Summary
Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.
Abstract
Los lípidos neutros (NL) son una clase de biomoléculas hidrofóbicas y sin carga que desempeñan un papel clave en la homeostasis energética y lipídica. Las NL se sintetizan de novo a partir de acetil-CoA y están presentes principalmente en eucariotas en forma de triglicéridos (TG) y ésteres de esteroles (SE). Las enzimas responsables de la síntesis de NLs están altamente conservadas desde Saccharomyces cerevisiae (levadura) a los humanos, lo que hace de la levadura un organismo modelo útil para diseccionar la función y regulación de las enzimas del metabolismo NL. Si bien se sabe mucho sobre cómo el acetil-CoA se convierte en un conjunto diverso de especies de NL, todavía se están descubriendo mecanismos para regular las enzimas del metabolismo de NL y cómo la mala regulación puede contribuir a las patologías celulares. Numerosos métodos para el aislamiento y la caracterización de especies de NL se han desarrollado y utilizado durante décadas de investigación; sin embargo, no se ha discutido un protocolo cuantitativo y simple para la caracterización integral de las principales especies de NL. Aquí, se presenta un método simple y adaptable para cuantificar la síntesis de novo de las principales especies de NL en levaduras. Aplicamos 14etiquetas metabólicas de ácido C-acético junto con cromatografía de capa delgada para separar y cuantificar una amplia gama de NL fisiológicamente importantes. Además, este método se puede aplicar fácilmente para estudiar las tasas de reacción in vivo de las enzimas NL o la degradación de las especies nl a lo largo del tiempo.
Introduction
La acetil-CoA es el bloque de construcción fundamental de diversas biomoléculas, incluidos los lípidos neutros (ML), que sirven como una moneda biomolecular versátil para construir membranas, generar ATP y regular la señalización celular1,2. La disponibilidad de NLs para ser desviados a cualquiera de estas vías respectivas está, en parte, regulada por su almacenamiento. Las gotas lipídicas (LDE), orgánulos citoplasmáticos compuestos por núcleos hidrofóbicos de triglicéridos (TG) y ésteres de esteroles (SE), son los principales compartimentos de almacenamiento de la mayoría de las NEL celulares. Como tal, los LDE secuestran y regulan los NLs, que pueden ser degradados y posteriormente utilizados para procesos bioquímicos y metabólicos3,4. Se sabe que la mala regulación de las proteínas asociadas a NL y LD se correlaciona con la aparición de patologías que incluyen lipodistrofia y síndromes metabólicos5,6. Debido a esto, la investigación actual de LD se centra intensamente en cómo la síntesis de NL se regula espacialmente, temporalmente y a través de distintos tejidos de organismos multicelulares. Debido a las funciones celulares ubicuas para las NLs, muchas enzimas responsables de la síntesis y regulación de las NLs se conservan a lo largo de los eucariotas7. De hecho, incluso algunos procariotas almacenan NLs en LDs8. Por lo tanto, los organismos modelo genéticamente tratables como Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) han sido útiles para el estudio de la síntesis y regulación de NL.
La separación y cuantificación de NLs de extractos celulares se puede lograr de muchas maneras, incluyendo cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas (UPLC-MS)9,10,11. Quizás el método más simple para separar las NLs es a través de la cromatografía de capa delgada (TLC), que permite la cuantificación densitométrica posterior a partir de una curva estándar12,13. Aunque TLC proporciona solo una separación de NLs de grano de curso, sigue siendo una técnica poderosa porque es económica y permite la rápida separación de NLs de varias muestras simultáneamente. Dos de los desafíos más considerables que enfrenta el estudio de las NL a través de TLC son: 1) la amplia gama de abundancias celulares de las especies de NL y sus intermedios, y 2) el rango de hidrofilicidad / hidrofobicidad de los intermedios lipídicos dentro de las vías de síntesis de NL. En consecuencia, la cuantificación de las especies nl a través de TLC se restringe típicamente a las especies más abundantes; sin embargo, la introducción de una radioetiqueta de ácido acético 14C puede mejorar significativamente la detección de intermedios de baja abundancia dentro de las vías NL. El ácido acético se convierte rápidamente en acetil-CoA por la acetil-CoA sintetasa ACS214,que hace que el ácido 14C-acético sea un sustrato de radiomarcado adecuado enlevaduras 15. Además, la separación tanto de las NLs hidrofóbicas como de los intermedios hidrófilos de las NLs puede lograrse mediante el uso de múltiples sistemas de disolventes16. Aquí, se presenta un método para la separación de NLs utilizando el etiquetado metabólico de ácido C-acético 14en levadura. Los lípidos etiquetados durante el período de pulso se aíslan posteriormente mediante un protocolo de aislamiento lipídico total bien establecido17,seguido de la separación de las especies de NL por TLC. El desarrollo de placas TLC tanto por autoradiografía para visualizar lípidos etiquetados, como por un spray químico para visualizar lípidos totales, permite múltiples métodos de cuantificación. Las bandas lipídicas individuales también se pueden extraer fácilmente de la placa TLC utilizando una cuchilla de afeitar, y el conteo de centelleo se puede usar para cuantificar la cantidad de material radiomarcado dentro de la banda.
