Summary
ここでは 、14C-酢酸を用いた酵母の代謝標識に関するプロトコルが提示され、これは中性脂質の分離のための薄層クロマトグラフィーと結合される。
Abstract
中性脂質(ヌル)は、エネルギーおよび脂質恒常性において重要な役割を果たす疎水性、無用な生体分子のクラスです。NLsはアセチルCoAからデノボを合成し、主にトリグリセリド(TG)およびステロールエステル(SE)の形で真核生物に存在する。ネルの合成を担う酵素は 、サッカロミセス・セレビシエ (酵母)からヒトまで高度に保存されており、酵母はNL代謝酵素の機能と調節を解剖するのに有用なモデル生物となっています。アセチルCoAがNL種の多様なセットに変換される方法については多くのことが知られていますが、NL代謝酵素を調節するメカニズム、および誤調節が細胞病理にどのように寄与できるかはまだ発見されています。NL種の分離と特性評価のための数多くの方法が開発され、研究の数十年にわたって使用されています。しかし、主要なNL種の包括的な特性評価のための定量的かつ単純なプロトコルは議論されていない。ここでは、酵母における主要なNL種のデノボ合成を定量化する簡便かつ適応可能な方法が提示される。薄層クロマトグラフィーと組み合わせた 14のC-酢酸代謝標識を適用して、生理学的に重要なNLの多様な範囲を分離し定量化します。
Introduction
アセチルCoAは、膜を構築し、ATPを生成し、細胞シグナル伝達を調節するための汎用性の高い生体分子通貨として機能する中性脂質(NLs)を含む多様な生体分子の基本的なビルディングブロックである1,2。これらのそれぞれの経路のいずれかにシャントされるLSの可用性は、部分的には、その貯蔵によって調節される。脂質滴(LD)は、トリグリセリド(TG)およびステロールエステル(SE)の疎水性コアからなる細胞質小器官であり、ほとんどの細胞のヌルの主な貯蔵室である。したがって、DLは、分解し、その後生化学的および代謝プロセス3、4に利用することができるDLを隔離し、調節する。NLおよびLD関連タンパク質の誤調節は、リポジストロフィーおよびメタボリックシンドローム5,6を含む病理の発症と相関することが知られている。このため、現在のLD研究は、NL合成が空間的、時間的、および多細胞生物の異なる組織にわたってどのように調節されているかに重点を置いて行われています。NLsのユビキタスな細胞の役割のために、DLの合成と調節を担当する多くの酵素は真核生物全体で保存される7.実際、一部の原核生物でさえ、DL 8にDLを保管しています。したがって、サッカロミセス・セレビシエ(出芽酵母)などの遺伝的に難解なモデル生物は、NLの合成および調節の研究に有用であった。
細胞抽出物からのNLの分離と定量は、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー質量分析(UPLC-MS)9、10、11など、無数の方法で達成できます。おそらく、最も簡単な方法は、薄層クロマトグラフィー(TLC)を介して、標準曲線12、13からのその後の密度定量を可能にする。TLC は、NLs のコース粒度の分離のみを提供しますが、コストが安価で、複数のサンプルから同時に NL を迅速に分離できるため、強力な手法です。TLCを介してのNLの研究が直面している最もかなりの課題の2つは、1)NL種とその中間体の細胞豊富の広い範囲、および2)NL合成経路内の脂質中間体の親水性/疎水性の範囲である。その結果、TLCを介したNL種の定量は、典型的には最も豊富な種に限定される。しかし、14C-酢酸放射標識の導入は、NL経路内の低存在性中間体の検出を有意に高めることができる。酢酸はアセチルCoA合成酵素ACS214によってアセチルCoAに急速に変換され、これは14C-酢酸を酵母15において適切な放射性標識基質にする。さらに、疎水性のNLsとNの親水性中間体の両方の分離は、複数の溶媒システム16を使用することにより、TLCによって達成することができる。ここでは、酵母における14のC-酢酸代謝標識を用いたNLsの分離方法を提示する。パルス期間中に標識された脂質は、その後、十分に確立された全脂質単離プロトコル17によって単離され、続いてTLCによるNL種の分離が続く。標識脂質を可視化するオートラジオグラフィーと、全脂質を可視化する化学スプレーの両方によるTLCプレートの開発は、複数の定量方法を可能にする。個々の脂質バンドはまた、カミソリの刃を使用してTLCプレートから容易に抽出することができ、およびシンチレーションカウントは、バンド内の放射性標識材料の量を定量するために使用することができる。
