Summary
Vi beskriver beredningen av band av seriella sektioner och deras samling på stora överföringsstöd för användning som Array Tomography prover, tillsammans med automatiserade bildbehandling förfaranden i en scanning elektronmikroskop. Protokollet tillåter screening, hämtning och riktad avbildning av lokala, sällsynta händelser och förvärv av stora data volymer.
Abstract
Elektronmikroskopi används inom biologi och medicin för avbildning av cellulära och strukturella detaljer vid nanometerupplösning. Historiskt sett har Transmission Electron Microscopy (TEM) gett insikt i cellens ultrastruktur, men under det senaste decenniet har utvecklingen av moderna scanningelektronmikroskop (SEM) förändrat sättet att se inuti cellerna. Även om upplösningen av TEM är överlägsen när proteinnivå strukturella detaljer behövs, är SEM-upplösning tillräcklig för majoriteten av organelle-nivå cellbiologi-relaterade frågor. Teknikutvecklingen möjliggjorde automatiska volymförvärvslösningar som Serial block-face imaging (SBF-SEM) och Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Men än i dag är dessa metoder ineffektiva när identifiering och navigering till intressanta områden är avgörande. Utan medel för exakt lokalisering av målområden före avbildning måste operatörerna skaffa mycket mer data än de behöver (i SBF-SEM), eller ännu värre, förbereda många rutnät och avbilda dem alla (i TEM). Vi föreslår strategin för "lateral screening" med arraytomografi i SEM, vilket underlättar lokalisering av intresseområden, följt av automatiserad avbildning av den relevanta delen av den totala provvolymen. Matristomografiprover sparas under avbildningen och kan ordnas i avsnittsbibliotek som är redo för upprepad avbildning. Flera exempel visas där lateral screening gör det möjligt för oss att analysera strukturella detaljer som är otroligt utmanande att komma åt med någon annan metod.
Introduction
Trots vikten av EM-relaterade tekniker håller den ansträngning som krävs för att behärska dem hela fältet begränsat till ett litet antal specialister. En betydande svårighet är identifieringen och hämtningen av en intresseregion (ROI) i de prover som bevarats för EM. Utseendet på samma prov skiljer sig avsevärt när det analyseras av optisk mikroskopi och efter bearbetning för EM-observation. Ändringarna för kemiskt förberedda prover inkluderar anisotropa provkrympning efter uttorkningsstegen (~ 10% i varje dimension) och förlust av fluorescens vid användning av osmium i fixerings- och färgningsprotokollet(figur 1A). För ultrathinsektionen är proverna inbäddade i epoxi- eller akrylhartser med olika strategier (figur 1B). För att detta preparat ska lyckas skall hela provet fraktioneras i bitar som inte överstiger 1 mm x 1 mm. För att uppfylla standardkraven för transmissionselektronmikroskopi (TEM) är denna lilla del av provet ytterligare sektionerad till 50-150 nm tjocka skivor. De resulterande gråskalebilderna visar vävnadsorganisation och organellstruktur på en minut bråkdel av hela provet mer detaljerat än någon annan mikroskopiteknik (figur 1C). En typisk TEM-datauppsättning ger 2D-information, teoretiskt extrapolerad för att förstå de processer som förekommer naturligt i ett 3D-utrymme i celler och vävnader. Figur 1D innebär utmaningen med förvärvet av strukturella volymer: om en kub på sidan 1 000 μm är sektionerad vid 50 nm tjocklek krävs 20 000 sektioner för att täcka hela volymen; för en 500 μm sidokuk blir det 10 000 sektioner. För att täcka en volym på 50 μm x 50 μm x 50 μm kan 1 000 sektioner "endast" vara nödvändiga. Att få denna volym manuellt är praktiskt taget omöjligt och extremt utmanande att utföra med automatisering. Om vi, förutom provdjup, behöver täcka hela ytan av sådana hypotetiska kuber, blir täckningen av 1 μm2 yta vid rimlig upplösning ett allvarligt logistiskt problem (figur 1E). Även om det stora antalet avsnitt är avgörande för de extraordinära storskaliga projekten, såsom anslutningsmetoder, är det avgörande för de flesta av de "vardagliga" EM-projekten, vilket innebär en betydande nackdel att generera fler avsnitt som krävs för observationen.
Det finns flera metoder för att förvärva 3D-ultrastrukturell information: seriell sektion transmission elektronmikroskopi (TEM), TEM-tomografi, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) och Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). De viktigaste skillnaderna mellan dessa metoder är sektionsstrategin och om bildförvärvet är kopplat till avsnittsgeneration1. I seriell avsnitt TEM samlas sekventiella sektioner in på kortplatsrutnät, TEM-bilder genereras från dessa sekvenser och justeras2,3,4,5. I TEM-tomografi ger tiltserier från 150-300 nm sektioner på ett rutnät, och när de är kopplade till seriell sektionering, en mycket hög upplösning, men relativt små volymer6,7,8. AT-metoden använder fysisk sektion med olika manuella och halvautomatiska sätt för sektionsuppsamling på relativt stort stöd, till exempel glasöverdrag, kiselplattor eller ett speciellt tejp. För bildförvärv analyseras stödet i SEM, med olika bildförvärvsstrategier finnstillgängliga 9,10,11,12,13,14,15 . För SBF-SEM uppnås fysisk sektion med hjälp av en minimikrotom med en diamantkniv som är inställd direkt inuti SEM-kammaren, med SEM-bilden genererad från ytan av hartsblocket16,17,18,19. För FIB-SEM avlägsnar jonkällan tunna lager av provet, följt av automatisk avbildning av den exponerade ytan med SEM20,21. TEM-tomografi och AT genererar fysiska sektioner, som kan avbildas om det behövs, medan FSBF-SEM och FIB-SEM eliminerar avsnittet efter avbildning. En ny kombination av fysiska sektioner avbildade av en multi-beam SEM ger en kombination av metoder som löser "flaskhals" frågan om hastigheten på bildförvärv22. Var och en av dessa tekniker har revolutionerat hur EM-data kan erhållas och analyseras, och varje metod har sina praktiska effekter relaterade till en viss forskningsfråga.
Med tanke på preparatets art och de strukturella dimensionernas omfattning är det inte enkelt att förutsäga var en specifik målstruktur finns i provblocket(figur 1D,E). En lösning för ROI-lokaliseringen är att spela in bilderna från hela blocket med önskad upplösning från början. Strukturerna av intresse kan vara i den förvärvade datavolymen när de är borta från mikroskopet. Förvärvstid och datahantering i samband med denna strategi är problematiska. Det är önskvärt att minska mängden registrerade data, särskilt om ROI är mycket mindre än vävnadsblocket, dvs. om föremålen av intresse är specifika typer av celler (inte hela organ). Olika korrelativa ljus- och elektronmikroskopitekniker (CLEM) kan lyckas när fluorescensen bevaras och lokaliseras före eller efter beredningen inom samma prov23,24,25,26,27,28,29. Ändå är många cellulära strukturer igenkännliga även utan fluorescenskorrelation, endast baserat på den kända ultrastrukturen. För dessa fall tror vi att lateral screening Array Tomography ger en balans kompromiss mellan den ansträngning som investeras i ROI lokalisering och den strukturella informationskvaliteten. Med hjälp av denna strategi screenas en delmängd av sektionerna på skivan med jämna mellanrum, som kan fastställas baserat på AVKASTNINGEN storlek och natur. När roI har hittats ställs datainsamling in i en kontinuerlig serie avsnitt som börjar före och slutar efter ankarsektionen och samlar in relevant information på ett riktat sätt.
