Summary
配列断層撮影サンプルとして使用するための大きな転写サポートに関するシリアルセクションのリボンの作成と、走査型電子顕微鏡での自動イメージング手順について説明します。このプロトコルにより、局所的なまれな事象のスクリーニング、検索、および標的画像処理、および大量のデータ量の取得が可能になります。
Abstract
電子顕微鏡は、ナノメートルの解像度で細胞および構造の詳細を画像化するための生物学と医学に適用されます。従来、透過型電子顕微鏡(TEM)は、細胞の超構造に関する洞察を提供しましたが、最近の10年間で、現代の走査型電子顕微鏡(SEM)の開発は、細胞内部の探し方を変えました。タンパク質レベルの構造の詳細が必要な場合でも、細胞生物学に関する質問の大半に対しては、SEM解像度で十分です。技術の進歩により、シリアルブロックフェイスイメージング(SBF-SEM)やフォーカスイオンビームSEM(FIB-SEM)などの自動ボリューム取得ソリューションが実現しました。それにもかかわらず、これらの方法は、関心のある分野への識別とナビゲーションが重要である場合、非効率的なままです。イメージングの前にターゲット領域を正確にローカライズする手段がなければ、オペレータは必要以上のデータを取得する必要があります(SBF-SEMで)、さらに悪いことに、多くのグリッドを準備してすべて(TEMで)イメージする必要があります。関心領域の局在化を促進するSEMのアレイ断層撮影による「横スクリーニング」の戦略を提案し、その後、サンプル総量の関連分量を自動画像化する。アレイ断層撮影サンプルはイメージング中に保存され、繰り返しイメージングできるセクションライブラリに配置できます。横型スクリーニングにより、他の方法でアクセスするのが非常に困難な構造の詳細を分析できる例をいくつか示しています。
Introduction
EM関連の技術の重要性にもかかわらず、それらを習得するために必要な努力は、フィールド全体を少数の専門家に制限し続けます。重要な難点の 1 つは、EM 用に保存されているサンプル内の関心領域 (ROI) の識別と検索です。同じサンプルの外観は、光学顕微鏡で分析する場合とEM観察のための処理後にかなり異なります。化学的に調製されたサンプルの変化には、脱水ステップ後の異方性サンプル収縮(各次元で10%程度)と、固定および染色プロトコルでオスミウムを使用した場合の蛍光の損失が含まれる(図1A)。超薄い断面のために、サンプルは異なる戦略を用いてエポキシ樹脂またはアクリル樹脂に埋め込まれている(図1B)。この準備の成功の結果を得るには、サンプル全体を1 mm x 1 mm を超えない部分に分数する必要があります。標準的な透過電子顕微鏡(TEM)の観測条件の要件を満たすために、サンプルのこの小さな部分はさらに50〜150 nmの厚さのスライスに切り離されます。結果として得られたグレースケール画像は、他の顕微鏡技術よりも詳細にサンプル全体の分分分の組織組織およびオルガネラ構造を示す(図1C)。一般的な TEM データセットは、理論的には細胞や組織の 3D 空間で自然に発生するプロセスを理解するために、2D 情報を提供します。図1Dは、超構造容積の獲得の課題を示しています:側面1,000 μmの立方体が50nm厚で切り離されている場合、体積全体をカバーするために20,000のセクションが必要になります。500 μm側立方体の場合、10,000 個のセクションになります。50 μm x 50 μm x 50 μm のボリュームをカバーするには、1,000 個のセクションのみ必要な場合があります。このボリュームを手動で入手することは事実上不可能であり、自動化を使用して実行することは非常に困難です。サンプル深さに加えて、このような仮説立方体の表面全体をカバーする必要がある場合、合理的な解像度での1μm2表面のカバレッジは、重大なロジスティック問題になります(図1E)。コネクトロミクスのアプローチのような特別な大規模プロジェクトでは、多数のセクションが重要ですが、「平凡な」EMプロジェクトの大半では、観測に必要なセクションを生成することは大きな欠点を提示します。
3D超構造情報を取得する方法は、シリアルセグセクション型透過電子顕微鏡(TEM)、TEM断層撮影、アレイ断層撮影(AT)、シリアルブロック顔イメージング走査電子顕微鏡(SBF-SEM)、および集光イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)です。これらの方法の主な違いは、断面化戦略と、画像取得が断面生成 1 に結合されるかどうかです。シリアル断面 TEM では、シーケンシャル セクションがスロット グリッド上で収集され、TEM イメージがこれらのシーケンスから生成され、2、3、4、5に整列されます。TEM断層撮影では、グリッド上の150〜300nmのセクションからのチルトシリーズ、およびシリアル断面に結合すると、比較的少量6、7、8の非常に高解像度を提供する。ATアプローチは、ガラスカバースリップ、シリコンウェーハ、特殊テープなど、比較的大きなサポート上のセクションコレクションの多様な手動および半自動の方法で物理的な断面を使用します。画像取得の場合、サポートはSEMで分析され、多様な画像取得戦略が9、10、11、12、13、14、15が利用可能です。SBF-SEMの場合、物理的な断面は、SEMチャンバ内に直接セットされたダイヤモンドナイフを備えたミニミクロトームを用いて、樹脂ブロック16、17、18、19の表面から生成されるSEM画像を用いて行う。FIB-SEMの場合、イオン源はサンプルの薄い層を除去し、続いてSEM20,21による露出面の自動イメージングを行う。TEM断層撮影とATは、必要に応じて再画像化できる物理的なセクションを生成し、FSBF-SEMおよびFIB-SEMはイメージング後にセクションを排除します。マルチビームSEMによって画像化された物理断面の最近の組み合わせは、画像取得22の速度の「ボトルネック」問題を解決する方法の組み合わせを提供する。これらの技術は、EMデータの取得と分析方法に革命をもたらし、それぞれのアプローチは、特定の研究問題に関連する実用的な影響を及ぼします。
準備の性質と超構造寸法のスケールを考えると、サンプルブロック内の特定のターゲット構造がどこにあるかを予測することは簡単ではありません (図1D,E)。ROIローカリゼーションのための1つの解決策は、最初から望ましい解像度でブロック全体からの画像を記録することです。目的の構造は、顕微鏡から離れているときに取得したデータ量にすることができる。この戦略に関連する取得時間とデータ処理は問題です。特に、ROIが組織ブロックよりもはるかに小さい場合、すなわち目的の物体が特定のタイプの細胞(器官全体ではない)である場合、記録されたデータの量を減らすことが望ましい。異なるコリマンコ光および電子顕微鏡法(CLEM)は、同じサンプル23、24、25、26、27、28、29内の調製の前または後に蛍光が保存され、局在化する場合に成功する可能性がある。それにもかかわらず、多くの細胞構造は、公知の超構造のみに基づいて、蛍光相関がなくても認識可能である。このような場合、横スクリーニングアレイ断層撮影はROIローカリゼーションに取り組む取り組みと、超構造情報品質とのバランスのトレードオフを提供すると考えています。この戦略を使用して、ウエハ上のセクションのサブセットは、ROIのサイズと性質に基づいて確立することができる一定の間隔でスクリーニングされます。ROIが見つかると、データ取得はアンカーセクションの前と後に始まる連続した一連のセクションで設定され、関連情報をターゲットにした方法で収集します。
