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Biochemistry

मेटाबोलिक लेबलिंग और पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में तटस्थ लिपिड संश्लेषण का विश्लेषण

Published: February 2, 2021 doi: 10.3791/62201
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

यहां, 14सी-एसिटिक एसिड के साथ खमीर के मेटाबोलिक लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, जिसे बेअसर लिपिड के पृथक्करण के लिए पतली परत क्रोमेटोग्राफी के साथ मिलकर किया जाता है।

Abstract

न्यूट्रल लिपिड (एनएलएस) हाइड्रोफोबिक, चार्जलेस बायोमॉलिक्यूल्स का एक वर्ग है जो ऊर्जा और लिपिड होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एनएलएस एसिटिल-सीओए से संश्लेषित डी नोवो हैं और मुख्य रूप से ट्राइग्लिसराइड्स (टीजीएस) और स्टेरोल-एस्टर (एसईईएस) के रूप में यूकेरियोट्स में मौजूद हैं। एनएलएस के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार एंजाइमों को मनुष्यों के लिए सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (खमीर) से अत्यधिक संरक्षित किया जाता है, जिससे खमीर को एनएल मेटाबोलिज्म एंजाइमों के कार्य और विनियमन को विच्छेदन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव बना दिया जाता है। जबकि बहुत कैसे एसीटाइल-CoA एनएल प्रजातियों के एक विविध सेट में परिवर्तित किया जाता है के बारे में जाना जाता है, एनएल चयापचय एंजाइमों को विनियमित करने के लिए तंत्र, और कैसे गलत विनियमन सेलुलर विकृतियों में योगदान कर सकते हैं, अभी भी खोजा जा रहा है । एनएल प्रजातियों के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए कई तरीकों को विकसित किया गया है और दशकों के अनुसंधान में उपयोग किया गया है; हालांकि, प्रमुख एनएल प्रजातियों के व्यापक लक्षण वर्णन के लिए एक मात्रात्मक और सरल प्रोटोकॉल पर चर्चा नहीं की गई है । यहां, खमीर में प्रमुख एनएल प्रजातियों के डी नोवो संश्लेषण की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल और अनुकूलनीय विधि प्रस्तुत की जाती है। हम 14सी-एसिटिक एसिड मेटाबोलिक लेबलिंग को पतली परत क्रोमेटोग्राफी के साथ अलग करने और शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण एनएलएस की विविध श्रृंखला को निर्धारित करने के लिए लागू करते हैं । इसके अतिरिक्त, इस विधि को आसानी से एनएल एंजाइमों या समय के साथ एनएल प्रजातियों के क्षरण के वीवो प्रतिक्रिया दरों में अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

एसिटिल-सीओए तटस्थ लिपिड (एनएलएस) सहित विविध जैव अणुओं का मौलिक भवन ब्लॉक है, जो झिल्ली के निर्माण, एटीपी उत्पन्न करने और सेल सिग्नलिंग1,2को विनियमित करने के लिए एक बहुमुखी जैव अणु मुद्रा के रूप में काम करता है। इनमें से किसी भी संबंधित रास्ते में नृश किए जाने वाले एनएलएस की उपलब्धता उनके भंडारण द्वारा विनियमित है । लिपिड ड्रॉपलेट्स (एलडीएस), ट्राइग्लिसराइड्स (टीजीएस) और स्टेरोल-एस्टर (एसईएस) के हाइड्रोफोबिक कोर से बने साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल्स, अधिकांश सेलुलर एनएलएस के मुख्य भंडारण डिब्बे हैं। इस प्रकार, एलडी एनएलएस को अलग और विनियमित करता है, जिसे नीचा दिखाया जा सकता है और बाद में जैव रासायनिक और मेटाबोलिक प्रक्रियाओं के लिए उपयोग किया जा सकता है3,4। यह ज्ञात है कि एनएल और एलडी से जुड़े प्रोटीन का गलत नियमन लिपोडिस्ट्रोफी और मेटाबोलिक सिंड्रोम5, 6सहित विकृत विकृत है। इस वजह से, वर्तमान एलडी अनुसंधान तीव्रता से इस बात पर केंद्रित है कि एनएल संश्लेषण को कैसे विस्तृत रूप से, अस्थायी रूप से और बहु-सेलुलर जीवों के अलग-अलग ऊतकों में विनियमित किया जाता है। एनएलएस के लिए सर्वव्यापी सेलुलर भूमिकाओं के कारण, एनएलएस के संश्लेषण और विनियमन के लिए जिम्मेदार कई एंजाइम पूरे यूकेरियोट्स 7 मेंसंरक्षितहोते हैं। दरअसल, यहां तक कि कुछ प्रोकारियोट्स एलडीएस8में एनएलएस स्टोर करते हैं । इसलिए, आनुवंशिक रूप से ट्रैकेबल मॉडल जीव जैसे सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (नवोदित खमीर) एनएल संश्लेषण और विनियमन के अध्ययन के लिए उपयोगी रहे हैं।