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Protocol
1. 14C-酢酸を用いて酵母細胞の増殖と標識
- プレートからコロニーを摘み取り、2%デキストロースを含む合成完全(SC)培地の20mLに分配して酵母培養を接種する(SC培地のレシピについては 補足ファイル を参照)。200rpmで振盪して一晩30°Cでインキュベートする。
注:成長条件、サンプル量、および治療は、対象の脂質に基づいて異なります。完全な実験を実行する前に、最適な成長条件と培養量を経験的に決定する必要があります。このプロトコルは、生体膜および細胞増殖が遅くなるとの成長段階、およびNL合成が非常に活発である、静止期に成長した酵母培養物の放射性標識について議論する。 - 分光光度計を用いた一晩培養中のOD600 を測定し、2%デキストロースを含む新鮮なSC培地中の0.2の最終OD600 に酵母細胞培養を希釈した。細胞を24時間成長させるか、または静止期に達するまで(これは一般的に細胞倍増OD600 測定の平らな内層によって定義される)。
- セルを収集する前に、クエンチバッファを作成します(詳細は 補足ファイル を参照)。各サンプルに対して20 mLのクエンチン化バッファーのアリコートを2つ作り(すなわち、各サンプルに対して40 mLの焼入れバッファー)、2つの50 mL円錐形チューブに均等に分割します。今後使用するために、クエンチバッファーアリコートを-80 °Cに保管してください。
- 培養物が所望のODまたは増殖段階に達したら、4,100xgで10分間遠心して細胞を採取する。サンプルが遠心分離機にある間、最終濃度10μCi/mLのデキストロースフリーSC培地に[1-14C]酢酸ナトリウム塩を添加して、放射性標識媒体を調製します。
注意:放射性物質を扱う際には、適切な個人用保護具(PPE)を常に着用する必要があります。放射性物質の適切な保管、使用、廃棄については、常に現地のガイドラインに従ってください。
注:標識媒体中の 14C-酢酸の濃度と放射性標識インキュベーション時間の両方を、目的の代謝産物に応じて調整する必要があります。ここでは、20分の放射標識パルスインキュベーションが使用され、これは豊富な範囲のNL種を標識するのに十分である。 - ペレット化した細胞から上清を取り出し、ペレットをピペットで再懸濁して20mLのデキストロースフリーSC培地で細胞ペレットを1回洗浄する。5分間4,100 x g で遠心分離機を使用して細胞を再び回収します。
- デキストロースフリーSC培地中の細胞を1mLに再懸濁し、細胞を標識した2mLマイクロ遠心分離管に移す。2分間4,100 x g で遠心分離して細胞を再び回収します。
- デキストロースフリーSC培地の500μLで細胞を再懸濁します。50 mL円錐形チューブ用の遠心分離機を-10°Cまたは最低温度設定で事前に冷却します。
- 500 μLの細胞懸濁液(最終 14C-酢酸濃度= 5 μCi/mL)に500μLの放射性標識媒体を素早く添加することで、放射標識期間を開始します。ラベリング期間の終了前に30°Cの回転インキュベーターでチューブを20分間インキュベートし、各サンプルの20 mLアリコートを-80°C冷凍庫から氷のバケツに移します。
