Summary
L’article décrit la différenciation dirigée par étapes des cellules souches pluripotentes induites en organoïdes pulmonaires entiers tridimensionnels contenant à la fois des cellules pulmonaires épithéliales proximales et distales ainsi que du mésenchyme.
Abstract
Le développement et la maladie pulmonaires humaines ont été difficiles à étudier en raison de l’absence de systèmes modèles in vitro biologiquement pertinents. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) peuvent être différenciées progressivement en organoïdes pulmonaires multicellulaires 3D, constitués à la fois de populations de cellules épithéliales et mésenchymateuses. Nous récapitulons les signaux de développement embryonnaire en introduisant temporellement une variété de facteurs de croissance et de petites molécules pour générer efficacement un endoderme définitif, un endoderme de l’intestin antérieur et, par conséquent, des cellules progénitrices pulmonaires. Ces cellules sont ensuite intégrées dans un milieu de matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit (DFG), ce qui leur permet de se développer spontanément en organoïdes pulmonaires 3D en réponse à des facteurs de croissance externes. Ces organoïdes pulmonaires entiers (WLO) subissent des stades précoces de développement pulmonaire, y compris une morphogenèse ramifiée et une maturation après exposition à la dexaméthasone, à l’AMP cyclique et à l’isobutylxanthine. Les WHO possèdent des cellules épithéliales des voies respiratoires exprimant les marqueurs KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) et MUC5AC (gobelet) ainsi que des cellules épithéliales alvéolaires exprimant HOPX (type alvéolaire I) et SP-C (type alvéolaire II). Des cellules mésenchymateuses sont également présentes, notamment de l’actine musculaire lisse (SMA) et du récepteur A du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα). Les WFO dérivés de l’iPSC peuvent être maintenus dans des conditions de culture 3D pendant de nombreux mois et peuvent être triés pour les marqueurs de surface afin de purifier une population cellulaire spécifique. Les WFO dérivés de l’iPSC peuvent également être utilisés pour étudier le développement pulmonaire humain, y compris la signalisation entre l’épithélium pulmonaire et le mésenchyme, pour modéliser les mutations génétiques sur la fonction et le développement des cellules pulmonaires humaines et pour déterminer la cytotoxicité des agents infectieux.
Introduction
Le poumon est un organe compliqué, hétérogène et dynamique qui se développe en six stades distincts - maturation embryonnaire, pseudoglandulaire, canaliculaire, sacculaire, alvéolaire et microvasculaire1,2. Les deux dernières phases se produisent avant et après la naissance dans le développement humain, tandis que les quatre premières étapes se produisent exclusivement pendant le développement du fœtus, à moins qu’une naissance prématurée ne se produise3. La phase embryonnaire commence dans la couche germinale endodermique et se termine par le bourgeonnement de la trachée et des bourgeons pulmonaires. Le développement pulmonaire se produit en partie par signalisation entre les cellules épithéliales et mésenchymateuses4. Ces interactions entraînent la ramification pulmonaire, la prolifération, la détermination du devenir cellulaire et la différenciation cellulaire du poumon en développement. Le poumon est divisé en zones conductrices (trachée aux bronchioles terminales) et zones respiratoires (bronchioles respiratoires aux alvéoles). Chaque zone contient des types uniques de cellules épithéliales; y compris les cellules basales, sécrétoires, ciliées, de brosse, neuroendocrines et ionocytaires dans les voies respiratoires conductrices5, suivies des cellules alvéolaires de type I et II dans l’épithélium respiratoire6. On ignore encore beaucoup de choses sur le développement et la réponse aux blessures des différents types de cellules. Les modèles d’organoïdes pulmonaires dérivés de la CSPi permettent d’étudier les mécanismes qui stimulent le développement pulmonaire humain, les effets des mutations génétiques sur la fonction pulmonaire et la réponse de l’épithélium et du mésenchyme aux agents infectieux sans avoir besoin de tissu pulmonaire humain primaire.
