से 100 से 1,000 वर्गों को पकड़ सकता है। समर्थन कदम पर रिबन की व्यवस्था एक कदम है कि निपुणता और स्थिर हाथों की आवश्यकता है । हालांकि, इस कौशल के लिए सीखने की अवस्था तेजी से हासिल की है।
    4. टूथपिक(चित्रा 2Diii)पर चिपके एक बरौनी के एक साफ, गैर चिपचिपा टिप का उपयोग कर चाकू किनारे से रिबन अलग ।
    5. बरौनी का उपयोग करके, धीरे-धीरे रिबन को समर्थन माध्यम के केंद्र से ऊपर ले जाएं। इस बिंदु पर, यदि आवश्यक हो तो वर्गों को खींचने के लिए क्लोरोफॉर्म या हीटिंग पेन का उपयोग करें। हालांकि, याद रखें कि यह हेरफेर रिबन तोड़ने और विरूपण को प्रेरित कर सकता है।
    6. सिरिंज खींचकर पानी की निकासी शुरू करें। अधिक नाजुक रिबन या धीमी पानी के पीछे हटने के लिए, नली से सिरिंज को अलग करके पानी को ड्रिप करें। जब जल स्तर वेफर स्तर तक कम हो रहा है, तो रिबन को नियंत्रित करें और यदि आवश्यक हो तो इसे फिर से स्थान दें, धीरे-धीरे रिबन को केंद्र में धकेलकर। वेफर सतह पर रिबन को व्यवस्थित करने के बाद, जब तक शेष पानी बेसिन से पूरी तरह से मुकर न जाए तब तक सूखा जारी रखें।
      नोट: यदि नीचे पानी पीछे हटना एटीएस चाकू का उपयोग नहीं कर रहा है, तो ध्यान से एटीएस चाकू के किनारों से पानी को कम करने के लिए अशांति प्रेरित नहीं है ।
    7. स्नान के अंदर समर्थन पर वर्गों को छोड़ दें ताकि पूरी तरह से सूख जाएं। समर्थन और पर्यावरणीय आर्द्रता के स्तर की हाइड्रोफोबसिटी के आधार पर, पानी एक अलग दर(चित्रा 2Div)पर वाष्पित हो जाएगा। नमूना को कम करने या पूरी तरह से नमूने पर सभी सिलवटों से बचने के लिए धीरे-धीरे सूखने देना महत्वपूर्ण है।
    8. गंदगी संदूषण से बचाने के लिए सूखे नमूने को कसकर बंद बॉक्स में स्थानांतरित करें और इसे कम से कम 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें। यदि आवश्यक हो, तो समग्र विपरीत को बढ़ाने के लिए भारी धातुओं का उपयोग करके अनुभागों का मुकाबला करें।
    9. प्रक्रिया के अंत में, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए चाकू को सावधानी से साफ करें
      नोट: स्लॉट ग्रिड (चित्रा2F)पर स्थानांतरण की तुलना में वेफर(चित्रा 2E)पर कई या धारावाहिक अनुभागों का हस्तांतरण ईएम तैयारी अनुभव को पूरी तरह से बदल देता है। एकल समर्थन पर अनुभागों की निर्बाध धारा और संग्रह धारावाहिक अनुभागिंग में अक्सर अनुभागिंग और अनुभाग संग्रह से संबंधित गलतियों की मात्रा को कम कर देता है। एक वेफर पर एकत्र 1000 माइक्रोन एक्स 500 माइक्रोन के 100 वर्गों के बराबर 33 स्लॉट ग्रिड(चित्रा 2G)से मेल खाती है।

3. नमूना अवलोकन

नोट: यह अनुभाग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके लागू किए गए कार्यप्रवाह चरणों का वर्णन करता है। सही डिटेक्टरों से लैस किसी भी एसईएम पर किसी भी छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि, विशिष्ट उपयोगकर्ता क्रियाएं अलग होंगी और अक्सर अधिक मैनुअल होंगी।

  1. एसईएम छवियों का अवलोकन मानचित्र प्राप्त करें जो वेफर पर अनुभाग स्थानों का पता चलता है। एक अंतर्निहित ऑप्टिकल कैमरा छवि एक एसईएम छवि मोज़ेक को परिभाषित करने में मदद करती है जो वर्गों या सभी वर्गों के रिबन को कवर करती है। क्लिक द्वारा पच्चीकारी बनाएं-नमूने के कैमरे की छवि पर माउस के साथ खींचें और स्वचालित अधिग्रहण शुरू करते हैं।
    नोट: बहुत मोटे इमेजिंग सेटिंग्स, यानी, 1-2 माइक्रोन पिक्सल आकार और 1 माइक्रोन पर्याप्त समय रहता है । इस प्रक्रिया को अनुपूरक सामग्री (पृष्ठ 2-7) में दर्शाया गया है।
  2. सेक्शन फाइंडर ऑटो डिटेक्शन फ़ंक्शन के साथ अनुभागों का पता लगाएं या उन्हें मैन्युअल रूप से ढूंढें। छवि मिलान के आधार पर इस सॉफ़्टवेयर के साथ अनुभाग की स्थिति और रूपरेखा स्वचालित रूप से प्राप्त की जाती है। इस प्रक्रिया के चित्रण के लिए, पूरक सामग्री (पृष्ठ 8 - 15) देखें।
  3. यदि अवलोकन छवियां आरओआई स्पष्ट रूप से नहीं दिखाती हैं, तो अनुभागों की उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियां प्राप्त करें। छवियों को स्वचालित रूप से बनाने और प्राप्त करने के लिए अनुभाग पूर्वावलोकन फ़ंक्शन का उपयोग करें. इस प्रक्रिया को अनुपूरक सामग्री,पृष्ठ 16-18 में दर्शाया गया है। इमेजिंग सेटिंग्स को आरओआई की प्रकृति और आकार के अनुसार चुना जाना चाहिए जिसे उपयोगकर्ता खोजता है।
    1. इष्टतम सेटिंग्स खोजने के लिए, माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में लाइव इमेजिंग को सक्रिय करें और एक आरओआई पर नेविगेट करें। इमेजिंग सेटिंग्स को तब तक बदलें जब तक छवियां आरओआई स्पष्ट रूप से नहीं दिखाती हैं, लेकिन छवि अधिग्रहण अत्यधिक लंबा नहीं है।
  4. इमेजिंग क्षेत्रों को परिभाषित करें
    नोट: कई अलग-अलग रणनीतियां प्रस्तावित हैं।
    1. यदि केवल कुछ वर्गों को इमेज करने की आवश्यकता है, तो प्रासंगिक वर्गों में नेविगेट करने के लिए अब तक बनाए गए अनुभागों की छवियों का उपयोग करें और ज़ूमेबल दर्शक का उपयोग करें जो सभी वर्गों को देखने के लिए अपने मूल सापेक्ष स्थानों में सभी अधिग्रहीत छवियों को दिखाता है। एक बार जब एक अनुभाग पाया जाता है कि उच्च संकल्प पर छवि होनी चाहिए, क्लिक-खींचें के साथ एक इमेजिंग क्षेत्र बनाएं । हाई रेजोल्यूशन इमेजिंग सेटिंग्स चुनें और सेटिंग्स को टेंपरेचर में स्टोर करें। आगे के वर्गों के लिए इस टेम्पलेट का फिर से उपयोग करें।
    2. दुर्लभ घटनाओं का पता लगाने के लिए विशेष रूप से छोटे या कठिन खोजने के लिए, पार्श्व स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का उपयोग करें। मैन्युअल रूप से हर दसवें खंड पर या रिबन प्रति एक खंड पर उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग सेटिंग्स के साथ एक इमेजिंग क्षेत्र बनाएं और छवियों को प्राप्त करें। उन छवियों और चिह्नित अनुभागों की समीक्षा करें जिनमें सॉफ्टवेयर में आरओआई होते हैं या नोट लेते हैं।
      1. आरओआई वाले वर्गों से शुरू होकर, अनुभाग सेट के माध्यम से आगे और पीछे नेविगेट करें और जब तक संरचना अनुभाग में अभी भी दिखाई देती है, तब तक उसी सापेक्ष स्थानों में उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग क्षेत्र बनाएं। यह मैन्युअल रूप से या अगले चरणों में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके किया जा सकता है।
    3. लगातार दस से अधिक खंडों में छवियों को प्राप्त करें। मैनुअल में वर्णित पंजीकृत अनुभाग स्थानों की सटीकता बढ़ाने के लिए छवि को ज़ूम करने के बाद स्टार्ट पोजीशन रिफाइनमेंट पर क्लिक करें। ऐसा करने से इमेज सीरीज की स्थिति परिवर्तनशीलता कम हो जाती है। प्रक्रिया को 19-21 अनुपूरक सामग्री पृष्ठों में दर्शाया और समझाया गया है।
    4. ऑल्ट कुंजी को नीचे रखते हुए इमेजिंग क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए किसी भी अनुभाग पर क्लिक-ड्रैग करें और माउस बटन जारी होने पर खुलने वाले संदर्भ मेनू से क्रियमेंट टाइल सेट ऐरे चुनें। इसके बाद सॉफ्टवेयर उन सभी वर्गों में एक ही सापेक्ष स्थान में इमेजिंग क्षेत्र बनाता है जो पहले पाए गए हैं या चिह्नित किए गए हैं। सेक्शन स्पैन स्लाइडर के साथ इमेजिंग को अनुभाग की एक विशिष्ट श्रृंखला तक सीमित करना संभव है।
      नोट: इस प्रक्रिया को इमेजिंग क्षेत्रों के किसी भी संख्या के साथ दोहराया जा सकता है और इसलिए प्रत्येक खंड पर एक बड़ी छवि रिकॉर्ड करने के बजाय कई छोटे उच्च संकल्प छवियों को रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है।
    5. एक बार बनाए जाने के बाद, प्रत्येक इमेज सीरीज में पिक्सेल काउंट, पिक्सल साइज, टाइलिंग लेआउट, पिक्सल थवेल टाइम आदि सेट करें । एक बार इमेजिंग श्रृंखला बनाई और स्थापित कर रहे हैं, वे सब एक नौकरी क्यू में सूचीबद्ध हैं ।
  5. कॉन्फ़िगर ऑटो कार्य और छवि अधिग्रहण शुरू
    1. पिछले चरण में वर्णन के रूप में एक ही विधि का उपयोग कर ऑटो कार्यों के लिए एक अलग छवि श्रृंखला बनाएं। छवि श्रृंखला को उस अनुभाग पर एक स्थिति में ले जाएं जिसमें उच्च-विपरीत संरचनाएं हैं।
    2. इमेज सीरीज को 1024 x 884 पिक्सल पर सेट करें और पिछले स्टेप्स में सेट किए गए इमेज सीरीज में इस्तेमाल किए गए सबसे ज्यादा रेजोल्यूशन के अनुरूप पिक्सेल साइज चुनें । ऑटो कार्यों की सूची में, ऑटो फोकस और ऑटो कलंककी जांच करें ।
    3. अधिग्रहण अनुक्रम नियंत्रण में अनुभाग द्वारा चुनें और सुनिश्चित करें कि ऑटो कार्य छवि सूची में पहला आइटम है। जॉब क्यू के बगल में रन बटन पर क्लिक करके इमेज एक्विजिशन शुरू करें। इन प्रक्रियाओं को अनुपूरक सामग्री,पृष्ठ 22-23 में दर्शाया गया है।
      नोट: प्रत्येक अनुभाग पर मैन्युअल रूप से पूर्व-ध्यान केंद्रित करना आवश्यक नहीं है। रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान, जब भी माइक्रोस्कोप एक नए अनुभाग में आगे बढ़ता है, तो इस अनुभाग में अन्य सभी छवियों को दर्ज करने से पहले ऑटो कार्यों को निष्पादित किया जाएगा।