我々は、多数のセクションで関心のある領域やイベントの取得を簡素化し、加速し、より良い整列画像ボリュームを得るATのためのプロトコルを提示します。横型スクリーニングとマルチステップ取得は、正確にターゲット領域で非常に高解像度のデータを生成します。我々が説明する手順は、サンプル調製ワークフローを根本的に変更することなく、幅広い試料との互換性を提供する3D EMデータ取得のいくつかの課題に対処します。セクション作成およびSEM買収の対象ローカリゼーション。セットアップ中の時間と労力の削減。結果のボリュームのより良い位置合わせと複数のセクション内の領域のイメージング;そして、ステッチモザイク画像に異なる画像をコンパイルするためのスムーズなステッチと整列手順。私たちは、公開されたプロジェクトと進行中のプロジェクトからいくつかのサンプルで私たちの方法の強さを実証することを選びました。このアプローチは、EMの経験が限られている研究者であっても、対象となるEMデータの生成と取得を大幅に促進できると考えています。
Protocol
注: サンプルの準備方法については、他の場所で説明しています14、30、31、このドキュメントでは説明しません。要するに、示された例はグルタルアルデヒドで化学的に固定され、1%OsO4で後固定され、次いで、埋め込み樹脂に埋め込む前に1%酢酸ウラン酸水溶液で処理した。あるいは、試料は、高圧凍結を用いて調製することができ、アセトン中の0.1%のウラニル酢酸で置換し、アクリル樹脂に埋め込む凍結を行うことができる。サンプルブロックは、サンプルの明確なビューを可能にする平坦な埋め込み方法を使用して作成し、断面化の向きを容易にします(図1B)。
1. アレイ生成手順
- 埋め込みサンプルの向きとトリミング
- 双眼鏡/顕微鏡を使用して、ブロックの表面をカミソリの刃で軽く傷つけて、埋め込みブロック表面のROIを識別してマークします。これは、超ミクロトーム内のサンプルを向けるのに役立ち、断面面を減少させます。
- サンプルをウルトラミクロトームホルダーにクランプします(図2A)。
- サンプルの周りに樹脂をトリミングし、まずカミソリの刃(粗いトリミング)を使用して、ダイヤモンドトリミングツール(細かいトリミング)を続行します。 図 2A)。ブロックの上面と底面がナイフの刃先に平行になるように、20°または90°エッジ傾斜のナイフを使用してください。
注: この手順は、直列の断面化とストレート リボンの取得に不可欠です。 - 3:1の割合でキシレンと接着剤を混ぜます。爪楊枝にまつげが取り付けられた状態で、トリミングされたブロックの上端と下端にこの混合物を適用します。十分に乾燥させてください。
- アレイ取り付け支持A(すなわち、シリコンウェーハ)を用意する。
- ウエハ切断ツール(EMS)を使用してウエハピースをカットし、プロジェクトの目標に合わせてサイズを調整します。2cm×4cmは光顕微鏡観察と電子顕微鏡観察の両方に便利です。
- 残骸を取り除くために蒸留水でウエハーを清掃します。
- グロー放電/プラズマは、標準機器を使用して表面をきれいにします。正確なパラメータは、使用するマシンによって異なります。グリッドの放電のパラメータから始め、経験的に時間を調整します。このステップは、セクションが乾燥している間、サポート上のセクションの良好な広がりのために重要であり、省略すべきではありません。
- アレイ取り付けサポートB(ガラスカバースリップ)を用意します。
- 多重免疫標識実験を計画する場合は、カバースリップ上のサンプルを転送して蛍光シグナルをより良く検出します。カバースリップの粘着性を改善するために、詳細なゼラチンコーティング手順を使用して、前述の9.
- 酸化インジウムスズ(ITO)または蒸着によって金でスライドをコーティングすることにより、導電率を高めます。準備したカバーリップをクリーンな環境に保ちます。グローは、1.2.3 で説明したようにサンプルを排出します。
2. サンプルの断面化
- ATナイフの準備
メモ:アレイを生成するには、長いリボンの取得を容易にするために設計された修正ナイフ(ATS)を使用します。大きいサポートのセクションの生成のために考案されたヒストジャンボナイフまたは類似のナイフは、同様にATの切り離しに役立つことができます。- 泡状の粘着テープを使用してナイフの底に針を取り付け、それを突き刺します(図2B)。ATSナイフをウルトラミクロトームホルダーに0°に置きます。標準的な手順を使用して、ブロックサーフェスに平行なナイフのエッジを調整します。
- 切断の準備ができている位置にナイフの端にトリミングされたブロックを持参します。
- ナイフの洗面器の中にウエハ/カバースリップを置き、ナイフの端と同じレベルに水で満たします。ナイフのダイヤモンドの端を適切に加湿させ、必要に応じて付属の注射器を使用して水を引き出します(図2C)。
- アレイの断面化と転送
- ミクロトームを目的の切削パラメータに設定します。ATSナイフを使用すると、50-100 nmの範囲と0.6-1 mm/sの切断速度が推奨されます。断面化を開始します (図 2Di)。
- 対象となる Z ボリュームをカバーする長さのリボンを取得し、コレクションを停止します。ブロックサイズ、組織の均質性、樹脂の種類に応じて、リボンは比較的まっすぐになります(図2D-ii)。多くのサンプルは、努力とナイフの種類が使用されているにもかかわらず、ストレートリボンを生成しません。
- 最終目標に応じて、1つまたは複数の短いリボンを並べて配置します。2 cm x 4 cmのサポートは便利に100から1,000セクションを握ることができる。サポートステップのリボンの配置は、器用さと安定した手を必要とするステップです。しかし、このスキルの学習曲線は急速に獲得されます。
- 爪楊枝に接着したまつげの清潔で粘着性のない先端を使用して、ナイフエッジからリボンを取り外します(図2Diii)。
- まつげを使用して、支持媒体の中央の上にリボンを静かに動かします。この時点で、必要に応じてセクションのストレッチにクロロホルムまたは加熱ペンを使用します。ただし、この操作はリボンの破損や変形を引き起こす可能性があることに注意してください。
- 注射器を引っ張って水を水に流し始めます。より繊細なリボンや遅い水の引き込みのために、ホースから注射器を取り外すことによって水を滴下させます。水位がウエハーレベルまで下がったら、リボンを中央に静かに押し込んで、必要に応じてリボンをコントロールし、位置を変更します。ウエハ表面にリボンを落とした後、残りの水が流域から完全に引き込まれるまで排水を続けます。
注:底水引きATSナイフを使用しない場合は、気流を誘発しないようにATSナイフの側面から水を慎重に減らしてください。 - 完全に乾燥させるためにお風呂の中のサポートのセクションを残します。支持の疎水性と環境湿度レベルに応じて、水は異なる速度で蒸発します(図2Div)。サンプルをゆっくりと乾燥させて減少させるか、サンプルのすべての折り目を完全に避けることは重要です。
- 乾燥したサンプルを密閉した箱に移して汚れから保護し、60°Cのオーブンに少なくとも30分間置きます。必要に応じて、全体的なコントラストを高めるために重金属を使用してカウンターステインセクション。
