티오글리콜산(TGA)을 이용한 식물바이오매스 리그닌 함량 추정

Lignin은 식물 세포벽의 중요한 하중 베어링 구성 요소 중 하나이며 지구 1에서 두 번째로 풍부한^{폴리머입니다.} 화학적으로, 리그닌은 아로마 폴리머의 자연 재생 가능한 공급원을 형성하는 고분자량 복합 페놀 화합물로 구성된 교차형 이성포합체이며 생체 재료^2,3. 이 천연 폴리머는 식물 성장, 발달, 생존, 기계적 지원, 세포벽 강성, 물 수송, 광물 수송, 숙박 저항, 조직 및 장기 개발, 에너지 증착 및 생체 및 생물학적 스트레스^{4,5,6,7로부터의}보호에 중요한 역할을 한다. Lignin은 주로 세 가지 다른 모노리그놀로 구성됩니다: 코니페릴, 시나필 및 페닐 프로파노이드^통로에서파생된 p-coumaryl 알코올^8,9. 리닌의 양과 단량의 조성물은 식물 종, 조직/장기 유형 및 식물 개발의 상이한 단계에 따라^{다릅니다(10).} 리그닌은 소스와 모노리그놀 조성에 기초하여 침엽수, 나무, 잔디 리그닌으로 광범위하게 분류됩니다. 소프트우드는 주로 4% p-coumaryl과 1% 시나필 알코올로 95%의 침엽수 알코올로 구성됩니다. 나무는 같은 비율로 수막과 시나필 알코올을 가지고 있으며, 잔디 리그닌은 40eryl, 시나필 및 p-coumaryl 알코올^11,12의다양한 비율로 구성됩니다. 단량체의 조성은 세포벽의 리그닌 강도, 분해 및 분해뿐만 아니라 분자 구조, 분기 및 다른^{다당류(13,14)와}교차하는 것을 결정하기 때문에 중요하다.

Lignin 연구는 저비용과 높은^{풍요로움15,16로}인해 섬유 산업, 제지 산업 및 바이오 에탄올, 바이오 연료 및 바이오 제품에 대한 중요성을 얻고 있습니다. 다양한 화학적 방법(예를 들어, 아세틸 브로마이드, 산세제, 클라손, 퍼망가네이트 산화)와 기악방법(예를 들어, 근적외선(NIR) 분광법, 핵자기공명(NMR) 분광법 및 자외선(UV) 분광성^제17호에사용하였다. 리그닌의 분석 방법은 일반적으로 전자기 방사선, 중력 및 용해도에 따라 분류됩니다. 전자기 방사선에 의한 리그닌 추정의 원리는 특정 파장에서 빛을 흡수하는 리그닌의 화학적 특성에 기초했다. 이러한 결과는 리그닌이 탄수화물보다 더 강한 UV 흡광도를 가지고 있다는 원리에 따라 추정되었다. 1962년 볼커와 서머빌은 염화칼륨 펠릿을 사용하여^18번나무의 리그닌 함량을 추정했다. 그러나, 이 방법은 비리닌 페놀 화합물의 존재와 적절한 소멸 계수의 부재로 인해 초본 샘플로부터 의 리그닌 함량의 추정에 단점이 있다. 1970년 퍼거스와 고링은 구아실과 실리실 화합물 흡수 극대화가 280nm와 270nm에 있는 것으로 나타났으며, 볼커와 서머빌 방법^19의멸종 계수 문제를 수정했다. 나중에 페놀을 특성화하기 위한 매우 민감한 기술인 적외선 분광법은 소량의 식물 바이오매스 샘플을 가진 리그닌 추정에도 사용되었습니다. 이러한 기술의 한 가지 예는 분산 반사포리미티에 변형 분광측정법이었습니다. 그러나 이 방법은 UV^{방법(20)과}유사한 적절한 표준이 부족하다. 나중에, 리그닌 함량은 NIRS (근적외선 분광법) 및 NMR (핵 자기 공명 분광법)에 의해 추정되었다. 그러나, 이러한 방법에단점이 있다, 그들은 리그닌의 화학 구조를 변경하지 않습니다, 그 순도^{유지 20.}

