Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de metabolische etikettering van gist met 14C-azijnzuur, dat wordt gekoppeld aan dunnelaagchromatografie voor de scheiding van neutrale lipiden.
Abstract
Neutrale lipiden (NLs) zijn een klasse van hydrofobe, chargeless biomoleculen die een sleutelrol spelen in energie en lipide homeostase. NLs worden gesynthetiseerd de novo van acetyl-CoA en zijn voornamelijk aanwezig in eukaryoten in de vorm van triglyceriden (TGs) en sterol-esters (SEs). De enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese van NLs zijn sterk geconserveerd van Saccharomyces cerevisiae (gist) op de mens, waardoor gist een nuttig modelorganisme is om de functie en regulering van NL-metabolismeenzymen te ontleden. Hoewel er veel bekend is over hoe acetyl-CoA wordt omgezet in een diverse set NL-soorten, worden er nog steeds mechanismen ontdekt voor het reguleren van NL-metabolismeenzymen en hoe verkeerde regulatie kan bijdragen aan cellulaire pathologieën. Gedurende tientallen jaren van onderzoek zijn tal van methoden voor de isolatie en karakterisering van NL-soorten ontwikkeld en gebruikt; een kwantitatief en eenvoudig protocol voor de alomvattende karakterisering van grote NL-soorten is echter niet besproken. Hier wordt een eenvoudige en aanpasbare methode gepresenteerd om de de novo synthese van belangrijke NL-soorten in gist te kwantificeren. We passen 14C-azijnzuur metabolische etikettering in combinatie met dunne laagchromatografie toe om een divers scala aan fysiologisch belangrijke NLs te scheiden en te kwantificeren. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden toegepast om in vivo reactiesnelheden van NL-enzymen of afbraak van NL-soorten in de loop van de tijd te bestuderen.
Introduction
Acetyl-CoA is de fundamentele bouwsteen van diverse biomoleculen, waaronder neutrale lipiden (NLs), die dienen als een veelzijdige biomoleculaire valuta voor het bouwen van membranen, het genereren van ATP en het reguleren van celsignalering1,2. De beschikbaarheid van NLs die in een van deze respectieve trajecten moeten worden gemeden, wordt gedeeltelijk gereguleerd door hun opslag. Lipidedruppels (LDs), cytoplasmatische organellen bestaande uit hydrofobe kernen van triglyceriden (TGs) en sterolesters (SE's), zijn de belangrijkste opslagcompartimenten van de meeste cellulaire NLs. Als zodanig, LDs sequester en reguleren NLs, die kunnen worden afgebroken en vervolgens worden gebruikt voor biochemische en metabolische processen3,4. Het is bekend dat de verkeerde regulatie van NL- en LD-geassocieerde eiwitten gecorreleerd is met het begin van pathologieën waaronder lipodystrofie en metabool syndromen5,6. Hierdoor is het huidige LD-onderzoek intensief gericht op hoe NL-synthese ruimtelijk, tijdelijk en over verschillende weefsels van multicellulaire organismen wordt gereguleerd. Vanwege de alomtegenwoordige cellulaire rollen voor NLs, worden veel enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese en regulering van NLs bewaard in eukaryoten7. Inderdaad, zelfs sommige prokaryoten slaan NLs op in LDs8. Daarom zijn genetisch trekbare modelorganismen zoals Saccharomyces cerevisiae (ontluikende gist) nuttig geweest voor de studie van NL-synthese en -regulatie.