Les marqueurs correspondant aux différents stades de la différenciation embryonnaire comprennent CXCR4, cKit, FOXA2 et SOX17 pour l’endoderme définitif (DE)7, FOXA2, TBX1 et SOX2 pour l’endoderme antérieur de l’intestin antérieur (AFE)8, et NKX2-1 pour les cellules progénitrices pulmonaires précoces9. Dans le développement pulmonaire embryonnaire, l’intestin antérieur se divise en œsophage dorsal et trachée ventrale. Les bourgeons des poumons droit et gauche apparaissent comme deux outpouchings indépendants autour du bourgeon trachéal10. Au cours de la morphogenèse ramifiée, le mésenchyme entourant l’épithélium produit du tissu élastique, du muscle lisse, du cartilage et du système vasculaire11. L’interaction entre l’épithélium et le mésenchyme est essentielle au développement normal des poumons. Cela inclut la sécrétion de FGF1012 par le mésenchyme et de SHH13 produit par l’épithélium.
Ici, nous décrivons un protocole pour la différenciation dirigée des hiPSC en organoïdes pulmonaires entiers (WLO) tridimensionnels (3D). Bien qu’il existe des approches similaires qui intègrent l’isolement des cellules progénitrices pulmonaires par tri au stade LPC pour fabriquer des organoïdes alvéolaires14,15 (distaux) ou des organoïdes des voies respiratoires16 (proximaux), ou génèrent des sphéroïdes ventraux-antérieurs de l’intestin antérieur pour fabriquer des organoïdes pulmonaires humains exprimant des marqueurs alvéolaires et mésenchymateux et des organoïdes progénitrices de la pointe des bourgeons17 , la force de cette méthode est l’inclusion des deux types de cellules épithéliales et mésenchymateuses pulmonaires pour modéliser et orchestrer la morphogenèse, la maturation et l’expansion des ramifications pulmonaires in vitro.
Ce protocole utilise de petites molécules et des facteurs de croissance pour diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes à travers l’endoderme définitif, l’endoderme de l’intestin antérieur et les cellules progénitrices pulmonaires. Ces cellules sont ensuite induites en organoïdes pulmonaires entiers 3D à travers des étapes de développement importantes, y compris la ramification et la maturation. Le résumé du protocole de différenciation est illustré à la figure 1a avec des images représentatives en champ clair de la différenciation endodermique et organoïde illustrées à la figure 1b. La figure 1c,d montre les détails de l’expression génique de la différenciation endodermique ainsi que l’expression génique des populations proximales et distales des cellules épithéliales pulmonaires après avoir terminé la différenciation.
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Protocol
Ce protocole d’étude a été approuvé par l’Institutional Review Board du Human Research Protections Program de l’UCSD (181180).
1. Induction définitive de l’endoderme à partir de cellules souches pluripotentes induites (Jour 1 - 3)
- Décongeler lentement le facteur de croissance réduit (DFG)-milieu de la matrice de membrane basale (BM) sur la glace 30 minutes avant l’utilisation. Dans le mélange DMEM/F12 froid, diluer le milieu de matrice GFR BM 1:1 de telle sorte qu’il constitue 50% de ce milieu. Placez les embouts de pipette P1000 au congélateur pour les refroidir avant utilisation.
- Recouvrir chaque puits d’une plaque de 12 puits avec 500 μL de milieu de matrice de membrane basale GFR à 50 % préparé dans du DMEM/F12 glacé. Une fois que le nombre souhaité de puits est revêtu, retirez tout excès de mélange de milieu et/ou de bulles des puits et placez la plaque sur de la glace ou un réfrigérateur à 4 °C pendant 20 min pour fixer. Ensuite, déplacez la plaque vers l’incubateur à 37 °C pendant la nuit pour geler et sécher.
- Une fois que les hiPSC atteignent 70 à 90 % de confluence, ajoutez 10 μM d’inhibiteur de la kinase rho-associée (ROCK) Y-27632 une heure avant la dissociation. Aspirer le milieu et laver une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Dissocier les cSH en ajoutant un milieu de détachement cellulaire (0,5 mL/puits d’une plaque de 12 puits) et incuber pendant 20 min à 37 °C dans un incubateur à CO2 à 5 %.