Vi presenterar protokoll för AT som förenklar och påskyndar förvärv av regioner eller händelser av intresse i många avsnitt och ger bättre anpassade bildvolymer. Sidoscreening och multistep-förvärv producerar data med mycket hög upplösning i exakt riktade regioner. Förfarandet vi beskriver tar upp flera utmaningar med 3D EM-datainsamling, eftersom det föreskriver: kompatibilitet med ett brett spektrum av exemplar utan att i grunden ändra arbetsflödet för provberedning; Riktad lokalisering för sektionering och SEM-förvärv. minskad tid och ansträngning under installationen; Bildframställning av regioner i flera sektioner med bättre anpassning av de resulterande volymerna. och en smidig sömnads- och justeringsprocedur för att sammanställa olika bilder till en sydd mosaikbild. Vi valde att visa styrkan i vår metod med flera prover från publicerade och pågående projekt. Vi tror att detta tillvägagångssätt avsevärt kan underlätta generering och förvärv av riktade EM-data, även för utredare med begränsad EM-erfarenhet.
Protocol
EXEMPELberedningsmetoder beskrivs någon annanstans14,30,31och omfattas inte av denna publikation. Kort sagt, exemplen som visades var kemiskt fixerade med glutaraldehyd, post-fixed med 1% OsO4, sedan behandlas med 1% vattenhaltigt uranylacetat innan inbäddning i inbäddningshartset. Alternativt kan prover beredas med högtrycksfrysning, frysa ersätts med 0,1% uranylacetat i aceton och bäddas in i akrylharts. Provblocken utarbetades med hjälp av en platt inbäddningsmetod som möjliggör en tydlig bild av provet, vilket underlättar dess orientering för sektioneringen (figur 1B).
1. Förfarande för matrisgenerering
- Inbäddad provorientering och trimning
- Använd kikaren/mikroskopet och identifiera och markera avkastningen på den inbäddade blockytan genom att lätt repa blockets yta med ett rakblad. Detta hjälper till att orientera provet inuti ultramicrotomen och minskar sektionsytan.
- Kläm fast provet på ultramicrotomhållaren(figur 2A).
- Trimma hartset runt provet, först med rakbladet (grov trimning) och fortsätt med diamanttrimmeringsverktyget (fin trimning; Figur 2A). Använd knivar med 20° eller 90° kantlutning för att säkerställa att blockets övre och nedre ytor är parallella med knivens skäregg.
OBS: Det här steget är avgörande för seriell avsnitting och förvärv av raka band. - Blanda xylen och limma i 3:1 proportion. Applicera denna blandning på toppen och bottenkanterna på det trimmade blocket med en ögonfrans fäst vid en tandpetare. Låt det torka ordentligt.
- Förbered matrismonteringsstödet A (dvs. kiselplattor).
- Skär waferbiten med hjälp av ett waferklyvningsverktyg (EMS) och justera dess storlek till projektmålet. 2 cm x 4 cm är bekvämt för både ljus- och elektronmikroskopiobservationer.
- Rengör skivan i destillerat vatten för att bli av med skräpet.
- Glödurladdning/plasma rengör ytan med hjälp av standardutrustning. De exakta parametrarna beror på vilken maskin som används. Börja med parametrarna för rutnätens urladdning och justera tiden empiriskt. Detta steg är avgörande för en god spridning av sektionerna på stödet medan sektioner torkar och bör inte utelämnas.
- Förbered matrisernas monteringsstöd B (dvs. glasskydd)
- Om du planerar multiplex immunmärkningsexperiment, överför proverna på ett täckslip för att bättre upptäcka fluorescenssignalen. För att förbättra täckslipslim, använd en detaljerad gelatinbeläggningsprocedur beskrivs tidigare9.
- Öka konduktiviteten genom att belägga bilderna med indium-tennoxid (ITO) eller guld genom avdunstning. Förvara de förberedda täcksläparna i en ren miljö. Glödurladdning av proverna enligt beskrivningen i 1.2.3.
2. Avsnitt av provet
- AT-knivberedning
OBS: För att generera matriserna, använd en modifierad kniv (ATS), utformad för att underlätta förvärv av långa band. Histo-Jumbo knivar eller liknande knivar utformade för generering av sektionerna på stora stöd kan också tjäna för AT-sektionering.- Fäst nålen på knivens underkant med den skummande tejpen och genomborra den (figur 2B). Placera ATS-kniven i ultramicrotomhållaren vid 0°. Justera knivens kant parallellt med blockytan med hjälp av standardproceduren.
- För det trimmade blocket till knivens kant i ett läge som är redo för sektionering.
- Placera skivan/täckslipen inuti knivbassängen och fyll den med vatten till samma nivå som knivkanten. Låt knivens diamantkant fukta ordentligt och vid behov dra ut vatten med den bifogade sprutan(figur 2C).
- Matrissektion och överföring
- Ställ in mikrotomen på önskade skärparametrar. Med ATS-kniven är räckvidden 50-100 nm och en skärhastighet på 0,6-1 mm/s tillrådligt. Börja dela upp (bild 2Di).
- Skaffa ett band av längden som täcker en riktad z-volym och stoppa samlingen. Beroende på blockstorlek, homogenitet hos vävnaden och typ av harts kommer bandet att vara relativt rakt (figur 2D-ii). Många prover kommer inte att producera raka band, trots den investerade ansträngningen och typen av kniv används.
- Beroende på det slutliga målet, gör ett långt eller flera korta band justerat sida vid sida. Ett stöd på 2 cm x 4 cm kan bekvämt rymma 100 till 1 000 sektioner. Arrangemanget av bandet på stödsteget är ett steg som kräver fingerfärdighet och stadiga händer. Inlärningskurvan för denna färdighet förvärvas dock snabbt.
- Lossa bandet från knivkanten med en ren, icke-klibbig spets av en ögonfrans limmad på tandpetaren (figur 2Diii).
- Använd ögonfransen och flytta försiktigt bandet ovanför mitten av stödmediet. Använd nu kloroform eller värmepenna för sträckning av sektionerna om det behövs. Kom dock ihåg att denna manipulering kan inducera bandbrytning och deformation.
- Börja tömma vattnet genom att dra sprutan. För mer känsliga band eller en långsammare vattenupprullning, låt vatten droppa genom att lossa sprutan från slangen. När vattennivån sänks till wafer-nivån, kontrollera bandet och flytta det om det behövs genom att försiktigt trycka bandet till mitten. Efter att ha satt banden på waferytan, fortsätt att dränera tills det återstående vattnet är helt indraget från bassängen.
OBS: Om du inte använder ats-kniven med bottenvatten, minska försiktigt vattnet från ATS-knivens sidor för att inte framkalla turbulens. - Låt sektionerna på stödet inuti badet torka helt. Beroende på stödets hydrofobi och luftfuktigheten i miljön kommer vatten att avdunsta i en annan takt (figur 2Div). Det är viktigt att låta provet torka långsamt för att minska eller helt undvika alla veck på provet.