그레이비메트릭 클라슨 방법은 우디 줄기의 리그닌 추정을 위한 직접적이고 신뢰할 수 있는 분석 방법입니다. 그레이비메트릭 리그닌 추정의 기초는 비리그닌 화합물의 가수분해/용해화 및 중력에 대한 불용성 리그닌의^{수집이다(21).} 이 방법에서, 탄수화물은 농축 된 H₂SO_4를 가진 바이오 매스의 가수분해에 의해 제거되어 리그닌 잔류물^20,22를추출한다. 이 방법에 의해 추정된 리그닌 함량은 산 불용성 리그닌 또는 클라손 리그닌이라고 합니다. Klason 방법의 적용은 식물 종, 조직 유형 및 세포벽 유형에 따라 다릅니다. 탄닌, 다당류 및 단백질과 같은 비 리그닌 성분의 가변적인 양의 존재는 산 불용성/수용성 리그닌 함량의 추정에 비례적인 차이를 초래합니다. 따라서, 클라슨 방법은 우디^{줄기(17,23)와}같은 고리닌 함량 바이오매스의 리닌 추정에만 권장된다. 아세틸 브로마이드(AcBr), 산불용성 리그닌, 티오글리콜산(TGA)과 같은 용해도 방법은 다양한 식물 바이오매스 소스로부터 리그닌 함량을 추정하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 김 외는 용해도에 의한 리그닌 추출을 위한 두 가지 방법을 확립했다. 제1방법은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 용해시킴으로써 용해성 잔류물로서 리그닌을 추출하고, 두 번째 방법은 용해 분획에서 리그닌을 분리하여 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 용해성^{잔류물(24)로}남겨두는다.

용해도에 기초하여 리그닌 추정에 사용되는 유사한 방법은 티글리글리콜산(TGA) 및 아세틸 브로마이드(AcBr)^{방법(25)이다.} TGA와 아세틸 브로마이드 방법 모두 280 nm에서 용액화된 리그닌의 흡광도를 측정하여 리그닌 함량을 추정합니다. 그러나, AcBr 방법은 리그닌 용해화 과정에서 자일란을 저하시키고 리그닌^{함량(26)의}잘못된 증가를 나타낸다. 티오글리콜레이트(TGA) 방법은 TGA를 이용한 리그닌의 벤실 알코올 그룹의 티오에테르 그룹과의 특정 결합에 의존하기 때문에 보다 신뢰할 수 있는 방법입니다. TGA 바운드 리그닌은 HCl을 이용한 산성 조건하에서 침전되며, 리그닌 함량은 280nm^27에서흡광도를 이용하여 추정된다. TGA 방법은 덜 구조적 수정, 리그닌 추정의 가용성 형태, 비 리그닌 성분의 간섭 감소, TGA와의 특정 결합으로 인한 리그닌의 정확한 추정의 추가 이점이 있습니다.

이러한 TGA 방법은 리그닌 함량 추정에 사용되는 식물 바이오매스 샘플의 종류에 따라 수정된다. 여기서, 우리는 리닌 함량을 추정하기 위해 면 조직에 쌀 빨대^(27)의 급속한 TGA 방법을 수정하고 적응시켰다. 간단히, 건조된 분말 식물 샘플은 단백질 및 알코올 용해 분획을 제거하기 위해 단백질 용해화 완충제 및 메탄올 추출을 실시하였다. 알코올 불용성 잔류물은 산성 조건하에서 TGA와 침전 된 리그닌으로 치료되었다. 리닌 표준 곡선은 상업적 대나무 리그닌을 사용하여 생성되었고 회귀 라인(y = mx+c)이 얻어졌다. "x" 값은 280nm에서 리그닌의 평균 흡광도 값을 사용하며, "m" 및 "c" 값은 회귀 라인에서 입력되어 면 식물 바이오매스 샘플에서 알 수 없는 리그닌 농도를 계산합니다. 이 방법은 5단계로 나뉩니다: 1) 식물 시료의 준비; 2) 물과 메탄올로 샘플을 세척; 3) 리그닌을 침전시키는 TGA 및 산으로 펠릿의 치료; 4) 리그닌의 강수량; 및 5) 샘플의 표준 곡선 제제 및 리그닌 함량 추정. 처음 2단계는 주로 식물 재료 제제에 초점을 맞추고 물, PSB(단백질 용해화 완충제) 및 메탄올 추출을 통해 알코올 불용성 물질을 얻습니다. 이어서, TGA(티오글리콜산) 및 HCl로 처리되어 제3상에서 리그닌을 가진 복합체를 형성하였다. 결국, HCl은 280 nm^28에서흡광도를 측정하기 위해 수산화 나트륨에 용해된 리그닌을 침전시키는 데 사용되었다.