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Protocol
1. Crecimiento y etiquetado de células de levadura con ácido 14C-acético
- Inocular un cultivo de levadura recogiendo una colonia de una placa y dispensándola en 20 ml de medios sintéticos completos (SC) que contienen 2% de dextrosa (consulte el Archivo complementario para la receta de medios SC). Incubar a 30 °C durante la noche con agitación a 200 rpm.
NOTA: La condición de crecimiento, el volumen de la muestra y el tratamiento diferirán según los lípidos de interés. Antes de ejecutar experimentos completos, las condiciones óptimas de crecimiento y los volúmenes de cultivo deben determinarse empíricamente. Este protocolo discute el radiomarcado de cultivos de levadura cultivados en fase estacionaria, una fase de crecimiento cuando el crecimiento de biomembranas y células se ralentiza, y la síntesis de NL es muy activa. - Mida el OD600 del cultivo nocturno utilizando un espectrofotómetro y diluya el cultivo de células de levadura a un OD600 final de 0.2 en 50 mL de medios SC frescos que contengan 2% de dextrosa. Cultive las células durante 24 h, o hasta que hayan alcanzado la fase estacionaria (que comúnmente se define por un revestimiento plano de la célula que duplica la medición de OD600).
- Antes de recopilar las celdas, haga el búfer de enfriamiento (consulte Archivo complementario para obtener más información). Haga dos alícuotas de 20 ml de tampón de enfriamiento para cada muestra (es decir, búfer de enfriamiento de 40 ml para cada muestra) y divida uniformemente en dos tubos cónicos de 50 ml). Almacene las alícuotas del búfer de enfriamiento a -80 °C para su uso futuro.
- Una vez que los cultivos han alcanzado la OD o fase de crecimiento deseada, recoger las células centrifugando a 4.100 x g durante 10 min. Mientras las muestras están en la centrífuga, prepare medios de radiomarcado agregando[1-14C] sal de sodio de ácido acético a los medios SC libres de dextrosa a una concentración final de 10 μCi/mL.
PRECAUCIÓN: Se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado todo el tiempo cuando se trabaja con materiales radiactivos. Siempre siga las pautas locales para el almacenamiento, uso y eliminación adecuados de materiales radiactivos.
NOTA: Tanto la concentración de ácido 14C-acético en el medio de etiquetado como el tiempo de incubación del radiomarcado deben ajustarse de acuerdo con el(los) metabolito(s) de interés. Aquí, se utiliza una incubación de pulsos de radiomarcado de 20 minutos, que es suficiente para etiquetar especies de NL con un rango de abundancia. - Retire el sobrenadante de las células peletadas y lave el gránulo celular una vez con 20 ml de medios SC libres de dextrosa resuspiendo el pellet con una pipeta. Recoger las células de nuevo centrifugando a 4.100 x g durante 5 min.
- Resuspend las células en 1 ml de medios SC libres de dextrosa y transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 2 ml etiquetado. Recoger las células de nuevo centrifugando a 4.100 x g durante 2 min.
- Resuspend las células una vez más en 500 μL de medios SC libres de dextrosa. Preenfríe una centrífuga equipada para tubos cónicos de 50 ml a -10 °C o en el ajuste de temperatura más bajo.