De scheiding en kwantificering van NLs uit celextracten kan op talloze manieren worden bereikt, waaronder gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en ultra-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS)9,10,11. Misschien is de eenvoudigste methode voor het scheiden van NLs via dunnelaagchromatografie (TLC), die latere densitometrische kwantificering mogelijk maakt van een standaardcurve12,13. Hoewel TLC slechts een koerskorrelige scheiding van NLs biedt, blijft het een krachtige techniek omdat het goedkoop is en het zorgt voor een snelle scheiding van NLs van meerdere monsters tegelijkertijd. Twee van de belangrijkste uitdagingen voor de studie van NLs via TLC zijn: 1) het brede scala aan cellulaire overvloed aan NL-soorten en hun tussenproducten, en 2) het bereik van hydrofielheid/hydrofobiciteit van lipide-tussenproducten binnen NL-syntheseroutes. Bijgevolg is de kwantificering van NL-soorten via TLC doorgaans beperkt tot de meest voorkomende soorten; de introductie van een 14C-azijnzuur radiolabel kan echter de detectie van tussenproducten met een lage overvloed binnen NL-trajecten aanzienlijk verbeteren. Azijnzuur wordt snel omgezet in acetyl-CoA door de acetyl-CoA synthetase ACS214, waardoor 14C-azijnzuur een geschikt radiolabeling substraat in gist15. Bovendien kan TLC zowel hydrofobe NLs als hydrofiele tussenproducten van NLs scheiden door het gebruik van meerdere oplosmiddelsystemen16. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de scheiding van NLs met behulp van 14C-azijnzuur metabolische etikettering in gist. Lipiden die tijdens de pulsperiode worden geëtiketteerd, worden vervolgens geïsoleerd door een goed vastgesteld totaal lipidenisolatieprotocol17, gevolgd door de scheiding van NL-soorten door TLC. Het ontwikkelen van TLC-platen door zowel autoradiografie om gelabelde lipiden te visualiseren, als een chemische spray om totale lipiden te visualiseren, maakt meerdere kwantificeringsmethoden mogelijk. Individuele lipidenbanden kunnen ook gemakkelijk uit de TLC-plaat worden gehaald met behulp van een scheermesje en scintillatietelling kan worden gebruikt om de hoeveelheid radioactief gelabeld materiaal in de band te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Groei en etikettering van gistcellen met 14C-azijnzuur
- Ent een gistcultuur in door een kolonie uit een bord te plukken en deze te doseren in 20 ml synthetische complete (SC) media die 2% dextrose bevatten (zie Aanvullend bestand voor het recept van SC-media). Incubeer bij 30 °C voor een nacht met schudden bij 200 tpm.
OPMERKING: Groeiconditie, monstervolume en behandeling zullen verschillen op basis van de lipide(en) van belang. Voorafgaand aan volledige experimenten moeten optimale groeiomstandigheden en cultuurvolumes empirisch worden bepaald. Dit protocol bespreekt radiolabeling van gistculturen die in stationaire fase zijn gegroeid, een groeifase waarin de groei van biomembraan en cellen vertraagt en de NL-synthese zeer actief is. - Meet de OD600 van de nachtcultuur met behulp van een spectrofotometer en verdun de gistcelkweek tot een uiteindelijke OD600 van 0,2 in 50 ml verse SC-media die 2% dextrose bevatten. Laat de cellen 24 uur groeien, of totdat ze de stationaire fase hebben bereikt (wat meestal wordt gedefinieerd door een vlakke voering van de celverdubbeling van OD600-meting).
- Voordat u de cellen verzamelt, maakt u de blusbuffer (zie Aanvullend bestand voor meer informatie). Maak voor elk monster twee 20 ml voedingsbuffer (d.w.z. 40 ml blusbuffer voor elk monster) en verdeel gelijkmatig in twee conische buizen van 50 ml). Bewaar de blusbuffer aliquots bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
- Zodra de culturen de gewenste OD of groeifase hebben bereikt, verzamelt u de cellen door gedurende 10 minuten bij 4.100 x g te centrifugeren. Terwijl de monsters zich in de centrifuge bevinden, bereidt u radiolabelingmedia voor door[1-14C] azijnzuurnatriumzout toe te voegen aan dextrosevrije SC-media bij een eindconcentratie van 10 μCi/ml.
LET OP: Bij het werken met radioactieve stoffen dient u altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) te dragen. Volg altijd de lokale richtlijnen voor de juiste opslag, gebruik en verwijdering van radioactieve materialen.