- Överför det torra provet till en tätt sluten låda för att skydda mot smutsförorening och placera den i en ugn på 60 °C i minst 30 minuter. Vid behov motbehåll sektioner med tungmetaller för att förbättra den övergripande kontrasten.
- Rengör försiktigt kniven i slutet av proceduren enligt tillverkarens instruktioner
OBS: Överföringen av flera eller seriella sektioner på en skiva(bild 2E) jämfört med överföringen på ett spårnät(bild 2F) förändrar EM-förberedelseupplevelsen helt. Den oavbrutna delningen och insamlingen av avsnitten om enskilt stöd minskar mängden avsnitts- och avsnittssamlingsrelaterade misstag som ofta förekommer i serieavsnitt. Motsvarande 100 sektioner på 1000 μm x 500 μm som samlas in på en skiva motsvarar 33 spårgaller(figur 2G).
3. Provobservation
I det här avsnittet beskrivs arbetsflödesstegen som implementerade med hjälp av en kommersiellt tillgänglig programvara (se Tabell över material). Alla bildförvärvsprogram på alla SEM-detektorer som är utrustade med rätt detektorer kan användas, men de specifika användaråtgärderna kommer att skilja sig åt och kommer ofta att vara mer manuella.
- Skaffa en översiktskarta över SEM-bilder som avslöjar avsnittsplatser på skivan. En inbyggd optisk kamerabild hjälper till att definiera en SEM-bildmosaik som täcker ett band av sektioner eller alla sektioner. Skapa mosaiken genom att klicka-dra med musen direkt på kamerabilden av exemplet och starta automatisk anskaffning.
OBS: Mycket grova bildinställningar, dvs. 1-2 μm pixelstorlek och 1 μs uppehållstid räcker. Denna process illustreras i Kompletterande material (sidorna 2-7). - Leta reda på avsnitt med funktionen Automatisk identifiering av avsnittssökare eller hitta dem manuellt. Avsnittspositioner och konturer hämtas automatiskt med den här programvaran baserat på bildmatchning. För illustration av denna process, se Kompletterande material (sidorna 8 - 15).
- Om översiktsbilderna inte visar ROI tydligt, skaffa bilder av avsnitt med högre upplösning. Använd funktionen Förhandsgranskning av avsnitt för att skapa och hämta bilder automatiskt. Denna process illustreras i Kompletterande material, sidorna 16-18. Bildinställningar måste väljas beroende på typen och storleken på den ROI som användaren söker efter.
- Om du vill hitta optimala inställningar aktiverar du Live Imaging i mikroskopstyrningsprogramvaran och navigerar till en ROI. Ändra bildinställningarna tills bilderna visar ROIs tydligt, men bildförvärvet är inte överdrivet långt.
- Definiera bildområden
OBS: Flera olika strategier föreslås.- Om bara ett fåtal avsnitt behöver avbildas använder du bilderna av avsnitt som hittills har skapats för att navigera till relevanta avsnitt och använd zoombar visning som visar alla förvärvade bilder på sina ursprungliga relativa platser för att titta på alla avsnitt. När ett avsnitt har hittats som ska avbildas med hög upplösning skapar du ett bildområde med klickdrag. Välj högupplösta bildinställningar och lagra inställningarna i en mall. Återanvänd den här mallen för ytterligare avsnitt.
- Använd metoden lateral screening för att hitta särskilt små eller svåra att upptäcka sällsynta händelser. Skapa en bildområde manuellt med högupplösta bildinställningar i vart tionde avsnitt eller på ett avsnitt per menyfliksområde och hämta bilderna. Granska bilderna och markera avsnitt som innehåller ROI i programvaran eller anteckna.
- Börja från avsnitt som innehåller avkastningen, navigera framåt och bakåt genom avsnittsuppsättningen och skapa högupplösta bildområden på samma relativa platser så länge strukturen fortfarande är synlig i avsnittet. Detta kan göras manuellt eller genom att använda proceduren som beskrivs i nästa steg.
- Hämta bilder i mer än tio på varandra följande avsnitt. Klicka på Starta position förfining efter att du har zoomat bilden om du vill öka precisionen för registrerade avsnittsplatser enligt beskrivningen i handboken. Om du gör det minskar bildseriens positionsvariation. Förfarandet illustreras och förklaras i kompletterande materialsidorna 19-21.
- Klicka på ett avsnitt om du vill definiera ett bildområde medan du håller ned Alt-tangenten och väljer Skapa paneluppsättningsmatris på snabbmenyn som öppnas när musknappen släpps. Programvaran skapar sedan bildområden på samma relativa plats i alla avsnitt som har hittats eller markerats tidigare. Det är möjligt att begränsa avbildningen till ett visst område med skjutreglaget Section Span.
OBS: Den här proceduren kan upprepas med valfritt antal bildområden och gör det därför möjligt att spela in många små högupplösta bilder i stället för att spela in en enda större bild på varje avsnitt. - När du har skapat pixelantalet, pixelstorleken, plattsättningslayouten, pixelboendetiden osv. i varje bildserie efter behov. När bildserien har skapats och konfigurerats visas alla i en jobbkö.
- Konfigurera automatiska funktioner och starta bildförvärv
- Skapa en separat bildserie för automatiska funktioner med samma metod som beskrivs i föregående steg. Flytta bildserien till en position i avsnittet som innehåller strukturer med hög kontrast.
- Ställ in bildserien på 1 024 x 884 pixlar och välj en pixelstorlek som motsvarar den högsta upplösningen som används i bildserien som ställts in i föregående steg. I listan över automatiska funktioner kontrollerar du AutoFokus och Auto Stigmator.
- Välj Efter avsnitt i kontroller av anskaffningssekvensen och kontrollera att bilden av automatiska funktioner är det första objektet i listan. Starta bildförvärvet genom att klicka på knappen Kör bredvid jobbreferensen. Dessa procedurer illustreras i kompletterande material, sidorna 22-23.
OBS: Det är inte nödvändigt att manuellt förfokusera på varje avsnitt. Under inspelningssessionen, när mikroskopet går vidare till ett nytt avsnitt, kommer de automatiska funktionerna att utföras innan alla andra bilder spelas in i det här avsnittet.
4. Anpassning och analys av data
- Dataexport
- Se till att data sparas i .tif format, så att det inte finns något behov av en dedikerad exportfunktion. Sortera data i en mappstruktur som motsvarar lagren och elementen i lagerträdet.
- När bildmosaik har spelats in använder du StitchAll-funktionen för att automatiskt sy alla brickor.
- Stackjustering och beskärning i Fiji
NOT. Många programvarupaket (gratis och kommersiella) kan användas för att arbeta med Array Tomography-data. Stegen nedan visas med open source-programmet Fiji32 eftersom det är allmänt tillgängligt och innehåller alla nödvändiga funktioner.- Importera en hög med bilder (eller sydda bilder) till Fiji som en virtuell stack.
- Om kontrast/ljusstyrka behöver normaliseras väljer du Förbättrad kontrast... från Process-menyn. Ange mättade pixlar till 0,1 eller mindre och markera Bearbeta alla segment.
- Välj Registrering | på plugin-menyn Linjär stackjustering med SIFT.
- Välj Rigid eller Affine på den nedrullningsbar menyn Förväntad omvandling. Annars behåller du standardinställningarna. Starta justeringen genom att klicka på OK.