- 放射標識の期間が終了したら、ピペットを使用して、1 mL サンプル全体を 20 mL のコールドクエンチング バッファーに突き落とします。5-10 s用の円錐管をボルテックスし、試料が焼入れバッファーと完全に混合されていることを確認する。氷上で2分間、焼入れバッファーにサンプルをインキュベートします。
- -10 °Cまたは最低温度設定で3分の5,000 x g で遠心分離機で回転させて細胞ペレットを収集します。サンプルチューブが回転している間に、-80°C冷凍庫から氷で満たされたバケツ(すなわち、サンプルごとに20 mLチューブの1つ)に焼入れバッファーアリコートの別のセットを移します。
- 細胞ペレットから焼入れバッファー上清を取り出し、20 mL 新鮮な、冷たい、焼入れバッファーに交換します。渦を振り、ペレットが円錐管の底部から外れ、焼入れバッファーに完全に再懸濁されるまでサンプルを振る。サンプルを5,000 x g で-10°Cで3分間再び遠心分離し、細胞を採取する。
- 細胞がペレット化されたら、上清を注ぎ出し、ピペットで余分なものを取り除くことによって、サンプルからすべての焼入れバッファーを完全に除去します。さらに処理するために-80°Cでチューブを保管してください。
2. 酵母からの総脂質の分離
注:脂質の分離のための次のプロトコルは、効率的に最も中立脂質種17、18を抽出する確立され、頻繁に使用される方法に基づいています。
注意:有機溶剤を使用する場合は、常に適切なPPEを着用し、可能な限りヒュームフードの内側で作業してください。脂質抽出の際は、有機溶剤と相性のないプラスチックを使用しないでください。ポリプロピレンチューブは、次のプロトコルに適しています。
- 各サンプルに対して0.3gの酸洗浄ガラスビーズの重量を量り、氷の上の2 mLマイクロ遠心分離チューブに保管してください。-80°C冷凍庫から細胞ペレットを取り出し、氷の上に保管します。各サンプルに350 μLメタノールと700 μLクロロホルムを加え、再懸濁し、あらかじめ計量したガラスビーズを含むマイクロ遠心チューブに移します。
- 渦3x上のチューブを1分間攪拌し、攪拌の間に氷の上に30 sのインキュベーションを行い、細胞をリーゼする。あるいは、細胞は3つの1分周期のためのミニビーズビーターを使用して、lysedすることができる。25~30 μLの全細胞ライセートを別のチューブに保存して、シンチレーションカウントを行います。
注:保存されたリセートは、TLCプレートにロードされる各サンプルの量に影響を与えるパルス期間中に各サンプルによって取り込まれる放射性同位元素の相対的な量を決定するために使用されます。これについては、ステップ 3.2 でさらに説明します。 - 2 mL マイクロ遠心分離チューブの内容物を 15 mL ガラス遠心管に注ぎます[チューブA]。2 mL マイクロ遠心分離チューブを、1 mLのメタノールとボルテックスを 10~15 s に加えて洗浄します。1 mLメタノール洗浄をチューブAに移し、2 mLのクロロホルムをチューブAに加え、400 μLの水を加え、最終サンプル量4.45mLを得ます。
- 1分間の渦サンプルの後に1,000 x gで5分の遠心が続 く.遠心分離後、水相(上側)と有機(下)相は、界面に横たわる細胞デブリと視覚的に明確に分離する必要があります。
- ガラスパスツールピペットを使用して、チューブAから有機相を収集し、新しい15 mLガラス遠心管(チューブB)に移動します。チューブBに1M KClの1 mLを加えます。チューブAに、メタノール1mLとクロロホルム2mL、及び200μLミリQ水を加える。チューブAで渦と遠心のステップを繰り返します。
- チューブAから有機相を回収し、チューブBに加え、適切な容器にチューブAを入れます。ボルテックスチューブBは1分間、1,000 x gで5分遠心分離が続 きます。
- 上層水層をチューブBから取り出し、処分する。1 mLの新鮮な1 M KClをチューブBに加え、ボルテックス/遠心分離ステップを繰り返します。層が分離されたら、慎重にラベル付けされた4 mLガラスバイアルに底の有機層全体を収集します。