OPMERKING: Zowel de concentratie van 14C-azijnzuur in de etiketteermedia als de radiolabel incubatietijd moeten worden aangepast aan de metaboliet(en) van belang. Hier wordt een 20 min radiolabeling pulse incubatie gebruikt, wat voldoende is om NL soorten met een scala aan overvloed te labelen. - Verwijder het supernatant uit de geplet cellen en was de celkorrel eenmaal met 20 ml dextrosevrije SC-media door de pellet opnieuw te gebruiken met een pipet. Verzamel de cellen opnieuw door gedurende 5 minuten op 4.100 x g te centrifugeren.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml dextrosevrije SC-media en breng de cellen over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 2 ml. Verzamel de cellen opnieuw door gedurende 2 minuten op 4.100 x g te centrifugeren.
- Resuspend de cellen opnieuw in 500 μL dextrosevrije SC-media. Koel een centrifuge die is uitgerust voor 50 ml conische buizen voor tot -10 °C of op de laagste temperatuurinstelling.
- Begin de radiolabelperiode door snel 500 μL radiolabelingmedia toe te voegen aan elke 500 μL celsuspensie (uiteindelijke concentratie 14C-azijnzuur = 5 μCi/ml). Incubeer de buizen in een roterende incubator bij 30 °C gedurende 20 min. 2 min voor het einde van de etiketteringsperiode, breng één 20 ml voedingsbuffer voor elk monster over van de vriezer van -80 °C naar een emmer ijs
- Zodra de radiolabelperiode is afgelopen, gebruikt u een pipet om het hele monster van 1 ml in 20 ml koude blusbuffer te dompelen. Draai de conische buizen 5-10 s om ervoor te zorgen dat het monster grondig is gemengd met de blusbuffer. Incubeer de monsters in de blusbuffer gedurende 2 minuten op ijs.
- Verzamel de celkorrel door in een centrifuge van 5.000 x g te draaien gedurende 3 minuten ingesteld op -10 °C of op de laagste temperatuurinstelling. Terwijl de monsterbuizen draaien, breng u nog een set blusbuffer aliquot van de -80 °C vriezer over in een emmer gevuld met ijs (d.w.z. één 20 ml buis blusbuffer per monster).
- Verwijder het blusbuffer supernatans uit celkorrels en vervang het door 20 ml verse, koude, blusbuffer. Draai de monsters en schud de monsters totdat de pellet van de bodem van de conische buis is losgeraakt en volledig in de blusbuffer is geresuspendeerd. Centrifugeer de monsters opnieuw op 5.000 x g gedurende 3 minuten bij -10 °C om de cellen te verzamelen.
- Zodra de cellen zijn geplet, verwijdert u alle blusbuffer grondig uit de monsters door het supernatant af te gieten en het overtollige met een pipet te verwijderen. Bewaar buizen bij -80 °C voor verdere verwerking.
2. Isolatie van totale lipiden uit gist
OPMERKING: Het volgende protocol voor lipidenisolatie is gebaseerd op een gevestigde en veelgebruikte methode die efficiënt de meest neutrale lipidensoorten17,18extraheert .
LET OP: Draag bij het gebruik van organisch oplosmiddel altijd de juiste PBM en werk indien mogelijk in een zuurkast. Vermijd tijdens lipidenextractie het gebruik van kunststoffen die onverenigbaar zijn met organische oplosmiddelen. Polypropyleen buizen zijn geschikt voor het volgende protocol.
- Weeg 0,3 g zuurgekalkte glasparels voor elk monster en bewaar ze in microcentrifugebuizen van 2 ml op ijs. Haal de celkorrels uit de vriezer van -80 °C en houd ze op ijs. Voeg 350 μL methanol en 700 μL chloroform toe aan elk monster, resuspend, en breng over in microcentrifugebuizen met voorgewogen glasparels.