- 手順の最後に、メーカーの指示に従って慎重にナイフを清掃する
メモ:ウエハ上の複数またはシリアルセクションの転送(図2E)とスロットグリッドでの転送(図2F)は、EM準備の経験を完全に変えます。単一のサポートに関するセクションの中断のないセクションとコレクションは、連続セクションで頻繁にセクションおよびセクションコレクションに関連するミスの量を減らします。1つのウエハに集められた1000 μm x 500 μmの100セクションに相当する部分は、33スロットグリッドに相当します(図2G)。
3. サンプル観察
注: このセクションでは、市販のソフトウェアを使用して実装されたワークフローの手順について説明します(「 資料一覧」を参照)。正しい検出器を搭載したSEM上の画像取得ソフトウェアは使用できますが、特定のユーザーアクションは異なり、多くの場合、より手動になります。
- ウェーハ上のセクション位置を明らかにするSEM画像の概観図を取得します。内蔵光学カメラ画像は、セクションまたはすべてのセクションのリボンをカバーするSEM画像モザイクを定義するのに役立ちます。サンプルのカメラ画像上でマウスを右クリックしてモザイクを作成し、 自動取得を開始します。
注:非常に粗いイメージング設定、すなわち、1〜2 μmピクセルサイズと1μsの住み時間で十分です。このプロセスは 補足資料 (2-7 ページ) で示されています。 - セクションファインダー自動検出機能を使用してセクションを見つけるか、手動でそれらを見つけます。セクションの位置とアウトラインは、画像マッチングに基づいて、このソフトウェアで自動的に取得されます。このプロセスの説明については、補足資料(8 ~ 15 ページ) を参照してください。
- 概要画像にROIが明確に表示されない場合は、セクションの高解像度画像を取得します。 セクションプレビュー 機能を使用して、画像を自動的に作成および取得します。このプロセスは 補足資料、16-18 ページで示されています。イメージング設定は、ユーザーが検索する ROI の性質とサイズに応じて選択する必要があります。
- 最適な設定を見つけるには、顕微鏡制御ソフトウェアで ライブイメージング を有効にし、1つのROIに移動します。画像にROIが明確に表示されるまでイメージング設定を変更しますが、画像の取得が過度に長くなりません。
- イメージング領域の定義
注: いくつかの異なる戦略が提案されています。- 数個のセクションのみを画像化する必要がある場合は、これまでに作成したセクションの画像を使用して関連セクションに移動し、取得した画像をすべて元の相対位置に表示する Zoomable Viewer を使用してすべてのセクションを表示します。高解像度で画像を作成する必要があるセクションが見つかったら、クリック アンド ドラッグでイメージング領域を作成します。高解像度のイメージング設定を選択し、テンプレートに設定を保存します。このテンプレートを、以降のセクションで再利用してください。
- 特に小規模な事象や検出困難な事象を見つけるには、横スクリーニングアプローチを使用します。10 分の 1 セクションごと、またはリボンごとに 1 つのセクションに高解像度のイメージング設定を使用してイメージング領域を手動で作成し、イメージを取得します。ソフトウェアの ROI を含むイメージとマーク セクションを確認するか、メモを取ります。
- ROI を含むセクションから開始し、セクション セットを前後に移動し、構造がセクションに表示されている限り、同じ相対位置に高解像度イメージング領域を作成します。これは、手動で行うか、次の手順で説明する手順を使用して行うことができます。
- 連続した10個以上のセクションで画像を取得します。イメージをズームした後、[ 位置絞り込 み開始]をクリックして、マニュアルの説明に従って、登録された断面の位置の精度を上げます。そうすることで、画像系列の位置変動性が低下します。この手順は補足 資料 ページ 19-21 で説明されています。
- 任意のセクションをクリックアンドドラッグして 、Alt キーを押しながらイメージング領域を定義し、マウスボタンを離したときに開くコンテキストメニューから [タイルセットアレイを作成 ]を選択します。ソフトウェアは、以前に検出またはマークされたすべてのセクションで、同じ相対位置にイメージング領域を作成します。 断面スパン スライダーを使用して、特定の範囲のセクションにイメージングを制限することができます。
注: この手順は、任意の数のイメージング領域で繰り返すことができるため、各セクションに大きな画像を 1 つ記録する代わりに、多数の小さな高解像度画像を記録できます。 - 作成後は、必要に応じて、各画像シリーズにピクセル数、ピクセルサイズ、タイルレイアウト、ピクセルドウェル時間などを設定します。イメージングシリーズが作成され、設定されると、それらはすべてジョブキューにリストされます。
- 自動機能の設定と画像取得の開始
- 前の手順で説明したのと同じ方法を使用して、自動機能用の別のイメージ シリーズを作成します。イメージシリーズを、コントラストの高い構造を含むセクションの位置に移動します。
- イメージシリーズを 1024 x 884 ピクセルに設定し、前の手順で設定したイメージ シリーズで使用した最高解像度に対応するピクセル サイズを選択します。自動機能のリストで、 オートフォーカス と 自動スティグマをチェックしてください。
- 取得シーケンス コントロールで [セクション別 ] を選択し、自動関数イメージがリストの最初の項目であることを確認します。ジョブキューの横にある[ 実行 ]ボタンをクリックして、画像の取得を開始します。これらの手順は、 補足資料(22-23 ページ)で説明されています。
注: 各セクションに手動で事前に焦点を当てる必要はありません。記録セッション中、顕微鏡が新しいセクションに進むたびに、自動機能は他のすべての画像がこのセクションに記録される前に実行されます。
4. データのアライメントと分析
- データエクスポート
- データが.tif形式で保存されていることを確認して、専用のエクスポート機能を必要としないようにしてください。レイヤーツリー内のレイヤーと要素に直接対応するフォルダー構造にデータを並べ替えます。
- 画像モザイクが記録されたら 、StitchAll 関数を使用してすべてのタイルを自動的にステッチします。
- フィジーでのスタックの配置とトリミング
手記。多くのソフトウェア パッケージ (無料および商用) を使用して、アレイトモグラフィ データを操作できます。オープンソースプログラムFiji32では、広く利用可能で、必要な機能がすべて含まれているため、以下の手順が示されています。- イメージのスタック (またはステッチされた画像) を、仮想スタックとしてフィジーにインポートします。
- コントラスト/明るさを正規化する必要がある場合は、[拡張コントラスト]を選択します。プロセスメニューから。 [飽和ピクセル]を 0.1 以下に設定し、[すべてのスライスを処理] をオンにします。
- [プラグイン]メニューから、[登録]| SIFT を使用した線形スタックの位置合わせ。
- [変換が期待される]ドロップダウン メニューから [リジッド] または[アフィン] を選択します。それ以外の場合は、既定の設定をそのまま使用します。[OK]をクリックして配置を開始します。