- Comience el período de radiomarcado agregando rápidamente 500 μL de medios de radiomarcado a cada 500 μL de suspensión celular (concentración final de 14C-ácido acético = 5 μCi/mL). Incubar los tubos en una incubadora giratoria a 30 °C durante 20 min. 2 min antes del final del período de etiquetado, transferir una alícuota de 20 ml de tampón de enfriamiento para cada muestra del congelador de -80 °C a un cubo de hielo
- Una vez que el período de radioetiquetado haya terminado, use una pipeta para sumergir toda la muestra de 1 ml en 20 ml de tampón de enfriamiento en frío. Vórtice los tubos cónicos durante 5-10 s para asegurarse de que la muestra se haya mezclado completamente con el búfer de enfriamiento. Incubar las muestras en tampón de enfriamiento durante 2 min sobre hielo.
- Recoger el pellet celular girando en una centrífuga a 5.000 x g durante 3 min ajustado a -10 °C o en el ajuste de temperatura más bajo. Mientras los tubos de muestra están girando, transfiera otro conjunto de alícuota de tampón de enfriamiento del congelador de -80 °C a un cubo lleno de hielo (es decir, un tubo de 20 ml de tampón de enfriamiento por muestra).
- Retire el sobrenadante de tampón de enfriamiento de los gránulos de celda y reemplácelo con un tampón de enfriamiento fresco, frío y de 20 ml. Vórtice y agite las muestras hasta que el pellet haya sido desalojado del fondo del tubo cónico y resuspendido completamente en el tampón de enfriamiento. Centrifugar las muestras de nuevo a 5.000 x g durante 3 min a -10 °C para recoger las células.
- Una vez que las células estén peletadas, retire completamente todo el tampón de enfriamiento de las muestras vertiendo el sobrenadante y eliminando el exceso con una pipeta. Almacene los tubos a -80 °C para su posterior procesamiento.
2. Aislamiento de lípidos totales de levadura
NOTA: El siguiente protocolo para el aislamiento de lípidos se basa en un método bien establecido y de uso frecuente que extrae eficientemente la mayoría de las especies de lípidos neutros17,18.
PRECAUCIÓN: Cuando use solvente orgánico, siempre use el EPP apropiado y trabaje dentro de una campana de humos cuando sea posible. Durante la extracción de lípidos, evite el uso de plásticos que sean incompatibles con los disolventes orgánicos. Los tubos de polipropileno son adecuados para el siguiente protocolo.
- Pesar 0,3 g de perlas de vidrio lavadas con ácido para cada muestra y almacenarlas en tubos de microcentrífuga de 2 ml sobre hielo. Retire los gránulos de célula del congelador de -80 °C y manténgalos en hielo. Agregue 350 μL de metanol y 700 μL de cloroformo a cada muestra, resuspenda y transfiérala a tubos de microcentrífuga que contengan perlas de vidrio prepesadas.
- Lise las células agitando tubos en un vórtice 3x durante 1 min, con incubaciones de 30 s en hielo entre agitaciones. Alternativamente, las células se pueden lisar usando un mini batidor de cuentas durante tres ciclos de 1 minuto. Guarde 25-30 μL de lisato de células enteras en un tubo separado para el conteo de centelleo.
NOTA: El lisato guardado se utilizará para determinar la cantidad relativa de radioisótopos absorbidos por cada muestra durante el período de pulso, lo que influirá en la cantidad de cada muestra cargada en la placa TLC. Esto se analiza más a fondo en el paso 3.2. - Vierta todo el contenido del tubo de microcentrífuga de 2 ml en un tubo de centrífuga de vidrio de 15 ml [Tubo A]. Lave los tubos de microcentrífuga de 2 ml agregando 1 ml de metanol y vórtice durante 10-15 s. Transfiera el lavado de metanol de 1 ml al tubo A y agregue 2 ml de cloroformo al tubo A seguido de 400 μL de agua para un volumen de muestra final de 4,45 ml.
- Muestras de vórtice durante 1 min seguidas de una centrifugación de 5 min a 1.000 x g. Después de la centrifugación, las fases acuosa (superior) y orgánica (inferior) deben separarse visualmente claramente con restos celulares que yacen en la interfaz.
- Usando una pipeta Pasteur de vidrio, recoja la fase orgánica del tubo A y muévase a un nuevo tubo centrífuga de vidrio de 15 ml (tubo B). Añadir 1 mL de 1M KCl al tubo B. Para el tubo A, agregue 1 ml de metanol y 2 ml de cloroformo, y 200 μL de agua MiliQ. Repita los pasos de vórtice y centrifugación en el tubo A.