सेल अर्क से एनएलएस के पृथक्करण और मात्राकरण को असंख्य तरीकों से पूरा किया जा सकता है, जिसमें गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस), उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी), और अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एमएस)9,10, 11शामिल हैं। शायद एनएलएस को अलग करने के लिए सबसे सरल तरीका पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) के माध्यम से है, जो मानक वक्र12,13से बाद के घनत्व मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। हालांकि टीएलसी एनएलएस का केवल एक कोर्स-दानेदार पृथक्करण प्रदान करता है, यह एक शक्तिशाली तकनीक बनी हुई है क्योंकि यह सस्ती है, और यह एक साथ कई नमूनों से एनएलएस के तेजी से अलग होने की अनुमति देता है। टीएलसी के माध्यम से एनएलएस के अध्ययन का सामना करने वाली सबसे काफी चुनौतियों में से दो हैं: 1) एनएल प्रजातियों और उनके मध्यवर्ती के सेलुलर बहुतायत की व्यापक श्रृंखला, और 2) एनएल संश्लेषण मार्गों के भीतर लिपिड मध्यवर्ती की हाइड्रोफिलिसिटी/हाइड्रोफोबसिटी की सीमा । नतीजतन, टीएलसी के माध्यम से एनएल प्रजातियों का मात्राकरण आमतौर पर सबसे प्रचुर मात्रा में प्रजातियों तक सीमित है; हालांकि, 14सी-एसिटिक एसिड रेडियोलेबल की शुरूआत एनएल रास्तों के भीतर कम बहुतायत मध्यवर्ती का पता लगाने में काफी वृद्धि कर सकती है। एसिटिक एसिड को एसिटिल-सीओए सिंथेस्टेस एसी214द्वारा तेजी से एसिटिल-सीओए में परिवर्तित किया जाता है, जो 14सी-एसिटिक एसिड को खमीर15में उपयुक्त रेडियोलाबेलिंग सब्सट्रेट बनाता है। इसके अतिरिक्त, एनएलएस के हाइड्रोफोबिक एनएलएस और हाइड्रोफिलिक इंटरमीडिएट दोनों को अलग करने का लक्ष्य टीएलसी द्वारा मल्टीपल सॉल्वेंट सिस्टम16के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। यहां, खमीर में 14सी-एसिटिक एसिड मेटाबोलिक लेबलिंग का उपयोग करके एनएलएस के पृथक्करण के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। नाड़ी अवधि के दौरान लेबल किए गए लिपिड को बाद में एक अच्छी तरह से स्थापित कुल लिपिड आइसोलेशन प्रोटोकॉल17द्वारा अलग किया जाता है, जिसके बाद टीएलसी द्वारा एनएल प्रजातियों को अलग किया जाता है। लेबल किए गए लिपिड की कल्पना करने के लिए दोनों ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा टीएलसी प्लेटों का विकास, और कुल लिपिड की कल्पना करने के लिए एक रासायनिक स्प्रे, मात्राकरण के कई तरीकों के लिए परमिट। व्यक्तिगत लिपिड बैंड भी आसानी से एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर टीएलसी प्लेट से निकाला जा सकता है, और प्रस्फुटन गिनती बैंड के भीतर रेडियोलेबल सामग्री की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