注: データを仮想スタックとして読み込むと、フィジーはあらゆるサイズのスタックを処理できます。アライメントの出力は RAM で作成されます。ただし、これにより、処理できるスタックの最大サイズが制限される場合があります。その場合は、同じ登録アルゴリズムのフォルダー間実装である 仮想スタックスライスの登録を使用します。登録が完了したら、出力データを仮想スタックとしてロードします。 - [ トリミング] をクリックしてイメージ スタックをトリミングし、ROI のみを含めます。
- スタックを単一の.tifイメージまたは一連の.tif画像として保存します。
注: アレイ断層撮影の重要な手順を 図 3に示します。
Representative Results
以下の例は、推奨されるワークフローの多様性を示すことを目的としています。ケーススタディのイラストは、他のテクニックで満足のいく結果を得るのが難しかったプロジェクトです。私たちは、多くのタイプのサンプルで遭遇する可能性のある典型的な課題を説明するために、ショウジョウバエの成人を選びました。この管状器官は、長さ約6mm、断面で500〜1000μm、独特の機能と細胞組成を有する異なる領域に分けられる(図4A)33。断面の向きによって、腸のプロファイルの寸法とセクションの外観が異なります。横断的または縦方向の方位のセクションは比較的大きく、単一のTEMグリッドに配置できるのはカップルだけです(図2F)。組織のごく一部のみをFIBで画像化することができ、SBF-SEMの場合、難易度は非均質なサンプルと同様である。ATは、このようなサンプルの分析のための効率的なトレードオフを提供し、フラット埋め込みはROIのローカリゼーションを容易にします。選択した領域の周囲の樹脂の過剰を慎重にトリミングする(図4B)は、関連する領域からアレイを効率的に収集するために重要である(図4C)。1つのウェーハ上で、連続またはランダムに何百ものセクションを収集できます(図4D)。研究の質問に応じて、サンプルスクリーニングと取得には異なる戦略が必要であり、我々は任意に複数のシナリオに分けられます。さまざまなシナリオをよりターゲットにした方法で説明するために、異なる研究プロジェクトからいくつかのケーススタディを選択しました。
ランダムに分布する多数の大構造物の解析 1~10 μm範囲 (図4E)
多くの場合、超構造データは、いくつかの実験的アプローチから生じた仮説を検証するために必要であり、標準と実験的に変化した状態を比較する。このような場合、一般的にグリッド上でランダムに収集され、対象領域をローカライズして画像化するために、いくつかのセクションがスクリーニングされます。この戦術は通常、あまり体系的ではなく、分析されたセクションの数に限定されます。特定のリボンから数十/数百の中解像度セクションの概要を記録することをお勧めします (図 4D)。70 nmの典型的なセクションでは、200個のセクションが約14 μmに及び、30分以内に完了した多数の細胞(完全または部分的に)が含まれます。最初のステップとして、リボン全体の低解像度の概要が記録され、概要は、準備アーティファクト(例えば、折り目、汚れ)を示すセクションを省略するのに役立ちます。取得後、手動または自動で、セクションの選択した部分に直接、またはセクション全体に対して、単一またはモザイクイメージングを使用して、ステッチング(図4E)を行うことができます(図4E)。後で、選択した領域からの画像を高解像度のパラメータを使用して取得できます。例えば、ミトコンドリア、核、およびマイクロビリは、このような統計的に改善された方法の恩恵を受けることができる(図4Ei-iii)。
複数の小さく、まばらな分布構造の分析 500-1,000 nm 範囲 (補足動画 1)
このシナリオでは、低倍率の概要スキャンでは ROI を識別できず、高解像度のイメージが必要になります。従来の TEM サンプルでは、必要な機能が見つかるまで、セクションのズームインとズームアウトが必要です。多くの場合、複数のサンプル内の複数の独立した場所をイメージングすることは、単一の大きなボリュームの生成よりも統計的に関連性が高くなります。このような場合、手動取得の複雑さは指数関数的に増加します。複数の TEM ソリューションを使用すると、自動取得や複数のグリッドのスクリーニングが可能になりますが、グリッドのサイズとシリアル断面化の課題によって、多くのサンプルに対してこのアプローチに互換性が持たれない場合が頻繁に発生します。同様のケースでは、対象の構造を特定するのに十分な解像度で、複数のセクションで全体的なROIの完全な中解像度マップを生成します。この横スクリーニングステップでは、ランダムに接近したときに関心のある構造の少なくとも一部を打つことを目指して、一度に複数のセクションを飛躍させることをお勧めします。これは構造の全体的な寸法に大きく依存します:例えば、構造の全体的なサイズが500nmで、セクションが50nm厚い場合、行内の少なくとも9つの連続したセクションが対象の構造の一部を含む可能性が高い。このようにして、6-7セクションのスキップは、複数の領域で多くの異なる種類の構造を見つけるのに効率的である必要があります。選択したセクションの解決されたモザイク マップを自動取得すると、これらのセクションを取得後に慎重にスクリーニングできます。このような高解像度マップを取得すると、いくつかの ROI を切り取るか、または ROI (補足ムービー 1)上の追加のローカル イメージング領域を定義するために使用できます。ゴルジ、セントリオレス、接合部、微小管、異なるタイプの小胞は、このシナリオの恩恵を受ける可能性のある構造の良い例である(補足ムービー1)。
大サンプル中のまばら分布の大きいROIの分析(図4F-4H)
このシナリオでは、問題がROI識別ではなくローカリゼーションにある「干し草の山の針」とよく言われる、まれなイベントが含まれます。多くのサンプルの相関アプローチは有効なオプションではありませんが、多くの場合ROIは明らかな超構造を有し、ローカライズされると高い信頼性で識別できます。これらのサンプルでは、中解像度で数十から数百のセクションを含む事前にスクリーニングされたサンプルから始めて、マルチレベル取得を適用することが不可欠です。ここで使用するソフトウェアでは、複数のセクションのイメージ セットを取得するための 2 つの異なる方法があります: プレビュー イメージを高解像度で記録する、または適切な設定で配列タイル セットを取得する (図 4F)。ショウジョウバエ 腸内の異なる特殊な細胞タイプは、ランダムに分布し(例えば、ステム、腸内分泌細胞)、およびランダムな配向で薄いセクション。しかし、これらは、単一のセクションから、またはシリアル画像の集合として、高解像度のパラメータを使用して得られた画像をスクリーニングした後に視覚的に区別することができます(図4G)。アライメントの後、スタックはさまざまなソフトウェア ソリューション (図 4H、補足ムービー 2) を使用してレンダリングできます。
シナリオ1:腸オルガノイド(図5A)