- Una vez más, recoja la fase orgánica del tubo A y agréguela al tubo B. Deseche el tubo A en un recipiente apropiado. Tubo de vórtice B durante 1 min seguido de una centrifugación de 5 min a 1.000 x g.
- Retire la capa acuosa superior del tubo B y deséchela. Añadir 1 ml de KCl fresco de 1 M al tubo B y repetir el paso de vórtice/centrifugación. Una vez que las capas estén separadas, recoja cuidadosamente toda la capa orgánica inferior en un vial de vidrio de 4 ml etiquetado.
NOTA: En este paso, los extractos de lípidos se pueden almacenar a -80 ° C, o el protocolo se puede continuar para la separación de lípidos TLC.
3. Separación y cuantificación de NLs radioisótopos mediante cromatografía de capa delgada
- Si los extractos de lípidos se colocaron a -80 ° C, lleve lentamente a temperatura ambiente incubando en hielo y posteriormente en una mesa de trabajo. Evapore completamente el disolvente de los extractos de lípidos mediante secado al vacío o utilizando una corriente suave de gas inerte (por ejemplo, argón o nitrógeno). Mientras tanto, precaliente un horno a 145 °C para calentar la placa TLC.
- Antes de que las muestras puedan cargarse en la placa TLC, determine las cantidades relativas de radioetiquetas tomadas por las células. Pipetear 10 μL de la célula entera lisar desde el paso 2.2 en un vial de centelleo de vidrio de 6 ml, agregar 6 ml de líquido de centelleo y colocar los viales en un estante. Utilice un contador de centelleo para medir el cpm o dpm de cada muestra utilizando la opción de recuento único de bastidor establecida en un tiempo de recuento de 1 minuto. Mida cada célula entera lisada por duplicado para obtener un promedio para cada muestra. Ajuste la cantidad de carga de acuerdo con un tipo salvaje o una muestra de referencia
NOTA: La cantidad de cada muestra a cargar en la placa TLC se puede determinar utilizando la siguiente ecuación: (recuentos de muestras promedio) / (recuentos de referencia promedio) x volumen de carga deseado. Por ejemplo, si 20 μL de la muestra de referencia se va a cargar en la placa TLC, y tiene un recuento promedio de 1.000, entonces una muestra experimental con un recuento promedio de 2.000 tendrá 10 μL cargado en la placa TLC. - Reconstituir los lípidos de la muestra en 40-50 μL de cloroformo:metanol 1:1 (v/v%) mediante vórtice durante 5 min. Preparar 101 ml del disolvente de fase móvil en un cilindro graduado de vidrio (consulte la sección resultados representativos para ver un ejemplo de la separación de las principales especies de NL por un disolvente 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexano:Éter de petróleo:Éter dietílico:Disolvente de ácido acético).
- Vierta el disolvente en una cámara TLC de vidrio que contenga una almohadilla de saturación TLC de 20 x 20 y una tapa hermética. Prepare una placa canalizada de gel de sílice de 20 x 20 G marcando suavemente una línea a 1,5 cm sobre la parte inferior de la placa con un lápiz. La línea designa el origen y dónde se cargarán los lípidos. Debajo de la línea, etiquete suavemente la muestra que se cargará en cada carril. Una vez que la placa TLC haya sido preparada, incuba la placa en un horno de 145 °C durante al menos 30 minutos para precalentar la placa y eliminar el exceso de humedad.
- Una vez que la placa se haya calentado lo suficiente y la almohadilla de saturación de TLC esté saturada de disolvente, retire la placa de TLC del horno e inmediatamente proceda a cargar la placa de TLC. Cargar la placa mientras está caliente garantiza una rápida evaporación del disolvente. Para cada especie lipídica de interés, cargue 5-20 μg de un estándar de lípidos purificados en un carril de la placa TLC para rastrear la separación y la distancia de migración esperada. Usando una pipeta, ubíque 5μL de muestra en el origen de cada carril ubicado a 1,5 cm por encima de la parte inferior de la placa TLC. Repita la carga de 5 puntos de μL hasta que se hayan cargado 20-40 μL de muestra en cada carril.