OBS: Genom att läsa in data som virtuell stack kan Fiji hantera stackar av alla storlekar. Justeringens utdata skapas i RAM- minne. Detta kan dock begränsa den maximala storleken på staplar som kan bearbetas. I så fall använder du Register Virtual Stack Slices, som är en mapp-till-mapp-implementering av samma registreringsalgoritm. När registreringen är klar läser du in utdata som en virtuell stack. - Beskär bildstacken genom att klicka på Beskär så att den bara innehåller avkastningen.
- Spara stapeln som en enda .tif bild eller serie .tif bilder.
Obs: Kritiska steg i matristomografi visas i bild 3.
Representative Results
Exemplen nedan syftar till att visa mångsidigheten hos de rekommenderade arbetsflödena. Fallstudie illustrationer är projekt för vilka vi hade svårt att få tillfredsställande resultat med andra tekniker. Vi valde Drosophila vuxen för att illustrera typiska utmaningar man kan stöta på med många typer prover. Detta rörformiga organ på ca 6 mm långt, 500-1000 μm i tvärsnitt, är uppdelat i olika regioner med en unik funktion och cellulär sammansättning (figur 4A)33. Beroende på sektionsorienteringen varierar dimensionerna på tarmprofilen och dess utseende på avsnittet. Antingen tvärgående eller längsgående orienterade sektioner är relativt stora, och endast ett par kan placeras på ett enda TEM-rutnät (figur 2F). Endast en liten del av vävnaden kan avbildas i FIB, och för SBF-SEM liknar svårigheten alla icke-homogena prover. AT ger en effektiv kompromiss för analys av sådana prover och platt inbäddning underlättar ROI-lokaliseringen. Noggrann trimning av överskottet av harts runt det valda området(figur 4B) är viktigt för en effektiv insamling av matriserna från det relevanta området(figur 4C). Hundratals sektioner kan samlas in på en enda skiva sekventiellt eller slumpmässigt (figur 4D). Beroende på forskningsfrågan kommer provscreening och förvärv att kräva en annan strategi, som vi godtyckligt delar in i flera scenarier. För att illustrera olika presenterade scenarier på ett mer målinriktat sätt valde vi flera fallstudier från det olika forskningsprojektet.
Analys av många slumpmässigt fördelade stora strukturer 1-10 μm intervall(figur 4E)
Ofta krävs strukturella data för att validera en hypotes som uppstod från flera experimentella metoder, jämföra en standard och experimentellt förändrat villkor. I dessa fall samlas flera avsnitt vanligtvis slumpmässigt in i rutnät och screenas för att lokalisera och avbilda de intressanta områdena. Denna taktik är vanligtvis mindre systematisk och begränsad till ett litet antal analyserade avsnitt. Vi föreslår att du registrerar översikter över tiotals/ hundratals medelupplösningsavsnitt från ett visst menyfliksområde (figur 4D). För typiska sektioner på 70 nm kommer 200 sektioner att sträcka sig över cirka 14 μm, som kommer att innehålla många celler, antingen helt eller delvis, slutförda inom en halvtimme. Som det första steget registreras den lågupplösta översikten över hela menyfliksområdet, och översikten hjälper till att utelämna de avsnitt som visar förberedelseföremål (t.ex. veck, smuts). Därefter kan förvärvet utföras manuellt eller automatiskt direkt på valda delar av sektionen, eller en hel sektion, med hjälp av enstaka eller mosaikavbildning, följt av sömmar (figur 4E). Därefter kan bilder från det valda området förvärvas med hjälp av högupplösta parametrar. Till exempel kan mitokondrier, kärnor och mikrovilli dra nytta av en sådan statistiskt förbättrad metod (figur 4Ei-iii).
Analys av flera små, glest fördelade strukturer 500-1 000 nm intervall (Kompletterande film 1)
I det här scenariot kan avkastningen inte bara identifieras i en översiktssökning med låg förstoring och högupplösta bilder behövs. I konventionella TEM-prover är den tråkiga zoomningen in och ut ur avsnittet nödvändig tills den nödvändiga funktionen hittas. Ofta är avbildning av flera oberoende platser i flera prover mer relevant statistiskt än generering av en enda stor volym. I sådana fall växer komplexiteten i manuell förvärv exponentiellt. Även om flera TEM-lösningar möjliggör automatiska förvärv eller screening av flera rutnät, gör storleken på rutnätet och seriella avsnittsutmaningar ofta metoden inkompatibel för många exempel. För liknande fall genererar vi en komplett medelupplösningskarta över en övergripande ROI i flera avsnitt med en upplösning som är tillräcklig för att identifiera intressestrukturerna. Under detta laterala screeningsteg är det lämpligt att hoppa flera sektioner åt gången, i syfte att träffa åtminstone en del av intressestrukturen när den närmar sig slumpmässigt. Detta beror till stor del på strukturens övergripande dimensioner: t.ex. om strukturens totala storlek är 500 nm och sektionerna är 50 nm tjocka, kommer minst nio sekventiella sektioner i rad sannolikt att innehålla en del av intressestrukturen. På så sätt ska det vara effektivt att hoppa över 6–7 sektioner för att hitta många olika typer av strukturer inom flera områden. Automatiskt förvärv av de lösta mosaikkartorna över utvalda sektioner möjliggör noggrann screening av dessa avsnitt efter förvärvet. När en sådan högupplöst karta har förvärvats kan flera ROM-områden beskäras eller användas för att definiera ytterligare lokala bildområden på ROM(Kompletterande film 1). Golgi, centrioles, korsningar, mikrotubuli, olika typer av blåsor är bra exempel på de strukturer som kan dra nytta av detta scenario (Kompletterande film 1).
Analys av glest fördelade stora ROM i stora prover (figur 4F-4H)
Detta scenario innebär sällsynta händelser, som ofta beskrivs som "en nål i en höstack" där problemet inte är i ROI identifiering utan dess lokalisering. För många exempel är korrelativ metod inte ett giltigt alternativ, men ofta har ROI en avslöjande ultrastruktur och, när den är lokaliserad, kan identifieras med hög tillförlitlighet. För dessa prover är det viktigt att tillämpa förvärv på flera nivåer, till att börja med de förkontrollerade exemplen med tiotals till hundratals sektioner med medelupplösning. I programvaran som används här finns det två olika strategier för att få bilduppsättningar med flera avsnitt: Spela in förhandsgranskningsbilderna med högre upplösning eller förvärva en array tile set med lämpliga inställningar (bild 4F). Olika specialiserade celltyper iDrosophila tarmen distribueras slumpmässigt (t.ex. stam, enteroendokrina celler) och tunna sektionera vid slumpmässig orientering. Ändå kan de visuellt särskiljas efter att ha visat de bilder som erhållits med hjälp av högupplösta parametrar antingen från enstaka sektioner eller som en samling seriella bilder (figur 4G). Efter justeringen kan staplarna återges med hjälp av olika programvarulösningar (bild 4H, kompletterande film 2).