- Retirer les plaques de l’incubateur et ajouter 0,5 mL/12 puits de milieu de passage des cellules souches (tableau 1) aux puits; triturez doucement les cellules à l’aide d’une pointe P1000 pour obtenir une suspension unicellulaire. Transférer des cellules dissociées dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL; centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
- Aspirer le milieu et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu mTeSR Plus complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM (Y-27632). Effectuez un comptage de cellules. Ajouter 2,0 x 105 hiPSC dans 1 mL de mTeSR complété par un inhibiteur de ROCK Y-27632 par puits d’une plaque enduite de milieu de membrane basale GFR de 12 puits. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
REMARQUE: Le nombre de semis de cellules doit être optimisé par lignée cellulaire. 24 h après le placage, les puits doivent être confluents à 50% à 70%. - Le jour 1, aspirez le mTeSR Plus et ajoutez le milieu d’induction de l’endoderme définitif (DE) (tableau 1) complété par 100 ng/mL d’activine A humaine et 5 μM d’inhibiteur de GSK3β/activateur Wnt CHIR99021.
REMARQUE: Les milieux DE avec inhibiteur de GSK3β / activateur Wnt CHIR99021 doivent être retirés dans les 20 à 24 heures suivant le jour 1 de l’induction DE pour une différenciation réussie. - Le jour 2 et le jour 3, passez au milieu d’induction DE complété par 100 ng / mL d’activine A uniquement.
REMARQUE: La différenciation DE ne doit pas dépasser un total de 72 h, sinon l’efficacité diminuera. Le jour 4, si l’on observe une mort cellulaire importante, diminuer le temps total d’exposition au milieu DE de 6 à 12 h. - Pour analyser l’efficacité du DE, confirmer une expression supérieure à 90 % de CXCR4 et/ou de cKit par cytométrie en flux ou immunofluorescence de FOXA2 et/ou SOX17 (Figure 2a).
2. Induction de l’endoderme de l’intestin antérieur (AFE) (Jour 4 - 6)
- Le jour 4, changer le milieu en milieu basal libre sérique (SFBM) (tableau 1) complété par 10 μM SB431542 et 2 μM dorsomorphine pour l’induction de l’AFE. Changez de média AFE tous les jours pendant 3 jours (jour 4, jour 5 et jour 6).
- Pour analyser l’efficacité de l’AFE, confirmez l’expression robuste de SOX2, TBX1 et FOXA2 par coloration par immunofluorescence (Figure 2b).
3. Différenciation des cellules progénitrices pulmonaires (LPC) (Jour 7 - 16)
- Le jour 7, décongeler le milieu de la matrice de membrane basale GFR sur la glace. Aspirer le support AFE et bien laver avec 1x PBS. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire et incuber pendant 10 min à 37 °C.
- Ajouter 1 mL de milieu de trempe (2 % de FBS dans le DMEM/F12) aux puits contenant une solution de détachement cellulaire. Gardez les cellules sous forme d’agrégats en pipetant doucement de haut en bas. Assurez-vous que toutes les cellules sont délogées et transférées dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. Centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de trempe complété par 10 ng/mL de protéine morphogénique osseuse recombinante humaine 4 (BMP4), 0,1 μM d’acide rétinoïque tout trans (PR), 3 μM d’inhibiteur de GSK3β/activateur Wnt CHIR99021 et 10 μM d’inhibiteur de roche Y-27632.
- Effectuez un comptage de cellules. Ajouter 2,5 x 105 cellules à 100 μL de milieu de matrice de membrane basale GFR froid, bien mélanger et placer la gouttelette dans un puits d’une plaque de 12 puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 à 60 min pour permettre au milieu de polymériser. Ajouter 1 mL de milieu LPC complété par 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632 par puits en veillant à ce que la goutte moyenne soit complètement immergée et incuber à 37 °C pendant la nuit.
- Le jour 8, 24 h après l’induction du LPC, changez le milieu du LPC pour éliminer l’inhibiteur de ROCK Y-27632. Changez le support LPC tous les deux jours pour un total de 9 à 11 jours.
REMARQUE: Si le milieu devient jaune dans les 24 heures, changez de milieu tous les jours. - Pour analyser l’efficacité du LPC, confirmer l’expression robuste du facteur de transcription intracellulaire NKX2-1 ou effectuer une cytométrie en flux pour les marqueurs de surface CD47hi/CD26low15 ou CPM18 (Figure 2c). En gros, les sphéroïdes LPC doivent être ronds et transparents (Figure 2c).
REMARQUE: Ne procédez pas à la différenciation organoïde pulmonaire si l’efficacité de NKX2-1 est inférieure à 30%.