オルガノイドは、現代の生命科学の最先端のツールの1つになりつつあります。この生理学的な3D幹細胞由来の器官モデルはティッシュの再生、薬剤への応答および再生医学を含む生体内の生物プロセスの範囲の正確な研究を可能にする。最近導入されたミニ腸管34は、生体内組織生理学、細胞型組成、ホメオスタシスに密接に似た新世代のオルガノイド技術を開き、疾患モデリング、宿主微生物相互作用、および創薬に対する広い視点を可能にする。しかし、超構造特性化が必要な場合、ランダムサンプルを用いた大きな組織などで異なる細胞型の局在化が困難になる場合がある。また、可変的な「感染」アッセイでは、分析が組織に影響を与える異なる発達段階を明らかにすることが重要です。このような研究では、サンプルの統計的に有意なカバレッジが中心でありながら、従来のTEMオングリッドアプローチを使用して達成することは困難です。ATシナリオ1は、このような場合に有益である:多くのシーケンシャルセクションは、ウエハー(図5Aii)上に生成され、関心のある一般的な領域を局所化するために低解像度のパラメータを使用してスクリーニングすることができます(図5Aiii;矢印)。これらの領域は、高度な取得パラメータ(図5Aiv および 図5Av)を使用して、さらなる分析を対象とすることができます。関連する構造(通常は100~300セクションに1回ずつ5~10セクションのクラスター)が検出されると、対象の各構造に集中して、単一の画像を手動で取得したり、オートメーション機能を使用して複数のセクションにわたって画像ボリュームを取得することができます。
シナリオ2:ショウジョウバエプパル・ノータム(図5B)
細胞分裂と細胞周期を通して進行を制御するメカニズムを研究することは、多細胞生物の標準的なプロセスと変化したプロセスの両方を理解するために重要です。存在する情報は、多くの場合、単細胞系から導き出されます。しかし、この溶液は、組織内の細胞間の3D相互作用の重要な文脈を欠いている。単一細胞単層である公別体の、ショウジョウバの幼虫の発達後部は、特に35の細胞分裂と一般における上皮細胞との相互作用に最適なモデルである。これは、蛍光顕微鏡と遺伝子操作によって利用可能なデータの組み合わせを使用して、分子および細胞相互作用研究のための確立されたモデルです。細胞分裂の最後のステップである棄権は、2つの分裂細胞間の最終的な分離を保証し、棄権の間に起こる構造変化を特徴付けることは、有糸分裂の理解に不可欠である。しかし、柱の有糸分裂は、超構造レベルでの局所化が容易ではない:細胞は、棄権帯と比較して比較的大きい(図5B)。被覆する断面の全体の大きさと断面の表面との比率は大きい(図5Bi)。TEMまたはSBF-SEM法36を用いて棄権ゾーンを局地化することは可能ですが、この作業は面倒です。このシナリオでは、20 ~ 40 セクションの飛躍の自動中解像度の概要イメージを使用して、分割セルをローカライズできます (図 5Bii)。このような細胞が同定されると、セクションは近くのセクションを詳しく調べるためのアンカーとなり、さらに分析するために多数の分裂細胞を見つけて選択することができます。このようにして、アブシスゾーン全体を見つけて画像化することができます(図5Biii)。質問に応じて、単一の高解像度画像または3〜7の画像シーケンスを収集して、構造の深さをカバーすることができます(図5Biv)。
シナリオ3:マウスタニルテニューロン(図5C)
マウスは脳の発達のための確立されたモデルを提供し、EMによって含む異なるレベルで十分に文書化されています。脳組織を研究するためにさまざまな自動連続ブロック顔法が広く使用されているにもかかわらず、ATが必要なデータを収集するためにより良く適応されている場合があります。視床下部は、十分に確立された神経科学モデルであり、複数の神経細胞タイプの機能を含む脳の一部である。視床下部のタニュサイトは、第3心室の底部に並ぶエペンディモグリア細胞の特定のサブセットを表し、異常に長いプロセス(最大300μm)および大きなエンドフィート(〜5μm)37を有する。これにより、TEMまたはFIB法による分析には不便です。いくつかの独立したタニサイトをローカライズして分析する必要がある場合、タスクはさらに複雑になります。この作業を容易にするアプローチの1つは、EMの固定および埋め込み前に蛍光標識サンプルから蛍光マップを得るセミコリ相関ターゲティングであり得る。断面は、蛍光サンプルと平らな埋め込みプラスチックレプリカからの位置情報を組み合わせることによって捕捉された領域に対して行われる。その後、ATシナリオ3を使用することができます:高レベルの概観図画像が生成され、タニサイトエンドフィートクラスターを持つ領域が明らかになります。その後、ソフトウェアのオートメーション機能を使用して、1つまたは複数の領域から画像のシーケンスの取得を単一の画像またはタイルモードで設定します。これらの画像は、個別に、整列されたスタックとして分析するか、その後にレンダリングすることができます。
AT法の力により、2Dから3Dへのデータの比較的簡単な「アップグレード」が可能になります:マップは一次取得から利用可能であり、ボリュームは選択された領域とその周辺から得ることができます。結果のスタックは、整列し、その後レンダリングできます。ROI を見つけるために必要な解像度と画質を事前に判断することが重要です。取得時間はピクセルドウェル時間とピクセルサイズの逆二乗に比例して比例するため、イメージングではROIを認識できますが、この値を超えては認識できません。
図1:EMサンプル調製と体積獲得の課題( A)サンプル調製中の高重金属濃度と脱水により蛍光と収縮の損失が起こります。(i) EM用に調製した同じ試料をLM(ii)下で観察した試料の模式図で、完全に不透明になり、体積の約10%を失う。(B)サンプル埋め込みは、典型的にはエポキシ樹脂またはアクリル樹脂を使用して行われる。従来のブロック(i)は、特定の向きを必要としない均質なサンプルに対して正常に使用できます。フラットブロック(ii)は、顕微鏡下での標的および配向に不可欠な場合に有用であり、例えば、非均質サンプルまたは相関顕微鏡の手順において、断面化を目的とした正確な領域である。(C)サンプル体積全体のうち、1つの50 nmセクションに限られた分数のみが表され、3Dサンプルの2D画像を提供し、しばしば不慣れな向きに表示される。(D)過度に大きなボリュームと正確なターゲティングを記録する問題を説明するために、1000、500、50μmの面を持つ3つの同心円キューブを選択し、仮説的な1000 x 500 x 500 μmサンプル(ダークマルーン)を含むように構成しました。このような仮説的なサンプルキューブが50nmのスライスで完全に切り離されている場合、ボリューム全体をカバーするために、合計20,000、10,000、および1,000スライス、および800 tb、100 tb、および100 gb(イメージング解像度5 nm x 5nm x 50nm、8ビット)が必要です。これは、必要最小限の量を取得するためだけに、EMデータの取得を計画することの重要性を示しています。(E) 大きなサンプル表面積を高解像度でカバーすると、大きなボリュームと同様の問題が発生します。複数の高解像度の画像を 1 つに分割することは、このような問題に対する役立つ解決策です。ただし、2024 x 1048 フレームを 10,000 倍の倍率で使用して 1 mm x 1 mm の表面を覆うには、膨大な数のタイルが必要になり、ステッチが難しくなる可能性があります。さらに、切断時にセクションが可変的に圧縮または歪んでいる場合、結果のデータスタックは整列することがほとんど不可能になります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:大きなサポート上のセクションの配列を直接生成するためのワークフロー。 