NOTA: Se pueden agregar 5-20 μg de lípidos purificados sin etiquetar a cada carril de muestra como trazadores que se pueden teñir y visualizar después de la separación TLC de lípidos. La presencia de un estándar teñido permite un fácil seguimiento y escisión de bandas lipídicas radiomarcadas para el posterior conteo de centelleo. Los estándares purificados que se carguen en la placa serán determinados por la especie NL de interés. Consulte la sección Resultados representativos para ver ejemplos de separación de ácido oleico (FFA), 1,2 dioleoil-glicerol (DG), trioleína (TG), colesterol (Chol), colesteril-linoleato (SE) y escualeno en carriles adyacentes a los carriles de muestra. - Una vez cargadas las muestras estándar y experimentales, coloque la placa en la cámara de desarrollo y espere hasta que el disolvente haya llegado a la parte superior de la placa (40-60 min). Una vez que la placa esté completamente desarrollada, retírela de la cámara y déjala secar en la campana extractora de humos durante 20 minutos.
- Después de secar la placa, cúbrala con una película de plástico y colóquela en un casete en desarrollo con una pantalla de autoradiografía. Deje que la placa se desarrolle con la pantalla durante 24-48 h.
4. Visualización y cuantificación de lípidos separados por TLC
- Retire la pantalla del cassette en desarrollo y colóquela dentro de un reproductor de imágenes de fósforo. Seleccione la opción Imagen de fósforo y desarrolle a 800-1000 V.
NOTA: Las imágenes de fósforo dan una visión cualitativa de los lípidos radiomarcados en la placa TLC. Sin embargo, la cuantificación de los lípidos radiomarcados se logra mejor mediante el conteo de centelleo, que se describe posteriormente. - Mezcle 100 ml de reactivo de p-anisaldehído (ver Archivo Suplementario)y deposite en una botella de spray de vidrio. Rocíe la placa TLC con reactivo de p-anisaldehído hasta que la sílice esté saturada. Hornea el plato en un horno de 145 °C durante 5 min, o hasta que hayan aparecido bandas.
- Para cuantificar especies de lípidos individuales utilizando el conteo de centelleo de radioetiquetas, use una cuchilla de afeitar para raspar el gel de sílice de la placa TLC de vidrio. Transfiera cada banda de gel de sílice correspondiente a una sola especie lipídica radiomarcada a un vial de centelleo de vidrio y agregue 6 ml de líquido de centelleo. Vórtice vigorosamente hasta que la banda de sílice se haya reducido a pedazos pequeños.
- Alternativamente, los lípidos se pueden extraer de la banda de gel de sílice utilizando el protocolo de extracción de lípidos en la sección 3. Si se extraen lípidos del gel de sílice, evapore el disolvente por completo como en el paso 3.1 y agregue 6 ml de líquido de centelleo a los lípidos secos. Coloque el estante que contiene los viales de centelleo en un contador de centelleo. Seleccione la opción Contar bastidor único y ajuste el tiempo de recuento a 2 minutos por vial. Los resultados del contador de centelleo se imprimirán y se pueden visualizar como un gráfico de barras.
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Representative Results
En este protocolo, hemos demostrado que el etiquetado, la detección y la cuantificación de las especies de NL se pueden lograr mediante el etiquetado metabólico de ácido C-acético 14. Las principales especies de NL se pueden separar en un sistema solvente de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexano:Éter de petróleo:Éter dietílico:Ácido acético (Figura 1A,B). Las imágenes de fósforo permiten la visualización de ácidos grasos libres (FFA), triacilglicerol (TG), diacilglicerol (DG), colesterol (Chol) y escualeno (SQ)(Figura 1A). Aunque los SE se pueden separar de otras especies de NL en este disolvente, no se detecta ninguno en el autorradiograma después de un pulso de 20 minutos. Esto puede atribuirse a la síntesis lenta de SE durante la fase estacionaria de crecimiento en la levadura. También se demuestra que las especies lipídicas purificadas pueden separarse en este método y posteriormente visualizarse mediante pulverización de la placa TLC con reactivo de p-anisaldehído(Figura 1B). Mientras que las especies nl están bien separadas en este disolvente, las especies polares como la fosfatidilcolina (PC) permanecen en el origen(Figura 1B). Mediante la aplicación de un período de persecución en medios sin radioetiquetas después del pulso, se puede medir el flujo relativo a través de las vías NL (Figura 1C). Después de una persecución de 10 minutos, la piscina principal de SQ ha desaparecido y el Chol total se eleva. Del mismo modo, la aparición de DG en el período de persecución se correlaciona con una disminución en la señal FFA.