1. 식물 샘플 준비

1. 온실에서 2개월 된 면화 식물을 수집합니다(그림1A).
2. 식물 냄비를 부드럽게 뒤집어 토양과 뿌리를 그대로 측면 뿌리로 분리하여 식물 주위의 토양을 느슨하게합니다(도1B).
3. 수집된 식물을 물로 가득 채운 트레이에 철저히 세척하여 모든 먼지(뿌리 샘플용)를 제거합니다(도1C).
4. 종이 타월을 사용하여 분리된 뿌리, 줄기 및 잎 조직을 건조시키고 라벨을 붙입니다(그림1D). 곰팡이 오염을 방지하기 위해 실온에서 2 일 동안 공기 건조(그림 1E).
5. 샘플 조직을 라벨이 부착된 용기/알루미늄 호일로 옮기고 7~10일 동안 49°C에서 온도 조절 인큐베이터에서 인큐베이션을한다(그림 1F).
   참고: 온도가 높을수록 리그닌 구조가 변경될 수 있습니다. 또는 동결 건조기를 사용하여 식물 바이오매스에 화학적 변화를 일으키지 않고 1~2일 동안 시료를 건조시킬 수 있습니다.
6. 블레이드를 사용하여 인큐베이터 건조 조직을 5mm 크기의 조각으로 자르거나 바이오매스 그라인더를 사용하여 식물 조직을 분쇄합니다(도1G, 도 1H).
   참고: 바이오매스 그라인더/블레이드는 각 시료를 절단/접기 후에 청소해야 합니다.
7. 절단 된 조직 / 바이오 매스 접지 식물 재료를 연삭 바이알로 옮기고 액체 N_2를가진 냉동고 밀 또는 극저온 분쇄기를 사용하여 1mm 크기의 미세 분말로 갈아 냅니다.
8. 10 CPS (각 사이클 스팬 2 분)의 속도로 3 사이클에 대한 샘플을 균일 한 분말(그림 1I,1J, 1K)으로분쇄합니다.
   참고: 이 시점에서 실험을 일시 중지할 수 있으며 샘플은 장기 보관을 위해 밀폐 용기에 실온에서 저장할 수 있습니다.