- Lyse cellen door het roeren van buizen op een vortex 3x gedurende 1 min, met 30 s incubaties op ijs tussen agitaties. Als alternatief kunnen cellen gedurende drie cycli van 1 minuut worden gelyseerd met behulp van een mini-kraalklopper. Bewaar 25-30 μL hele cellysaat in een aparte buis voor het tellen van scintillatie.
OPMERKING: Het opgeslagen lysaat wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheid radio-isotoop te bepalen die door elk monster tijdens de pulsperiode wordt opgenomen, wat van invloed is op de hoeveelheid van elk monster dat op de TLC-plaat wordt geladen. Dit wordt verder besproken in stap 3.2. - Giet de volledige inhoud van de 2 ml microcentrifugebuis in een glazen centrifugebuis van 15 ml [buis A]. Was de 2 ml microcentrifugebuizen door 1 ml methanol toe te voegen en 10-15 s te vortexen. Breng de 1 ml methanolwas over naar buis A en voeg 2 ml chloroform toe aan buis A, gevolgd door 400 μL water voor een eindmonstervolume van 4,45 ml.
- Vortexmonsters gedurende 1 min gevolgd door een 5 min centrifugeren bij 1.000 x g. Na centrifugeren moeten de waterige (bovenste) en organische (onderste) fasen duidelijk visueel worden gescheiden met celresten die op de interface liggen.
- Verzamel met behulp van een glazen Pasteur pipet de organische fase van buis A en ga naar een nieuwe glazen centrifugebuis van 15 ml (buis B). Voeg 1 ml 1 ML 1 M KCl toe aan buis B. Voeg aan buis A 1 ml methanol en 2 ml chloroform en 200 μL MiliQ-water toe. Herhaal de vortex- en centrifugeerstappen op buis A.
- Verzamel nogmaals de organische fase van buis A en voeg deze toe aan buis B. Gooi buis A weg in een geschikte container. Vortexbuis B gedurende 1 min gevolgd door een 5 min centrifugeren bij 1.000 x g.
- Verwijder de bovenste waterige laag van buis B en gooi deze weg. Voeg 1 ml verse 1 M KCl terug toe aan buis B en herhaal de vortexing/centrifugatiestap. Zodra de lagen zijn gescheiden, verzamelt u voorzichtig de hele organische onderste laag in een gelabelde glazen flacon van 4 ml.
OPMERKING: Bij deze stap kunnen lipide-extracten worden opgeslagen bij -80 °C, of het protocol kan worden voortgezet voor TLC-scheiding van lipiden.
3. Scheiding en kwantificering van radio-isotoop-gelabelde NLs door dunnelaagchromatografie
- Als lipideextracten op -80 °C worden geplaatst, breng dan langzaam op kamertemperatuur door op ijs te broeden en vervolgens op een bankje. Verdampt het oplosmiddel volledig uit lipideextracten door vacuüm te drogen of een zachte stroom inert gas (bijv. argon of stikstof) te gebruiken. Verwarm ondertussen een oven voor op 145 °C voor het verwarmen van de TLC-plaat.
- Voordat monsters op de TLC-plaat kunnen worden geladen, moet u de relatieve hoeveelheden radiolabel bepalen die door de cellen worden opgenomen. Pipet 10 μL van het hele cellysaat vanaf stap 2.2 in een glazen scintillatieflacon van 6 ml, voeg 6 ml scintillatievloeistof toe en plaats flacons in een rek. Gebruik een scintillatieteller om de cpm of dpm van elk monster te meten met behulp van de teloptie single rack ingesteld op een teltijd van 1 min. Meet elke hele cellysaat in tweevoud om een gemiddelde voor elk monster te verkrijgen. Pas de laadhoeveelheid aan op basis van een wild type of referentiemonster
OPMERKING: De hoeveelheid van elk monster dat op de TLC-plaat moet worden geladen, kan worden bepaald met behulp van de volgende vergelijking: (gemiddelde steekproeftellingen)/(gemiddelde referentietellingen) x het gewenste laadvolume. Als bijvoorbeeld 20 μL van het referentiemonster op de TLC-plaat moet worden geladen en een gemiddeld aantal van 1.000 heeft, wordt een experimenteel monster met een gemiddelde telling van 2.000 10 μL op de TLC-plaat geladen. - Reconstitueert de monsterlipiden in 40-50 μL van 1:1 (v/v%) chloroform:methanol door 5 minuten vortexen. Bereid 101 ml van het mobiele fase-oplosmiddel voor in een glazen gegradueerde cilinder (zie de sectie Representatieve resultaten voor een voorbeeld van grote NL-soortscheiding door een 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexaan:Petroleumether:Diethylether:Azijnzuuroplosmiddel).