4. डेटा अलाइनमेंट और विश्लेषण

  1. डेटा निर्यात
    1. सुनिश्चित करें कि डेटा .tif प्रारूप में सहेजा गया है, इसलिए एक समर्पित निर्यात समारोह की कोई आवश्यकता नहीं है। डेटा को एक फ़ोल्डर संरचना में सॉर्ट करें जो परतों और परतों के पेड़ में तत्वों से सीधे मेल खाती है।
    2. एक बार छवि मोज़ेक रिकॉर्ड हो जाने के बाद, सभी टाइल्स को स्वचालित रूप से सिलाई करने के लिए स्टिचऑल फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  2. फिजी में स्टैक अलाइनमेंट और क्रॉपिंग
    नोट। कई सॉफ्टवेयर पैकेज (मुफ्त और वाणिज्यिक) सरणी टोमोग्राफी डेटा के साथ काम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। नीचे दिए गए चरणों को ओपन-सोर्स प्रोग्राम फिजी32 के साथ दिखाया गया है क्योंकि यह व्यापक रूप से उपलब्ध है और इसमें सभी आवश्यक कार्य शामिल हैं।
    1. एक आभासी ढेर के रूप में फिजी में छवियों (या सिले छवियों) के ढेर का आयात करें।
    2. यदि इसके विपरीत/चमक को सामान्यीकृत करने की आवश्यकता है, तो बढ़ी हुई कंट्रास्टचुनें ... प्रक्रिया मेनू से। संतृप्त पिक्सेल को 0.1 या उससे कम सेट करें, और सभी स्लाइस की प्रक्रियाकी जांच करें।
    3. प्लगइन्स मेनू से, पंजीकरण | चुनें सिफ्ट के साथ रैखिक स्टैक अलाइनमेंट।
    4. अपेक्षित परिवर्तन ड्रॉप-डाउन मेनू से कठोर या एफ़िन चुनें। अन्यथा, डिफ़ॉल्ट सेटिंग रखें। ओकेपर क्लिक करके अलाइनमेंट शुरू करें ।
      नोट: वर्चुअल स्टैक के रूप में डेटा लोड करने से फिजी को किसी भी आकार के ढेर को संभालने की अनुमति देता है। संरेखण का आउटपुट रैम में बनाया गया है; हालांकि, यह स्टैक के अधिकतम आकार को सीमित कर सकता है जिसे संसाधित किया जा सकता है। उस स्थिति में, रजिस्टर वर्चुअल स्टैक स्लाइसका उपयोग करें, जो एक ही पंजीकरण एल्गोरिदम का फ़ोल्डर-टू-फ़ोल्डर कार्यान्वयन है। एक बार पंजीकरण पूरा हो जाने के बाद, आउटपुट डेटा को वर्चुअल स्टैक के रूप में लोड करें।
    5. फसल पर क्लिक करके छवि स्टैक को क्रॉप करें ताकि इसमें केवल आरओआई हो।
    6. ढेर को एक .tif छवि या .tif छवियों की श्रृंखला के रूप में सहेजें।
      नोट: सरणी टोमोग्राफी के महत्वपूर्ण कदम चित्र 3में दिखाए गए हैं ।

Representative Results

नीचे दिए गए उदाहरणों का उद्देश्य अनुशंसित कार्यप्रवाहों की बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करना है। केस स्टडी के दृष्टांत ऐसी परियोजनाएं हैं जिनके लिए हमें किसी भी अन्य तकनीक के साथ संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने में कठिनाई होती थी। हमने ड्रोसोफिला वयस्क को विशिष्ट चुनौतियों का वर्णन करने के लिए चुना जो कई प्रकार के नमूनों के साथ सामना कर सकते हैं। क्रॉस-सेक्शन में लगभग 6 मिमी लंबे, 500-1000 माइक्रोन का यह ट्यूबलर अंग, एक अद्वितीय कार्य और सेलुलर संरचना(चित्र 4 ए)33के साथ विभिन्न क्षेत्रों में विभाजित है। सेक्शनिंग ओरिएंटेशन के आधार पर, आंत प्रोफाइल के आयाम और अनुभाग पर इसकी उपस्थिति भिन्न होती है। या तो पारदर्शी या देशांतर केंद्रित अनुभाग अपेक्षाकृत बड़े होते हैं, और केवल एक जोड़े को एक ही TEM ग्रिड(चित्रा 2F)पर रखा जा सकता है। केवल ऊतक के एक छोटे से हिस्से को एफआईबी में चित्रित किया जा सकता है, और एसबीएफ-एसईएम के लिए, कठिनाई किसी भी गैर-सजातीय नमूनों के समान है। AT ऐसे नमूनों के विश्लेषण के लिए एक कुशल ट्रेडऑफ प्रदान करता है और फ्लैट एम्बेडिंग आरओआई स्थानीयकरण की सुविधा प्रदान करता है। चयनित क्षेत्र(चित्रा 4B)के आसपास राल की अधिकता को सावधानीपूर्वक ट्रिम करना संबंधित क्षेत्र(चित्रा 4 C)से सरणी के कुशल संग्रह के लिए महत्वपूर्ण है। सैकड़ों अनुभागों को क्रमिक रूप से या बेतरतीब ढंग से(चित्रा 4D)पर एकत्र किया जा सकता है। अनुसंधान प्रश्न के आधार पर, नमूना स्क्रीनिंग और अधिग्रहण के लिए एक अलग रणनीति की आवश्यकता होगी, जिसे हम मनमाने ढंग से कई परिदृश्यों में विभाजित करते हैं। विभिन्न प्रस्तुत परिदृश्यों को अधिक लक्षित तरीके से चित्रित करने के लिए, हमने विभिन्न शोध परियोजना से कई केस अध्ययनों को चुना।