Scenario 1: Intestinala organoider (figur 5A)
Organoider håller snabbt på att bli ett av de mest banbrytande verktygen inom modern biovetenskap. Denna nästan fysiologiska 3D-stamcellsbaserade organmodell möjliggör en noggrann studie av en rad in vivo-biologiska processer, inklusive vävnadsförnyelse, svar på läkemedel och regenerativ medicin. Nyligen introducerade mini-gut rör34 öppnar upp en ny generation av organoid teknik, nära liknar in vivo vävnad fysiologi, cell-typ sammansättning och homeostas, vilket möjliggör breda perspektiv för sjukdomsmodellering, värd-mikrob interaktion och läkemedelsupptäckt. Men när ultrastrukturell karakterisering krävs kan lokalisering av olika celltyper i så stor vävnad med slumpmässiga prover vara utmanande. I varierande "infektionsanalyser" är det också viktigt att säkerställa att analysen avslöjar olika utvecklingsstadier som påverkar vävnaden. För sådana studier är statistiskt signifikant täckning av urvalet central, men ändå svår att uppnå med hjälp av den traditionella TEM-metoden för nät. AT-scenario 1 är fördelaktigt i sådana fall: många sekventiella avsnitt kan genereras på en wafer (figur 5Aii) och screenas med hjälp av lågupplösta parametrar för att lokalisera de allmänna intresseområdena (figur 5Aiii; pilar). Dessa områden kan inriktas på ytterligare analys med hjälp av avanceradeförvärvsparametrar ( figurerna 5Aiv och figur 5Av). När en relevant struktur identifieras (vanligtvis ett kluster med 5-10 avsnitt en gång i var 100-300 avsnitt) är det enkelt att koncentrera sig på var och en av intressestrukturerna och skaffa enstaka bilder manuellt eller använda automatiseringsfunktionerna för att hämta bildvolymer över flera avsnitt.
Scenario 2: Drosophila pupal notum ( figur5B)
Att studera celldelning och de mekanismer som styr progressionen genom cellcykeln är avgörande för att förstå både standardprocesser och förändrade processer i multicellulära organismer. Information som finns härleds ofta från encelliga system. Denna lösning saknar dock det kritiska sammanhanget för 3D-interaktionerna mellan cellerna i en vävnad. En encellig monoskikt av notum, den utvecklande baksidan av Drosophila larven, är en perfekt modell för interaktionen mellan epitelcellerna i allmänhet och celldelning i synnerhet35. Det är en etablerad modell för molekylära och cellulära interaktionsstudier med hjälp av kombinationen av de data som finns tillgängliga genom fluorescerande mikroskopi och genetiska manipuleringar. Abscission, det sista steget i celldelning, säkerställer den slutliga separationen mellan två delningsceller och känneteckna de strukturella förändringar som uppstår under abscission är avgörande för vår förståelse av mitos. Mitotiska uppdelningar i notum är dock inte lätta att lokalisera på den strukturella nivån: cellerna är relativt stora jämfört med abscissionszonen (figur 5B). Förhållandet mellan abscissionszonens totala storlek och ytan på den sektion som ska täckas är stort (figur 5Bi). Även om det är möjligt att lokalisera abscissionszonen med hjälp av TEM- eller SBF-SEM-metoderna36är uppgiften mödosam. Med det här scenariot kan de automatiska bilder av medelupplösningsöversikten av sprången på 20-40 avsnitt användas för att lokalisera delningscellerna (figur 5Bii). När sådana celler identifieras fungerar sektionerna som ankare för närmare undersökning av sektionerna i närheten, och många delningsceller kan hittas och väljas för vidare analys. På så sätt kan abscissionszonen lokaliseras och avbildas i sin helhet (figur 5Biii). Beroende på frågan kan enstaka högupplösta bilder eller 3-7 bildsekvenser samlas in för att täcka strukturens djup (figur 5Biv).
Scenario 3: Mus tanycyte nervceller (bild 5C)
Musen ger en väletablerad modell för hjärnans utveckling och är väl dokumenterad på olika nivåer, bland annat av EM. Även om olika automatiserade serial-block-face metoder har använts i stor utsträckning för att studera hjärnvävnad, finns det fall där AT är bättre anpassad för att samla in nödvändiga data. Hypotalamus är en väletablerad neurovetenskaplig modell, en del av hjärnan som innehåller flera neuronala typer funktioner. Hypotalamus tanycyter representerar en viss delmängd av ependymoglial celler som fodrar botten av den tredje ventrikeln, med ovanligt långa processer (upp till 300 μm) och stor ändfeet (~ 5 μm)37. Detta gör dem obekväma för analysen med antingen TEM- eller FIB-metoder. Uppgiften är ytterligare komplicerad när flera oberoende tanycyter behöver lokaliseras och analyseras. Ett av metoderna för att underlätta denna uppgift kan vara halvkorrelativ inriktning, där fluorescenskartan erhålls från de fluorescerande märkta proverna innan de fixeras och bäddas in för EM. Sektionering utförs på det område som fångas in genom att kombinera positionsinformation från fluorescensprovet och den platta inbäddade plastrepliken. Därefter kan AT-scenario 3 användas: mosaikbilderna på hög nivå genereras för att avslöja regionerna med tanycyte endfeet-kluster. Därefter används automatiseringsfunktioner i programvaran för att ställa in förvärv av sekvenser av bilderna från ett eller flera områden i en enda bild eller kaklat läge. Dessa bilder kan analyseras separat, som justerade staplar eller återges efter det.
Kraften i AT-metoden tillåter relativt enkel "uppgradering" av data från 2D till 3D: kartorna är tillgängliga från det primära förvärvet och volymerna kan erhållas från det valda området och dess närhet. Den resulterande stacken kan justeras och sedan återges. Det är viktigt att i förväg avgöra vilken upplösning och bildkvalitet som behövs för att hitta ROM. Avbildning bör göra det möjligt att känna igen ROI: erna, men inte utöver det här värdet eftersom förvärvstiden skalar proportionellt till pixelboendetid och den omvända kvadraten med pixelstorlek.