- Giet het oplosmiddel in een glazen TLC-kamer met een 20 x 20 TLC verzadigingskussen en een nauwsluitend deksel. Bereid een gekanaliseerde plaat van 20 x 20 silicagel 60 G voor door voorzichtig een lijn 1,5 cm boven de bodem van de plaat te markeren met een potlood. De lijn geeft de oorsprong aan en waar de lipiden worden geladen. Label onder de lijn voorzichtig het monster dat in elke rijstrook wordt geladen. Zodra de TLC-plaat is voorbereid, incubeer de plaat in een oven van 145 °C gedurende ten minste 30 minuten om de plaat voor te verwarmen en overtollig vocht te verwijderen.
- Zodra de plaat voldoende is verwarmd en het TLC-verzadigingskussen verzadigd is met oplosmiddel, verwijdert u de TLC-plaat uit de oven en gaat u onmiddellijk verder met het laden van de TLC-plaat. Het laden van de plaat terwijl deze warm is, zorgt voor een snelle verdamping van oplosmiddelen. Laad voor elke lipidesoort van belang 5-20 μg van een gezuiverde lipidenstandaard op een rijstrook van de TLC-plaat om de scheiding en de verwachte migratieafstand te volgen. Plaats met behulp van een pipet 5 μL monster op de oorsprong van elke baan die zich 1,5 cm boven de bodem van de TLC-plaat bevindt. Herhaal het laden van 5 μL-vlekken totdat 20-40 μL monster in elke rijstrook is geladen.
OPMERKING: 5-20 μg ongelabelde gezuiverde lipiden kunnen aan elke monsterstrook worden toegevoegd als tracers die kunnen worden gekleurd en gevisualiseerd na TLC-scheiding van lipiden. De aanwezigheid van een bevlekte standaard maakt het mogelijk om radioactief gelabelde lipidenbanden eenvoudig te volgen en te excisie voor daaropvolgende scintillatietelling. Welke gezuiverde normen op de plaat worden geladen, wordt bepaald door de NL-interessesoort. Zie de sectie Representatief resultaat voor voorbeelden van het scheiden van oliezuur (FFA), 1,2 dioleoyl-glycerol (DG), trioleïne (TG), cholesterol (Chol), cholesteryl-linoleaat (SE) en squaleen in rijstroken naast de monsterbanen. - Zodra de standaard en de experimentele monsters zijn geladen, plaatst u de plaat in de ontwikkelkamer en wacht u tot het oplosmiddel de bovenkant van de plaat heeft bereikt (40-60 min). Zodra de plaat volledig is ontwikkeld, verwijdert u deze uit de kamer en laat u deze 20 minuten drogen in de zuurkast.
- Nadat de plaat is gedroogd, bedek je deze met plastic folie en plaats je deze in een ontwikkelende cassette met een autoradiografiescherm. Laat de plaat zich 24-48 uur met het scherm ontwikkelen.
4. Visualisatie en kwantificering van TLC gescheiden lipiden
- Verwijder het scherm van de zich ontwikkelende cassette en plaats het in een fosforbeeld. Selecteer de optie Fosfor imaging en ontwikkel bij 800-1000 V.