कई बेतरतीब ढंग से वितरित बड़ी संरचनाओं का विश्लेषण 1-10 माइक्रोन रेंज(चित्रा 4E)
अक्सर, अल्ट्रास्ट्रक्चरल डेटा को एक अवधारणा को मान्य करने की आवश्यकता होती है जो कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों से उत्पन्न हुई है, जो मानक और प्रयोगात्मक रूप से बदली हुई स्थिति की तुलना करती है। इन मामलों में, कई वर्गों को आम तौर पर ग्रिड पर बेतरतीब ढंग से एकत्र किया जाता है और ब्याज के क्षेत्रों को स्थानीयकृत और छवि बनाने के लिए जांच की जाती है। यह रणनीति आमतौर पर कम व्यवस्थित होती है और विश्लेषण किए गए वर्गों की एक छोटी संख्या तक सीमित होती है। हम किसी दिए गए रिबन(चित्रा 4D)से दसियों/सैकड़ों मध्यम-संकल्प वर्गों के रिकॉर्डिंग अवलोकन का सुझाव देते हैं । 70 एनएम के विशिष्ट वर्गों के लिए, 200 वर्गों का विस्तार लगभग 14 माइक्रोन होगा, जिसमें कई कोशिकाएं होंगी, या तो पूरी तरह से या आंशिक रूप से, आधे घंटे के भीतर पूरी हो जाएंगी। पहले कदम के रूप में, पूरे रिबन का कम-रिज़ॉल्यूशन अवलोकन दर्ज किया जाता है, और अवलोकन उन वर्गों को छोड़ने में मदद करता है जो तैयारी कलाकृतियों (जैसे, सिलवटों, गंदगी) को दिखाते हैं। इसके बाद, अधिग्रहण मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से सीधे अनुभाग के चयनित भागों, या एक पूरे खंड पर किया जा सकता है, एकल या मोज़ेक इमेजिंग का उपयोग करके, सिलाई(चित्रा 4E)के बाद। इसके बाद, चयनित क्षेत्र की छवियों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन मापदंडों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया, नाभिक और माइक्रोविली इस तरह के सांख्यिकीय रूप से बेहतर विधि(चित्र 4Ei-iii)से लाभान्वित हो सकते हैं।

कई छोटे, विरल वितरित संरचनाओं का विश्लेषण 500-1,000 एनएम रेंज (अनुपूरक मूवी 1)
इस परिदृश्य में, आरओआई को कम आवर्धन अवलोकन स्कैन में पहचाना नहीं जा सकता है, और उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की आवश्यकता होती है। पारंपरिक TEM नमूनों में, अनुभाग में और बाहर थकाऊ ज़ूमिंग आवश्यक है जब तक आवश्यक सुविधा नहीं मिल जाती है। अक्सर, कई नमूनों में इमेजिंग कई स्वतंत्र स्थानों एक बड़ी मात्रा की पीढ़ी की तुलना में सांख्यिकीय अधिक प्रासंगिक है । ऐसे मामलों में, मैनुअल अधिग्रहण की जटिलता तेजी से बढ़ती है। हालांकि कई TEM समाधान स्वचालित अधिग्रहण या कई ग्रिड की स्क्रीनिंग सक्षम, ग्रिड और धारावाहिक खंड चुनौतियों के आकार अक्सर कई नमूनों के लिए असंगत दृष्टिकोण बनाते हैं । इसी तरह के मामलों के लिए, हम ब्याज की संरचनाओं की पहचान करने के लिए पर्याप्त संकल्प पर कई वर्गों में एक समग्र आरओआई का एक पूर्ण मध्यम-समाधान मानचित्र उत्पन्न करते हैं। इस पार्श्व स्क्रीनिंग चरण के दौरान, एक समय में कई वर्गों को छलांग लगाने की सलाह दी जाती है, जिसका लक्ष्य बेतरतीब ढंग से संपर्क किए जाने पर ब्याज की संरचना का कम से कम एक हिस्सा हिट करना है। यह काफी हद तक संरचना के समग्र आयामों पर निर्भर करेगा: उदाहरण के लिए, यदि संरचना का समग्र आकार 500 एनएम है और अनुभाग 50 एनएम मोटे हैं, तो एक पंक्ति में कम से कम नौ अनुक्रमिक वर्गों में ब्याज की संरचना का एक हिस्सा होने की संभावना होगी। इस तरह, 6-7 वर्गों की लंघन कई क्षेत्रों में कई अलग-अलग प्रकार की संरचनाओं को खोजने के लिए कुशल होगी। चयनित वर्गों के हल मोज़ेक मानचित्रों का स्वचालित अधिग्रहण उनके अधिग्रहण के बाद इन वर्गों की सावधानीपूर्वक स्क्रीनिंग करने में सक्षम बनाता है। एक बार इस तरह के एक उच्च संकल्प नक्शा का अधिग्रहण किया है, कई ROIs बाहर फसली या ROIs(अनुपूरक फिल्म 1)पर अतिरिक्त स्थानीय इमेजिंग क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । गोलगी, सेंटीयोल्स, जंक्शन, माइक्रोट्यूबल्स, विभिन्न प्रकार के वेसिकल्स संरचनाओं के अच्छे उदाहरण हैं जो इस परिदृश्य(अनुपूरक मूवी 1)से लाभान्वित हो सकते हैं।

बड़े नमूनों में विरल वितरित बड़े आरओआई का विश्लेषण (आंकड़े 4F-4H)
इस परिदृश्य में दुर्लभ घटनाएं शामिल हैं, जिन्हें अक्सर "घास के ढेर में सुई" के रूप में वर्णित किया जाता है जिसमें समस्या आरओआई पहचान में नहीं है बल्कि इसका स्थानीयकरण है। कई नमूनों के लिए सहसंबद्ध दृष्टिकोण एक वैध विकल्प नहीं है, फिर भी अक्सर आरओआई के पास एक खुलासा अल्ट्रास्ट्रक्चर होता है और, जब स्थानीयकृत होता है, तो उच्च विश्वसनीयता के साथ पहचाना जा सकता है। इन नमूनों के लिए, यह बहुस्तरीय अधिग्रहण लागू करने के लिए आवश्यक है, मध्यम संकल्प पर दसियों से सैकड़ों वर्गों के साथ पूर्व जांच नमूनों के साथ शुरू । यहां उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर में, कई वर्गों के छवि सेट प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग रणनीतियां हैं: पूर्वावलोकन छवियों को उच्च रिज़ॉल्यूशन पर रिकॉर्ड करना या उपयुक्त सेटिंग्स(चित्रा 4F)के साथ एक सरणी टाइल सेट प्राप्त करना। ड्रोसोफिला आंत में विभिन्न विशेष सेल प्रकार बेतरतीब ढंग से वितरित किए जाते हैं (जैसे स्टेम, एंटेरोएंड्रोक्राइन कोशिकाएं), और यादृच्छिक अभिविन्यास पर पतली अनुभागित। फिर भी वे या तो एकल वर्गों से या धारावाहिक छवियों(चित्रा 4G)के संग्रह के रूप में उच्च संकल्प मापदंडों का उपयोग कर प्राप्त छवियों की स्क्रीनिंग के बाद नेत्रहीन प्रतिष्ठित किया जा सकता है । संरेखण के बाद, ढेर विभिन्न सॉफ्टवेयर समाधान(चित्रा 4H,अनुपूरक फिल्म 2) का उपयोग करके प्रदान किया जा सकता है।

परिदृश्य 1: आंतों के ऑर्गेनॉइड (चित्रा 5A)
ऑर्गेनॉइड तेजी से आधुनिक जीवन विज्ञान के सबसे अत्याधुनिक उपकरणों में से एक बन रहे हैं । यह लगभग शारीरिक 3 डी स्टेम-सेल-व्युत्पन्न अंग मॉडल ऊतक नवीकरण, दवाओं के प्रति प्रतिक्रिया और पुनर्योजी दवा सहित वीवो जैविक प्रक्रियाओं में की एक श्रृंखला का सटीक अध्ययन संभव बनाता है। हाल ही में शुरू की मिनी आंत ट्यूब३४ ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी की एक नई पीढ़ी को खोलने, बारीकी से वीवो ऊतक शरीर विज्ञान, सेल प्रकार संरचना, और होमोस्टेसिस में जैसी, रोग मॉडलिंग, मेजबान माइक्रोब बातचीत, और दवा की खोज के लिए व्यापक दृष्टिकोण को सक्षम करने । हालांकि, जब अल्ट्रास्ट्रक्चरल लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है, तो यादृच्छिक नमूनों का उपयोग करके ऐसे बड़े ऊतकों में विभिन्न सेल प्रकारों का स्थानीयकरण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, चर "संक्रमण" परख में, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि विश्लेषण ऊतक को प्रभावित करने वाले विभिन्न विकासात्मक चरणों का पता चलता है। इस तरह के अध्ययनों के लिए, नमूने का सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कवरेज केंद्रीय है, फिर भी पारंपरिक TEM ऑन-ग्रिड दृष्टिकोण का उपयोग करके प्राप्त करना मुश्किल है। एटी-परिदृश्य 1 ऐसे मामलों में फायदेमंद है: कई अनुक्रमिक वर्गों को वेफर(चित्रा 5एआईआई) पर उत्पन्न किया जा सकता है और ब्याज के सामान्य क्षेत्रों(चित्रा 5एआईआईआई;तीर) को स्थानीयकृत करने के लिए कम-रिज़ॉल्यूशन मापदंडों का उपयोग करके जांच की जा सकती है। इन क्षेत्रों को उन्नत अधिग्रहण मापदंडों(आंकड़े 5Aiv और चित्रा 5एवी)का उपयोग करके आगे विश्लेषण के लिए लक्षित किया जा सकता है। जब एक प्रासंगिक संरचना का पता लगाया जाता है (आमतौर पर हर 100-300 वर्गों में एक बार 5-10 वर्गों का एक क्लस्टर), ब्याज की प्रत्येक संरचना पर ध्यान केंद्रित करना और एकल छवियों को मैन्युअल रूप से प्राप्त करना या कई वर्गों में छवि की मात्रा प्राप्त करने के लिए स्वचालन सुविधाओं का उपयोग करना आसान है।