Figur 1: Utmaningar med EM-provberedning och volymförvärv. (A) Förlusten av fluorescens och krympning sker på grund av en hög tungmetallkoncentration och uttorkning under provberedningen. i) En schematisk ritning av ett prov som observerats under LM ii, samma prov som bereds för EM, som blir helt ogenomskinligt och förlorar cirka 10 % av sin volym. (B)Provinbäddning görs vanligtvis med epoxi- eller akrylhartser. Traditionella block (i) kan framgångsrikt användas för homogena prover som inte kräver en viss orientering. Platta block ii är till hjälp när det är viktigt att rikta in sig på och orientera sig under mikroskopet, ett exakt område som syftar till sektionering, t.ex. i icke-homogena prover eller korrelativa mikroskopiförfaranden. (C) Av hela provvolymen representeras endast en begränsad fraktion på en enda 50 nm-sektion, vilket ger en 2D-bild av ett 3D-prov, ofta i obekant orientering. (D) För att illustrera problemet med att registrera alltför stora volymer kontra exakt inriktning valde vi tre koncentriska kuber med ansikten på 1000, 500 och 50 μm organiserade för att inkludera ett hypotetiskt 1000 x 500 x 500 μm-prov (mörk rödbrun). Om sådana hypotetiska provkuber är noggrant sektionerade med 50 nm skivor, för att täcka hela volymen, kommer det att kräva totalt 20 000, 10 000 och 1 000 skivor och 800 msk, 100 msk och 100 gb, följaktligen (upplösningsavbildning 5 nm x 5 nm x 50 nm, 8 bitars data). Detta visar vikten av att planera förvärvet av EM-data endast för att förvärva den minsta nödvändiga volymen. (E) Att täcka en stor provyta med hög upplösning utgör ett problem som liknar det med stor volym. Att tiling flera högupplösta bilder i en är en användbar lösning på ett sådant problem. Men för att täcka en 1 mm x 1 mm yta med ramen 2024 x 1048 i 10 000x förstoring kommer det att krävas ett stort antal plattor, vilket kan bli utmanande att sy. Om avsnitten komprimeras eller förvrängs var och ens är olika under skärning blir de resulterande datastackarna nästan omöjliga att justera. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Arbetsflödet för direktgenerering av matriser med sektioner på stort stöd. (A) För tät trimning med trimverktyget är blocken säkrade inuti mikrotomhållaren. Detta steg hjälper till att säkerställa parallella sidor av ett block och minskar också tom harts runt provet. (B)En modifierad kniv för AT-sektioners förvärv. En stor båt underlättar överföringen av sektionerna och deras manipulering under provsektion och överföring på stödet. En stor bassäng möjliggör manipulering av sektionerna; dräneringssystemet begränsar bandens rörelse under dräneringssteget, den plana botten gör gradvis torkning av stödet tillförlitligt. (C) Kniven, klar för sektionering med en glödurladdning som placeras längst ner i bassängen och vatten som är jämnt till kanterna. Knivens konstruktion håller nålen inbäddad, utan att störa stödet. (D)Matrisgenerering, övervy på mikrotomsektionsområdet. i) De första sektionerna är vanligtvis lätta att få tag på eftersom de håller sig till varandra och bildar ett vanligt band. (ii) När fler sektioner läggs till i menyfliksområdet, och det blir längre, förlorar menyfliksområdet sin stabilitet och ofta kurvor. Det är viktigt att hålla ordningssekvensspåren ordnade i följd inför bildförvärvssteget. iii) När ett band av sektioner når önskad längd lossas det försiktigt från knivkanten med hjälp av en ögonfrans. iv) Vatten dräneras från bassängen. skivan förblir inuti tills den är helt lufttorkad. Detta steg är viktigt, eftersom det hjälper till att räta ut sektionerna och undvika bildandet av mikrovecken. Skivan placeras i ugnen vid 60°C i minst 30 minuter för att fästa sektionerna på stödet. (E) Exempel wafers med de överförda sektionerna. Även om det är bekvämt att få raka och exakta band, förhindrar faktiska prover bildandet av sådana idealiska band i de flesta fall. Ändå är även "slarviga" band mycket informativa för det stora antalet fall, och vikten av det "snygga" bandet beror på en forskningsstrategi för vilken sektionerna samlas in. Skalstreck 1 cm. (F) Exempel på kortplatsrutnät med de seriella sektionerna. Även när många sektioner samlas in på ett rutnät är det fortfarande en liten bråkdel av vad som kan samlas in på en enda skiva. Den färdighet som krävs för att behärska överföringen av sektionerna på ett rutnät (i synnerhet spårgaller) utgjorde en betydande flaskhals för att behärska elektronmikroskopiprovberedning. Skalstång 500 μm. (G) Oavsett vilken sektionsinsamlingsmetod som användes är styrkorna i AT-metoden den relativa lättheten i genereringen av sekventiella sektioner jämfört med insamlingen på nätet. Om ett provblock på 1000 μm x 500 μm beaktas är det inga problem att passa runt 100 sektioner på en 2 cm x 4 cm wafer (i). Samma storleksavsnitt på ett spårrutnät passar endast tre sektioner/rutnät på maximalt (ii). Vi tillhandahåller en skalad bild för att visa hur många rutnät som kan krävas för att täcka samma antal avsnitt, utan att nämna svårigheten att samla in seriella avsnitt i rutnätet. Skalningslist = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Kritiska steg i arbetsflödet för matristomografi. Schemat för arbetsflödet för obevakad anskaffning av högupplösta bildstackar. Alla förberedande steg är automatiserade (gröna växelsymboler) och kräver inte att några åtgärder utförs manuellt, avsnitt för avsnitt. Bildstaplar kan justeras i alla bildanalysprogram som kan automatiskt styv eller affinjustering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Tre förvärvsscenarier med Drosophila vuxen tarm som en demonstrationsmodell. A)ritning av en dissekerad Drosophila midgut, med tre större regioner som betecknas av olika färger: främre, mellersta och bakre. (B) Trimmat platt block där en tarm är orienterad för tvärsnitt. Observera att den tomma hartsmängden är noggrant balanserad runt vävnaden som innehåller den intresseområde (vit rektangel). (C) Tvärgående seriella sektioner flyter på vattenytan inuti AT-knivens bassäng. Alla bilder förvärvades i sekundär elektron SEM-läge med hjälp av spegeldetektorn med den omvända kontrasten. (D) Sydd mosaikbild av tvärgående seriella sektioner på en skiva. Skalstången är 1000 μm. (E) Tvärsnitt genom Drosophila gut. Skalstång 20 μm. Bilden är en sydd mosaik av 7 x 7 mellanklassbilder. Insets - högre förstorings- och upplösningsbilder av de specifika områden av intresse: (ii) kärna, iii) penselkant och (i) mitokondrier. Skalstång 5 μm för alla. (F) En mellanklassbild av en tvärgående sektion genom tarmen som riktar in sig på platsen för att utveckla celler (kvadratisk). Skalstrecket är 20 μm. (G) Den riktade matrisen av seriella sektioner som samlas in baserat på det område som lokaliseras under analysen av avsnittet som finns i panel F. Skalstrecket är 10 μm. (H) 3D-modellen återges baserat på 50 sektioners stacksekvens som erhållits från den riktade serieförvärvet i panel G. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fallstudier för AT-tillämpningsscenarierna. (A) Lokalisering av olika cellstrukturer i tarmorganoiden. i) Inbäddat mikrochip av kisel. Skalstång = 200 μm. (ii) En sydd mosaikbild av 127 tvärsnitt genom chipets centrala del. Skalstång = 1500 μm (iii) Fyra lågupplösta bilder av en komplett tvärgående sektion genom den del av tarmorganoiden. Pilar pekar på den potentiella platsen av intresse. Skalstapeln är 20 μm. (iv) Olika ROI: er, riktade mot lågupplösta mikrografer som valts ut för vidare analys. Skalningslist = 10 μm. (v) Högupplöst bild av den infekterade cellen av intresse. Analys av samma region i de intilliggande avsnitten kan ge riktad 3D-information vid behov. Skalstång = 5 μm. (B) Midbody lokalisering i Drosophila melanogaster pupal notum. i) En schematisk vy av en dissekerad Drosophila pupa. Notum exponeras för dissekering (beige) efter att ha tagit bort delen av skydds nagelbandet (brun). Den svarta linjen anger sektionsriktningen ii) Ett tvärsnitt genom det område som visas i diagrammet. Bilden kombinerar 3x7 sekventiellt tagna högupplösta SEM-bilder sydda till en mosaikpanel. Den svarta rektangeln avgränsar området som innehåller en delningscell. Skalstrecket är 15 μm. (iii) En zoomad bild på delningscellen från panel ii. Vid denna förstoring och upplösning är mellankroppen uppenbar (vita pilar). Hela avsnittet analyseras för att hitta delningscellerna. Att hoppa mellan olika band av sektioner i 20-30 sektioner intervaller under lateral screening steg tillåter sto lokalisera många dela cellpar. Skalstrecket är 5 μm (iv) när en delningscell är lokaliserad, sekventiella bilder av mellankroppen som samlas in från fyra sektioner runt mellankroppen avgränsade av gul kvadrat i panelen (iii). Skalstången är 1 μm. (C) Tanycytes endfeet lokalisering i musen hypotalamus. i) Fluorescensbild av en vibratomskiva. Tanycyter uttrycker tdTomato fluorescerande protein (rött). En vit rektangel avgränsar intresseområdet. Skalstång 500 μm. ii) Samma vibratomsektion som bereds för EM kommer noggrant att trimmas runt det intresseområde som baseras på den indirekta korrelationen mellan fluorescerande information från panel i. Den prickade vita linjen representerar området för ultrathin-sektionering. Skalstången är 50 μm för båda panelerna. iii) Tvärsnitt genom vibratomskivan inom intresseområdet. SEM mosaikbild består av 75 sydda bilder. Flera sektioner är riktade mot lateral screening och avbildas med liknande parametrar. Avsnitten analyseras "offline" för att hitta ROI - tanycyte endfeet. Den svarta rektangeln representerar det område som innehåller tanycyte-endfeet. Detta avsnitt kommer att fungera som ett ankare för ytterligare analys. Skalstången är 15 μm. (iv) Högupplöst, hög förstoringsbild av tanycyte endfeet som omger ett blodkärl. Efter den första lokaliseringen av ROI på ett avsnitt samlas z-sekvensen in från de intilliggande sektionerna uppströms till ankarsektionen (panel iii). Skalstreck 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Problem vid ultramikromatomi, sektionsinsamling och sektionslagring kan leda till artefakter. Det mesta av det tomma hartset lossnar från vävnaden och vikts på sig själv (sepia). Streckad svart ruta anger ett område som används för att innehålla hela avsnittet. Skalstång 500 μm. (B) En liten, lokal vikning på ytan av en 50 nm tjock zebrafisksektion. Skalstång 1 μm. (C) Knivmärke på ytan av en 70nm mushjärnsektion. Skalstång 5 μm. (D) Håret (asterisk) på ytan av skivan som delvis täcker en zebrafisk muskelsektion. I gult är vävnaden inriktad på analysen. I rosa brukade en cell fungera som referens för storleken på det drabbade området. Skalstång 50 μm. (E) Zebrafish notochord med rynkor längst ner till höger (svarta pilar), där tät neural vävnad (skuggad i blått) gränsar till mjukare muskelvävnad och tomt harts (svarta pilar). Skalstång 10 μm. (F) Volymsegmentering av en stack med 50 bilder som i E, som visar att denna region visade rynkor i de flesta sektioner. Streckad polygon beskriver det område som visas i G. Scale bar 10 μm. (G) XY-vyn av samma volymsegmentering som i F, som visar rynkor som korta svarta slag i den högra halvan av blocket. Observera att stapelns inriktning i de återstående delarna av vävnaden inte påverkas av rynkor. Skalstång 5 μm. (H) XZ-projektion av samma område som i G, som visar rynkor i alla 50 sektioner. Skalstreck 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: En högupplöst montagebild av ett tvärsnitt genom Drosophila främre midgut. Mosaik bild av en inverterad SE-MD SEM bild. 352 separata bildplattor förvärvades automatiskt vid 5 nm upplösning och syddes för att presentera hela tvärsnittet. Det är möjligt att zooma in för mer information och få en uttömmande täckning av data med samma bild. Snäva korsningar, mikrotubuli, olika typer av blåsor kan vara när du zoomar in. Skalningsfältet är 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande film 2: Drosophila tarmceller rendering. Femtio justerade mosaikbilder av sektionerna i området för delning av tarmceller. IMOD-rendering av cellkanterna (blå, turkos och orange) och kärnor (vita). Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande material. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Elektronmikroskopi ger insikt i cellernas och organismernas ultrastruktur, för vilken det ofta är önskvärt att avbilda strukturer av intresse i deras 3-dimensionella sammanhang. Trots många EM-taktiker för ultrastrukturell analys finns det fortfarande ingen "guldstandard" lösning. Den främsta orsaken är det stora utbudet av prover, många biologiska frågor, som ofta kräver ett skräddarsytt tillvägagångssätt. Det föreslagna AT-arbetsflödet är utformat för att minimera den tid som krävs för prov bearbetning, datainsamling, utvärdering och lagring. Dessutom ger den modifierade kniven ett användbart verktyg för att förenkla matrisförvärv. Den kompakta layouten av sektioner på plattor är bekväm, både för observation och efterföljande lagring av proverna. Detta arrangemang möjliggör "lateral screening" av prover genom att horisontellt flytta från band till band och skanna endast ett avsnitt på varje, vilket avsevärt minskar den tid som krävs för att lokalisera en ROI. Föreslagna scenarier för datainsamling underlättar inriktningen av små och slumpmässigt fördelade områden. När AT/SEM väl har hittats begränsar den högupplösta avbildningen exakt till den mängd av intresse som utförs manuellt eller med hjälp av automatisk funktion. AT för begränsade volymer kan slutföras manuellt, där operatören navigerar genom provet och definierar bildområden en efter en. Den automatiserade modulen i programvaran ger en flexibel bildförvärvsstrategi för avbildning av små områden på stora sektioner. Automatiseringen i denna programvara gör det möjligt att spela in stora högupplösta bilder på hundratals sektioner, vilket uppnår liknande volymer som SBFI. Att spela in översiktsbilder av alla avsnitt förenklar ROI-lokaliseringen och minskar tiden vid mikroskopet. Eftersom avsnitten inte skadas under inspelningen av översikter och förhandsversionen med högre upplösning tillåter AT/SEM återanvändning av provet för att samla in ytterligare data från andra ROM-produkter eller med högre upplösning.
Bildförvärvstid är en av de viktigaste (och dyraste) aspekterna av 3D EM och bör därför beaktas i experimentdesignen. Även om det inte är förvånande att avbildning av stora områden tar längre tid än att avbilda små områden, är det lätt att underskatta effekten: Beroende på vilka bildparametrar som valts kan förvärvstiden för varje avsnitt variera från sekunder till timmar. Kritiska bildparametrar inkluderar storleken på synfältet, upplösningen och uppehållstiden. Om man antar en målupplösning på 10nm per pixel och 1 μs uppehållstid, tar det 4 sekunder, 100 sekunder eller 2 500 μm att registrera ett fält på 20 μm x 20 μm, 100 μm x 100 μm eller 2 500 s. Vi kan multiplicera dessa bildtider per avsnitt med antalet avsnitt för att uppskatta den tid som krävs för hela bildjobbet. Långa bildtider per avsnitt kan vara acceptabla om antalet sektioner är litet eller om mikroskopverktygstiden inte är något problem.
Det är dock nödvändigt att begränsa inspelningstiden till ett nattjobb eller ett helgjobb i de flesta fall. En lika kritisk aspekt av 3D EM som bör beaktas är mängden och strukturen för de resulterande bilddata. Om du registrerar ovannämnda bildfält i 100 avsnitt genereras 400 mb, 10 gb respektive 250 gb bilddata. Bilderna på 500 μm x 500 μm utgör det ytterligare problemet med att vara större än 2 gb vardera. Många av de program som används för datautvärdering kan inte öppna bilder av denna storlek.
