Summary
Описана подготовка лент серийных сечений и их сбор на большой передаточной опоре для использования в качестве образцов массивной томографии, а также автоматизированные процедуры визуализации в сканирующем электронном микроскопе. Протокол позволяет проводить скрининг, извлечение и целенаправленную визуализацию локальных, редких событий и сбор больших объемов данных.
Abstract
Электронная микроскопия применяется в биологии и медицине для визуализации клеточных и структурных деталей с нанометровым разрешением. Исторически сложилось так, что просвечивающая электронная микроскопия (TEM) дала представление об ультраструктуре клеток, но в последнее десятилетие развитие современных сканирующих электронных микроскопов (SEM) изменило способ взгляда внутрь клеток. Несмотря на то, что разрешение TEM превосходит, когда требуются структурные детали на уровне белка, SEM-разрешение достаточно для большинства вопросов, связанных с клеточной биологией на уровне органелл. Развитие технологий позволило использовать решения для автоматического сбора объема, такие как последовательная блочная визуализация (SBF-SEM) и сфокусированный ионный пучок SEM (FIB-SEM). Тем не менее, по сей день эти методы остаются неэффективными, когда идентификация и навигация по районам, представляющим интерес, имеют решающее значение. Без средств для точной локализации целевых областей перед визуализацией операторам необходимо получить гораздо больше данных, чем им нужно (в SBF-SEM), или, что еще хуже, подготовить множество сеток и изобразить их все (в TEM). Мы предлагаем стратегию «бокового скрининга» с использованием Array Tomography в SEM, которая облегчает локализацию интересующих областей с последующей автоматической визуализацией соответствующей доли от общего объема образца. Образцы массивной томографии сохраняются во время визуализации, и они могут быть организованы в библиотеки секций, готовые к повторной визуализации. Показано несколько примеров, в которых боковой скрининг позволяет нам анализировать структурные детали, к которым невероятно сложно получить доступ любым другим методом.
Introduction
Несмотря на важность методов, связанных с ЭМ, усилия, необходимые для их освоения, ограничивают всю область небольшим количеством специалистов. Одной из существенных трудностей является идентификация и извлечение интересующей области (ROI) в образцах, сохраненных для ЭМ. Внешний вид одного и того же образца значительно отличается при анализе с помощью оптической микроскопии и после обработки для ЭМ-наблюдения. Изменения для химически подготовленных образцов включают анизотропную усадку образца после стадий обезвоживания (~10% в каждом измерении) и потерю флуоресценции при использовании осмия в протоколе фиксации и окрашивания(рисунок 1А). Для ультратонкого сечения образцы встраиваются в эпоксидные или акриловые смолы с использованием различных стратегий(рисунок 1B). Для получения успешных результатов данной подготовки весь образец необходимо фракционировать на кусочки, не превышающие 1 мм х 1 мм. Чтобы соответствовать стандартным условиям наблюдения за просвечивающей электронной микроскопией (ТЭМ), эта крошечная часть образца дополнительно секционируется до срезов толщиной 50-150 нм. Полученные изображения в оттенках серого показывают организацию ткани и структуру органелл мельчайшей доли всего образца с большей детализацией, чем любой другой метод микроскопии(рисунок 1C). Типичный набор данных TEM предоставляет 2D-информацию, теоретически экстраполированную для понимания процессов, естественно происходящих в 3D-пространстве в клетках и тканях. Рисунок 1D представляет собой проблему получения ультраструктурных объемов: если куб стороны 1000 мкм разделен толщиной 50 нм, то для покрытия всего объема потребуется 20 000 секций; для бокового куба размером 500 мкм это будет 10 000 секций. Для покрытия объема 50 мкм х 50 мкм х 50 мкм может потребоваться 1000 секций «только». Получение этого тома вручную практически невозможно и чрезвычайно сложно выполнить с автоматизацией. Если, помимо глубины образца, нам нужно покрыть всю поверхность таких гипотетических кубов, то покрытие поверхности 1мкм2 при разумном разрешении становится серьезной логистической проблемой(рисунок 1Е). В то время как для экстраординарных крупномасштабных проектов, таких как подходы коннектомики, большое количество секций имеет решающее значение, для большинства «обыденных» проектов ЭМ создание большего количества разделов, необходимых для наблюдения, представляет собой существенный недостаток.
Существует несколько методов получения 3D-ультраструктурной информации: серийная секционная просвечивающая электронная микроскопия (TEM), томография TEM, массивная томография (AT), сканирующая электронная микроскопия с последовательным блоком лица (SBF-SEM) и сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионно-лучевым сканированием (FIB-SEM). Принципиальные различия между этими методами заключаются в стратегии секционирования и в том, связано ли получение изображения с поколением раздела1. При последовательном секционировании ТЕА последовательные сечения собираются на щелевые сетки, изображения ТЕА генерируются из этих последовательностей и выравниваются2,3,4,5. В темографии ТЕА наклонные серии от 150-300 нм участков на сетке, а при соединении с последовательным сечением обеспечивают очень высокое разрешение, хотя и относительно небольшие объемы6,7,8. Подход AT использует физическое секционирование с разнообразными ручными и полуавтоматическими способами сбора секций на относительно больших опорах, таких как стеклянная крышка, кремниевые пластины или специальная лента. Для получения изображений поддержка анализируется в SEM, при этом доступны различные стратегии получения изображений9,10,11,12,13,14,15. Для SBF-SEM физическое сечение достигается с помощью мини-микротома с алмазным ножом, установленным непосредственно внутри камеры SEM, с изображением SEM, генерируемым с поверхности смоляного блока16,17,18,19. Для FIB-SEM источник ионов удаляет тонкие слои образца с последующим автоматическим изображением открытой поверхности SEM20,21. ТЭМ-томография и АТ генерируют физические участки, которые при необходимости могут быть повторно визуализированы, в то время как FSBF-SEM и FIB-SEM устраняют участок после визуализации. Недавняя комбинация физических участков, изображенных многолучевым SEM, обеспечивает комбинацию методов, которая решает проблему «узкого места» скорости получения изображения22. Каждый из этих методов произвел революцию в том, как можно получить и проанализировать электромагнитные данные, и каждый подход имеет свои практические последствия, связанные с данным исследовательским вопросом.
Учитывая характер подготовки и масштаб ультраструктурных размеров, непросто предсказать, где находится конкретная целевая структура в блоке выборки(рисунок 1D,E). Одним из решений для локализации ROI является запись изображений со всего блока в нужном разрешении с самого начала. Структуры, представляющие интерес, могут находиться в полученном объеме данных, когда они находятся вдали от микроскопа. Время сбора и обработка данных, связанных с этой стратегией, являются проблематичными. Желательно уменьшить объем записываемых данных, особенно если ROI значительно меньше тканевого блока, т. е. если объектами интереса являются специфические типы клеток (не целые органы). Различные коррелятивные методы световой и электронной микроскопии (CLEM) могут быть успешными, когда флуоресценция сохраняется и локализуется до или после приготовления в пределах одного образца23,24, 25,26,27,28,29. Тем не менее, многие клеточные структуры узнаваемы даже без флуоресцентной корреляции, только на основе известной ультраструктуры. В этих случаях мы считаем, что боковой скрининг Array Tomography обеспечивает баланс между усилиями, вложенными в локализацию ROI, и качеством ультраструктурной информации. Используя эту стратегию, подмножество секций на пластине экранируется через регулярные промежутки времени, которые могут быть установлены на основе размера и характера ROI. Как только ROI найдены, сбор данных настраивается в непрерывной серии разделов, начиная с до и заканчивая после якорной секции, собирая соответствующую информацию целевым образом.