1. 14सी-एसिटिक एसिड के साथ खमीर कोशिकाओं का विकास और लेबलिंग

  1. एक थाली से एक कॉलोनी उठा और यह सिंथेटिक पूरा (अनुसूचित जाति) 2% डेक्सट्रोस युक्त मीडिया के 20 मिलील में वितरण द्वारा एक खमीर संस्कृति टीका (अनुसूचित जाति मीडिया के नुस्खा के लिए अनुपूरक फ़ाइल देखें) । 200 आरपीएम पर मिलाते हुए रात के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: विकास की स्थिति, नमूना मात्रा, और उपचार ब्याज की लिपिड (ओं) के आधार पर अलग होगा। पूर्ण प्रयोगों को चलाने से पहले, इष्टतम विकास की स्थिति और संस्कृति की मात्रा अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। यह प्रोटोकॉल स्थिर चरण में उगाई जाने वाली खमीर संस्कृतियों के रेडियोलेबलिंग पर चर्चा करता है, एक विकास चरण जब जैव-झिल्ली और सेल विकास धीमा हो जाता है, और एनएल संश्लेषण बहुत सक्रिय होता है।
  2. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर रातोंरात संस्कृति के OD600 को मापने और ताजा अनुसूचित जाति मीडिया के 50 एमएल में 0.2 के एक अंतिम OD600 के लिए खमीर सेल संस्कृति को कमजोर 2% डेक्सट्रोस युक्त। 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित करें, या जब तक वे स्थिर चरण तक नहीं पहुंच जाते (जिसे आमतौर पर सेल दोहरीकरण ओडी600 माप की एक सपाट अस्तर द्वारा परिभाषित किया जाता है)।
  3. कोशिकाओं को इकट्ठा करने से पहले, शमन बफर (विवरण के लिए पूरक फ़ाइल देखें) बनाएं। प्रत्येक नमूने के लिए दो 20 एमएल एलिकॉट्स शमन बफर (यानी, प्रत्येक नमूने के लिए 40 एमएल शमन बफर) बनाएं और समान रूप से दो 50 एमएल शंकु ट्यूबों में विभाजित करें।) भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शमन बफर एलिकोट्स स्टोर करें।
  4. एक बार जब संस्कृतियां वांछित ओडी या विकास चरण तक पहुंच गई हैं, तो कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 4,100 x ग्राम पर अपकेंद्री करके इकट्ठा करें। जबकि नमूने अपकेंद्रित्र में हैं, 10 μCi/mL की अंतिम एकाग्रता पर डेक्सट्रोस मुक्त अनुसूचित जाति मीडिया के लिए[1-14सी] एसिटिक एसिड सोडियम नमक जोड़कर रेडियोलाबेलिंग मीडिया तैयार करें ।
    सावधानी: रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) को हर समय पहना जाना चाहिए। हमेशा रेडियोधर्मी सामग्रियों के उचित भंडारण, उपयोग और निपटान के लिए स्थानीय दिशानिर्देशों का पालन करें।
    नोट: लेबलिंग मीडिया में 14सी-एसिटिक एसिड की एकाग्रता और रेडियोलाबेलिंग इनक्यूबेशन समय दोनों को रुचि के मेटाबोलाइट (ओं) के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। यहां, एक 20 मिनट रेडियोलाबेलिंग पल्स इनक्यूबेशन का उपयोग किया जाता है, जो बहुतायत की एक श्रृंखला के साथ एनएल प्रजातियों लेबल के लिए पर्याप्त है ।
  5. पैलेट कोशिकाओं से सुपरनैट को हटा दें, और एक बार सेल पेलेट को डेक्सट्रोस-मुक्त एससी मीडिया के 20 एमएल के साथ एक पिपेट के साथ गोली को फिर से खर्च करके धोएं। 5 मिनट के लिए 4,100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को फिर से ले लीजिए।
  6. डेक्सट्रोस-मुक्त अनुसूचित जाति मीडिया के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और कोशिकाओं को लेबल 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 2 मिनट के लिए 4,100 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को फिर से ले लीजिए।
  7. डेक्सट्रोस-मुक्त अनुसूचित जाति मीडिया के 500 माइक्रोल में कोशिकाओं को एक बार फिर से रीसुस्ट करें। 50 एमएल शंकु नलियों के लिए -10 डिग्री सेल्सियस या सबसे कम तापमान सेटिंग पर सुसज्जित एक अपकेंद्रित्र को प्री-कूल करें।
  8. सेल निलंबन के प्रत्येक 500 माइक्रोन में रेडियोलेबलिंग मीडिया के 500 माइक्रोन को जल्दी से जोड़कर रेडियोलाबेलिंग अवधि शुरू करें (अंतिम 14सी-एसिटिक एसिड एकाग्रता = 5 माइक्रोसी/एमएल)। 20 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन इनक्यूबेटर में ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। लेबलिंग अवधि के अंत से 2 मिनट पहले, प्रत्येक नमूने के लिए एक 20 एमएल एलिकोट को बर्फ की एक बाल्टी में स्थानांतरित करें
  9. एक बार रेडियोलाबेलिंग अवधि समाप्त हो जाने के बाद, पूरे 1 एमएल नमूने को ठंडे शमन बफर के 20 मिलील में डुबकी लगाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। भंवर 5-10 एस के लिए शंकु ट्यूबों को सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना अच्छी तरह से शमन बफर के साथ मिलाया गया है । बर्फ पर 2 मिनट के लिए बफर शमन में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  10. -10 डिग्री सेल्सियस या सबसे कम तापमान सेटिंग पर 3 मिनट सेट के लिए 5,000 x ग्राम पर एक अपकेंद्रित्र में घूमते हुए सेल पेलेट ले लीजिए। जबकि नमूना ट्यूब कताई कर रहे हैं, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बुझाने बफर एलिकोट का एक और सेट बर्फ से भरा बाल्टी (यानी, प्रति नमूना बफर शमन की एक 20 एमएल ट्यूब) को स्थानांतरित करें।
  11. सेल छर्रों से शमन बफर सुपरनैंट निकालें और इसे 20 एमएल ताजा, ठंडा, शमन बफर के साथ बदलें। भंवर और नमूनों हिला जब तक गोली शंकुदाता ट्यूब के नीचे से उखाड़ दिया गया है और पूरी तरह से बफर शमन में फिर से निलंबित कर दिया । कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए -10 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर फिर से नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
  12. एक बार कोशिकाओं को गोली मार रहे हैं, अच्छी तरह से नमूनों से सभी शमन बफर को हटा दें और एक पिपेट के साथ अतिरिक्त को हटा दें। आगे की प्रक्रिया के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब स्टोर करें।

2. खमीर से कुल लिपिड का अलगाव

नोट: लिपिड अलगाव के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से स्थापित और अक्सर उपयोग की जाने वाली विधि पर आधारित है जो सबसे तटस्थ लिपिड प्रजातियों को कुशलतापूर्वक निकालता है17,18।
सावधानी: कार्बनिक सॉल्वेंट का उपयोग करते समय, हमेशा उपयुक्त पीपीई पहनें और जब संभव हो तो एक धुएं हुड के अंदर काम करें। लिपिड निष्कर्षण के दौरान, प्लास्टिक का उपयोग करने से बचें जो कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ असंगत हैं। पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त हैं।