2. 물, PSB 및 메탄올로 시료 를 세척

1. 실험실 노트북에서 리그닌 함량 추정에 사용되는 모든 빈 2mL 마이크로퍼지 튜브의 중량을 측정하고 기록합니다.
2. 지상 샘플 파우더 20 mg을 미리 계량된 튜브로 옮기습니다. 조직 및 조직 분말튜브의 무게를 측정하고 실험실 노트북에 이러한 가중치를 기록합니다.
3. 모든 2mL 마이크로퍼지 튜브 (열린 뚜껑)와 열 블록 또는 오븐에서 20 mg의 조직 분말을 1 시간 동안 60 ° C로 배양하십시오.
4. 인큐베이션 후 실온(RT)에서 10분 동안 시료를 식힙니다.
5. 각 미세 분리 튜브에 1.8mL의 물을 넣고 소용돌이에 섞습니다. 그런 다음, 원심분리기는 RT에서 10분 동안 25,200 x g(15,000 rpm)에서 원심분리기를 폐기하고 상퍼트(그림2)를폐기한다.
6. 1.8mL의 단백질 용해성 버퍼(PSB)(표1)를각 유지 펠릿에 넣고 소용돌이에 섞습니다. RT에서 10분 동안 25,200 x g(15,000 rpm)의 원심분리기와 상류부를 폐기합니다.
7. 각 샘플에 대해 2.6 단계를 다시 반복합니다.
8. 각 펠릿에 1.8mL의 물을 넣고, 10분 동안 25,200 x g(15,000rpm)에 25,200 x g(15,000rpm)에 원심분리기를 섞습니다. 원심 분리 후 펠릿을 저장하고 상체를 폐기하십시오.
9. 유지 된 펠릿에, 메탄올의 1.8 mL을 추가하고 20 분 동안 60 °C 열 블록에 인큐베이션. 그런 다음 RT에서 10 분 동안 25,200 x g (15,000 rpm)의 원심 분리기. 원심분리 후, 상신체를 버리고 펠릿을유지한다(도 2).
10. 각 샘플에 대해 2.9 단계를 다시 반복합니다.
11. RT에서 펠릿을 건조시키거나 진공 건조로 즉시 진행합니다. 진공 건조기를 사용하여 30°C에서 2~ 3시간 동안 또는 펠릿이 완전히 건조될 때까지 진공 건조.
    참고: 이 시점에서 야간 공기 건조로 실험을 일시 중지하거나 진공 건조로 계속 사용할 수 있습니다.
12. 건조 후, 말린 펠릿으로 샘플 튜브를 계량하고 실험실 노트북에 각각의 빈 튜브 무게 옆에 무게를 기록합니다. 두 값을 빼서 펠릿 가중치를 추정합니다. 이러한 가중치는 리그닌 추출 공정의 끝에서 리그닌 추정에 사용됩니다.
13. 리그닌 추출의 이 시점에서, 리그닌 표준 곡선의 생성을 위한 상업적 대나무 리그닌을 포함한다. 상용 대나무 리그닌을 0.5 mg에서 5 mg에 0.5 mg 단위로 측정하십시오 (0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg 및 5.0 mg). 세 가지 기술 복제에 대해 각 농도를 세 번 측정합니다.
    참고: 여기에서, 위의 단계에서 측정된 표준은 건조된 견본과 같은 방식으로 처리되었습니다.

3. 리그닌을 침전시키는 TGA와 산으로 펠릿의 치료

1. 상기 단계에서 측정된 표준과 함께, TGA(티오글리콜산) 처리에 대한 과목 가공 샘플.
2. 각 펠릿에 3N HCl(표1)및 100 μL의 1mL를 추가합니다.
3. 소용돌이 및 인큐베이션은 연기 후드에서 3시간 동안 80°C 예열된 열블록(도2)에배양한다.
   참고: 80°C의 가열 단계를 모니터링해야 합니다. 고압 축적은 뚜껑을 열 수 있으며 화학 물질 유출로 이어질 수 있습니다. 나사 캡 튜브는 권장하지만 이러한 유출을 방지하기위한 대안으로이 단계에서 2 mL 튜브를 느슨하게 덮을 수 있습니다.
4. 인큐베이션 후 RT에서 10-15분 동안 원심분리기에서 10분 동안 식힙니다.
   참고: 산성 및 유기 용매에서 발생하는 폐기물을 분리하여 통풍이 잘 되는 캡이 있는 유리 용기에 보관해야 합니다. TGA 산성 폐기물 및 산성 폐기물의 수집을 위해 별도의 유리 용기를 사용합니다.
5. 원심 분리 후, 상체를 버리고 펠릿을 유지합니다. 1mL의 물을 넣고, 소용돌이로 섞고, 원심분리기는 RT에서 10분 동안 25,200 x g(15,000rpm)에 섞습니다.
6. 원심분리 후, 상체를 버리고 펠릿을 1N NaOH에서 24시간 동안 37°C 쉐이커/열믹서에서저속(그림 2)으로혼합한다.
   참고: 이 인큐베이션 시간은 1시간^7로단축될 수 있습니다.
7. 인큐베이션 후, RT에서 10분 동안 25,200 x g(15,000 rpm)에서 2mL 마이크로퍼지 튜브를 원심분리합니다.
   참고: 절차는 강한 산 및 자연에서 부식성 다른 화학 물질의 사용을 포함. 따라서, 적절한 PPE를 착용하는 것은 리그닌 추정 의 과정 전반에 걸쳐 권장됩니다. TGA는 강한 불쾌한 냄새를 가지고 있으며 자연에서 부식성입니다. 따라서 연기 후드에서만 사용하는 것이 좋습니다.