このステップは、ブロックの平行な側面を確保し、またサンプルの周りの空の樹脂を減らすのに役立ちます。 (B) At セクション取得用の修正ナイフ。大型ボートは、サンプルの切り離し、サポート上の転送中にセクションとその操作の転送を容易にします。大きな洗面器はセクションの操作を可能にする;排水システムは、排水ステップ中にリボンの動きを制限し、フラットボトムは、信頼性の高いサポートの徐々乾燥を行います。(C)ナイフは、水面の底に置かれたグロー放電ウエハと、エッジに平準化された水で切り離す準備ができています。ナイフの構造は、サポートを妨げることなく、針を埋め込み続けます。(D) 配列生成、ミクロトーム断面領域のトップビュー。(i) 最初のセクションは、通常、互いに固執し、通常のリボンを形成するので、入手が容易です。(ii) リボンにセクションが追加され、長くなると、リボンの安定性が失われ、頻繁にカーブが行われます。画像取得の手順に備えて、シーケンストラックを順番に整理しておくことが重要です。(iii) セクションのリボンが所望の長さに達すると、まつげを使用してナイフエッジから慎重に取り外されます。(iv) 水は流域から排出される。ウエハーは完全に空気乾燥するまで内部に残ります。セクションをまっすぐにし、マイクロフォールドの形成を避けるのに役立つため、このステップは不可欠です。ウエハーは、サポート上のセクションを取り付けるために、少なくとも30分間、60°Cでオーブンに置かれます。(E)移管されたセクションを有するウェーハの例。まっすぐで正確なリボンを得ることは便利ですが、実際のサンプルは、ほとんどの場合、このような理想的なリボンの形成を防ぎます。それにもかかわらず、「ずさんな」リボンでさえ、膨大な数のケースにとって非常に有益であり、「きちんとした」リボンの重要性は、セクションが収集される研究戦略に依存します。スケールバー 1cm(F)シリアルセクションを使用したスロットグリッドの例。1つのグリッドに多数のセクションが集められる場合でも、単一のウエハで収集できる部分はごく一部です。グリッド上のセクションの移動をマスターするために必要なスキル(特にスロットグリッド)は、電子顕微鏡サンプル調製を習得するための重大なボトルネックを表しました。スケールバー500μm(G)どのセクション収集方法を使用しても、ATアプローチの強みは、オングリッドコレクションと比較して、シーケンシャルセクションの生成の相対的な容易さです。1000 μm x 500 μm サンプルブロックを考慮すると、2 cm x 4 cm のウェハ(i)に100個のセクションを収めるのに問題ありません。スロットグリッド上の同じサイズのセクションは、最大で3つのセクション/グリッドにのみ収まります(ii)。グリッド上のシリアルセクションを収集する難しさについては触れず、同じセクション数をカバーするために必要なグリッドの数を示すスケーリングされた画像を提供します。スケールバー= 1 cm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アレイ断層化ワークフローの重要なステップ 高解像度イメージ スタックの無人取得のワークフローの概略図。すべての準備ステップは自動化されており(緑色の歯車シンボル)、セクションごとに手動で実行する必要はありません。画像スタックは、自動剛性またはアフィンアライメントが可能な任意の画像解析ソフトウェアで整列させることができます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ショウジョウバエの成人腸をデモンストレーションモデルとして用いた3つの買収シナリオ(A) 剖剖後ショウジョウバエの中腸の描画, 異なる色で指定された3つの主要な領域を持つ: 前, 中間, 後部.(B) 腸が横断断面に向いている整った平坦なブロック。なお、空の樹脂量は、対象領域(白色の長方形)を含む組織のまわりで慎重にバランスが取れている。(C)横シリアルセクションは、ATナイフの洗面体内の水面に浮かんでいる。全ての画像は、逆対比のミラー検出器を用いて、二次電子SEMモードで取得した。(D) ウェーハ上の横シリアルセクションのモザイク画像をステッチ。スケールバーは1000μm(E)ショウジョウバエ腸を通る断面である。スケールバー20 μm。画像は7 x 7中間範囲の画像のステッチモザイクです。インセット - 関心のある特定の領域のより高い倍率および分解能画像:(ii)核、(iii)ブラシの境界線、および(i)ミトコンドリア。スケールバー5 μm すべて。(F) 細胞の発生場所をターゲットとする腸内を通る横断面の中間画像(正方形)。スケールバーは20 μmです(G) パネルFに存在するセクションの分析中に局所化された領域に基づいて収集されたシリアルセクションのターゲット配列は10 μmです。
図5: ATアプリケーションシナリオのケーススタディ(A)腸管オルガノイドにおける異なる細胞構造の局在化(i) 埋め込みシリコンマイクロチップ。スケールバー= 200 μm. (ii) チップの中央部を通る127の断面のステッチモザイク画像。スケールバー= 1500 μm (iii) 腸オルガノイドの部分を通る完全な横切り部の4つの低解像度画像。矢印は、関心のある潜在的なサイトを指しています。スケールバーは20 μm(iv)異なるROIで、さらなる分析のために選択された低解像度の顕微鏡写真をターゲットにしています。スケールバー= 10 μm( v) 感染した対象細胞の高解像度画像。隣接するセクション内の同じ領域を分析すると、必要に応じてターゲットを絞った 3D 情報を提供できます。スケールバー=5μm(B)ショウジョウバエメラノガスタープパルノタムにおける中身体の局在化。(i) 解剖されたショウジョウバエの子犬の概略図。保護キューティクルの一部を除去した後の解剖(ベージュ)のために露出したノータム(茶色)。黒い線は、(ii) 図で示された領域を通る断面の方向を示します。画像は、1つのモザイクパネルにステッチされた3x7連続して撮影された高解像度SEM画像を組み合わせたものです。黒い四角形は、分割セルを含む領域を区切ります。スケールバーは15μm(iii)パネルiiから分割セル上のズーム画像である。この倍率と解像度では、ミッドボディが明らか(白い矢印)です。セクション全体が分析され、分割セルが見つかります。横のスクリーニングのステップの間に20-30セクション間隔のセクションの異なったリボン間の跳躍は多数の分裂細胞の対を局的にする。スケールバーは、分割セルが局在化する場合に5μm(iv)、パネル内の黄色い四角で区切られたミッドボディの周囲の4つのセクションから収集された中型の逐次画像(iii)。。スケールバーはマウス視床下部における1μm(C)のタニサイトエンドフィート局在化である。(i)ビブラートメスライスの蛍光画像。タキサイトはtdトマト蛍光タンパク質(赤色)を発現する。白い四角形は対象領域を区切ります。スケールバー500 μm(ii) EM用に用意された同じビブラートオームセクションは、パネル(i)からの蛍光情報の間接的な相関に基づいて、関心領域の周りに慎重にトリミングされます。点線の白い線は、超薄い断面の面積を表します。スケールバーは両方のパネルのための50 μmである。(iii) 対象領域のビブラートメスライスを通して断面。SEMモザイク画像は75枚のステッチ画像で構成されています。