Мы представляем протоколы для AT, которые упрощают и ускоряют получение интересующих регионов или событий в многочисленных разделах и дают более согласованные объемы изображений. Боковой скрининг и многоступенчатый сбор данных с очень высоким разрешением в точно целевых регионах. Процедура, которую мы описываем, решает несколько проблем сбора данных 3D EM, поскольку она предусматривает: совместимость с широким спектром образцов без фундаментального изменения рабочего процесса подготовки образцов; целевая локализация для секционирования и приобретения SEM; сокращение времени и усилий во время настройки; визуализация областей в нескольких секциях с лучшим выравниванием полученных объемов; и процедура плавного сшивания и выравнивания для компиляции различных изображений в сшитую мозаичную картину. Мы решили продемонстрировать силу нашего метода с помощью нескольких образцов из опубликованных и текущих проектов. Мы считаем, что такой подход может значительно облегчить генерацию и получение целевых данных em даже для исследователей с ограниченным опытом работы в EM.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы пробоподготовки описаны в других разделах14,30,31и не рассматриваются в данной публикации. Короче говоря, показанные примеры химически фиксировали глутаровым альдегидом, постфиксировали 1% OsO4,затем обрабатывали 1% водным уранилацетатом перед встраиванием во встраиваемую смолу. Альтернативно, образцы могут быть получены с использованием замораживания под высоким давлением, замораживания, замещенного 0,1% уранилацетатом в ацетоне и встроенного в акриловую смолу. Блоки образцов были подготовлены с использованием метода плоского встраивания, который позволяет четко видеть образец, облегчая его ориентацию для секционирования(рисунок 1B).
1. Процедура генерации массива
- Встроенная ориентация и обрезка образцов
- С помощью бинокля/микроскопа определите и отметьте рентабельность инвестиций на встроенной поверхности блока, слегка поцарапав поверхность блока лезвием бритвы. Это поможет сориентировать образец внутри ультрамикротома и уменьшит поверхность сечения.
- Зажмите образец на держателе ультрамикротома(рисунок 2А).
- Обрежьте смолу вокруг образца, сначала лезвием бритвы (грубая обрезка), а затем инструментом алмазной обрезки (тонкая обрезка; Рисунок 2А). Используйте ножи с наклоном кромки 20° или 90°, чтобы верхняя и нижняя поверхности блока были параллельны режущей кромке ножа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для последовательного сечения и получения прямых лент. - Смешайте ксилол и клей в пропорции 3:1. Ресницей, прикрепленной к зубочистке, нанесите эту смесь на верхний и нижний края обрезанного блока. Дайте ему тщательно высохнуть.
- Подготовьте монтажную опору массива А (т.е. кремниевые пластины).
- Вырежьте кусок пластины с помощью инструмента для расщепления пластин (EMS), отрегулировав его размер в соответствии с целью проекта. 2 см х 4 см удобно как для световых, так и для электронных микроскопических наблюдений.
- Очистите пластину в дистиллированной воде, чтобы избавиться от мусора.
- Тлеющий разряд/плазма очищают поверхность с помощью стандартного оборудования. Точные параметры будут зависеть от используемой машины. Начните с параметров разгрузки сетки и эмпирически отрегулируйте время. Этот шаг имеет решающее значение для хорошего распространения секций на опоре во время высыхания секций и не должен быть опущен.
- Подготовьте монтажную опору массивов B (т.е. стеклянную крышку)
- При планировании экспериментов с мультиплексной иммуномаркировкой перенесите образцы на крышку, чтобы лучше обнаружить флуоресцентный сигнал. Для улучшения адгезии обшивки используют подробную процедуру желатинового покрытия, описаннуюранее 9.
- Увеличьте проводимость, покрыв слайды оксидом индия-олова (ITO) или золотом путем испарения. Храните подготовленные крышки в чистой среде. Тлеющий разряд образцов, описанный в разделе 1.2.3.
2. Секционирование образца
- Подготовка ножа AT
ПРИМЕЧАНИЕ: Для генерации массивов используйте модифицированный нож (ATS), предназначенный для облегчения приобретения длинных лент. Ножи Histo-Jumbo или аналогичные ножи, предназначенные для генерации секций на больших опорах, также могут служить для секционирования AT.- Прикрепите иглу к нижней части ножа с помощью пенистой липкой ленты и проткните ее(рисунок 2B). Поместите нож ATS в держатель ультрамикротома под углом 0°. Отрегулируйте край ножа параллельно поверхности блока, используя стандартную процедуру.
- Поднесите обрезанный блок к краю ножа в положении, готовом к разделению.
- Поместите пластину/крышку внутрь ножевого таза и наполните его водой до того же уровня, что и лезвие ножа. Дайте алмазному краю ножа увлажниться должным образом и при необходимости отвести воду с помощью прикрепленного шприца(рисунок 2С).
- Секционирование и передача массива
- Установите микротом на нужные параметры резки. С ножом ATS рекомендуется диапазон 50-100 нм и скорость резания 0,6-1 мм/с. Начать секционирование(рисунок 2Di).
- Получите ленту длины, которая будет покрывать целевой z-том, и остановите коллекцию. В зависимости от размера блока, однородности ткани и типа смолы лента будет относительно прямой(рисунок 2D-ii). Многие образцы не будут производить прямые ленты, несмотря на вложенные усилия и тип используемого ножа.
- В зависимости от конечной цели, сделайте одну длинную или несколько коротких лент, выровненных бок о бок. Опора размером 2 см x 4 см может удобно вмещать от 100 до 1000 секций. Расположение ленты на опорной ступени – это ступенька, требующая ловкости и твердых рук. Тем не менее, кривая обучения этому навыку быстро приобретается.
- Отсоедините ленту от лезвия ножа с помощью чистого, нелипкого кончика ресницы, наклеенного на зубочистку(рисунок 2Diii).
- Используя ресницы, аккуратно переместите ленту над центром поддерживающей среды. В этот момент используйте хлороформ или нагревательную ручку для растяжения секций, если это необходимо. Однако помните, что эта манипуляция может вызвать разрыв и деформацию ленты.
- Начните сливать воду, потянув за шприц. Для более тонких лент или более медленного втягивания воды дайте воде капнуть, отсоединив шприц от шланга. Когда уровень воды опустится до уровня пластины, контролируйте ленту и при необходимости переместите ее, осторожно подталкивая ленту к центру. После оседания лент на поверхности пластины продолжайте слив до полного удаления оставшейся воды из бассейна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы не используете нож ats для втягивания нижней воды, осторожно уменьшите воду с боков ножа ATS, чтобы не вызвать турбулентность. - Оставьте секции на опоре внутри ванны, чтобы дать полностью высохнуть. В зависимости от гидрофобности опоры и уровня влажности окружающей среды вода будет испаряться с разной скоростью(рисунок 2Div). Важно, чтобы образец высыхал медленно, чтобы уменьшить или вообще избежать всех складок на образце.