4. 리그닌강수량

1. 상체를 신선한 2mL 마이크로퍼지 튜브로 옮기고 농축 된 HCl. 인큐베이션200을 4 시간 또는 하룻밤 동안 4 °C에서 추가합니다(그림 2).
   참고: 냉장 단계를 하룻밤 사이에 연장하여 추출 프로세스를 일시 중지할 수 있습니다.
2. 원심분리기는 RT에서 10분 동안 25,200 x g(15,000 rpm)에서 1ML의 1mL에서 펠릿을 용해시고 1N NaOH의 1mL에 용해한다.
3. NAOH에서 펠릿을 완전히 중단하기 위해 10 분 동안 RT에서 셰이커에 인큐베이션하십시오.
4. 마지막으로, 분광광계를 사용하여 280 nm에서 샘플의 흡광도를 측정하고 표준 리그닌 곡선과 비교합니다.
5. 280 nm에서 추출된 시료의 교정 곡선 회귀 라인 값 및 흡광도를 사용하여 리그닌의 알 수 없는 농도를 측정한다.

5. 샘플의 표준 곡선 준비 및 리그닌 추정

1. TGA 처리에서 실험 견본과 같은 방법으로 리그닌 표준을 처리합니다.
2. 상용 대나무 리그닌 기준을 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg 및 5 mg에서 시작 하 고 있습니다. 이어서, TGA, HCl에 의한 공정은 1N NaOH에서 용해한 다음 280nm(그림3A)에서흡광도를 측정한다.
3. 리닌 농도 및 흡광도 판독값을 사용하여 표준 리그닌곡선(도 3B)의흩어진 플롯을 생성한다.
4. 리그닌 표준 커브 회귀 라인에서 추출된 샘플의 평균 흡광도로부터 "x" 값을 사용하여 준비된 샘플의 알 수 없는 리닌 함량을 추정하기 위해, 산란된 플롯에서 생성된 회귀 라인, y = mx+c를 사용합니다.
5. mg당 리그닌 농도를 얻기 위해 메탄올 추출 후 진공/공기 건조 식물 바이오매스 샘플의 총 중량으로 리그닌 함량을 나누어 야량량(약 15 mg)을 추출한다. 그런 다음 이 값을 100으로 곱하여 mg당 리그닌 백분율을 계산합니다.

두 개의 다른 면 실험 라인은 다른 조직에서 그들의 리그닌 내용의 차이에 대 한 비교 되었다. 각 시료의 추출된 리그닌 함량은 280nm에서 측정되고 각각의 흡광도 값을 기록했다. 각 생물학적 복제의 평균 흡광도 값은 리그닌 표준 곡선의 회귀선(표 2, 도 3C)과비교하였다. 회귀 라인, y =mx + c는 추출된 실험 선, 샘플 1 및 샘플 2의 알 수 없는 리그닌 함량을 계산하는 데 사용된다. 평균 OD 값의 결과는 "x"로 대체되었으며 "m"과 "c" 값은 리닌 표준 곡선의 회귀 선으로부터 mg에서 리그닌 농도 "y"를얻었다(표 3, 도 3B). 다음 단계에서는, 리그닌 함량의 1 mg당 계산하고, 메탄올 추출 후 시료(15 mg)의 중량으로 "y" 값을 나눕니다. 다음 단계에서는 그램당 계산(= 1,000 mg)을 계산하여 y/15 값을 1,000배 곱하였다. 리그닌의 %를 얻으려면 y/15 값을 1,000으로 나누고 100으로 곱합니다. 3개의 생물학적 복제에 대한 리그닌%의 평균(각 선, 샘플 1 및 샘플 2)은 두 개의 실험 라인 샘플 1(11.7%) 사이에서 비교되었다. 및 표본 2 (10.3 %). 리그닌 값은 TGA 방법이 신뢰할 수 있는 방법이며 리그닌 함량을 측정하기 위해 매우 특이적임을 시사하는 생물학적 복제중 일관되게 하였다. 비교 연구는 또한 면화의 두 실험 라인의 다른 조직 유형 (루트, 줄기 및 잎) 사이에서 이루어졌으며, 두 줄 모두 잎에서 상대적으로 낮은 리그닌 함량 (3.4%)을 보였다. 줄기에 비해 (9.4% 받는 9.9%) 뿌리(9.4% ~ 9.2%) (표4, 그림 4).