  1. प्रत्येक नमूने के लिए एसिड से धुले कांच के मोतियों का 0.3 ग्राम वजन करें और उन्हें बर्फ पर 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्टोर करें। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से सेल छर्रों को हटा दें और उन्हें बर्फ पर रखें। प्रत्येक नमूने में 350 माइक्रोन मेथनॉल और 700 माइक्रोल क्लोरोफॉर्म जोड़ें, फिर से खर्च करें, और पूर्व-तौला ग्लास मोतियों वाले माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  2. 1 मिनट के लिए एक भंवर 3x पर आंदोलन ट्यूबों द्वारा Lyse कोशिकाओं, आंदोलनों के बीच बर्फ पर 30 एस ऊष्मायन के साथ । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को तीन 1-मिनट चक्रों के लिए एक मिनी मनका-डिब्बा का उपयोग करके lysed किया जा सकता है। प्रस्फुटन मतगणना के लिए एक अलग ट्यूब में पूरी सेल के 25-30 माइक्रोन को बचाएं।
    नोट: सहेजे गए lysate का उपयोग पल्स अवधि के दौरान प्रत्येक नमूने द्वारा उठाए गए रेडियोआइसोटोप की सापेक्ष राशि का निर्धारण करने के लिए किया जाएगा, जो टीएलसी प्लेट पर लोड किए गए प्रत्येक नमूने की मात्रा को प्रभावित करेगा। इस पर आगे चरण 3.2 में चर्चा की गई है।
  3. 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब की पूरी सामग्री को 15 एमएल ग्लास सेंट्रलाइज ट्यूब [ट्यूब ए] में डालें। 1 एमएल मेथनॉल डालकर 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को धोएं और 10-15 एस के लिए भंवर से ओताई जाए। 1 एमएल मेथनॉल वॉश को ट्यूब ए में ट्रांसफर करें और ट्यूब ए में क्लोरोफॉर्म के 2 एमएल जोड़ें और इसके बाद 4.45 एमएल के अंतिम सैंपल वॉल्यूम के लिए 400 माइक्रोन पानी के बाद।
  4. 1 मिनट के लिए भंवर के नमूने और उसके बाद 1,000 x ग्रामपर 5 मिनट अपकेंद्रित्र। अपकेंद्रित्र के बाद, जलीय (ऊपरी) और कार्बनिक (निचले) चरणों को स्पष्ट रूप से नेत्रहीन को इंटरफ़ेस पर पड़े सेल मलबे के साथ अलग किया जाना चाहिए।
  5. एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, ट्यूब ए से कार्बनिक चरण एकत्र करें और एक नए 15 एमएल ग्लास सेंट्रलाइज ट्यूब (ट्यूब बी) में जाएं। ट्यूब बी में 1एम केसीएल का 1 एमसीएल जोड़ें। ट्यूब ए में मेथनॉल की 1 एमएल और क्लोरोफॉर्म की 2 एमएल और 200 माइक्रोन मिलीक्यू पानी डालें। ट्यूब ए पर भंवर और अपकेंद्रित्र कदम दोहराएं।
  6. एक बार फिर ट्यूब ए से कार्बनिक चरण इकट्ठा करें और इसे ट्यूब बी में जोड़ें। 1 मिनट के लिए भंवर ट्यूब बी और उसके बाद 1,000 x gपर 5 मिनट की अपकेंद्रित्र ।
  7. ट्यूब बी से ऊपरी जलीय परत निकालें और निपटाने। ताजा 1 एम केसीएल के 1 एमएल को वापस ट्यूब बी में जोड़ें और भंवर/अपकेंद्रित्र चरण दोहराएं । एक बार परतों को अलग कर रहे हैं, ध्यान से एक लेबल 4 एमएल ग्लास शीशी में पूरे नीचे कार्बनिक परत इकट्ठा ।
    नोट: इस चरण में, लिपिड अर्क को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, या लिपिड के टीएलसी जुदाई के लिए प्रोटोकॉल जारी रखा जा सकता है।

3. पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा रेडियोआइसोटोप-लेबल एनएलएस का पृथक्करण और मात्राकरण