注:このステップでは、脂質抽出物は-80°Cで保存することができ、またはプロトコルは、脂質のTLC分離のために継続することができます。
3. 薄層クロマトグラフィーによる放射性同位元素標識のNLの分離と定量化
- 脂質抽出物を-80°Cにした場合、氷上でのインキュベートを行い、その後ベンチトップに置いて室温にゆっくりと持ち込む。真空乾燥または不活性ガス(例えば、アルゴンまたは窒素)の穏やかな流れを使用して、脂質抽出物から溶媒を完全に蒸発させます。一方、オーブンを145°Cに予熱してTLCプレートを加熱します。
- サンプルを TLC プレートにロードする前に、細胞が取り込んだ放射性ラベルの相対量を決定します。ステップ2.2から6mLガラスシンチレーションバイアルに全細胞ライセートのピペット10 μL、6 mLのシンチレーション液を加え、バイアルをラックに入れます。1 分のカウント時間に設定された カウント 1 ラック オプションを使用して各サンプルの cpm または dpm を測定するには、シンチレーション カウンターを使用します。各サンプルの平均を得るために、各細胞全体のライセートを重複して測定します。野生の種類または参照サンプルに応じて負荷量を調整する
注: TLC プレートにロードする各サンプルの量は、(平均サンプル数)/(平均参照カウント) x 所望の荷重量の式を使用して決定できます。例えば、参照サンプルの20 μLをTLCプレートに積み込み、平均カウントが1,000の場合、平均カウント2,000の実験サンプルはTLCプレートに10 μLをロードします。 - サンプル脂質を1:1(v/v%)クロロホルム:メタノールの40~50 μLで5分間ボルテックスして再構成します。ガラスの段階的なシリンダーで移動相溶媒の101 mLを調製します(主要なNL種分離の例については 、代表結果 セクションを参照してください(50:40:10:10:1)ヘキサン:石油エーテル:ジエチルエーテル:酢酸溶媒。
- 20 x 20 TLC 飽和パッドと密閉蓋を含むガラスTLCチャンバーに溶剤を注ぎます。鉛筆を使用してプレートの底面から1.5cm上に線をそっとマーキングして、チャネリングされた20 x 20シリカゲル60Gプレートを準備します。ラインは、脂質がロードされる原点と場所を指定します。ラインの下で、各レーンにロードされるサンプルに優しくラベルを付けます。TLCプレートを準備したら、145°Cのオーブンでプレートを少なくとも30分間インキュベートし、プレートを予熱し、余分な水分を取り除きます。
- プレートが十分に加熱されたら、TLC飽和パッドを溶媒で飽和させ、オーブンからTLCプレートを取り出し、すぐにTLCプレートをロードします。暖かいうちにプレートを積み込むことで、迅速な溶剤蒸発が保証されます。対象となる各脂質種について、精製された脂質標準の5~20 μgをTLCプレートのレーンに負荷し、分離と予想される移動距離を追跡します。ピペットを使用して、TLCプレートの底部の1.5cm上にある各レーンの原点にサンプルの5μLをスポットします。20~40 μLのサンプルが各レーンに積み込まれるまで、5 μL スポットの繰り返しローディングを行います。
注:5-20 μgの非標識精製脂質を、TLCの脂質分離後に染色し可視化できるトレーサーとして各サンプルレーンに添加することができます。染色された標準の存在は、その後のシンチレーションカウントのための放射標識脂質バンドの容易な追跡および切除を可能にする。どの精製された標準がプレートにロードされるかは、関心のあるNL種によって決定されます。オレイン酸(FFA)、1,2ジオレオロイルグリセロール(DG)、トリオレイン(TG)、コレステロール(Chol)、コレステリルリノオレ酸(SE)、およびスクアレンをサンプルレーンに隣接するレーンで分離する例については、 代表結果セクションを参照してください。 - 標準サンプルと実験サンプルがロードされたら、現像室にプレートを置き、溶剤がプレートの上部(40〜60分)に達するまで待ちます。プレートが完全に開発されたら、チャンバーから取り出し、フュームフードで20分間乾燥させます。