- Переложите сухой образец в плотно закрытую коробку для защиты от загрязнения грязью и поместите его в духовку с температурой 60 °C не менее чем на 30 минут. При необходимости противодействуйте секциям с использованием тяжелых металлов для повышения общей контрастности.
- В конце процедуры осторожно очистите нож, следуя инструкциям производителя
ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос нескольких или последовательных секций на пластину(рисунок 2E)по сравнению с переносом по щелевой сетке(рисунок 2F)полностью изменяет опыт подготовки ЭМ. Непрерывное секционирование и сбор разделов на одной опоре уменьшает количество ошибок, связанных с секционированием и сбором разделов, часто встречающихся при последовательном секционировании. Эквивалент 100 секций размером 1000 мкм х 500 мкм, собранных на одной пластине, соответствует 33 щелевым сеткам(рисунок 2G).
3. Наблюдение за выборкой
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются этапы рабочего процесса, реализованные с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Можно использовать любое программное обеспечение для получения изображений на любом SEM, оснащенном правильными детекторами, однако конкретные действия пользователя будут отличаться и часто будут более ручными.
- Получите обзорную карту изображений SEM, которая показывает расположение секций на пластине. Встроенное изображение оптической камеры помогает определить мозаику изображения SEM, которая охватывает ленту секций или все секции. Создайте мозаику, перетащив мышью прямо на изображение образца с камеры и запустите функцию автоматического сбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно очень грубых настроек изображения, т.е. размер пикселя 1-2 мкм и время выдержки 1 мкс. Этот процесс проиллюстрирован в Дополнительных материалах (стр. 2-7). - Найдите разделы с функцией автоматического обнаружения section Finder или найдите их вручную. Положения и контуры секций извлекаются автоматически с помощью этого программного обеспечения на основе сопоставления изображений. Иллюстрацию этого процесса см. в Дополнительных материалах (стр. 8 - 15).
- В случае, если обзорные изображения не показывают ROI четко, получите изображения секций с более высоким разрешением. Используйте функцию предварительного просмотра разделов для автоматического создания и получения изображений. Этот процесс проиллюстрирован в Дополнительных материалах,страницы 16-18. Параметры изображения должны выбираться в соответствии с характером и размером ROI, который ищет пользователь.
- Чтобы найти оптимальные настройки, активируйте Live Imaging в программном обеспечении управления микроскопом и перейдите к одной окупаемости инвестиций. Изменяйте параметры изображения до тех пор, пока на изображениях не будет четко показана рентабельность инвестиций, но получение изображения не будет слишком длинным.
- Определение областей изображения
ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается несколько различных стратегий.- Если необходимо визуализировать только несколько разделов, используйте изображения разделов, созданных до сих пор, для перехода к соответствующим разделам и используйте Zoomable Viewer, который показывает все полученные изображения в их исходных относительных местоположениях, чтобы посмотреть на все разделы. Как только будет найден раздел, который должен быть изображен с высоким разрешением, создайте область изображения с помощью перетаскивания щелчком мыши. Выберите параметры изображения с высоким разрешением и сохраните их в шаблоне. Повторно используйте этот шаблон для дальнейших разделов.
- Чтобы найти особенно маленькие или трудно обнаруживаемые редкие события, используйте подход бокового скрининга. Вручную создайте область изображения с параметрами изображения высокого разрешения на каждом десятом участке или на одном участке на ленте и получите изображения. Просмотрите изображения и отметьте разделы, содержащие рентабельность инвестиций в программном обеспечении, или сделайте заметку.
- Начиная с разделов, содержащих рентабельность инвестиций, перемещайтесь вперед и назад по набору разделов и создавайте области изображения с высоким разрешением в тех же относительных местах до тех пор, пока структура все еще видна в разделе. Это можно сделать вручную или с помощью процедуры, описанной в следующих шагах.
- Получайте изображения в более чем десяти последовательных разделах. Нажмите кнопку Начать уточнение положения после масштабирования изображения, чтобы повысить точность расположения зарегистрированных разделов, как описано в руководстве. Это уменьшает изменчивость положения серий изображений. Эта процедура проиллюстрирована и объяснена на страницах 19-21 Дополнительных материалов.
- Щелкните и перетащите любой раздел, чтобы определить область изображения, удерживая клавишу ALT, и выберите «Создать массив набора плиток» в контекстном меню, которое открывается при отпускании кнопки мыши. Затем программное обеспечение создает области изображения в одном и том же относительном расположении во всех разделах, которые были найдены или помечены ранее. Можно ограничить изображение определенным диапазоном участков с помощью ползунка Section Span.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может быть повторена с любым количеством областей изображения и, следовательно, позволяет записывать много небольших изображений с высоким разрешением вместо записи одного большего изображения на каждом участке. - После создания настройте количество пикселей, размер пикселя, макет плитки, время ожидания пикселя и т. Д. В каждой серии изображений по мере необходимости. После создания и настройки серий изображений все они перечисляются в подсказке задания.
- Настройка автоматических функций и запуск сбора изображений
- Создайте отдельный ряд изображений для автоматических функций, используя тот же метод, который описан на предыдущем шаге. Переместите ряд изображений в положение раздела, содержащего высококонтрастные структуры.
- Установите для серии изображений значение 1024 x 884 пикселя и выберите размер пикселя, соответствующий самому высокому разрешению, используемому в серии изображений, настроенной на предыдущих шагах. В списке автофункций установите флажки Автофокус и Авто стигматор.
- Выберите «По разделу» в элементах управления последовательности получения и убедитесь, что изображение автоматических функций является первым элементом в списке. Начните получение изображения, нажав кнопку Выполнить рядом с подсказкой задания. Эти процедуры проиллюстрированы в Дополнительных материалах,страницы 22-23.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости вручную предварительно фокусироваться на каждом разделе. Во время сеанса записи, всякий раз, когда микроскоп переходит в новую секцию, автоматические функции будут выполняться до того, как все другие изображения будут записаны в этом разделе.
4. Выравнивание и анализ данных
- Экспорт данных
- Убедитесь, что данные сохранены в .tif формате, поэтому нет необходимости в выделенной функции экспорта. Сортировка данных в структуру папок, которая соответствует непосредственно слоям и элементам в дереве слоев.
- После записи мозаики изображений используйте функцию StitchAll для автоматического сшивания всех плиток.
- Выравнивание стека и обрезка на Фиджи
ЗАМЕТКА. Многие программные пакеты (бесплатные и коммерческие) могут быть использованы для работы с данными Array Tomography. Приведенные ниже шаги показаны с программой с открытым исходным кодом Fiji32, потому что она широко доступна и содержит все необходимые функции.- Импортируйте стопку изображений (или сшитых изображений) на Фиджи в виде виртуального стека.
- Если контрастность/яркость необходимо нормализовать, выберите Повышенная контрастность... в меню Процесс. Установите для параметра Насыщенные пикселы значение 0,1 или меньше и установите флажок Обрабатывать все фрагменты.
- В меню Плагины выберите Регистрация | Линейное выравнивание стека с помощью SIFT.