いくつかのセクションは、横スクリーニングによってターゲットとされ、同様のパラメータで画像化されます。セクションはROIを見つけるために「オフライン」で分析されます - タニサイトの端足。黒い長方形は、タニーサイトの端足を含む領域を表します。このセクションは、さらなる分析のためのアンカーとして機能します。スケールバーは15μm(iv)血管を取り囲むタニサイトのエンドフィートの高解像度、高倍率画像です。1つのセクションでROIの初期ローカリゼーションが行った後、zシーケンスは隣接するセクションからアンカーセクション(パネルiii)に向けて集められます。スケールバー5 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:超ミクロトミー、セクションコレクション、セクション保存中の問題は、アーティファクトにつながる可能性があります。 空の樹脂のほとんどは、組織から取り外され、それ自体(セピア)に折り畳まれた。破線の黒いボックスは、セクション全体を含めるために使用される領域を示します。スケールバー500 μm(B)50nm厚のゼブラフィッシュセクションの表面に小さく、局所的な折り目。スケールバー 1 μm(C) 70nmマウス脳部の表面にナイフマーク。スケールバー 5 μm(D) ゼブラフィッシュ筋部を部分的に覆うウエハ表面の髪(アスタリスク)黄色では、組織は分析のために標的にされる。ピンク色のセルは、影響を受ける領域のサイズの基準として使用されます。スケールバー 50 μm. (E) ゼブラフィッシュの脊索と右下にしわが付き (黒い矢印) 、 密度の高い神経組織 (青で影) が柔らかい筋肉組織と空の樹脂 (黒い矢印) に接しています。スケールバー10μm(F)Eのように50枚の画像の積層の体積セグメンテーションは、この領域がほとんどのセクションでしわを示したことを示した。破線ポリゴンは、F と同じボリュームセグメンテーションの G. Scale バー 10μm(G)XY ビューに表示される領域の輪郭を描き、ブロックの右半分に短い黒いストロークとしてシワを示します。なお、組織の残りの部分におけるスタックの位置合わせは、シワの影響を受けません。Gと同じ領域のスケールバー5μm(H)XZ投影は、全50区間のしわを示す。スケールバー5 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足映画1:ショウジョウバエ前腸を通る断面の高解像度モンタージュ画像。反転した SE-MD SEM 画像のモザイク画像。352の別々のイメージタイルは5 nmの決断で自動的に獲得され、全体の横断を提示するためにステッチされた。同じ画像を使用して、より詳細なズームインを行い、データを網羅的にカバーすることが可能です。タイトな接合、微小管、異なるタイプの小胞は、ズームインするときにすることができます。スケールバーは10μmです。この映画をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足映画2: ショウジョウバエ 腸細胞のレンダリング。 腸細胞を分割する領域のセクションの50整列モザイク画像。セルの境界(青、ターコイズ、オレンジ)と核(白)のIMODレンダリング。この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
電子顕微鏡は、細胞や生物の超構造に関する洞察を与え、その3次元的文脈で関心のある構造を画像化することがしばしば望ましい。超構造解析のための多数のEM戦術にもかかわらず、まだ「ゴールドスタンダード」ソリューションはありません。主な理由は、多くの場合、カスタマイズされたアプローチを必要とするサンプル、多くの生物学的な質問の多種多様です。提案されたATワークフローは、サンプル処理、データ収集、評価、およびストレージに必要な時間を最小限に抑えるように設計されています。さらに、修正されたナイフは配列の獲得を容易にする有用な用具を提供する。ウエハ上のセクションのコンパクトなレイアウトは、観察とサンプルの後続の保存の両方に便利です。この配置により、リボンからリボンに水平に移動し、各セクションを1セクションのみスキャンすることでサンプルの「側面スクリーニング」が可能になり、ROIのローカライズに必要な時間を大幅に短縮できます。提案されたデータ取得シナリオは、小規模でランダムに分散されたエリアのターゲット設定を容易にします。AT/SEM は、一度検出されると、手動で実行するか、自動機能の助けを借りて実行するかにかかわらず、目的の量に高解像度のイメージングを正確に制限します。限られた容積のためのATはサンプルを通して移動し、イメージ作成領域を1つずつ定義して、手動で完了することができる。ソフトウェアの自動化モジュールは、大きなセクション上の小さな領域のイメージングのための柔軟な画像取得戦略を提供します。このソフトウェアの自動化により、数百のセクションに大きな高解像度画像を記録し、SBFIと同様のボリュームを達成できます。すべてのセクションの概要画像を記録することで、ROIのローカリゼーションが簡素化され、顕微鏡での時間が短縮されます。概要や高解像度プレビューの記録中にセクションに問題が発生しないため、AT/SEM ではサンプルを再利用して他の ROI のデータを収集したり、より高い解像度で収集したりできます。
画像取得時間は、3D EMの最も重要な(そして最も高価な)側面の1つであり、したがって実験計画で考慮されるべきです。大きな領域のイメージングは小さな領域をイメージングするよりも時間がかかることは驚くべきことではありませんが、影響を過小評価するのは簡単です:選択したイメージングパラメータによっては、各セクションの取得時間は数秒から時間までさまざまです。重要なイメージング パラメータには、視野のサイズ、解像度、および時間の短縮が含まれます。1ピクセル当たり10nmの目標解像度と1μsのドウェル時間を想定して、20μm x 20 μm、100 μm x100 μm、または500 μm x500 μmのフィールドを撮像するには、4秒、100秒、または2,500秒かかります。これらの断面イメージング時間にセクション数を掛けて、完全なイメージングジョブに必要な時間を見積もることができます。セクション数が少ない場合や、顕微鏡ツール時間が問題ない場合は、セクションごとの長いイメージング時間を許容できます。
ただし、ほとんどの場合、記録時間を夜間ジョブまたは週末ジョブに制限する必要があります。考慮すべき3D EMの同様に重要な側面は、結果の画像データの量と構造です。上記のイメージングフィールドを100セクションに記録すると、それぞれ400 mb、10 gb、または250gbの画像データが生成されます。500 μm x 500 μm のイメージは、それぞれ 2 gb を超える追加の問題を引き起こします。データ評価に使用されるソフトウェア プログラムの多くは、このサイズのイメージを開くことができません。