För att minska bildtiden är det viktigt att välja pixel uppehållstid för att uppfylla kraven på signal-till-brus-förhållande för efterföljande datautvärdering (t.ex. rekonstruktion, spårning) och begränsa inspelningarna till definierade ROI. AT-förlängningen av programvaran underlättar bildförvärv i små områden i seriella sektioner. Programvaran stöder manuella och automatiska arbetsflöden och många halvautomatiska varianter: bildområden kan placeras manuellt och fokuseras på varje avsnitt, eller användaren kan använda den automatiska sektionssökaren och positionsjusteringsfunktionerna. Beroende på vilken automatiseringsnivå som valts och stöds av exempeltypen eller bild avbildningsmålen kan den tid som krävs för att konfigurera bildförvärv i hundratals avsnitt ta en hel arbetsdag (görs manuellt) eller bara några minuter. I princip gör Array Tomography det mer utmanande än andra 3D EM-metoder att förvärva små ROIs; oprecis regionplacering på på varandra följande avsnitt måste kompenseras genom förvärv av större arealer. Om avkastningen till exempel är 20 μm x 20 μm i storlek och sektion-till-sektion-positionsvariationen för bildfält är 10 μm, måste man skaffa 40 μm x 40 μm bilder för att vara säker på att ROI är helt fångad i varje bild, på varje avsnitt. Den verkliga bildpositionsvariationen varierar från 100 μm till <10 μm beroende på tillgängligheten eller kvaliteten på programvarufunktioner för positionsjustering eller användarens tålamod. Med denna programvara kan 10 μm uppnås utan för mycket manuell intervention i de flesta prover.
Liksom alla tekniker har AT flera svaga punkter som kan påverka framgångsrikt datainsamling, och många liknar andra sektionsbaserade metoder. Brist på homogen fördelning av tomt harts kontra vävnad kan resultera i böjda eller trasiga matriser. I extrema fall kan sektioner lossna från stödet (figur 6A). Variabel komprimering eller sträckning under skärprocessen kan skapa veck som kan störa provet i variabla områden på efterföljande sektioner (bild 6B). Knivmärken kan förekomma på ytan av de insamlade sektionerna med en skadad kniv (figur 6C). Skillnader i sektionsförhållanden kan inducera tillfälliga sektionskomprimerings- och tjockleksskillnader. Damm- eller smutspartiklar kan landa på en sektion och delvis skymma intressezonen(figur 6D). Bildförvärv kan misslyckas på grund av ofullständiga funktioner för automatisk kontrast, autofokus och auto-stigmator. Placeringen av automatiskt skapade bildområden kan vara variabel och kan misslyckas med att fånga avkastningen i alla avsnitt.
Flera problem kan uppstå vid söm- och inriktningsstadiet. Den automatiska sömmen av mosaikplattor förvärv kan misslyckas, till exempel på grund av det stora tomma utrymmet inuti provet. På grund av en drastisk förändring i form i 3D kan bildstackar vara utmanande att registrera sig. Specialutvecklade program (t.ex. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB eller MAPS-AT) kan underlätta halvautomatisk inriktning32,38,39,40. Mer utmanande avsnitt kan justeras manuellt med hjälp av fotoredigeringsprogram. Tyvärr kan vissa data uppsättningar vara omöjliga att justera korrekt.
Stora prover är utmanande för TEM-seriella sektioner som monteras på rutnät. Å andra sidan motiverar många projekt inte ett långt automatiskt förvärv med FIB/SEM eller SBF-SEM. AT är ett enkelt alternativ till en tråkig seriesektion TEM där insamling och manipulering av seriella sektioner på en wafer är enklare än med slitsrutnäten. Flera strategier utvecklades för att underlätta insamlingen av matriserna, och vi delar vår metod för att utöka den befintliga verktygslådan. I de fall där identifieringen av roi är utmanande ger AT-SEM en grundläggande fördel, med effektiv screening av proverna där organellskalans upplösning krävs över 50 till 500 sektioner. För större volymer kan de automatiska insamlings-AT-strategierna samlas in effektivt om fler avsnitt krävs. AT-prover kan avbildas flera gånger, vilket underlättar riktad avbildning av högupplösta områden baserat på tidigare förvärvade översiktsbilder. Vi tror att den riktade analysen och den minskade översamplingen av AT/SEM som föreslås här minskar arbets- och datalagringskraven. I slutändan kan bibliotek med sektioner samlas in och underhållas för senare återanvändning och samråd. För volymförvärv erbjuder FIB- eller SBF-SEM-metoder en utmärkt lösning när avkastningen är lätt att identifiera på blockytan eller om stora 3D-volymer behövs för analysen. FIB/SBF-SEM är dock mindre effektiva när den högupplösta stackbilden måste samlas in från en definierad ROI på ett riktat sätt. Sammanfattningsvis gör de föreslagna metoderna för screening av AT-prover och användningen av bilder med medelupplösningsöversikt det möjligt att begränsa bildförvärvet till de relevanta delarna av avsnittsmatrisen. Exakt mål för bildregioner påskyndar tid till data och förenklar datautvärderingen.
Sammanfattningsvis, även om begreppet AT/SEM inte är nytt, är dess användning fortfarande inte så utbredd som dess fördelar skulle antyda. På det hela taget ger det ett kompletterande förfarande till andra befintliga EM-metoder. AT/SEM är kompatibel med det bredaste utbudet av provberedningsprotokoll och bildarbetsflöden och kan göras på alla FIB/SEM- eller SBF-SEM-mikroskop som en medföljande teknik. I det här dokumentet har vi koncentrerat oss på AT för att registrera strukturella data från prover som är mindre benägna att hanteras framgångsrikt med andra metoder. Vi hoppas att det beskrivna förfarandet för bekväm insamling av sektioner och avsevärt automatiserade förvärvsstrategier kommer att hjälpa till i de första försöken för dem som aldrig har stött på metoden och kommer att bidra till att fullända den för dem som redan har viss erfarenhet.
Disclosures
Författaren Tilman Franke är anställd av Thermo Fisher som tillverkar elektronmikroskop och pilotprogram som används i artikeln.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i EM-anläggningen vid universitetet i Lausanne för deras stöd under denna utveckling av olika steg i AT-förfarandet. Vi vill tacka Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien och Lindsay Lewellyn för diskussioner under utarbetandet av manuskriptet och kritisk läsning. Vi vill uppmärksamma de grupper som bidrog med de prover som användes för att demonstrera de olika scenarierna: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat och Fanny Langlet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting | |||
| AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
| Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
| Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
| Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
| Image acquisition | |||
| FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
| Image analysis | |||
| Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |
References
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Mulcahy, B., et al. A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system. Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. Electron tomography of molecules and cells. Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).
- Hoog, J. L., et al. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
- Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography. Cells. 8 (1), 57 (2019).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Kubota, Y., et al. A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure. Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).
- Wacker, I. U., et al. Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Templier, T. MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy. Elife. 8, 45696 (2019).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb. Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).
- Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
- Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M.
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 25916 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution. Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).
- Maco, B., et al. Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons. PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).
- Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
- Markert, S. M., et al. 3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species. Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).
- Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms. Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).
- Kolotuev, I. Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production. Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).
- Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Daniel, E., et al. Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues. Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).
- Pasquettaz, R., et al. Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma. Journal of Comparative Neurology. , (2020).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