- プレートを乾燥させた後、プラスチックフィルムで覆い、自動ラジオグラフィースクリーン付きの現像カセットに入れます。プレートが24-48時間の画面で発達するようにします。
4. TLC分離脂質の可視化と定量化
- 現像カセットからスクリーンを取り外し、蛍光体のイメージャーの内部に置きます。[蛍光体イメージング]オプションを選択し、800-1000 Vで開発します。
注: 蛍光体イメージング は、TLCプレート上の放射状脂質の質的なビューを提供します。しかしながら、放射性標識脂質の定量は、後述するシンチレーションカウントによって最もよく達成される。 - p-アニアルデヒド試薬を100 mL混合し( 補足ファイルを参照)、ガラススプレーボトルに付着します。TLCプレートにp-アニアルデヒド試薬をスプレーして、シリカを飽和させます。145°Cのオーブンでプレートを5分間、またはバンドが現れるまで焼きます。
- 放射性シンチレーションカウントを使用して個々の脂質種を定量化するには、カミソリの刃を使用してガラスTLCプレートからシリカゲルを削ります。単一の放射性標識脂質種に対応する各シリカゲルバンドをガラスシンチレーションバイアルに移し、6 mLのシンチレーション液を加える。シリカバンドが小片に縮小されるまで激しく渦を流す。
- あるいは、脂質は、セクション3の脂質抽出プロトコルを用いてシリカゲルバンドから抽出することができる。シリカゲルから脂質を抽出する場合は、ステップ3.1のように溶媒を完全に蒸発させ、乾燥した脂質に6mLのシンチレーション液を加える。シンチレーションバイアルを含むラックをシンチレーションカウンターに入れます。 [単一ラックをカウント ] オプションを選択し、カウント時間をバイアルあたり 2 分に調整します。シンチレーションカウンターからの結果は印刷され、棒グラフとして視覚化することができる。
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Representative Results
このプロトコルでは、14C-酢酸代謝標識によってNL種の標識、検出、定量化が可能であることを実証しました。主なNL種は、50:40:10:10:1(v/v/v/v)ヘキサン:石油エーテル:ジエチルエーテル:酢酸(図1A、B)の溶媒系で分離することができます。蛍光体イメージングは、標識遊離脂肪酸(FFA)、トリアシルグリセロール(TG)、ジアシルグリセロール(DG)、コレステロール(Chol)、およびスクアレン(SQ)の可視化を可能にする(図1A)。この溶媒では他のNL種から分離できるが、20分間のパルスに続くオートラジオグラムでは何も検出されない。これは、酵母の成長の静止段階の間にSE合成を遅くすることに起因する可能性があります。また、この方法で精製脂質種を分離し、続いてTLCプレートをp-アニアルデヒド試薬で散布して可視化できることも実証されている(図1B)。NL種はこの溶媒で十分に分離されているが、ホスファチジルコリン(PC)のような極性種は起源にとどまる(図1B)。パルスに続くラジオラベルフリー媒体にチェイス期間を適用することにより、NL経路を介した相対フラックスを測定することができる(図1C)。10分の追跡の後、SQの主要なプールは消え、総チョルは上昇します。同様に、チェイス期間におけるDGの出現は、FFA信号の減少と相関する。