- Выберите Жесткий или Аффинный в раскрывающемся меню Ожидаемое преобразование. В противном случае сохраните параметры по умолчанию. Начните выравнивание, нажав кнопку ОК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка данных в виде виртуального стека позволяет Фиджи обрабатывать стеки любого размера. Вывод выравнивания создается в оперативной памяти; однако это может ограничить максимальный размер стеков, которые могут быть обработаны. В этом случае используйте Параметр Register Virtual Stack Slices, который представляет собой реализацию того же алгоритма регистрации между папками. После завершения регистрации загрузите выходные данные в виде виртуального стека. - Обрежьте стек изображений, щелкнув Обрезать, чтобы он содержал только рентабельность инвестиций.
- Сохраните стек как одно .tif изображение или серию .tif изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критические этапы массивной томографии показаны на рисунке 3.
Representative Results
Приведенные ниже примеры призваны продемонстрировать универсальность рекомендуемых рабочих процессов. Иллюстрации тематических исследований — это проекты, для которых у нас были трудности с получением удовлетворительных результатов с помощью любых других методов. Мы выбрали дрозофилу взрослую, чтобы проиллюстрировать типичные проблемы, с которыми можно столкнуться с образцами многочисленных типов. Этот трубчатый орган длиной около 6 мм, 500-1000 мкм в поперечном сечении, разделен на различные области с уникальной функцией и клеточным составом(Рисунок 4А)33. В зависимости от ориентации сечения размеры профиля кишечника и его внешний вид на участке варьируются. Либо поперечно, либо продольно ориентированные участки относительно велики, и только пара может быть размещена на одной сетке ТЕА(рисунок 2F). Только небольшая часть ткани может быть изображена в FIB, а для SBF-SEM сложность аналогична любым неоднородным образцам. AT обеспечивает эффективный компромисс для анализа таких образцов, а плоское встраивание облегчает локализацию ROI. Тщательная обрезка избытка смолы вокруг выбраннойобласти (рисунок 4B)важна для эффективного сбора массивов из соответствующейобласти (рисунок 4C). Сотни секций могут быть собраны на одной пластине последовательно или случайным образом(рисунок 4D). В зависимости от исследовательского вопроса, отбор и получение образцов потребует другой стратегии, которую мы произвольно разделили на несколько сценариев. Чтобы проиллюстрировать различные представленные сценарии более целенаправленным образом, мы выбрали несколько тематических исследований из разных исследовательских проектов.
Анализ многочисленных случайно распределенных крупных структур в диапазоне 1-10 мкм(рисунок 4E)
Часто ультраструктурные данные требуются для подтверждения гипотезы, возникшей из нескольких экспериментальных подходов, сравнивая стандартное и экспериментально измененное состояние. В этих случаях несколько секций обычно случайным образом собираются на сетках и экранируются для локализации и изображения областей, представляющих интерес. Эта тактика обычно менее систематична и ограничена небольшим количеством анализируемых разделов. Мы предлагаем записывать обзоры десятков/сотен секций среднего разрешения с данной ленты(рисунок 4D). Для типичных секций 70 нм 200 секций будут охватывать приблизительно 14 мкм, которые будут содержать многочисленные ячейки, полностью или частично, завершенные в течение получаса. В качестве первого шага записывается обзор всей ленты с низким разрешением, и обзор помогает опустить разделы, которые показывают артефакты подготовки (например, складки, грязь). После этого сбор может быть выполнен вручную или автоматически непосредственно на выбранных частях секции, или целой секции, с использованием одиночной или мозаичной визуализации с последующей сшиванием(рисунок 4E). После этого изображения из выбранной области могут быть получены с использованием параметров высокого разрешения. Например, митохондрии, ядра и микроворсинки могут извлечь выгоду из такого статистически улучшенного метода(рисунок 4Ei-iii).
Анализ нескольких малых, разреженно распределенных структур в диапазоне 500-1000 нм (Дополнительный фильм 1)
В этом случае рентабельность инвестиций не может быть просто идентифицирована при обзорном сканировании с низким увеличением, и необходимы изображения с высоким разрешением. В обычных образцах ТЕА необходимо утомительное увеличение и уменьшение масштаба участка до тех пор, пока не будет найдена требуемая функция. Часто визуализация нескольких независимых мест в нескольких выборках более актуальна статистически, чем генерация одного большого объема. В таких случаях сложность ручного приобретения растет в геометрической прогрессии. Хотя некоторые решения ТЕА позволяют автоматически собирать или отсеивать несколько сетей, размер сетки и проблемы последовательного секционирования часто делают этот подход несовместимым для многих образцов. Для аналогичных случаев мы генерируем полную карту среднего разрешения общей рентабельности инвестиций в нескольких секциях с разрешением, достаточным для определения структур, представляющих интерес. Во время этого этапа бокового скрининга желательно прыгать на несколько секций одновременно, стремясь поразить, по крайней мере, часть интересующей структуры при случайном приближении. Это будет в значительной степени зависеть от общих размеров структуры: например, если общий размер структуры составляет 500 нм, а секции имеют толщину 50 нм, по крайней мере, девять последовательных секций подряд, вероятно, будут содержать часть интересующей структуры. Таким образом, пропуск 6-7 секций должен быть эффективным для обнаружения множества различных видов структур в нескольких областях. Автоматическое получение разрешенных мозаичных карт выбранных участков позволяет тщательно отсеивать эти участки после их получения. Как только такая карта с высоким разрешением получена, несколько ROI могут быть обрезаны или использованы для определения дополнительных локальных областей изображения на ROI(Дополнительный фильм 1). Гольджи, центриоли, соединения, микротрубочки, различные типы везикул являются хорошими примерами структур, которые могут извлечь выгоду из этого сценария(Дополнительный фильм 1).
Анализ разреженных больших ROI в больших выборках (рис. 4F-4H)
Этот сценарий включает в себя редкие события, которые часто описываются как «иголка в стоге сена», в которых проблема заключается не в идентификации ROI, а в ее локализации. Для многих образцов корреляционный подход не является допустимым вариантом, но часто ROI имеет показательную ультраструктуру и при локализации может быть идентифицирован с высокой надежностью. Для этих образцов важно применять многоуровневое получение, начиная с предварительно отсеянных образцов с десятками и сотнями секций со средним разрешением. В используемом здесь программном обеспечении есть две различные стратегии для получения наборов изображений из нескольких секций: запись изображений предварительного просмотра с более высоким разрешением или получение array Tile Set с подходящими настройками(рисунок 4F). Различные специализированные типы клеток вкишечнике дрозофилы распределяются случайным образом (например, стволовые, энтероэндокринные клетки) и тонко секционируются в случайной ориентации. Тем не менее, их можно визуально отличить после скрининга изображений, полученных с использованием параметров высокого разрешения, либо из отдельных секций, либо в виде коллекции последовательных изображений(рисунок 4G). После выравнивания стеки могут быть отрисованы с использованием различных программныхрешений (рисунок 4H,дополнительный ролик 2).