그림 1: 식물 바이오매스 샘플의 준비.  (A)녹색 집에서 면화 식물 재료를 수집. (B)냄비를 부드럽게 뒤집어 뿌리를 분리합니다. (C)모든 먼지를 제거하기 위해 물에 철저히 세척. (D)분리 된 뿌리, 줄기 및 잎 조직. (E)조직을 분리한 후 2일 동안 공기 건조 조직. (F)공기 건조 조직은 10일 동안 49°C에서 인큐베이터로 이송된다. (G)바이오매스 분쇄기가 식물 바이오매스 샘플을 분쇄하는 데 사용되었습니다. (H)뿌리, 줄기 및 잎의 지상 식물 바이오 매스 샘플. (I)분쇄 시료는 냉동실 밀 챔버에 배치된 분쇄 유리알에 적재되어 3사이클 동안 10CPS의 속도로 냉동실에 접지된다. (J)냉동고 공장에서 연삭 후 미세하게 분쇄 된 조직 분말을 보여주는 분쇄 된 유리병. (K)분쇄용 냉동고를 사용한 후 뿌리, 줄기, 잎의 조직 분말을 미세하게 분쇄합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: TGA 중재 리그닌 추출에 관련된 중요한 단계. TGA 방법을 이용한 리닌 추출에 관여하는 중요한 단계의 흐름도: 1. 냉동고 밀을 사용하여 미세 분말로 충분한 건조 및 분쇄에 의한 식물 시료 의 준비; 2. 조직 분말의 20 mgPSB를 실시 했다, 메탄올 및 물 세차, 건조 및 추출 알코올 불용 성 물질; 3. TGA와 산을 사용하여, 리그닌은 침전되었다; 4. 상업용 대나무 리그닌을 이용한 리그닌 표준 곡선 의 준비; 5. 리그닌 함량의 추정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 샘플에서 표준 곡선 제제 및 리그닌 추정. (A)280 nm에서 흡광도 판독에서 리닌 표준 곡선을 생성하는 데 사용되는 상용 대나무 리그닌의 상이한 농도를 나타내는 표. (B)표 A.(C)샘플 1 및 샘플 2의 추정 루트 조직 리그닌 함량을 나타내는 막대 그래프의 값을 사용하여 Excel 프로그램으로 생성된 분산 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 프로토콜에 사용되는 솔루션 준비. 프로토콜에 사용되는 다양한 솔루션의 준비를 보여주는 표입니다.

표 2: 리그닌 표준 곡선0.5 mg에서 3.5 mg의 산업용 대나무 리그닌을 제조하였다. m 및 c 값을 나타내는 회귀 선이 있는 분산된 그래프입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 280nm(x)의 샘플흡수도 판독값과 표준 곡선 회귀 라인 'm' 및 표준 곡선의 'c' 값을 사용하여 알 수 없는 리그닌 함량을 계산하는 데 사용되는 Lignin 템플릿입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 포스트 플라워 스테이지의 면식물의 다양한 조직(뿌리, 줄기, 잎)의 리닌 함량. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.