図1:14C-酢酸放射標識により、複数のNL種の検出が可能になります。(A)TLCによって分離された脂質のオートラジオグラムは、静止期において14C酢酸で放射標識された酵母から分離した。明らかに検出可能な種は、遊離脂肪酸(FFA)、トリグリセリド(TG)、ジアシルグリセロール(DG)、コレステロール(Chol)、およびスクアレン(SQ)を含む。ラベルなしバンドは、未確認のNL種です。(B)TLCによって分離され、p-アニアルデヒド染色によって可視化された精製脂質種。可視化された種は、(A)に記載されているすべての脂質を含むステロールエステル(SE)およびホスファチジルコリン(PC)に加えて。(C)TLCから分離した脂質のオートラジオグラムは、静止期で14-酢酸でパルスし、ラジオラベルフリー媒体で10分のチェイス期間を続けた。SQの消失はチョルの増加と満たされている。追跡期間におけるDGの上昇は、FFA種の減少を伴う。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル: バッファー、メディア、およびソリューションのレシピ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、酵母におけるNL種の合成を定量的に監視する多目的な放射標識プロトコルが提示される。このプロトコルは非常にモジュラーで、3-6日以内に手続きを終わらせることができます。さらに、脂質種と代謝産物を分離するためのTLCの使用に関する豊富な文献が存在し、これはユーザーがTLC溶媒系16,19の単純な変化で関心のあるいくつかの脂質種を検出することを可能にするべきである。このプロトコルは、放射性標識脂質の分離、検出、および定量化を助長します。また、ラベル付けされたNLのターンオーバー時間を検出するために、非ラベル付きメディアの追跡期間と組み合わすことができます。
HPLC、GC-MS、UPLC-MS などの他の方法では、脂質の分離と定量の分解能が高くなります。しかし、安定同位体を使用することで克服できますが、通常はMSを介して放射性標識されたサンプルを実行することは最適ではありません。それにもかかわらず、この放射性標識法は、多くの脂質種に高い検出感度と汎用性を提供します。MSと比較して、このプロトコルのもう一つの利点は、その手頃な価格です。脂質のTLC分離は比較的簡単で、贅沢な装置を必要としない、そして一般的な実験室材料に依存する。制限に関して:ある種の低存在量の低い種は、リソ−脂質のように 、14C標識の組み込み後でさえ検出できない場合がある。さらに、ほとんどのTLCアプローチは、所定の溶媒内の脂質種の経過粒度分離のために、「リピソミック」特性評価には適していません。
酵母は、放射性標識生化学的アプローチを介した脂質の研究に便利で遺伝的に難解なモデルシステムを提供します。しかし、特定の遺伝的背景において、または特定の代謝成長条件の間に、放射性標識酢酸または他の放射性標識の細胞取り込みが減少し得ることを留意すべきである。グルコースがない場合に 14C-酢酸を有する細胞の標識は、放射標識の取り込み量を強く増加させる。グルコースがない場合の長いインキュベーションは、比例して放射能標識の取り込み量を増加させます。しかし、これは問題の経路にも影響を与える可能性があります。したがって、特定の成長条件に対する標識効率は 、14C-酢酸放射標識プロトコルに完全に従う前に確立されるべきである。特に、放射表示期間の長さに注意を払う。標識時間は、脂質種の関心を検出するためにできるだけ短くしておくべきである。全体として、この手順は重要な脂質合成反応の研究を可能にし、無傷細胞におけるNL調節の調査を可能にするべきである。
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Disclosures
著者らは、この原稿の作成に競合する利益はないと宣言している。
Acknowledgments
著者らは、この研究の完了に関するヘルプと概念的なアドバイスをヘンネ研究所のメンバーに感謝したいと考えています。W.M.H.は、ウェルチ財団(I-1873)、NIH NIGMS(GM119768)、アラパレスギアン医学研究基金、UT南西部寄付奨学生プログラムからの資金によって支えられています。S.R は T32 プログラム交付 (5T32GM008297) によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
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