Сценарий 1: Кишечные органоиды (рисунок 5А)
Органоиды быстро становятся одним из самых передовых инструментов современных наук о жизни. Эта почти физиологическая 3D-модель органов, полученная из стволовых клеток, позволяет точно изучить ряд биологических процессов in vivo, включая обновление тканей, реакцию на лекарства и регенеративную медицину. Недавно представленные мини-кишечные трубки34 открывают новое поколение органоидной технологии, очень напоминающей физиологию тканей in vivo, состав клеточного типа и гомеостаз, что позволяет широко использовать модели заболеваний, взаимодействие микробов-хозяев и открытие лекарств. Однако, когда требуется ультраструктурная характеристика, локализация различных типов клеток в такой большой ткани с использованием случайных образцов может быть сложной задачей. Кроме того, в переменных анализах «инфекции» крайне важно убедиться, что анализ выявляет различные стадии развития, которые влияют на ткань. Для таких исследований статистически значимый охват выборки является центральным, однако его трудно достичь с использованием традиционного сетевого подхода ТЕА. AT-сценарий 1 полезен в таких случаях: многие последовательные участки могут быть сгенерированы на пластине(рисунок 5Aii)и экранированы с использованием параметров низкого разрешения для локализации общих областей интереса(рисунок 5Aiii;стрелки). Эти области могут быть нацелены на дальнейший анализ с использованием расширенных параметров сбора(рисунки 5Aiv и рисунок 5Av). При обнаружении соответствующей структуры (обычно кластер из 5-10 секций один раз в каждые 100-300 секций) легко сосредоточиться на каждой из интересующих структур и получить отдельные изображения вручную или использовать функции автоматизации для получения объемов изображений в нескольких секциях.
Сценарий 2: Drosophila pupal notum (рисунок 5B)
Изучение деления клеток и механизмов, контролирующих прогрессирование клеточного цикла, имеет решающее значение для понимания как стандартных, так и измененных процессов в многоклеточных организмах. Существующая информация часто поступает из одноклеточных систем; однако этому решению не хватает критического контекста 3D-взаимодействий между клетками в ткани. Одноклеточный монослой нотума, развивающейся задней части личинки дрозофилы, является идеальной моделью взаимодействия между эпителиальными клетками в целом и делением клеток в частности35. Это установленная модель для исследований молекулярных и клеточных взаимодействий с использованием комбинации данных, доступных флуоресцентной микроскопией и генетическими манипуляциями. Абсциссия, последняя стадия деления клеток, обеспечивает окончательное разделение между двумя делящимися клетками, и характеристика структурных изменений, которые происходят во время абсциссии, имеет важное значение для нашего понимания митоза. Однако митотические деления в нотуме нелегко локализовать на ультраструктурном уровне: клетки относительно большие, по сравнению с зоной абсциссии(рисунок 5В). Соотношение между общим размером зоны абсциссии и поверхностью покрываемого участка велико(рисунок 5Bi). Несмотря на то, что локализовать зону абсциссии можно с помощью методов ТЭМ или SBF-SEM36,задача трудоемкая. В этом сценарии автоматические обзорные изображения со средним разрешением скачков 20-40 секций могут быть использованы для локализации делящихся клеток(рисунок 5Bii). Когда такие клетки идентифицированы, участки служат якорем для более тщательного изучения участков в окрестностях, а многочисленные делящиеся клетки могут быть найдены и отобраны для дальнейшего анализа. Таким образом, зона абсциссии может быть расположена и изображена целиком(рисунок 5Biii). В зависимости от вопроса, для покрытия глубины структуры могут быть собраны одиночные изображения с высоким разрешением или 3-7 последовательностей изображений(рисунок 5Biv).
Сценарий 3: Нейроны таницита мыши (рисунок 5C)
Мышь обеспечивает хорошо зарекомендовавшую себя модель развития мозга и хорошо документирована на разных уровнях, в том числе с помощью ЭМ. Несмотря на то, что различные автоматизированные методы серийного блока лица широко использовались для изучения мозговой ткани, есть случаи, когда АТ лучше адаптируется для сбора необходимых данных. Гипоталамус — это хорошо зарекомендовавшая себя модель нейробиологии, часть мозга, которая содержит несколько нейронных типов функций. Гипоталамические танициты представляют собой особое подмножество эпендимоглиальных клеток, выстилающих дно третьего желудочка, с необычно длинными отростками (до 300 мкм) и крупными конечными клетками (~5 мкм)37. Это делает их неудобными для анализа методами ТЕА или ФИБ. Задача еще более усложняется, когда необходимо локализовать и проанализировать несколько независимых таницитов. Одним из подходов, облегчающих эту задачу, может быть полукоррелятивное таргетирование, при котором флуоресцентная карта получается из флуоресцентно меченых образцов перед фиксацией и встраиванием для ЭМ. Секционирование выполняется на участке, захваченном путем объединения позиционной информации из флуоресцентного образца и плоской встроенной пластиковой реплики. После этого можно использовать сценарий AT 3: генерируются высокоуровневые обзорные мозаичные изображения для выявления областей с кластерами конечных фитов таницитов. Впоследствии функции автоматизации в программном обеспечении используются для настройки получения последовательностей изображений из одной или нескольких областей в одном изображении или мозаичном режиме. Эти изображения могут быть проанализированы отдельно, как выровненные стеки или отрисованы после этого.
Мощность метода AT позволяет относительно легко «модернизировать» данные с 2D на 3D: карты доступны при первичном сборе, а объемы можно получить из выбранного района и его окрестностей. Полученный стек можно выровнять и впоследствии отобразить. Важно заранее определить, какое разрешение и качество изображения необходимы для поиска ROI. Изображение должно позволять распознавать ROI, но не сверх этого значения, поскольку время захвата масштабируется пропорционально времени ожидания пикселя и обратному квадрату размера пикселя.