OPMERKING: Fosforbeeldvorming geeft een kwalitatief beeld van radioactief gelabelde lipiden op de TLC-plaat. Kwantificering van radioactief gelabelde lipiden kan echter het beste worden bereikt door scintillatietelling, die vervolgens wordt beschreven. - Meng 100 ml p-anisaldehydereagens (zie Aanvullend bestand)en deponeer in een glazen spuitfles. Besproei de TLC-plaat met p-anisaldehydereagens totdat het silica verzadigd is. Bak de plaat 5 minuten in een oven van 145 °C of totdat er banden zijn verschenen.
- Om individuele lipidensoorten te kwantificeren met behulp van radiolabel scintillatietelling, gebruikt u een scheermesje om de silicagel van de glazen TLC-plaat te schrapen. Breng elke silicagelband die overeenkomt met een enkele radioactief gelabelde lipidesoort over in een glazen scintillatieflacon en voeg 6 ml scintillatievloeistof toe. Vortex krachtig totdat de silicaband tot kleine stukjes is gereduceerd.
- Als alternatief kunnen lipiden worden geëxtraheerd uit de silicagelband met behulp van het lipidenextractieprotocol in sectie 3. Als lipiden uit de silicagel worden geëxtraheerd, verdampt u het oplosmiddel volledig zoals in stap 3.1 en voegt u 6 ml scintillatievloeistof toe aan de gedroogde lipiden. Plaats het rek met scintillatiefons in een scintillatieteller. Selecteer de optie Tellen enkel rack en stel de teltijd in op 2 min per flacon. Resultaten van de scintillatieteller worden afgedrukt en kunnen worden gevisualiseerd als een staafdiagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol hebben we aangetoond dat het labelen, detecteren en kwantificeren van NL-soorten kan worden bereikt door 14C-azijnzuur metabolische etikettering. Grote NL-soorten kunnen worden gescheiden in een oplosmiddelsysteem van 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexaan:Petroleumether:Diethylether:Azijnzuur (Figuur 1A,B). Fosforbeeldvorming maakt visualisatie mogelijk van gelabeld vrij vetzuur (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), cholesterol (Chol) en squaleen (SQ) (figuur 1A). Hoewel SE's in dit oplosmiddel kunnen worden gescheiden van andere NL-soorten, worden er geen SE's gedetecteerd in het autoradiogram na een puls van 20 minuten. Dit kan worden toegeschreven aan langzame SE-synthese tijdens de stationaire groeifase van gist. Er wordt ook aangetoond dat gezuiverde lipidensoorten in deze methode kunnen worden gescheiden en vervolgens kunnen worden gevisualiseerd door de TLC-plaat te besproeien met p-anisaldehydereagens (figuur 1B). Hoewel NL-soorten goed gescheiden zijn in dit oplosmiddel, blijven polaire soorten zoals fosfatidylcholine (PC) aan de oorsprong (Figuur 1B). Door een achtervolgingsperiode toe te passen in radiolabelvrije media na de puls, kan de relatieve flux door NL-trajecten worden gemeten (Figuur 1C). Na een achtervolging van 10 minuten is de grote poel van SQ verdwenen en is de totale Chol verhoogd. Evenzo correleert het uiterlijk van DG in de achtervolgingsperiode met een afname van het FFA-signaal.