परिदृश्य 2: ड्रोसोफिला पुपल नोटम (चित्रा 5B)
सेल डिवीजन और कोशिका चक्र के माध्यम से प्रगति को नियंत्रित करने वाले तंत्र का अध्ययन बहुकोशिकीय जीवों में मानक और परिवर्तित प्रक्रियाओं दोनों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। मौजूद जानकारी अक्सर एककोशिकीय प्रणालियों से प्राप्त होती है; हालांकि, इस समाधान में ऊतक में कोशिकाओं के बीच 3 डी इंटरैक्शन के महत्वपूर्ण संदर्भ का अभाव है। नोटम का एक एकल-सेल मोनोलेयर, ड्रोसोफिला लार्वा का विकासशील पीठ, सामान्य रूप से एपिथेलियल कोशिकाओं और विशेष रूप से35में सेल डिवीजन के बीच बातचीत के लिए एक आदर्श मॉडल है। यह फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और आनुवंशिक जोड़तोड़ द्वारा उपलब्ध डेटा के संयोजन का उपयोग कर आणविक और सेलुलर इंटरैक्शन अध्ययनों के लिए एक स्थापित मॉडल है। कोशिका विभाजन का अंतिम चरण, एसेसियन, दो विभाजित कोशिकाओं के बीच अंतिम अलगाव का आश्वासन देता है, और अमूर्तता के दौरान होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों की विशेषता माइटोसिस की हमारी समझ के लिए आवश्यक है। हालांकि, नोटम में माइटोटिक डिवीजनों को अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर स्थानीयकरण करना आसान नहीं है: एब्सिसेशन जोन(चित्रा 5B)की तुलना में कोशिकाएं अपेक्षाकृत बड़ी हैं। abscision क्षेत्र के समग्र आकार और कवर करने के लिए अनुभाग की सतह के बीच अनुपात बड़ा है(चित्रा 5द्वि)। भले ही TEM या एसबीएफ-एसईएम विधियों36का उपयोग करके अमूर्त क्षेत्र को स्थानीय बनाना संभव है, लेकिन कार्य श्रमसाध्य है। इस परिदृश्य के साथ, 20-40 वर्गों की छलांग की स्वचालित मध्यम-संकल्प अवलोकन छवियों का उपयोग विभाजन कोशिकाओं(चित्रा 5बीआईआई)को स्थानीयकृत करने के लिए किया जा सकता है। जब ऐसी कोशिकाओं की पहचान की जाती है, तो अनुभाग आसपास के वर्गों की बारीकी से जांच के लिए लंगर के रूप में काम करते हैं, और कई विभाजित कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण के लिए पाया और चुना जा सकता है। इस तरह, abscission क्षेत्र स्थित है और अपनी संपूर्णता में छवि(चित्रा 5Biii)किया जा सकता है । प्रश्न के आधार पर, संरचना की गहराई को कवर करने के लिए एकल उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों या 3-7 छवि दृश्यों को एकत्र किया जासकता है (चित्रा 5Biv)।

परिदृश्य 3: माउस टैनिसिट न्यूरॉन्स (चित्रा 5C)
माउस मस्तिष्क के विकास के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल प्रदान करता है और ईएम सहित विभिन्न स्तरों पर अच्छी तरह से प्रलेखित है। हालांकि मस्तिष्क के ऊतकों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न स्वचालित धारावाहिक-ब्लॉक-फेस विधियों का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, फिर भी ऐसे मामले हैं जहां आवश्यक डेटा एकत्र करने के लिए बेहतर रूपांतरित किया जाता है। हाइपोथैलेमस एक अच्छी तरह से स्थापित तंत्रिका विज्ञान मॉडल है, मस्तिष्क का एक हिस्सा है जिसमें कई न्यूरोनल प्रकार के कार्य होते हैं। हाइपोथैलेमिक टैनिसाइट्स तीसरे वेंट्रिकल के नीचे अस्तर की एक विशेष सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं, असामान्य रूप से लंबी प्रक्रियाओं (300 माइक्रोन तक) और बड़े एंडफीट (~ 5 माइक्रोन)37के साथ। यह उन्हें या तो TEM या FIB तरीकों से विश्लेषण के लिए असुविधाजनक बनाता है । कार्य और जटिल है जब कई स्वतंत्र टैनीसाइट्स को स्थानीयकृत और विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है। इस कार्य को सुविधाजनक बनाने के लिए दृष्टिकोणों में से एक अर्ध-सहसंबद्ध लक्ष्यीकरण हो सकता है, जिसमें फ्लोरेसेंस मानचित्र को ईएम के लिए फिक्सिंग और एम्बेड करने से पहले फ्लोरोसेंटली लेबल वाले नमूनों से प्राप्त किया जाता है। खंड फ्लोरेसेंस नमूने और फ्लैट एम्बेडेड प्लास्टिक प्रतिकृति से स्थितीय जानकारी के संयोजन से कब्जा कर लिया क्षेत्र पर किया जाता है। उसके बाद, एटी परिदृश्य 3 का उपयोग किया जा सकता है: उच्च स्तरीय अवलोकन मोज़ेक छवियां टैनिसिट एंडफीट क्लस्टर वाले क्षेत्रों को प्रकट करने के लिए उत्पन्न होती हैं। इसके बाद, सॉफ्टवेयर में स्वचालन सुविधाओं का उपयोग एक या कई क्षेत्रों से छवियों के दृश्यों के अधिग्रहण को एक ही छवि या टाइल मोड में स्थापित करने के लिए किया जाता है। इन छवियों का अलग से विश्लेषण किया जा सकता है, गठबंधन के रूप में ढेर या उसके बाद प्रदान की गई।

एटी विधि की शक्ति 2D से 3 डी तक डेटा के अपेक्षाकृत सरल "अपग्रेड" की अनुमति देती है: नक्शे प्राथमिक अधिग्रहण से उपलब्ध हैं, और चयनित क्षेत्र और उसके आसपास से वॉल्यूम प्राप्त किए जा सकते हैं। परिणामस्वरूप स्टैक गठबंधन किया जा सकता है और बाद में प्रदान किया जा सकता है। आरओआई को खोजने के लिए पहले से ही यह निर्धारित करना आवश्यक है कि कौन से संकल्प और छवि गुणवत्ता की आवश्यकता है। इमेजिंग को आरओआई को पहचानने में सक्षम होना चाहिए, लेकिन इस मूल्य से परे नहीं क्योंकि अधिग्रहण समय आनुपातिक रूप से पिक्सेल निवास समय और पिक्सेल आकार के व्युत्क्रम वर्ग के लिए तराजू।