Рисунок 1:Проблемы подготовки образцов ЭМ и получения объема. (A) Потеря флуоресценции и усадки происходит из-за высокой концентрации тяжелых металлов и обезвоживания во время подготовки образца. i) схематический чертеж образца, наблюдаемого в рамках ЛМ ii) того же образца, подготовленного для ЭМ, который становится полностью непрозрачным и теряет около 10% своего объема. (B) Встраивание образцов обычно выполняется с использованием эпоксидных или акриловых смол. Традиционные блоки (i) могут быть успешно использованы для однородных образцов, не требующих определенной ориентации. Плоские блоки (ii) полезны, когда важно нацеливаться и ориентироваться под микроскопом, точную область, предназначенную для секционирования, например, в неоднородных образцах или процедурах корреляционной микроскопии. (C)Из всего объема образца только ограниченная часть представлена на одном участке 50 нм, обеспечивая 2D-изображение 3D-образца, часто в незнакомой ориентации. Чтобы проиллюстрировать проблему записи чрезмерно больших объемов по сравнению с точным нацеливанием, мы выбрали три концентрических куба с гранями 1000, 500 и 50 мкм, организованных таким образом, чтобы включить гипотетический образец 1000 x 500 x 500 мкм (темно-бордовый). Если такие гипотетические кубики образцов тщательно разделить срезами по 50 нм, чтобы покрыть весь объем, потребуется в общей сложности 20 000, 10 000 и 1000 срезов и 800 ТБ, 100 ТБ и 100 ГБ соответственно (разрешение изображения 5 нм x 5 нм x 50 нм, 8 бит данных). Это показывает важность планирования сбора электромагнитных данных только для получения минимально необходимого объема. (E)Покрытие большой площади поверхности образца в высоком разрешении представляет собой проблему, аналогичную проблеме большого объема. Объединение нескольких изображений с высоким разрешением в одно является полезным решением для такой проблемы. Тем не менее, чтобы покрыть поверхность 1 мм х 1 мм с использованием рамы 2024 x 1048 в 10 000-кратном увеличении, потребуется огромное количество плиток, которые могут стать сложными для сшивания. Кроме того, если секции по-разному сжимаются или искажаются во время резки, полученные стеки данных становится почти невозможно выровнять. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Рабочий процесс для непосредственной генерации массивов секций на большой опоре. ( A ) Дляплотнойобрезки с помощью инструмента обрезки блоки закрепляются внутри держателя микротома. Этот шаг помогает обеспечить параллельные стороны блока, а также уменьшает пустую смолу вокруг образца. (B) Модифицированный нож для приобретения секций AT. Большая лодка облегчает перенос секций и их манипуляции во время секционирования образцов и переноса на опору. Большой бассейн позволяет манипулировать секциями; дренажная система ограничивает движение лент во время дренажного этапа, плоское дно делает постепенную сушку опоры надежной. (C)Нож, готовый к разделению с тлеющей разряженной пластиной, помещенной на дно бассейна и выровненной по краям водой. Конструкция ножа удерживает иглу встроенной, не мешая опоре. (D) Генерация массива, вид сверху на область сечения микротомов. i) Первые секции, как правило, легко получить, поскольку они прилипают друг к другу и образуют обычную ленту. ii) Когда к ленте добавляется больше секций и она становится длиннее, лента теряет свою устойчивость и часто изгибается. Крайне важно, чтобы дорожки последовательности были организованы в последовательности при подготовке к этапу получения изображения. iii) Когда лента из секций достигает желаемой длины, она тщательно отсоединяется от лезвия ножа с помощью ресниц. iv) вода сливается из бассейна; пластина остается внутри до тех пор, пока она полностью не высохнет на воздухе. Этот шаг имеет важное значение, так как он помогает выпрямить участки и избежать образования микро складок. Пластину помещают в духовку при температуре 60°C на срок не менее 30 мин для крепления секций на опоре. (E) Примеры пластин с перенесенными секциями. Хотя удобно получать прямые и точные ленты, фактические образцы предотвращают образование таких идеальных лент в большинстве случаев. Тем не менее, даже «неряшливые» ленты очень информативны для огромного количества случаев, а важность «аккуратной» ленты будет зависеть от исследовательской стратегии, для которой собираются разделы. Шкала 1 см. (F) Пример сетки слотов с последовательными секциями. Даже когда много секций собрано на одной сетке, это все равно крошечная доля того, что может быть собрано на одной пластине. Навык, необходимый для освоения переноса участков на сетку (в частности, щелевую сетку), представлял собой значительное узкое место для освоения электронной микроскопии пробоподготовки. Шкала 500 мкм.(G)Независимо от того, какой метод сбора секций был использован, сильной стороной подхода AT является относительная легкость генерации последовательных секций по сравнению с внутрисетевым сбором. Если рассматривать блок образцов размером 1000 мкм х 500 мкм, то нет проблем с размещением около 100 секций на пластине размером 2 см х 4 см (i). Секции одинакового размера на сетке слотов будут помещаться только для трех секций / сетки максимум (ii). Мы предоставляем масштабированное изображение, чтобы показать, сколько сеток может потребоваться для покрытия одного и того же количества секций, не говоря уже о сложности сбора последовательных секций на сетке. Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Критические этапы рабочего процесса массивной томографии. Схема рабочего процесса для автоматического получения стеков изображений с высоким разрешением. Все подготовительные шаги автоматизированы (зеленые символы шестерни) и не требуют выполнения каких-либо действий вручную, раздел за разделом. Стеки изображений могут быть выровнены в любом программном обеспечении для анализа изображений, способном к автоматическому жесткому или аффинному выравниванию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Три сценария приобретения с дрозофилой взрослой кишки в качестве демонстрационной модели. (A)рисунок расчлененной средней кишки Drosophila, с тремя основными областями, обозначенными различными цветами: передней, средней и задней. (B) Обрезанный плоский блок, в котором кишка ориентирована на поперечное сечение. Обратите внимание, что количество пустой смолы тщательно сбалансировано вокруг ткани, содержащей интересующую область (белый прямоугольник). (C) Поперечные последовательные секции плавают на поверхности воды внутри бассейна ножа АТ. Все изображения были получены в режиме Вторичного электрона SEM с помощью зеркального детектора с обратным контрастом. (D) Сшитое мозаичное изображение поперечных последовательных сечений на пластине. Шкала стержня составляет 1000 мкм.(E)Поперечное сечение через кишечник дрозофилы. Шкала 20 мкм. Изображение представляет собой сшитую мозаику из изображений среднего диапазона 7 x 7. Вставки - изображения с более высоким увеличением и разрешением конкретных областей, представляющих интерес: (ii) ядро, (iii) граница кисти и (i) митохондрии. Шкала 5 мкм для всех. (F)Среднее изображение поперечного сечения через кишечник, которое нацелено на местоположение развивающихся клеток (квадрат). Шкала составляет 20 мкм. (G) Целевой массив последовательных секций, собранных на основе области, локализованной в ходе анализа секции, присутствующей в панели F. Шкала составляет 10 мкм. (H) 3D-модель визуализируется на основе последовательности стека из 50 секций, полученной из целевого последовательного сбора на панели G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Тематические исследования для сценариев применения АТ. (А) Локализация различных клеточных структур в кишечном органоиде. i) Встроенный кремниевый микрочип. Шкала = 200 мкм. (ii) Сшитое мозаичное изображение из 127 поперечных сечений через центральную часть чипа. Шкала бара = 1500 мкм (iii) Четыре изображения с низким разрешением полного поперечного сечения через часть кишечного органоида. Стрелки указывают на потенциальный интересующий сайт. Шкала составляет 20 мкм. (iv) Различные ROI, предназначенные для микроснимков с низким разрешением, выбранных для дальнейшего анализа. Шкала = 10 мкм. (v) Изображение с высоким разрешением зараженной интересующей клетки. Анализ одной и той же области в смежных разделах может предоставить целевую 3D-информацию, если это необходимо. Шкала bar = 5 мкм. (B) Локализация среднего тела у Drosophila melanogaster pupal notum. i) схематический вид рассеченной куколки дрозофилы. Нотум выставляется для рассечения (бежевый) после удаления части защитной кутикулы (коричневой). Черная линия обозначает направление сечения (ii) Поперечное сечение через область, представленную на диаграмме. Изображение сочетает в себе 3x7 последовательно сделанных SEM-изображений высокого разрешения, сшитых на одной мозаичной панели. Черный прямоугольник разграничивает область, содержащую делящуюся ячейку. Шкала составляет 15 мкм. (iii) Увеличенное изображение на делящейся ячейке с панели ii. При таком увеличении и разрешении видно среднее тело (белые стрелки). Весь раздел анализируется, чтобы найти делящиеся клетки. Прыжки между различными лентами секций с интервалом в 20-30 секций на этапе бокового скрининга позволяют локализовать многочисленные пары делящихся клеток. Шкала составляет 5 мкм (iv), когда локализована делящаяся клетка, последовательные изображения среднего тела собраны из четырех секций вокруг среднего тела, ограниченных желтым квадратом на панели (iii). Шкала бара составляет 1 мкм.