Figuur 1: 14C-Azijnzuur radiolabeling maakt het mogelijk om meerdere NL soorten te detecteren. (A) Autoradiogram van lipiden gescheiden door TLC geïsoleerd van gist radioactief gelabeld met 14C-azijnzuur in stationaire fase. Duidelijk detecteerbare soorten zijn vrij vetzuur (FFA), triglyceride (TG), diacylglycerol (DG), cholesterol (Chol) en squaleen (SQ). Ongelabelde banden zijn ongeïdentificeerde NL-soorten. (B) Gezuiverde lipidensoorten gescheiden door TLC en gevisualiseerd door p-anisaldehydekleuring. Gevisualiseerde soorten omvatten alle lipiden genoemd in (A) naast sterol-esters (SE) en fosfatidylcholine (PC). (C) Autoradiogram van lipiden gescheiden door TLC geïsoleerd van gist gepulseerd met 14-azijnzuur in stationaire fase gevolgd door een 10 minuten achtervolgingsperiode in radiolabelvrije media. Verdwijning van SQ wordt geconfronteerd met een toename van Chol. De stijging van DG in de achtervolgingsperiode gaat gepaard met een afname van de FFA-soorten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend dossier: Recepten voor buffers, media en oplossingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een veelzijdig radiolabeling protocol gepresenteerd om de synthese van NL soorten in gist kwantitatief te monitoren. Dit protocol is zeer modulair, waardoor de procedure binnen 3-6 dagen kan worden voltooid. Bovendien bestaat er een schat aan literatuur over het gebruik van TLC om lipidesoorten en metabolieten te scheiden, waardoor de gebruiker verschillende soorten lipiden van belang zou moeten kunnen detecteren met een eenvoudige wijziging van TLC-oplosmiddelsystemen16,19. Dit protocol is bevorderlijk voor de scheiding, detectie en kwantificering van radioactief gelabelde lipiden. Het kan ook worden gekoppeld aan een achtervolgingsperiode in niet-gelabelde media om de omlooptijd van gelabelde NLs te detecteren. Gezamenlijk geeft deze procedure een nuttige structuur om te beginnen met het verkennen van de radiolabeling van NL-soorten.
Andere methoden, zoals HPLC, GC-MS en UPLC-MS, bieden een hogere resolutie van lipidenscheiding en kwantificering; het is echter meestal niet optimaal om radioactief gelabelde monsters via MS uit te voeren, hoewel dit kan worden overwonnen door stabiele isotopen te gebruiken. Niettemin biedt deze radiolabelmethode een hoge detectiegevoeligheid en veelzijdigheid voor veel lipidesoorten. Een ander voordeel van dit protocol ten opzichte van MS is de betaalbaarheid ervan. TLC-scheiding van lipiden is relatief eenvoudig, vereist geen extravagante apparatuur en is afhankelijk van veelgebruikt laboratoriummateriaal. Met betrekking tot beperkingen: bepaalde soorten met een lage overvloed, zoals lyso-lipiden, zijn mogelijk niet detecteerbaar, zelfs niet na het opnemen van een 14C-label. Bovendien zijn de meeste TLC-benaderingen niet geschikt voor 'lipidomische' karakteriseringen, vanwege de koerskorrelige scheiding van lipidesoorten binnen een bepaald oplosmiddel.
Gist biedt een handig, genetisch tracteerbaar modelsysteem voor de studie van lipiden via radiolabel biochemische benaderingen. Er moet echter worden opgemerkt dat in specifieke genetische achtergronden, of tijdens een bepaalde metabole groeiomstandigheden, de cellulaire opname van radioactief gelabeld azijnzuur of andere radiolabels kan worden verminderd. Etikettering van cellen met 14C-azijnzuur bij afwezigheid van glucose verhoogt de opname van het radiolabel robuust. Lange incubaties bij afwezigheid van glucose zullen de opname van radiolabels proportioneel verhogen; dit kan echter ook van invloed zijn op de trajecten in kwestie. Daarom moet de etiketteringsefficiëntie voor een bepaalde groeiconditie worden vastgesteld voordat het 14C-azijnzuur radiolabelingprotocol volledig wordt gevolgd. Let met name op de lengte van de radiolabelperiode. De etiketteringstijd moet zo kort mogelijk worden gehouden om de lipidesoort die van belang is op te sporen. Al met al maakt deze procedure het mogelijk om belangrijke lipidesynthesereacties te bestuderen en moet het onderzoek van NL-regulatie in intacte cellen mogelijk zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen zijn bij de voorbereiding van dit manuscript.
Acknowledgments
De auteurs willen de leden van het Henne lab bedanken voor hulp en conceptueel advies bij de afronding van dit onderzoek. W.M.H. wordt ondersteund door fondsen van de Welch Foundation (I-1873), het NIH NIGMS (GM119768), het Ara Paresghian Medical Research Fund en het UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R. is ondersteund door een T32-programmasubsidie (5T32GM008297).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V.
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P.
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