Figure 1
चित्रा 1: ईएमनमूना तैयार करने और मात्रा अधिग्रहण की चुनौतियां। (ए)फ्लोरेसेंस और सिकुड़न का नुकसान नमूना तैयार करने के दौरान उच्च भारी धातु एकाग्रता और निर्जलीकरण के कारण होता है। (i) एलएम (ii) के तहत देखे गए नमूने का एक योजनाबद्ध चित्र ईएम के लिए तैयार किया गया एक ही नमूना, जो पूरी तरह से अपारदर्शी हो जाता है और इसकी मात्रा का लगभग 10% खो देता है । (ख)नमूना एम्बेडिंग आमतौर पर एपॉक्सी या एक्रेलिक रेजिन का उपयोग करके किया जाता है। पारंपरिक ब्लॉक (i) का उपयोग सजातीय नमूनों के लिए सफलतापूर्वक किया जा सकता है जिन्हें किसी विशेष अभिविन्यास की आवश्यकता नहीं होती है। जब माइक्रोस्कोप के तहत लक्ष्य और उन्मुख करना आवश्यक होता है, तो गैर-सजातीय नमूनों या सहसंबद्ध माइक्रोस्कोपी प्रक्रियाओं में, उदाहरण के लिए, खंडीकरण के उद्देश्य से एक सटीक क्षेत्र, जब फ्लैट ब्लॉक (ii) सहायक होते हैं। (ग)पूरे नमूना मात्रा में, केवल एक सीमित अंश को एक 50 एनएम अनुभाग पर दर्शाया जाता है, जो 3डी नमूने की 2डी छवि प्रदान करता है, अक्सर एक अपरिचित अभिविन्यास में। (घ)सटीक लक्ष्यीकरण बनाम अत्यधिक बड़ी मात्रा रिकॉर्डिंग की समस्या को समझाने के लिए, हमने 1000, 500 और 50 माइक्रोन के चेहरों के साथ तीन गाढ़ा क्यूब्स को चुना जिसमें एक काल्पनिक 1000 x 500 x 500 माइक्रोन (डार्क सैंपल मैरून) शामिल है। यदि इस तरह के काल्पनिक नमूना क्यूब्स को पूरी मात्रा को कवर करने के लिए 50 एनएम स्लाइस के साथ अच्छी तरह से अनुभागित किया जाता है, तो इसके लिए कुल 20,000, 10,000, और 1,000 स्लाइस, और 800 टीबी, 100 टीबी और 100 जीबी, तदनुसार (इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन 5 एनएम एक्स 5 एनएम x 50 nm, 8 बिट डेटा) की आवश्यकता होगी। यह केवल न्यूनतम आवश्यक मात्रा प्राप्त करने के लिए ईएम डेटा के अधिग्रहण की योजना बनाने के महत्व को दर्शाता है। (ई)उच्च संकल्प में एक बड़े नमूना सतह क्षेत्र को कवर करने के लिए एक बड़ी मात्रा के समान समस्या प्रस्तुत करता है । एक में कई उच्च संकल्प छवियों टाइलिंग ऐसी समस्या के लिए एक उपयोगी समाधान है । हालांकि, 10, 000x आवर्धन में 2024 x 1048 फ्रेम का उपयोग करके 1 मिमी x 1 मिमी सतह को कवर करने के लिए टाइल्स की एक विशाल संख्या की आवश्यकता होगी, जो सिलाई के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इसके अलावा, यदि काटने के दौरान वर्गों को अलग-अलग संकुचित या विकृत किया जाता है, तो परिणामस्वरूप डेटा स्टैक संरेखित करना लगभग असंभव हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:बड़े समर्थन पर वर्गों की सरणी की प्रत्यक्ष पीढ़ी के लिए कार्यप्रवाह। (क)ट्रिम टूल का उपयोग करके तंग ट्रिमिंग के लिए, ब्लॉक माइक्रोटॉम धारक के अंदर सुरक्षित होते हैं। यह कदम एक ब्लॉक के समानांतर पक्षों को सुनिश्चित करने में मदद करता है और नमूने के चारों ओर खाली राल को भी कम करता है। (ख)एटी सेक्शन अधिग्रहण के लिए एक संशोधित चाकू । एक बड़ी नाव समर्थन पर नमूना अनुभागिंग और हस्तांतरण के दौरान वर्गों के हस्तांतरण और उनके हेरफेर की सुविधा प्रदान करती है। एक बड़ा बेसिन वर्गों के हेरफेर को सक्षम बनाता है; ड्रेनिंग सिस्टम ड्रेनिंग चरण के दौरान रिबन के आंदोलन को सीमित करता है, फ्लैट नीचे समर्थन को धीरे-धीरे सुखाने को विश्वसनीय बनाता है। (ग)चाकू, बेसिन के तल पर रखा एक चमक-छुट्टी वेफर और किनारों को समतल पानी के साथ खंड के लिए तैयार है । चाकू का निर्माण समर्थन में हस्तक्षेप किए बिना सुई को एम्बेडेड रखता है। (घ)ऐरे जनरेशन, माइक्रोटॉम सेक्शनिंग एरिया पर टॉप व्यू । (i) पहले वर्गों को आमतौर पर प्राप्त करना आसान होता है क्योंकि वे एक-दूसरे से चिपके रहते हैं और एक नियमित रिबन बनाते हैं । (ii) जब रिबन में अधिक वर्ग जोड़े जाते हैं, और यह लंबा हो जाता है, तो रिबन अपनी स्थिरता खो देता है और अक्सर घटता है। छवि अधिग्रहण कदम की तैयारी में अनुक्रम पटरियों को अनुक्रम में व्यवस्थित रखना महत्वपूर्ण है। (iii) जब वर्गों का एक रिबन वांछित लंबाई तक पहुंचता है, तो यह एक बरौनी का उपयोग करके सावधानीपूर्वक चाकू की धार से अलग हो जाता है। (iv) बेसिन से पानी की निकासी की जाती है; वेफर तब तक अंदर रहता है जब तक कि यह पूरी तरह से हवा से सूखा न हो जाए। यह कदम आवश्यक है, क्योंकि यह वर्गों को सीधा करने और माइक्रो सिलवटों के गठन से बचने में मदद करता है। वेफर को समर्थन पर वर्गों को संलग्न करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखा गया है। (ई)स्थानांतरित वर्गों के साथ उदाहरण वेफर्स । हालांकि सीधे और सटीक रिबन प्राप्त करना सुविधाजनक है, वास्तविक नमूने ज्यादातर मामलों में ऐसे आदर्श रिबन के गठन को रोकते हैं। फिर भी, यहां तक कि "मैला" रिबन मामलों की विशाल संख्या के लिए बहुत जानकारीपूर्ण हैं, और "साफ" रिबन का महत्व एक शोध रणनीति पर निर्भर करेगा जिसके लिए वर्गों को एकत्र किया जाता है। स्केल बार 1 सेमी(एफ)सीरियल सेक्शन के साथ उदाहरण स्लॉट ग्रिड। यहां तक कि जब कई वर्गों को एक ग्रिड पर एकत्र किया जाता है, तो यह अभी भी एक वेफर पर एकत्र किया जा सकता है। ग्रिड (विशेष रूप से स्लॉट ग्रिड) पर वर्गों के हस्तांतरण में महारत हासिल करने के लिए आवश्यक कौशल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूना तैयारी में महारत हासिल करने के लिए एक महत्वपूर्ण अड़चन का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार 500 माइक्रोन (जी)कोई फर्क नहीं पड़ता कि किस सेक्शन संग्रह विधि का उपयोग किया गया था, एटी दृष्टिकोण की ताकत ऑन-ग्रिड संग्रह की तुलना में अनुक्रमिक वर्गों की उत्पादन में सापेक्ष आसानी है। यदि 1000 माइक्रोन एक्स 500 माइक्रोन नमूना ब्लॉक माना जाता है, तो 2 सेमी x 4 सेमी वेफर (i) पर लगभग 100 वर्गों को फिट करने में कोई समस्या नहीं है। स्लॉट ग्रिड पर समान आकार के खंड अधिकतम (ii) पर केवल तीन खंड/ग्रिड फिट होंगे। हम यह दिखाने के लिए एक छोटा छवि प्रदान करते हैं कि ग्रिड पर सीरियल सेक्शन एकत्र करने की कठिनाई का उल्लेख नहीं करते हुए, एक ही संख्या में वर्गों को कवर करने के लिए कितने ग्रिड की आवश्यकता हो सकती है। स्केल बार = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:सरणी टोमोग्राफी वर्कफ्लो के महत्वपूर्ण चरण। उच्च संकल्प छवि ढेर के उपेक्षित अधिग्रहण के लिए कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध। सभी प्रारंभिक चरण स्वचालित (हरे गियर प्रतीक) हैं और अनुभाग द्वारा मैन्युअल रूप से किए जाने वाले किसी भी कार्य की आवश्यकता नहीं है। छवि ढेर स्वचालित कठोर या एफ़ीन संरेखण में सक्षम किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में गठबंधन किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एक प्रदर्शन मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला वयस्क आंत के साथ तीन अधिग्रहण परिदृश्यों। (क)एक विच्छेदित ड्रोसोफिला मिडगट की ड्राइंग, जिसमें तीन प्रमुख क्षेत्र विभिन्न रंगों द्वारा नामित किए गए हैं: पूर्वकाल, मध्य और पीछे। (ख)छंटनी फ्लैट ब्लॉक जिसमें एक आंत ट्रांसवर्स सेक्शनिंग के लिए उन्मुख है । ध्यान दें कि खाली राल राशि ब्याज के क्षेत्र (सफेद आयत) युक्त ऊतक के आसपास सावधानी से संतुलित है। (ग)ट्रांसवर्स सीरियल सेक्शन एटी रीके के बेसिन के अंदर पानी की सतह पर तैर रहे हैं । सभी छवियों को उलटा विपरीत के साथ दर्पण डिटेक्टर का उपयोग कर माध्यमिक इलेक्ट्रॉन एसईएम मोड में अधिग्रहीत किया गया। (घ)एक वेफर पर ट्रांसवर्स सीरियल सेक्शन की सिले पच्चीकारी इमेज । स्केल बार ड्रोसोफिला आंत के माध्यम से 1000 माइक्रोन(ई)क्रॉस-सेक्शन है। स्केल बार 20 माइक्रोन। छवि 7 x 7 मध्य दूरी की छवियों की एक सिले पच्चीकारी है । इंसेट - उच्च आवर्धन और ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों के संकल्प छवियां: (ii) नाभिक, (iii) ब्रश सीमा, और (i) माइटोकॉन्ड्रिया। स्केल बार सभी के लिए 5 माइक्रोन। (च)आंत के माध्यम से एक ट्रांसवर्स सेक्शन की एक मध्य-दूरी की छवि जो कोशिकाओं (वर्ग) के विकास के स्थान को लक्षित कर रही है। स्केल बार 20 माइक्रोन है।