(C)Локализация конечного плода tanycytes в гипоталамусе мыши. i) Флуоресцентное изображение среза вибратома. Танициты экспрессируют tdTomato флуоресцентный белок (красный). Белый прямоугольник разграничивает интересующую область. Шкала 500 мкм. (ii) Та же секция вибратома, подготовленная для ЭМ, будет тщательно обрезана вокруг интересующей области на основе косвенной корреляции флуоресцентной информации от панели (i). Пунктирная белая линия представляет область ультратонкого сечения. Шкала составляет 50 мкм для обеих панелей. iii) поперечное сечение через срез вибратома в интересующей области. Мозаичное изображение SEM состоит из 75 сшитых изображений. Несколько участков нацелены на боковой скрининг и визуализируются с аналогичными параметрами. Разделы анализируются «в автономном режиме» с целью нахождения ROI - конечного фита таницита. Черный прямоугольник представляет область, содержащую концевую часть таницита. Этот раздел послужит якорем для дальнейшего анализа. Шкала бара составляет 15 мкм. (iv) Изображение с высоким разрешением и высоким увеличением конечного плода таницита, окружающего кровеносный сосуд. После первоначальной локализации ROI на одном участке z-последовательность собирается с соседних участков вверх по течению до якорной секции (панель iii). Шкала 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Проблемы во время ультрамикротомии, сбора секций и хранения секций могут привести к артефактам. (A) Участки образцов мозга на пластине. Большая часть пустой смолы отделяется от ткани и складывается на себя (сепия). Пунктирный черный ящик обозначает область, которая используется для размещения всего раздела. Шкала бар 500 мкм. (B) Небольшая, локальная складка на поверхности 50-нм толстого участка рыбок данио. Шкала полосы 1 мкм. (C) Маркировка ножа на поверхности 70-нм участка мозга мыши. Шкала 5 мкм. (D) Волос (звездочка) на поверхности пластины, которая частично покрывает мышечный участок рыбки данио. Желтым цветом ткань нацелена на анализ. В розовом цвете клетка служила ориентиром для размера пораженного участка. Шкала полосы 50 мкм.(E)Рыбки данионохорды с морщинами в правом нижнем углу (черные стрелки), где плотная нервная ткань (затененная синим цветом) граничит с более мягкой мышечной тканью и пустой смолой (черные стрелки). Шкала 10 мкм. (F) Объемная сегментация стека из 50 изображений, как в E, показывая, что эта область показала морщины в большинстве участков. Пунктирный многоугольник очерчивает область, показанную в шкале G. Шкала 10 мкм. (G) XY вид той же объемной сегментации, что и в F, показывая морщины в виде коротких черных штрихов в правой половине блока. Обратите внимание, что выравнивание стопки в оставшихся частях ткани не зависит от морщин. Шкала бара 5 мкм. (H) XZ проекция той же области, что и в G, показывающая морщины во всех 50 секциях. Шкала 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный фильм 1: Монтажное изображение с высоким разрешением поперечного сечения через переднюю среднюю кишку дрозофилы. Мозаичное изображение перевернутого изображения SE-MD SEM. 352 отдельные плитки изображений были автоматически получены с разрешением 5 нм и сшиты, чтобы представить все поперечное сечение. Можно увеличить для получения более подробной информации и получить исчерпывающее покрытие данных, используя одно и то же изображение. Плотные соединения, микротубулы, разные типы везикул могут быть при увеличении. Шкала составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный фильм 2: Рендеринг клеток кишечника дрозофилы. Пятьдесят выровненных мозаичных изображений участков в области деления клеток кишечника. IMOD-рендеринг границ клеток (синий, бирюзовый и оранжевый) и ядер (белый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Электронная микроскопия дает представление об ультраструктуре клеток и организмов, для чего часто желательно изображать интересующие структуры в их 3-мерном контексте. Несмотря на многочисленные электромагнитные тактики для ультраструктурного анализа, до сих пор нет решения «золотого стандарта». Основной причиной является большое разнообразие образцов, множество биологических вопросов, которые часто требуют индивидуального подхода. Предлагаемый рабочий процесс AT предназначен для минимизации времени, необходимого для обработки образцов, сбора, оценки и хранения данных. Кроме того, модифицированный нож является полезным инструментом для упрощения сбора массива. Компактная компоновка секций на пластинах удобна, как для наблюдения, так и для последующего хранения образцов. Такое расположение позволяет проводить «боковой скрининг» образцов путем горизонтального перемещения от ленты к ленте и сканирования только одной секции на каждой, что значительно сокращает время, необходимое для локализации ROI. Предлагаемые сценарии сбора данных облегчают нацеливание на небольшие и случайно распределенные районы. После обнаружения AT/SEM ограничивает изображение с высоким разрешением точно интересующим объемом, независимо от того, выполняется ли оно вручную или с помощью автоматической функции. AT для ограниченных объемов может быть заполнен вручную, при этом оператор перемещается по образцу и определяет области изображения один за другим. Автоматизированный модуль программного обеспечения обеспечивает гибкую стратегию получения изображений для визуализации небольших участков на больших участках. Автоматизация в этом программном обеспечении позволяет записывать большие изображения с высоким разрешением на сотни секций, достигая таких же объемов, как SBFI. Запись обзорных изображений всех участков упрощает локализацию ROI и сокращает время, проведенное за микроскопом. Поскольку разделы не повреждаются во время записи обзоров и предварительного просмотра с более высоким разрешением, AT/SEM позволяет повторно использовать образец для сбора дополнительных данных о других ROI или с более высоким разрешением.
Время получения изображения является одним из наиболее важных (и самых дорогих) аспектов 3D EM и поэтому должно учитываться при разработке эксперимента. Хотя неудивительно, что визуализация больших областей занимает больше времени, чем визуализация небольших областей, легко недооценить воздействие: в зависимости от выбранных параметров изображения время съемки на каждом участке может варьироваться от секунд до часов. Критические параметры изображения включают размер поля зрения, разрешение и время ожидания. Предполагая целевое разрешение 10 нм на пиксель и время ожидания 1 мкс, визуализация поля размером 20 мкм x 20 мкм, 100 мкм x100 мкм или 500 мкм x500 мкм требует 4 секунд, 100 секунд или 2 500 с для записи. Мы можем умножить это время визуализации на секцию на количество секций, чтобы оценить время, необходимое для завершения работы по визуализации. Длительное время визуализации на секцию может быть приемлемым, если количество секций невелико или если время инструмента микроскопа не имеет значения.
Тем не менее, в большинстве случаев необходимо ограничить время записи ночной работой или работой в выходные дни. Не менее важным аспектом 3D EM, который следует учитывать, является количество и структура полученных данных изображения. Запись вышеупомянутых полей изображения в 100 разделах генерирует 400 МБ, 10 ГБ или 250 ГБ данных изображения соответственно; изображения размером 500 мкм x 500 мкм представляют собой дополнительную проблему, заключающуюся в том, что каждый из них превышает 2 ГБ. Многие из программ, используемых для оценки данных, не могут открывать изображения такого размера.