  1. यदि लिपिड अर्क -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था, तो धीरे-धीरे बर्फ पर और बाद में एक बेंचटॉप पर इनक्यूबेटिंग करके कमरे के तापमान में लाएं। वैक्यूम सुखाने या निष्क्रिय गैस (जैसे, आर्गन या नाइट्रोजन) की कोमल धारा का उपयोग करके लिपिड अर्क से पूरी तरह से सॉल्वेंट वाष्पित हो जाते हैं। इस बीच, टीएलसी प्लेट को गर्म करने के लिए एक ओवन को 145 डिग्री सेल्सियस तक प्री-हीट करें।
  2. इससे पहले कि नमूनों टीएलसी प्लेट पर लोड किया जा सकता है, कोशिकाओं द्वारा उठाए गए रेडियोलेबल की सापेक्ष मात्रा निर्धारित करें। पूरे सेल के पिपेट 10 माइक्रोन स्टेप 2.2 से 6 एमएल ग्लास प्रस्फुटन शीशी में, 6 एमएल प्रस्फुटन तरल पदार्थ जोड़ें और एक रैक में शीशियां रखें। 1 मिनट की गिनती के समय के लिए निर्धारित गणना एकल रैक विकल्प का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के सीपीएम या डीपीएम को मापने के लिए एक प्रस्फुटन काउंटर का उपयोग करें। प्रत्येक नमूने के लिए एक औसत प्राप्त करने के लिए डुप्लिकेट में प्रत्येक पूरे सेल lysate उपाय। एक जंगली प्रकार या संदर्भ नमूने के अनुसार लोडिंग राशि को समायोजित करें
    नोट: टीएलसी प्लेट पर लोड करने के लिए प्रत्येक नमूने की मात्रा निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है: (औसत नमूना मायने रखता है)/(औसत संदर्भ मायने रखता है) एक्स वांछित लोडिंग मात्रा । उदाहरण के लिए, यदि संदर्भ नमूने के 20 μL टीएलसी प्लेट पर लोड किया जाना है, और १,० की औसत गिनती है, तो २,० की औसत गिनती के साथ एक प्रयोगात्मक नमूना टीएलसी प्लेट पर लोड 10 μL होगा ।
  3. 1:1 (v/v%) क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल के 40-50 माइक्रोन में 5 मिनट के लिए भंवर से नमूना लिपिड का पुनर्गठन करें। एक गिलास स्नातक सिलेंडर में मोबाइल चरण विलायक के १०१ एमसीएल तैयार (एक 50:40:10:1 (v/v/v/v%) हेक्साने: पेट्रोलियम ईथर: डायथिल ईथर: एसीटिक एसिड सॉल्वेंट द्वारा प्रमुख एनएल प्रजातियों जुदाई का एक उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें ।
  4. सॉल्वेंट को 20 x 20 टीएलसी संतृप्ति पैड और एक तंग फिटिंग ढक्कन वाले ग्लास टीएलसी कक्ष में डालें। एक मोड़ा 20 x 20 सिलिका जेल 60 जी प्लेट धीरे से एक पेंसिल का उपयोग कर प्लेट के नीचे 1.5 सेमी अंकन द्वारा तैयार करें। लाइन मूल को नामित करती है और लिपिड कहां लोड की जाएगी। लाइन के नीचे, धीरे-धीरे प्रत्येक लेन में लोड किए जाने वाले नमूने को लेबल करें। एक बार टीएलसी प्लेट को प्रीपेड करने के बाद, प्लेट को प्री-हीट करने और किसी भी अतिरिक्त नमी को हटाने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए 145 डिग्री सेल्सियस ओवन में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  5. एक बार प्लेट पर्याप्त रूप से गर्म हो जाने के बाद, और टीएलसी संतृप्ति पैड को सॉल्वेंट से संतृप्त किया जाता है, ओवन से टीएलसी प्लेट को हटा दें और तुरंत टीएलसी प्लेट लोड करने के लिए आगे बढ़ें। प्लेट लोड करते समय यह गर्म है तेजी से विलायक वाष्पीकरण सुनिश्चित करता है। ब्याज की प्रत्येक लिपिड प्रजातियों के लिए, जुदाई और अपेक्षित प्रवास दूरी को ट्रैक करने के लिए टीएलसी प्लेट की एक लेन पर एक शुद्ध लिपिड मानक के 5-20 माइक्रोन लोड करें। एक पिपेट का उपयोग करना, टीएलसी प्लेट के नीचे 1.5 सेमी स्थित प्रत्येक लेन की उत्पत्ति पर नमूने का 5μL स्पॉट करें। प्रत्येक लेन में 20-40 माइक्रोन के नमूने तक 5 माइक्रोल स्पॉट की लोडिंग दोहराएं।
    नोट: 5-20 अवेलेबल शुद्ध लिपिड के μg ट्रेसर के रूप में प्रत्येक नमूना लेन में जोड़ा जा सकता है कि दाग और लिपिड के टीएलसी जुदाई के बाद कल्पना की जा सकती है । एक दाग मानक की उपस्थिति बाद में प्रस्फुटन गिनती के लिए रेडियोलेबल लिपिड बैंड की आसान ट्रैकिंग और उत्तेजना के लिए अनुमति देती है। जो शुद्ध मानकों थाली पर लोड कर रहे है ब्याज की एनएल प्रजातियों द्वारा निर्धारित किया जाएगा । ओलिक एसिड (एफएफए), 1,2 डाइओलियोल-ग्लाइस्रोल (डीजी), ट्राइओलिन (टीजी), कोलेस्ट्रॉल (चोल), कोलेस्टेरिल-लिनोलेट (एसई) को अलग करने और नमूना गलियों से सटे गलियों में स्क्वैलीन के उदाहरणों के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें।
  6. एक बार मानक और प्रयोगात्मक नमूने लोड हो जाने के बाद, प्लेट को विकासशील कक्ष में रखें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सॉल्वेंट प्लेट (40-60 मिनट) के शीर्ष तक नहीं पहुंच जाता। एक बार प्लेट पूरी तरह से विकसित हो जाने के बाद, इसे कक्ष से हटा दें और इसे 20 मिनट के लिए धुएं के हुड में सूखने दें।
  7. प्लेट सूखने के बाद इसे प्लास्टिक फिल्म से ढक कर ऑटोरेडियोग्राफी स्क्रीन के साथ एक विकासशील कैसेट में रखें। प्लेट को 24-48 घंटे के लिए स्क्रीन के साथ विकसित करने की अनुमति दें।