(जी)पैनल एफ स्केल बार में मौजूद अनुभाग के विश्लेषण के दौरान स्थानीयकृत क्षेत्र के आधार पर एकत्र किए गए धारावाहिक खंडों की लक्षित सरणी 10 माइक्रोन है ।(एच)3डी मॉडल पैनल जी में लक्षित धारावाहिक अधिग्रहण से प्राप्त ५० खंडों स्टैक अनुक्रम के आधार पर प्रदान किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:एटी एप्लिकेशन परिदृश्यों के लिए केस अध्ययन। (ए)आंतों के ऑर्गेनॉइड में विभिन्न कोशिका संरचनाओं का स्थानीयकरण। (i) एम्बेडेड सिलिकॉन माइक्रोचिप। स्केल बार = 200 माइक्रोन. (ii) चिप के मध्य भाग के माध्यम से 127 क्रॉस-सेक्शन की एक सिले पच्चीकारी छवि। स्केल बार = 1500 माइक्रोन (iii) आंतों के ऑर्गेनॉइड के हिस्से के माध्यम से एक पूर्ण ट्रांसवर्स सेक्शन की चार कम-रिज़ॉल्यूशन छवियां। तीर ब्याज की संभावित साइट को इंगित करते हैं। स्केल बार 20 माइक्रोन (iv) विभिन्न आरओआई है, जो आगे के विश्लेषण के लिए चुने गए कम-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोग्राफ पर लक्षित है। स्केल बार = 10 माइक्रोन( v) ब्याज की संक्रमित कोशिका की उच्च संकल्प छवि। आसन्न खंडों में एक ही क्षेत्र का विश्लेषण यदि आवश्यक हो तो लक्षित 3D जानकारी प्रदान कर सकता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन(बी) ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर पुपल नोटम में मिडबॉडी स्थानीयकरण। (i) विच्छेदित ड्रोसोफिला पिल्ला का एक योजनाबद्ध दृष्टिकोण । सुरक्षात्मक क्यूटिकल (ब्राउन) के हिस्से को हटाने के बाद विच्छेदन (बेज) के लिए उजागर हुए नोटम। काली रेखा आरेख में प्रस्तुत क्षेत्र के माध्यम से खंड (ii) एक क्रॉस-सेक्शन की दिशा को नामित करती है। छवि 3x7 क्रमिक रूप से एक मोज़ेक पैनल के लिए सिले उच्च संकल्प SEM छवियों को जोड़ती है । काला आयत उस क्षेत्र का परिसीमन करता है जिसमें विभाजक कोशिका होती है। स्केल बार 15 माइक्रोन है। (iii) पैनल ii से डिवाइडिंग सेल पर एक ज़ूम इमेज है। इस आवर्धन और संकल्प पर, मिडबॉडी स्पष्ट है (सफेद तीर)। पूरे खंड का विश्लेषण विभाजन कोशिकाओं को खोजने के लिए किया जाता है। पार्श्व स्क्रीनिंग स्टेप के दौरान 20-30 वर्गों के अंतराल में वर्गों के विभिन्न रिबन के बीच छलांग ें कई विभाजित सेल जोड़े को स्थानीयकृत करने की अनुमति देती हैं। स्केल बार 5 माइक्रोन (iv) है जब एक विभाजन सेल स्थानीयकृत होता है, तो मिडबॉडी के चार वर्गों से एकत्र की गई मिडबॉडी की अनुक्रमिक छवियां पैनल (iii) में पीले वर्ग द्वारा सीमित होती हैं। स्केल बार माउस हाइपोथैलेमस में 1 माइक्रोन(सी)टैनिसाइट्स एंडफीट स्थानीयकरण है। (i) वाइब्रेटोम स्लाइस की फ्लोरेसेंस इमेज। Tanycytes एक्सप्रेस tdTomato फ्लोरोसेंट प्रोटीन (लाल) । एक सफेद आयत ब्याज के क्षेत्र का परिसीमन करता है। स्केल बार 500 माइक्रोन. (ii) ईएम के लिए तैयार समान वाइब्रेटोम अनुभाग को पैनल (i) से फ्लोरोसेंट जानकारी के अप्रत्यक्ष संबंध के आधार पर ब्याज के क्षेत्र के आसपास सावधानीपूर्वक छंटनी की जाएगी। बिंदीदार सफेद रेखा अल्ट्राथिन सेक्शनिंग के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करती है। स्केल बार दोनों पैनलों के लिए 50 माइक्रोन है। (iii) ब्याज के क्षेत्र में वाइब्रेकोम स्लाइस के माध्यम से क्रॉस-सेक्शन। SEM मोज़ेक छवि 75 सिले छवियों से बना है। कई वर्गों को पार्श्व स्क्रीनिंग द्वारा लक्षित किया जाता है और समान मापदंडों के साथ चित्रित किया जाता है। रॉय को खोजने के लिए वर्गों का विश्लेषण "ऑफ़लाइन" किया जाता है - टैनसाइट एंडफीट। काला आयत उस क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें टैनिसिट एंडफीट होता है। यह खंड आगे के विश्लेषण के लिए एक लंगर के रूप में काम करेगा। स्केल बार 15 माइक्रोन है। (iv) उच्च-संकल्प, रक्त वाहिका के आसपास के टैंसाइट एंडफीट की उच्च आवर्धन छवि। एक खंड पर आरओआई के प्रारंभिक स्थानीयकरण के बाद, जेड-अनुक्रम को आसन्न खंडों से लंगर अनुभाग (पैनल iii) तक एकत्र किया जाता है। स्केल बार 5 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:अल्ट्रा-माइक्रोटॉमी, सेक्शन कलेक्शन और सेक्शन स्टोरेज के दौरान समस्याएं कलाकृतियों को जन्म दे सकती हैं। (ए)वेफर पर ब्रेन सैंपल सेक्शन। अधिकांश खाली राल ऊतक से अलग हो जाते हैं और खुद (सेपिया) पर मुड़ा हुआ है। धराशायी ब्लैक बॉक्स एक क्षेत्र है कि पूरे खंड को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है नामित । स्केल बार 500 माइक्रोन(बी)50-एनएम मोटी जेब्राफिश अनुभाग की सतह पर एक छोटा, स्थानीय गुना। स्केल बार 1 माइक्रोन (सी)70एनएम माउस ब्रेन सेक्शन की सतह पर चाकू का निशान। स्केल बार 5 माइक्रोन(डी)वेफर की सतह पर बाल (तारक) जो आंशिक रूप से जेब्राफिश मांसपेशी अनुभाग को कवर करता है। पीले रंग में, ऊतक विश्लेषण के लिए लक्षित है। गुलाबी रंग में, एक कोशिका प्रभावित क्षेत्र के आकार के लिए एक संदर्भ के रूप में काम करती थी। स्केल बार 50 माइक्रोन(ई)जेब्राफिश नोटोकॉर्ड नीचे दाईं ओर झुर्रियों के साथ (काले तीर), जहां घने तंत्रिका ऊतक (नीले रंग में छायांकित) नरम मांसपेशियों के ऊतकों और खाली राल (काले तीर) पर सीमाओं। स्केल बार 10 माइक्रोन(एफ)ई में के रूप में 50 छवियों के ढेर की मात्रा विभाजन, दिखा रहा है कि इस क्षेत्र में ज्यादातर वर्गों में झुर्रियां दिखाई। धराशायी बहुभुज जी स्केल बार 10 माइक्रोन में दिखाए गए क्षेत्र को रेखांकित करता है।(जी)एफ में समान मात्रा विभाजन का XY दृश्य, ब्लॉक के दाहिने आधे हिस्से में छोटे काले स्ट्रोक के रूप में झुर्रियों को दिखाता है। ध्यान दें कि ऊतक के शेष हिस्सों में स्टैक का संरेखण झुर्रियों से प्रभावित नहीं होता है। स्केल बार 5 माइक्रोन(एच)एक्सजेड प्रक्षेपण जी में के रूप में एक ही क्षेत्र है, सभी 50 वर्गों में झुर्रियों को दिखा रहा है। स्केल बार 5 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फिल्म 1: ड्रोसोफिला पूर्वकाल मिडगुट के माध्यम से एक क्रॉस-सेक्शन की एक उच्च-संकल्प असेंबल छवि। एक उल्टे एसई-एमडी एसईएम छवि की मोज़ेक छवि। 352 अलग-अलग छवि टाइल्स स्वचालित रूप से 5 एनएम संकल्प पर अधिग्रहीत किए गए थे और पूरे क्रॉस-सेक्शन को पेश करने के लिए सिले गए थे। अधिक जानकारी के लिए ज़ूम इन करना और एक ही छवि का उपयोग करके डेटा का विस्तृत कवरेज प्राप्त करना संभव है। ज़ूम इन करते समय तंग जंक्शन, माइक्रोटुबुली, विभिन्न प्रकार के वेसिकल्स हो सकते हैं। स्केल बार 10 माइक्रोन है । कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फिल्म 2: ड्रोसोफिला आंत कोशिकाओं प्रतिपादन। आंतों की कोशिकाओं को विभाजित करने के क्षेत्र में वर्गों की पचास गठबंधन पच्चीकारी छवियां। सेल सीमाओं (नीला, फ़िरोज़ा, और नारंगी) और नाभिक (सफेद) का IMOD प्रतिपादन। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक सामग्री। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। 