イメージング時間を短縮するには、後続のデータ評価(例えば、再構成、トレース)の信号対雑音比要件を満たすためにピクセルドウェル時間を選択し、記録を定義されたROIに制限することが重要です。ソフトウェアのAT拡張は、シリアルセクションの小さな領域での画像取得を容易にします。ソフトウェアは、手動および自動ワークフローと多くの半自動バリアントをサポートしています:イメージングエリアは手動で配置し、各セクションに焦点を当てることができ、またはユーザーは、自動セクションファインダーと位置合わせ機能を使用することができます。サンプルタイプまたはイメージングの目標で選択されサポートされる自動化のレベルに応じて、数百のセクションで画像取得を設定するのに必要な時間は、作業日全体(手動で行う)または数分しかかかりません。基本的に、アレイ断層撮影は、小さいROISを取得する他の3D EMメソッドよりも困難です。連続したセクションでの不正確な領域配置は、より大きな領域を取得することによって補償されなければなりません。例えば、ROIのサイズが20μm x 20μmで、画像撮影場の断面間位置変動が10μmの場合、各セクションでROIが完全にキャプチャされるように、40μm x 40μmの画像を取得する必要があります。実際の画像位置の変動範囲は、位置調整やユーザーの忍耐に関するソフトウェア機能の可用性または品質に応じて、100 μmから<10 μmまでです。このソフトウェアを使用すると、ほとんどのサンプルで手作業での介入を行うことなく、10 μm を達成できます。
他の手法と同様に、AT にはデータ取得の成功に影響を与えるいくつかの弱点があり、その多くは他の断面ベースの方法と同様です。空の樹脂対組織の均質な分布の欠如は、湾曲または壊れたアレイをもたらすことができます。極端なケースでは、セクションがサポートから切り離される可能性があります(図6A)。切削処理中に可変圧縮またはストレッチを行う場合、後続のセクションで可変領域でサンプルを中断する可能性がある折り目が作成される可能性があります(図 6B)。ナイフマークは、損傷したナイフを使用して、収集したセクションの表面に表示することができます(図6C)。断面条件の違いは、時折セクションの圧縮と厚みの違いを引き起こす可能性があります。ほこりや汚れの粒子は、セクションに着陸し、部分的に関心のあるゾーンをあいまいにすることができます(図6D)。不完全な自動コントラスト、オートフォーカス、および自動スティグマ機能により、画像取得が失敗する可能性があります。自動的に作成されたイメージング領域の位置は可変であり、すべてのセクションでROIをキャプチャできない場合があります。
ステッチとアライメントの段階で、いくつかの問題が発生する可能性があります。モザイク タイルの取得の自動ステッチは、サンプル内の空き領域が大きいため、失敗する可能性があります。3Dの形状が大幅に変化するため、画像スタックの登録は困難な場合があります。特別に開発されたプログラム(例えば、IMOD、フィジー、トラックEM2、MIB、またはMAPS-AT)は、半自動アライメント32、38、39、40を容易にすることができます。より挑戦的なセクションは、手動で写真編集ソフトウェアを使用して整列することができます。残念ながら、データセットによっては正しく位置合わせできない場合があります。
大きなサンプルは、TEMシリアルセクションがグリッドに適合する場合に困難です。一方、多くのプロジェクトでは、FIB/SEM または SBF-SEM を使用した長い自動取得を正当化しません。ATは、ウエハ上のシリアルセクションの収集と操作がスロットグリッドよりも簡単である、退屈なシリアルセクションTEMに代わる簡単な方法です。配列の収集を容易にするためにいくつかの戦略が開発され、既存のツールキットを拡張する方法を共有しています。ROIの同定が困難な場合、AT-SEMは、50〜500セクションにわたるオルガネラスケール分解能が必要なサンプルを効率的にスクリーニングすることで、基本的な利点を提供します。ボリュームが大きい場合は、より多くのセクションが必要な場合に、AT の自動収集戦略を効率的に収集できます。ATサンプルを複数回再画像化できるため、以前に取得した概観画像に基づく高解像度領域のターゲット画像撮影が容易になります。ここで提案するAT/SEMによるターゲット分析とオーバーサンプリングの削減は、労働とデータストレージの要件を減少させると考えています。最終的には、セクションのライブラリを収集し、後で再利用し、相談するために維持することができます。量の取得のために、FIBまたはSBF-SEMアプローチはROIがブロック面上で識別しやすい場合、または分析のために大きな3Dボリュームが必要な場合に優れたソリューションを提供します。ただし、FIB/SBF-SEM は、高解像度のスタック イメージを、定義された ROI からターゲットを絞った方法で収集する必要がある場合、効率が低下します。結論として、ATサンプルのスクリーニングと中解像度の概観画像の使用のための提案された方法は、セクション配列の関連部分に画像取得を制限することを可能にする。イメージング領域の正確な狙いは、データの時間を短縮し、データ評価を簡素化します。
要約すると、AT/SEMの概念は斬新ではありませんが、その使用はまだそのメリットが示唆するほど広く普及していません。全体的に、それは他の既存のEMメソッドに相補的な手順を提供する。AT/SEMは、サンプル調製プロトコルおよびイメージングワークフローの最も広範な範囲と互換性があり、付随する技術として任意のFIB/SEMまたはSBF-SEM顕微鏡で行うことができます。本稿では、他の方法でうまく対処しにくいサンプルからの超構造データを記録するためにATに集中した。セクションの便利なコレクションとかなり自動化された買収戦略の説明された手順は、この方法に遭遇したことがない人のための最初の試みに役立ち、すでに経験のある人のためにそれを完璧にするのに役立つことを願っています。
Disclosures
著者ティルマン・フランケは、本稿で使用されている電子顕微鏡と操縦プログラムを製造するサーモフィッシャーの従業員です。
Acknowledgments
私たちは、ローザンヌ大学のEM施設のメンバーがAT手順の異なるステップのこの開発の間に彼らのサポートに感謝したいと思います。ガレス・グリフィス、マルタ・ロドリゲス、ウルスカ・レプニク、クリステル・ジェヌード、ヘルムート・グナエギ、アイナット・ゼリンガー、パオラ・モレノ=ローマン、ルーシー・オブライエン、リンジー・ルウェリンに感謝します。私たちは、マティアス・ルトルフ、ミハイル・ニコラエフ、デバンジャリ・ドゥッタ、ティル・マツァット、ファニー・ラングレットなど、さまざまなシナリオを実証するために使用されるサンプルを貢献したグループを認めたいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting | |||
| AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
| Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
| Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
| Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
| Image acquisition | |||
| FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
| Image analysis | |||
| Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |
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