4. दृश्य और टीएलसी अलग लिपिड की मात्रा

  1. विकासशील कैसेट से स्क्रीन निकालें और एक फॉस्फोरर इमेजर के अंदर रखें। फॉस्फोर इमेजिंग विकल्प का चयन करें और 800-1000 वी पर विकसित करें।
    नोट: फॉस्फोर इमेजिंग टीएलसी प्लेट पर रेडियोलेबल लिपिड का गुणात्मक दृश्य देता है। हालांकि, रेडियोलेबल लिपिड का मात्राकरण प्रस्फुटन गिनती द्वारा सबसे अच्छा पूरा किया जाता है, जिसे बाद में वर्णित किया जाता है।
  2. पी-एनिसल्डिहाइड रिएजेंट (सप्लीमेंट्री फाइलदेखें) के 100 एमएल मिलाएं और ग्लास स्प्रे बोतल में जमा करें। टीएलसी प्लेट को पी-एनिसल्डिहाइड रिएजेंट के साथ तब तक स्प्रे करें जब तक सिलिका संतृप्त न हो जाए। 5 मिनट के लिए एक 145 डिग्री सेल्सियस ओवन में प्लेट सेंकना, या जब तक बैंड दिखाई दिया है।
  3. रेडियोलेबल प्रस्फुटन गिनती का उपयोग कर व्यक्तिगत लिपिड प्रजातियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, ग्लास टीएलसी प्लेट से सिलिका जेल को कुरेदने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। प्रत्येक सिलिका जेल बैंड को एक ग्लास प्रस्फुटित शीशी में एक रेडियोलेबल लिपिड प्रजातियों के अनुरूप स्थानांतरित करें और 6 एमएल प्रस्फुटन तरल पदार्थ जोड़ें। भंवर सख्ती से जब तक सिलिका बैंड छोटे टुकड़ों को कम कर दिया गया है ।
    1. वैकल्पिक रूप से, लिपिड को धारा 3 में लिपिड निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करके सिलिका जेल बैंड से निकाला जा सकता है। यदि लिपिड सिलिका जेल से निकाले जाते हैं, तो सॉल्वेंट को पूरी तरह से चरण 3.1 के रूप में वाष्पित करें, और सूखे लिपिड में 6 एमएल प्रस्फुटन तरल पदार्थ जोड़ें। प्रस्फुटन शीशियों वाले रैक को प्रस्फुटन काउंटर में रखें। गिनती एकल रैक विकल्प का चयन करें और गिनती के समय को 2 मिनट प्रति शीशी में समायोजित करें। प्रस्फुटन काउंटर से परिणाम मुद्रित किया जाएगा और एक बार ग्राफ के रूप में कल्पना की जा सकती है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हमने यह प्रदशत किया है कि एनएल प्रजातियों की लेबलिंग, पता लगाने और मात्राकरण को 14सी-एसिटिक एसिड मेटाबोलिक लेबलिंग द्वारा पूरा किया जा सकता है। प्रमुख एनएल प्रजातियों को 50:40:10:1 (v/v/v/v%) हेक्साने: पेट्रोलियम ईथर: डिथाइल ईथर: एसिटिक एसिड(चित्रा 1A,B)की सॉल्वेंट प्रणाली में अलग किया जा सकता है । फॉस्फोर इमेजिंग लेबल फ्री फैटी एसिड (एफएफए), ट्राइसिल्गालिसेरोल (टीजी), डिसिलेग्लिसेरोल (डीजी), कोलेस्ट्रॉल (चोल), और स्क्वैलीन (एसक्यू)(चित्रा 1A)के दृश्य के लिए अनुमति देता है। हालांकि एसई इस विलायक में अन्य एनएल प्रजातियों से अलग किया जा सकता है, कोई भी एक 20 मिनट की नाड़ी के बाद ऑटोरेडियोग्राम में पता चला रहे हैं । यह खमीर में विकास के स्थिर चरण के दौरान धीमी गति से एसई संश्लेषण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। यह भी प्रदर्शित किया जाता है कि शुद्ध लिपिड प्रजातियों को इस विधि में अलग किया जा सकता है और बाद में टीएलसी प्लेट को पी-एनिसल्डिहाइड रिएजेंट(चित्रा 1 बी)के साथ छिड़ककर कल्पना की जा सकती है। जबकि एनएल प्रजातियों को इस विलायक में अच्छी तरह से अलग किया जाता है, फॉस्फेटिडिलकोलिन (पीसी) जैसी ध्रुवीय प्रजातियां मूल(चित्रा 1B)पर रहती हैं। पल्स के बाद रेडियोलेबल-फ्री मीडिया में चेस पीरियड लागू करके, एनएल रास्तों के माध्यम से सापेक्ष प्रवाह(चित्रा 1C)मापा जा सकता है। एक 10 मिनट का पीछा करने के बाद, वर्ग के प्रमुख पूल गायब हो गया है, और कुल Chol ऊंचा है । इसी तरह, चेस अवधि में डीजी की उपस्थिति एफएफए सिग्नल में कमी के साथ संबंधित है।