Discussion

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं और जीवों की अल्ट्रास्ट्रक्चर में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, जिसके लिए अक्सर उनके 3-आयामी संदर्भ में रुचि की छवि संरचनाओं के लिए वांछनीय होता है। अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए कई ईएम रणनीति के बावजूद, अभी भी कोई "स्वर्ण मानक" समाधान नहीं है। मुख्य कारण नमूनों की विस्तृत विविधता, कई जैविक प्रश्न हैं, जिन्हें अक्सर एक सिलवाया दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। प्रस्तावित एटी वर्कफ़्लो नमूना प्रसंस्करण, डेटा अधिग्रहण, मूल्यांकन और भंडारण के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसके अलावा, संशोधित चाकू सरणी अधिग्रहण को सरल बनाने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है। वेफर्स पर वर्गों का कॉम्पैक्ट लेआउट नमूनों के अवलोकन और बाद के भंडारण दोनों के लिए सुविधाजनक है। यह व्यवस्था क्षैतिज रूप से रिबन से रिबन तक जाकर नमूनों की "पार्श्व स्क्रीनिंग" को सक्षम बनाती है और प्रत्येक पर केवल एक अनुभाग को स्कैन करती है, जिससे आरओआई को स्थानीय बनाने के लिए आवश्यक समय काफी कम हो जाता है। प्रस्तावित डेटा अधिग्रहण परिदृश्य छोटे और बेतरतीब ढंग से वितरित क्षेत्रों को लक्षित करने की सुविधा प्रदान करते हैं। एक बार पाए जाने पर, एटी/एसईएम उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को ब्याज की मात्रा तक सीमित करता है, चाहे वह मैन्युअल रूप से या स्वचालित कार्य की मदद से किया गया हो। सीमित मात्रा के लिए मैन्युअल रूप से पूरा किया जा सकता है, ऑपरेटर के साथ नमूना के माध्यम से नेविगेट और इमेजिंग क्षेत्रों को एक-एक करके परिभाषित करते हैं। सॉफ्टवेयर का स्वचालित मॉड्यूल बड़े वर्गों पर छोटे क्षेत्रों की इमेजिंग के लिए एक लचीला छवि अधिग्रहण रणनीति प्रदान करता है। इस सॉफ्टवेयर में स्वचालन सैकड़ों वर्गों पर बड़े उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है, जो एसबीएफआई के समान वॉल्यूम प्राप्त करता है। सभी वर्गों की अवलोकन छवियों को रिकॉर्ड करना आरओआई स्थानीयकरण को सरल बनाता है और माइक्रोस्कोप पर बिताए गए समय को कम करता है। चूंकि अवलोकन और उच्च संकल्प पूर्वावलोकन की रिकॉर्डिंग के दौरान अनुभागों को नुकसान नहीं पहुंचाया जाता है, इसलिए एटी/एसईएम अन्य आरओआई के और डेटा एकत्र करने के लिए या उच्च संकल्प पर नमूने का पुन: उपयोग करने की अनुमति देता है।

छवि अधिग्रहण समय 3 डी ईएम के सबसे महत्वपूर्ण (और सबसे महंगे) पहलुओं में से एक है और इसलिए प्रयोग डिजाइन में विचार किया जाना चाहिए। हालांकि यह आश्चर्य की बात है कि इमेजिंग बड़े क्षेत्रों में छोटे क्षेत्रों की इमेजिंग से अधिक समय लगता है, प्रभाव का अनुमान लगाना आसान है: चयनित इमेजिंग मापदंडों के आधार पर, प्रत्येक अनुभाग पर अधिग्रहण का समय सेकंड से घंटों तक भिन्न हो सकता है। क्रिटिकल इमेजिंग पैरामीटर में देखने के क्षेत्र का आकार, संकल्प और समय निवास करना शामिल है। 10एनएम प्रति पिक्सेल और 1 माइक्रोस निवास समय के लक्ष्य संकल्प को मानते हुए, 20 माइक्रोन x 20 माइक्रोन, 100 माइक्रोन x100 माइक्रोन, या 500 माइक्रोन x500 माइक्रोन के एक क्षेत्र इमेजिंग रिकॉर्ड करने के लिए 4 सेकंड, 100 सेकंड, या 2,500 एस लेता है। हम पूर्ण इमेजिंग नौकरी के लिए आवश्यक समय का अनुमान लगाने के लिए वर्गों की संख्या से इन प्रति-अनुभाग इमेजिंग समय को गुणा कर सकते हैं। लंबे समय तक प्रति-खंड इमेजिंग समय स्वीकार्य हो सकता है यदि वर्गों की संख्या छोटी है या यदि माइक्रोस्कोप उपकरण समय कोई चिंता का विषय नहीं है।

हालांकि, ज्यादातर मामलों में रिकॉर्डिंग का समय रात भर नौकरी या वीकेंड जॉब तक सीमित करना जरूरी है । 3 डी ईएम का एक समान रूप से महत्वपूर्ण पहलू जिस पर विचार किया जाना चाहिए, परिणामी छवि डेटा की मात्रा और संरचना है। 100 खंडों में उपर्युक्त इमेजिंग फ़ील्ड रिकॉर्ड करने से क्रमशः 400 एमबी, 10 जीबी या 250 जीबी इमेज डेटा उत्पन्न होता है; 500 माइक्रोन x 500 माइक्रोन छवियां प्रत्येक 2 जीबी से बड़ा होने का अतिरिक्त मुद्दा पेश करते हैं। डेटा मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले कई सॉफ्टवेयर प्रोग्राम इस आकार की छवियों को नहीं खोल सकते हैं।

इमेजिंग समय को कम करने के लिए, बाद के डेटा मूल्यांकन (जैसे, पुनर्निर्माण, ट्रेसिंग) के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए पिक्सेल निवास समय का चयन करना महत्वपूर्ण है, और रिकॉर्डिंग को परिभाषित आरओआई तक सीमित करना महत्वपूर्ण है। सॉफ्टवेयर का एटी विस्तार सीरियल सेक्शन में छोटे क्षेत्रों में इमेज एक्विजिशन की सुविधा देता है । सॉफ्टवेयर मैनुअल और स्वचालित वर्कफ्लो और कई अर्ध-स्वचालित वेरिएंट का समर्थन करता है: इमेजिंग क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से तैनात किया जा सकता है और प्रत्येक अनुभाग पर केंद्रित किया जा सकता है, या उपयोगकर्ता स्वचालित अनुभाग खोजक और स्थिति संरेखण सुविधाओं का उपयोग कर सकता है। नमूना प्रकार या इमेजिंग लक्ष्यों द्वारा चुने गए और समर्थित स्वचालन के स्तर के आधार पर, सैकड़ों वर्गों में छवि अधिग्रहण स्थापित करने के लिए आवश्यक समय एक संपूर्ण कार्यदिवस (मैन्युअल रूप से किया गया) या केवल कुछ मिनट ले सकता है। सिद्धांत रूप में, सरणी टोमोग्राफी छोटे आरओआई प्राप्त करने के लिए अन्य 3डी ईएम विधियों की तुलना में इसे अधिक चुनौतीपूर्ण बनाती है; लगातार वर्गों पर असटीक क्षेत्र प्लेसमेंट बड़े क्षेत्रों को प्राप्त करके मुआवजा दिया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि आरओआई आकार में 20 माइक्रोन x 20 माइक्रोन है और इमेजिंग फ़ील्ड की सेक्शन-टू-सेक्शन स्थिति परिवर्तनशीलता 10μm है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि आरओआई प्रत्येक छवि में पूरी तरह से कैप्चर किया गया है, हर अनुभाग पर 40 माइक्रोन x 40 माइक्रोन छवियों को प्राप्त करने की आवश्यकता है। वास्तविक दुनिया छवि स्थिति परिवर्तनशीलता स्थिति संरेखण या उपयोगकर्ता के धैर्य के लिए सॉफ्टवेयर सुविधाओं की उपलब्धता या गुणवत्ता के आधार पर 100 माइक्रोन से <10 माइक्रोन तक है। इस सॉफ्टवेयर के साथ, अधिकांश नमूनों में बहुत अधिक मैन्युअल हस्तक्षेप के बिना 10 माइक्रोन प्राप्त किया जा सकता है।