Figura 1: 14 Elradiomarcado de ácido C-acético permite la detección de múltiples especies de NL. (A) Autorradiograma de lípidos separados por TLC aislados de levaduras radiomarcadas con ácido 14C-acético en fase estacionaria. Las especies claramente detectables incluyen ácido graso libre (FFA), triglicéridos (TG), diacilglicerol (DG), colesterol (Chol) y escualeno (SQ). Las bandas no etiquetadas son especies NL no identificadas. (B) Especies lipídicas purificadas separadas por TLC y visualizadas por tinción de p-anisaldehído. Las especies visualizadas incluyen todos los lípidos mencionados en (A) además de los ésteres de esteroles (SE) y la fosfatidilcolina (PC). (C) Autoradograma de lípidos separados por TLC aislados de levadura pulsada con ácido 14-acéticoen fase estacionaria seguido de un período de persecución de 10 min en medios libres de radioetiquetas. La desaparición de SQ se encuentra con un aumento en Chol. El aumento de la DG en el período de persecución se acompaña de una disminución de las especies de FFA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expediente complementario: Recetas para búferes, medios y soluciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí, se presenta un protocolo de radioetiquetado versátil para monitorear cuantitativamente la síntesis de especies de NL en levaduras. Este protocolo es muy modular, lo que permite que el procedimiento finalice en 3-6 días. Además, existe una gran cantidad de literatura sobre el uso de TLC para separar especies lipídicas y metabolitos, lo que debería permitir al usuario detectar varias especies lipídicas de interés con un simple cambio de los sistemas de solventes TLC16,19. Este protocolo es propicio para la separación, detección y cuantificación de lípidos radiomarcados. También se puede combinar con un período de persecución en medios no etiquetados para detectar el tiempo de rotación de las NL etiquetadas. Colectivamente, este procedimiento proporciona una estructura útil para comenzar a explorar el radioetiquetado de las especies de NL.
Otros métodos, como HPLC, GC-MS y UPLC-MS proporcionan una mayor resolución de separación y cuantificación de lípidos; sin embargo, normalmente no es óptimo ejecutar muestras radiomarcadas a través de la EM, aunque esto se puede superar mediante el uso de isótopos estables. Sin embargo, este método de radiomarca proporciona una alta sensibilidad de detección y versatilidad para muchas especies de lípidos. Otra ventaja de este protocolo en comparación con la EM es su asequibilidad. La separación de lípidos por TLC es relativamente simple, no requiere equipos extravagantes y se basa en materiales de laboratorio comunes. En cuanto a las limitaciones: ciertas especies de baja abundancia, como los lisolídicos, pueden no ser detectables incluso después de la incorporación de una etiqueta de 14C. Además, la mayoría de los enfoques de TLC no son adecuados para caracterizaciones "lipidómicas", debido a la separación de especies lipídicas dentro de un disolvente dado.
La levadura ofrece un sistema modelo conveniente y genéticamente tratable para el estudio de lípidos a través de enfoques bioquímicos de radiomarca. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que en antecedentes genéticos específicos, o durante una condición particular de crecimiento metabólico, la absorción celular de ácido acético radiomarcado u otras radioetiquetas puede reducirse. El etiquetado de células con ácido C-acético 14en ausencia de glucosa aumenta robustamente la absorción de la radioetiqueta. Las incubaciones largas en ausencia de glucosa aumentarán proporcionalmente la absorción de radiomarcas; sin embargo, esto también puede influir en las vías en cuestión. Por lo tanto, la eficiencia de etiquetado para una condición de crecimiento particular debe establecerse antes de seguir el protocolo de radiomarcado de ácido acético 14C en su totalidad. En particular, preste atención a la duración del período de radioetiquetado. El tiempo de etiquetado debe mantenerse lo más corto posible para detectar las especies lipídicas de interés. En conjunto, este procedimiento permite el estudio de reacciones importantes de síntesis de lípidos y debería permitir la investigación de la regulación de NL en células intactas.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos en la preparación de este manuscrito.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de Henne por su ayuda y asesoramiento conceptual para completar este estudio. W.M.H. cuenta con el apoyo de fondos de la Fundación Welch (I-1873), el NIH NIGMS (GM119768), el Fondo de Investigación Médica Ara Paresghian y el Programa de Becarios Dotados del Suroeste de UT. S.R ha sido apoyada por una subvención del programa T32 (5T32GM008297).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
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