Figure 1
चित्रा 1: 14सी-एसीटिक एसिड रेडियोलाबेलिंग कई एनएल प्रजातियों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। (A)टीएलसी द्वारा अलग किए गए लिपिड का ऑटोरेडियोग्राम स्थिर चरण में 14सी-एसिटिक एसिड के साथ खमीर रेडियोलेबल से अलग। स्पष्ट रूप से पता लगाने योग्य प्रजातियों में मुफ्त फैटी एसिड (एफएफए), ट्राइग्लिसराइड (टीजी), डाइसिलाग्लिसेरोल (डीजी), कोलेस्ट्रॉल (चोल), और स्क्वैलीन (एसक्यू) शामिल हैं। अवेलेबल बैंड अज्ञात एनएल प्रजातियां हैं। (ख)टीएलसी द्वारा अलग की गई शुद्ध लिपिड प्रजातियां और पी-एनीसलेडिहाइड स्टेनिंग द्वारा कल्पना की गई । विज़ुअलाइज़िस में स्टेरोल-एस्टर्स (एसई) और फॉस्फेटिडिलकोलिन (पीसी) के अलावा (ए) में उल्लिखित सभी लिपिड शामिल हैं। (ग)टीएलसी द्वारा अलग किए गए लिपिड के ऑटोरेडियोग्राम को स्थिर चरण में 14-एसिटिक एसिड के साथ स्पंदित किया गया और इसकेबाद रेडियोलाबेल-मुक्त मीडिया में 10 मिनट का पीछा अवधि होती है । वर्ग के गायब होने चोल में वृद्धि के साथ मुलाकात की है। चेस अवधि में डीजी में वृद्धि FFA प्रजातियों में कमी के साथ है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल: बफ़र्स, मीडिया और समाधानों के लिए व्यंजनों। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां, खमीर में एनएल प्रजातियों के संश्लेषण की मात्रात्मक निगरानी करने के लिए एक बहुमुखी रेडियोलाबेलिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह प्रोटोकॉल बहुत मॉड्यूलर है, जो प्रक्रिया को 3-6 दिनों के भीतर समाप्त करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, लिपिड प्रजातियों और मेटाबोलाइट्स को अलग करने के लिए टीएलसी के उपयोग पर साहित्य का खजाना मौजूद है, जो उपयोगकर्ता को टीएलसी सॉल्वेंट सिस्टम16, 19के सरल परिवर्तन के साथ ब्याज की कई लिपिड प्रजातियों का पता लगाने की अनुमतिदेना चाहिए। यह प्रोटोकॉल रेडियोलेबल लिपिड के पृथक्करण, पता लगाने और मात्राकरण के लिए अनुकूल है। यह भी संयुक्त राष्ट्र लेबल मीडिया में एक पीछा अवधि के साथ युग्मित किया जा सकता है लेबल NLs के कारोबार के समय का पता लगाने के लिए । सामूहिक रूप से, यह प्रक्रिया एनएल प्रजातियों के रेडियोलाबेलिंग की खोज शुरू करने के लिए एक उपयोगी संरचना देता है ।

एचपीएलसी, जीसी-एमएस और यूपीएलसी-एमएस जैसे अन्य तरीके लिपिड पृथक्करण और मात्राकरण का उच्च समाधान प्रदान करते हैं; हालांकि, एमएस के माध्यम से रेडियोलेबल नमूनों को चलाने के लिए आमतौर पर इष्टतम नहीं होता है, हालांकि स्थिर-आइसोटोप का उपयोग करके इसे दूर किया जा सकता है। फिर भी, यह रेडियोलेबल विधि कई लिपिड प्रजातियों के लिए उच्च पहचान संवेदनशीलता और बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करती है। एमएस की तुलना में इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ इसकी सामर्थ्य है। लिपिड का टीएलसी पृथक्करण अपेक्षाकृत सरल है, इसके लिए कोई असाधारण उपकरण की आवश्यकता नहीं है, और आम प्रयोगशाला सामग्रियों पर निर्भर करता है। सीमाओं के बारे में: कुछ कम बहुतायत प्रजातियों, जैसे लाइसो-लिपिड, 14सी लेबल के समावेश के बाद भी पता लगाने योग्य नहीं हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, किसी दिए गए विलायक के भीतर लिपिड प्रजातियों के पाठ्यक्रम-दाने वाले अलगाव के कारण अधिकांश टीएलसी दृष्टिकोण 'लिपिडोमिक' लक्षणों के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