किसी भी तकनीक की तरह, एटी में कई कमजोर बिंदु हैं जो सफल डेटा अधिग्रहण को प्रभावित कर सकते हैं, और कई अन्य खंड-आधारित तरीकों के समान हैं। खाली राल बनाम ऊतक के समरूप वितरण की कमी के परिणामस्वरूप घुमावदार या टूटी हुई सरणी हो सकती है। चरम मामलों में, अनुभाग समर्थन(चित्रा 6A)से अलग हो सकते हैं। काटने की प्रक्रिया के दौरान परिवर्तनीय संपीड़न या खींचने से ऐसे सिलवटें बन सकती हैं जो बाद के खंडों(चित्रा 6B)पर परिवर्तनीय क्षेत्रों में नमूने को बाधित कर सकती हैं। चाकू के निशान एक क्षतिग्रस्त चाकू(चित्रा 6C)का उपयोग कर एकत्र वर्गों की सतह पर दिखाई दे सकते हैं । अनुभागिंग स्थितियों में अंतर सामयिक अनुभाग संपीड़न और मोटाई मतभेदों को प्रेरित कर सकते हैं। धूल या गंदगी कण एक खंड पर उतर सकते हैं और आंशिक रूप से ब्याज के क्षेत्र(चित्रा 6D) को अस्पष्ट कर सकते हैं। छवि अधिग्रहण अपूर्ण ऑटो-कंट्रास्ट, ऑटो-फोकस और ऑटो-कलंक कार्यों के कारण विफल हो सकता है। स्वचालित रूप से बनाए गए इमेजिंग क्षेत्रों की स्थिति परिवर्तनीय हो सकती है और सभी वर्गों में आरओआई को कैप्चर करने में विफल हो सकती है।

सिलाई और संरेखण के चरण में कई समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं। मोज़ेक टाइल्स अधिग्रहण की स्वचालित सिलाई विफल हो सकती है, उदाहरण के लिए, नमूने के अंदर बड़ी खाली जगह के कारण। 3 डी में आकार में भारी परिवर्तन के कारण, छवि ढेर पंजीकरण करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। विशेष रूप से विकसित कार्यक्रम (जैसे, आईओडी, फिजी, ट्रैकेम2, एमआईबी, या मैप्स-एटी) अर्ध-स्वचालित संरेखण32,38, 39,40की सुविधा प्रदान करसकतेहैं। फोटो एडिटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अधिक चुनौतीपूर्ण अनुभागों को मैन्युअल रूप से संरेखित किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, कुछ डेटासेट सही ढंग से संरेखित करना असंभव हो सकता है।

बड़े नमूने ग्रिड पर फिटिंग TEM धारावाहिक वर्गों के लिए चुनौतीपूर्ण हैं; दूसरी ओर, कई परियोजनाएं एफआईबी/एसईएम या एसबीएफ-एसईएम का उपयोग करके लंबे समय तक स्वचालित अधिग्रहण का औचित्य साबित नहीं करती हैं। एटी एक थकाऊ धारावाहिक अनुभाग TEM के लिए एक सीधा विकल्प है जहां संग्रह और एक वेफर पर धारावाहिक वर्गों के हेरफेर स्लॉट ग्रिड के साथ की तुलना में अधिक सरल हैं । सरणी के संग्रह को सुविधाजनक बनाने के लिए कई रणनीतियां विकसित की गई थीं, और हम मौजूदा टूलकिट का विस्तार करने के लिए अपनी विधि साझा करते हैं। ऐसे मामलों में जहां आरओआई की पहचान चुनौतीपूर्ण है, एटी-एसईएम नमूनों की कुशल जांच के साथ एक मौलिक लाभ प्रदान करता है, जहां 50 से 500 वर्गों में ऑर्गेनेल-स्केल संकल्प की आवश्यकता होती है। बड़ी मात्रा के लिए, यदि अधिक वर्गों की आवश्यकता होती है तो स्वचालित संग्रह एटी रणनीतियों को कुशलतापूर्वक एकत्र किया जा सकता है। एटी नमूनों को कई बार फिर से इमेज किया जा सकता है, जो पहले से प्राप्त अवलोकन छवियों के आधार पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्षेत्रों की लक्षित इमेजिंग को सुविधाजनक बनाता है। हमारा मानना है कि यहां प्रस्तावित एटी/एसईएम द्वारा लक्षित विश्लेषण और कम ओवरसैंपलिंग श्रम और डेटा भंडारण आवश्यकताओं को कम कर देता है । अंततः, वर्गों के पुस्तकालयों को एकत्र किया जा सकता है और बाद में पुन: उपयोग और परामर्श के लिए बनाए रखा जा सकता है। वॉल्यूम अधिग्रहण के लिए, एफआईबी या एसबीएफ-एसईएम दृष्टिकोण एक उत्कृष्ट समाधान प्रदान करते हैं जब भी आरओआई ब्लॉक चेहरे पर पहचानना आसान होता है या विश्लेषण के लिए बड़े 3डी वॉल्यूम की आवश्यकता होती है। हालांकि, FIB/SBF-SEM कम कुशल है जब उच्च संकल्प स्टैक छवि एक लक्षित तरीके से एक परिभाषित आरओआई से एकत्र किया जाना है । निष्कर्ष निकालने के लिए, एटी नमूनों की स्क्रीनिंग के लिए प्रस्तावित तरीके और मध्यम संकल्प अवलोकन छवियों के उपयोग से अनुभाग सरणी के प्रासंगिक हिस्सों में छवि अधिग्रहण को सीमित करने की अनुमति मिलती है। इमेजिंग क्षेत्रों का सटीक लक्ष्य समय-से-डेटा को गति देता है और डेटा मूल्यांकन को सरल बनाता है।

संक्षेप में, हालांकि एटी/एसईएम की अवधारणा उपन्यास नहीं है, इसका उपयोग अभी भी उतना व्यापक नहीं है जितना कि इसके गुण सुझाए जाएंगे । कुल मिलाकर, यह अन्य मौजूदा ईएम विधियों के लिए एक पूरक प्रक्रिया प्रदान करता है। एटी/एसईएम नमूना तैयारी प्रोटोकॉल और इमेजिंग वर्कफ्लो की व्यापक रेंज के साथ संगत है और एक साथ तकनीक के रूप में किसी भी FIB/SEM या SBF-SEM माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है । इस पेपर में, हमने उन नमूनों से अल्ट्रास्ट्रक्चरल डेटा रिकॉर्ड करने के लिए एटी पर ध्यान केंद्रित किया है जिन्हें अन्य तरीकों से सफलतापूर्वक संबोधित किए जाने की संभावना कम है। हमें उम्मीद है कि वर्गों के सुविधाजनक संग्रह और काफी स्वचालित अधिग्रहण रणनीतियों के लिए वर्णित प्रक्रिया उन लोगों के लिए पहले प्रयासों में सहायता करेगी जिन्होंने कभी विधि का सामना नहीं किया है और उन लोगों के लिए इसे सही करने में मदद करेंगे जिनके पास पहले से ही कुछ अनुभव हैं।

Disclosures

लेखक तिलमन फ्रेंक थर्मो फिशर के एक कर्मचारी है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप और विमान का संचालन कार्यक्रम है कि लेख में उपयोग किया जाता है बनाती है ।

Acknowledgments

हम एटी प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के इस विकास के दौरान उनके समर्थन के लिए लुसाने विश्वविद्यालय के EM सुविधा के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम पांडुलिपि और महत्वपूर्ण पठन की तैयारी के दौरान चर्चाओं के लिए गैरेथ ग्रिफिथ्स, मार्टा रॉड्रिग्स, उर्सका रिपनिक, क्रिस्टन जेनाउड, हेल्मुट ग्नेगी, ईनाट Zelinger, पाओला मोरेनो-रोमन, लुसी ओ ब्रायन और लिंडसे लेवेलिन को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम उन समूहों को स्वीकार करना चाहते हैं जिन्होंने विभिन्न परिदृश्यों को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों का योगदान दिया: मैथियस लुटोल्फ, मिचेल निकोलेव, देवांजलि दत्ता, जब तक मटज़ट, और फैनी लैंगलेट।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cutting
AT sectioning knife Diatome DUATS3530 Diatome Jumbo knife
Diamond knife for trimming 90° Diatome DTB90 Diatome trimming 20°
Glass knife
Pattex contact adhesive Pattex PCL3C
Silicon wafer Ted Pella 16015 Resistance: 1-30 Ohms
Type P: (Boron) (1 primary flat)
Roughness: 2 nm
No SiO2 top coating
TTV: = <20 µm
Wafer is polished on one side
Ultramicrotome Leica UC6 Alternative: Leica UC7
Wafer cleaving kit EMS 7642 EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652
Image acquisition
FESEM Thermo Fischer Helios 1072419 Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN
Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography Thermo Fisher Scientific 1135932 Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.
Image analysis
Amira x.y Thermo Fisher Scientific 1131599 Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.
Image processing Open source Fiji (http://fiji.sc/#download) IMOD, MIB (See text for refferences)

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References

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Franke, T., Kolotuev, I. Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e61847, doi:10.3791/61847 (2021).

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