Чтобы сократить время обработки изображений, важно выбрать время ожидания пикселя для удовлетворения требований к соотношению сигнал/шум для последующей оценки данных (например, реконструкции, трассировки) и ограничить записи определенными ROI. Расширение at программного обеспечения облегчает получение изображений на небольших участках в последовательных секциях. Программное обеспечение поддерживает ручные и автоматические рабочие процессы и множество полуавтоматических вариантов: области визуализации могут быть вручную позиционированы и сфокусированы на каждой секции, или пользователь может использовать автоматический поиск секций и функции выравнивания положения. В зависимости от уровня автоматизации, выбранного и поддерживаемого типом образца или целями визуализации, время, необходимое для настройки получения изображений в сотнях секций, может занять целый рабочий день (вручную) или всего несколько минут. В принципе, массивная томография делает получение небольших ROI более сложными, чем другие методы 3D EM; неточное размещение региона на последовательных участках должно быть компенсировано приобретением более крупных площадей. Например, если ROI составляет 20 мкм x 20 мкм в размере, а изменчивость положения полей изображения от секции к секции составляет 10 мкм, необходимо получить изображения размером 40 мкм x 40 мкм, чтобы убедиться, что ROI полностью захвачен в каждом изображении, на каждом участке. Реальная изменчивость положения изображения колеблется от 100 мкм до <10 мкм в зависимости от доступности или качества программных функций для выравнивания положения или терпения пользователя. С помощью этого программного обеспечения 10 мкм может быть достигнуто без слишком большого ручного вмешательства в большинстве образцов.
Как и любая техника, AT имеет несколько слабых мест, которые могут повлиять на успешный сбор данных, и многие из них похожи на другие методы на основе секционирования. Отсутствие однородного распределения пустой смолы по сравнению с тканью может привести к искривлению или разрушению массивов. В крайних случаях секции могут отсоединяться от опоры(рисунок 6А). Переменное сжатие или растяжение во время процесса резки может создавать складки, которые могут нарушить образец в переменных областях на последующих участках(рисунок 6B). Следы ножа могут появляться на поверхности собранных участков с помощью поврежденного ножа(рисунок 6С). Различия в условиях сечения могут вызывать случайное сжатие сечения и различия в толщине. Частицы пыли или грязи могут приземляться на участок и частично скрывать интересующую зону(рисунок 6D). Получение изображения может завершиться сбоем из-за несовершенных функций автоконтрастности, автофокусировки и автостигатора. Позиционирование автоматически создаваемых областей изображения может быть переменным и может не отражать рентабельность инвестиций во всех секциях.
На этапе сшивания и выравнивания может возникнуть несколько проблем. Автоматическая сшивка приобретений мозаичной плитки может завершиться неудачей, например, из-за большого пустого пространства внутри образца. Из-за резкого изменения формы в 3D стеки изображений может быть сложно зарегистрировать. Специально разработанные программы (например, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB или MAPS-AT) могут способствовать полуавтоматическому выравниванию32,38,39,40. Более сложные разделы могут быть выровнены вручную с помощью программного обеспечения для редактирования фотографий. К сожалению, некоторые наборы данных невозможно правильно выровнять.
Большие образцы являются сложной задачей для серийных секций ТЕА, устанавливаемых на сетки; с другой стороны, многие проекты не оправдывают длительного автоматического приобретения с использованием FIB/SEM или SBF-SEM. AT является простой альтернативой утомительной последовательной секции TEM, где сбор и манипулирование последовательными секциями на пластине более просты, чем с сетками слотов. Для облегчения сбора массивов было разработано несколько стратегий, и мы делимся нашим методом расширения существующего инструментария. В тех случаях, когда идентификация ROI является сложной задачей, AT-SEM обеспечивает фундаментальное преимущество с эффективным скринингом образцов, где требуется разрешение в масштабе органелл на 50-500 секциях. Для больших объемов стратегии автоматического сбора AT могут быть эффективно собраны, если требуется больше разделов. Образцы AT могут быть повторно визуализированы несколько раз, что облегчает целевую визуализацию областей с высоким разрешением на основе ранее полученных обзорных изображений. Мы считаем, что целевой анализ и снижение избыточной выборки AT/SEM, предложенные здесь, снижают требования к трудозатратам и хранению данных. В конечном счете, библиотеки разделов могут быть собраны и сохранены для последующего повторного использования и консультаций. Для сбора объемов подходы FIB или SBF-SEM предлагают отличное решение в тех случаях, когда рентабельность инвестиций легко определить на лицевой стороне блока или если для анализа требуются большие 3D-объемы. Однако FIB/SBF-SEM менее эффективны, когда стековое изображение с высоким разрешением должно быть собрано из определенной рентабельности инвестиций целевым образом. В заключение следует отметить, что предложенные методы скрининга АТ-образцов и использования обзорных изображений среднего разрешения позволяют ограничить получение изображения соответствующими частями массива секций. Точное нацеливание областей изображения ускоряет время передачи данных и упрощает оценку данных.
Короче говоря, хотя концепция AT/SEM не является новой, ее использование все еще не так широко распространено, как можно было бы предположить из ее достоинств. В целом, он обеспечивает дополнительную процедуру к другим существующим методам ЭМ. AT/SEM совместим с самым широким спектром протоколов пробоподготовки и рабочих процессов визуализации и может быть выполнен на любом микроскопе FIB/SEM или SBF-SEM в качестве сопутствующего метода. В этой статье мы сосредоточились на AT для записи ультраструктурных данных из образцов, которые с меньшей вероятностью будут успешно решены другими методами. Надеемся, что описанная процедура удобного сбора разделов и значительно автоматизированных стратегий приобретения поможет в первых попытках тем, кто никогда не сталкивался с методом, и поможет усовершенствовать его тем, кто уже имеет некоторый опыт.
Disclosures
Автор Тильман Франке является сотрудником компании Thermo Fisher, которая производит электронные микроскопы и пилотные программы, которые используются в статье.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить членов EM-центра Лозаннского университета за их поддержку во время разработки различных этапов процедуры AT. Мы хотели бы поблагодарить Гарета Гриффитса, Марту Родригес, Урскую Репник, Кристель Генуд, Хельмута Гнаеги, Эйната Зелингера, Паолу Морено-Роман, Люси О'Брайен и Линдси Левеллин за обсуждения во время подготовки рукописи и критического чтения. Мы хотим отметить группы, которые предоставили образцы, использованные для демонстрации различных сценариев: Маттиас Лутольф, Михаил Николаев, Деванджали Дутта, Тилл Мацат и Фанни Ланглет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting | |||
| AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
| Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
| Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
| Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
| Image acquisition | |||
| FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
| Image analysis | |||
| Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |
References
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Mulcahy, B., et al. A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system. Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. Electron tomography of molecules and cells. Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).
- Hoog, J. L., et al. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
- Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography. Cells. 8 (1), 57 (2019).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Kubota, Y., et al. A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure. Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).
- Wacker, I. U., et al. Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Templier, T. MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy. Elife. 8, 45696 (2019).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb. Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).
- Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
- Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M.
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 25916 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution. Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).
- Maco, B., et al. Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons. PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).
- Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
- Markert, S. M., et al. 3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species. Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).
- Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms. Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).
- Kolotuev, I. Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production. Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).
- Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Daniel, E., et al. Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues. Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).
- Pasquettaz, R., et al. Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma. Journal of Comparative Neurology. , (2020).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