खमीर रेडियोलाबेल जैव रासायनिक दृष्टिकोण के माध्यम से लिपिड के अध्ययन के लिए एक सुविधाजनक, आनुवंशिक रूप से ट्रैक्टेबल मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि में, या किसी विशेष मेटाबोलिक विकास स्थितियों के दौरान, रेडियोलेबल-एसिटिक एसिड या अन्य रेडियोलैबल्स के सेलुलर तेज को कम किया जा सकता है। ग्लूकोज की अनुपस्थिति में 14सी-एसिटिक एसिड वाली कोशिकाओं की लेबलिंग से रेडियोलेबल का तेज मजबूती से बढ़ता है। ग्लूकोज की अनुपस्थिति में लंबे ऊष्मायन आनुपातिक रूप से रेडियोलेबल तेज में वृद्धि करेंगे; हालांकि, यह भी सवाल में रास्तों को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, 14सी-एसिटिक एसिड रेडियोलाबेलिंग प्रोटोकॉल का पूर्ण रूप से पालन करने से पहले एक विशेष विकास स्थिति के लिए लेबलिंग दक्षता स्थापित की जानी चाहिए। विशेष रूप से, रेडियोलाबेलिंग अवधि की लंबाई पर ध्यान दें। लिपिड प्रजातियों के ब्याज का पता लगाने के लिए लेबलिंग समय को यथासंभव कम रखा जाना चाहिए। कुल मिलाकर, यह प्रक्रिया महत्वपूर्ण लिपिड संश्लेषण प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देती है और बरकरार कोशिकाओं में एनएल विनियमन की जांच की अनुमति नी चाहिए।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा इस पांडुलिपि की तैयारी में कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं ।

Acknowledgments

लेखक इस अध्ययन के पूरा होने में मदद और वैचारिक सलाह के लिए हेन लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । डब्ल्यू.M एच को वेल्च फाउंडेशन (आई-1873), एनआईएच एनआईजीएमएस (GM119768), आरा पैरासघियन मेडिकल रिसर्च फंड और यूटी साउथवेस्टियन एंडोइन स्कॉलर्स प्रोग्राम से फंड द्वारा समर्थित किया गया है। एसआर को T32 प्रोग्राम ग्रांट (5T32GM008297) द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi PerkinElmer NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol Avanti 800811O
200 proof absolute ethanol Sigma 459836
Acid washed glass beads 425-600um Sigma G8772
Amber bulbs for Pastuer pipettes Fisher 03-448-24
Ammonium Sulfate >99% Sigma A4418
Beckman LS6500 scintillation counter PerkinElmer A481000
Chloroform (HPLC grade) Fisher C607SK
Cholesterol >99% Sigma C8667
Cholesteryl-linoleate >98% Sigma C0289
Concentrated sulfuric acid Sigma 339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap Sigma CLS430829
Dextrose, anhydrous grade Sigma D9434
Diethyl ether anhydrous grade Sigma 296082
Drying oven Fisher 11-475-155
EcoLume scintillation liquid VWR IC88247001
Eppendorf 5424R centrifuge Fisher 05-401-205
GE Storage phosphor screen Sigma GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS grade Sigma 695092
Glass 6mL scintillation vials Sigma M1901
Glass centrifuge tube caps Fisher 14-595-36A
Glass centrifuge tubes Fisher 14-595-35A
Glass Pasteur pipette Fisher 13-678-20C
Hexane, anhydrous grade Sigma 296090
L-Adenine >99% Sigma A8626
L-Alanine >98% Sigma A7627
L-Arginine >99% Sigma A1270000
L-Asparagine >98% Sigma A0884
L-Aspartate >98% Sigma A9256
L-Cysteine >97% Sigma W326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% Sigma 49621
L-Glutamine >99% Sigma G3126
L-Glycine >99% Sigma G8898
L-Histidine >99% Sigma H8000
L-Isoleucine >98% Sigma I2752
L-Leucine >98% Sigma L8000
L-Lysine >98% Sigma L5501
L-Methionine, HPLC grade Sigma M9625
L-Phenylalanine, reagent grade Sigma P2126
L-Proline >99% Sigma P0380
L-Serine >99% Sigma S4500
L-Theronine, reagent grade Sigma T8625
L-Tryptophan >98% Sigma T0254
L-Tyrosine >98% Sigma T3754
L-Uracil >99% Sigma U0750
L-Valine >98% Sigma V0500
Methanol, ACS grade Fisher A412
Oleic acid >99% Sigma O1008
p-anisaldehyde Sigma A88107
Petroleum ether, ACS grade Sigma 184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% Sigma P1652
Pipettes Eppendorf 2231000713
Potassium chloride, ACS grade Sigma P3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS Fisher S318-100
Squalene >98% Sigma S3626
Succinic Acid crystalline/certified Fisher 110-15-6
TLC saturation pad Sigma Z265225
TLC silica gel 60G glass channeled plate Fisher NC9825743 No fluorescent indicators
Transparency plastic film Apollo 829903
Tricine Sigma T0377
Triolein >99% Sigma T7140
Vortex mixer Fisher 02-215-414
Whatman exposure cassette Sigma WHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids Sigma Y1251

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 168 न्यूट्रल लिपिड रेडियो-लेबलिंग पतली परत क्रोमेटोग्राफी 14सी-एसिटिक एसिड एस सेरेविसिया
मेटाबोलिक लेबलिंग और पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा <em>सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में</em> तटस्थ लिपिड संश्लेषण का विश्लेषण
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Rogers, S., Henne, W. M. Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (168), e62201, doi:10.3791/62201 (2021).

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