4.3D induction organoïde pulmonaire (Jour 16 - 22)
- Le jour 17, décongeler le milieu de la matrice de la membrane basale GFR sur la glace. Aspirer le milieu d’induction LPC. Ajouter ensuite 2 μg/mL de dispase (1 mL) au puits et remettre en suspension le mélange milieu/dispase avec une pipette P1000. Incuber à 37 °C pendant 15 min. Triturer à nouveau le mélange et incuber à 37 °C pendant encore 15 min.
- Transférer la dispase et les cellules dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. Utilisez du PBS réfrigéré (2-3 ml) pour laver le puits et remettre en suspension le mélange dispase/cellule. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g. Retirez manuellement le surnageant, en prenant soin de ne pas désenduire la couche de granulés de milieu / cellule. Répétez le lavage PBS réfrigéré et centrifugez le tube de centrifugeuse conique pendant encore 5 minutes à 400 x g.
- Retirez manuellement le surnageant, puis ajoutez 2 mL de solution de dissociation à base de trypsine au tube de centrifugeuse conique. Incuber à 37 °C pendant 12 min.
- Après l’incubation, remettez en suspension les cellules avec une pointe de pipette P1000. Ajoutez ensuite un volume égal de milieu de trempe au tube de centrifugeuse conique et faites tourner vers le bas à 400 x g pendant 5 min. Aspirer les cellules surnageantes et les remettre en suspension dans un milieu de trempe + 10 μM de l’inhibiteur de ROCK Y-27632.
REMARQUE: L’induction réussie des organoïdes pulmonaires se produit lorsque les cellules sont incorporées sous forme d’agrégats, et non de cellules individuelles, ajustant le pipetage en conséquence. - Effectuez un comptage de cellules. Calculer le volume nécessaire pour obtenir 5,0-8,0 x 104 cellules par puits. Aliquoter les agrégats de la cellule LPC en tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger pendant 5 min à 400 x g. Enlevez l’excès de surnageant, en prenant soin de ne pas agiter la pastille cellulaire. Ne laisser que 10 μL de milieu résiduel.
- Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de milieu de matrice de membrane basale GFR froid et ajoutez-la aux inserts de membrane de culture cellulaire (6,5 mm de diamètre, pore de 0,4 μm, membrane de polyester). Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 à 60 min pour permettre au milieu de la matrice de la membrane basale GFR de polymériser.
- Ajouter 1 mL de milieu d’induction organoïde 3D (tableau 1) complété par le facteur de croissance des fibroblastes-7 (FGF7) (10 ng/mL), le FGF10 (10 ng/mL), l’inhibiteur GSK3β/activateur Wnt CHIR (3 μM), le facteur de croissance épidermique (EGF) (10 ng/mL) et 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632 à la chambre basolatérale de l’insert membranaire. Changez le support tous les deux jours pendant 6 jours.
5.3D Ramification organoïde pulmonaire (Jour 23 - 28)
- Le jour 23, le passage au milieu ramifié 3D (tableau 1) est complété par FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inhibiteur de GSK3β/activateur Wnt CHIR99021 (3 μM), PR (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) et facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) / facteur de croissance placentaire (PlGF) (10 ng/mL). Changez le support tous les deux jours pendant 6 jours.
REMARQUE: Au jour 6 de la différenciation des ramifications 3D, il devrait y avoir plusieurs organoïdes ramifiés (Figure 2).
6.3D maturation organoïde pulmonaire (Jour 29 - 34)
- Le jour 29, passer au milieu de maturation 3D (tableau 1), qui est le même que le milieu ramifié 3D, mais avec l’ajout de dexaméthasone (50 nM), d’AMPc (100 μM) et de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), un inhibiteur de la phosphodiestérase également appelé isobutylxanthine (100 μM). Changez le support tous les deux jours pendant 6 jours.
REMARQUE: Dans les 24 heures suivant la maturation 3D, les organoïdes ramifiés devraient se dilater et se transformer en sphères transparentes.
7.3D Immunocytochimie organoïde pulmonaire
- Pour l’analyse 3D des organoïdes pulmonaires entiers, fixez le milieu de la matrice de la membrane basale GFR dans les inserts membranaires avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 1 h à 4 °C. Intégrer dans de la cire de paraffine et monter sur des diapositives selon les protocoles standard publiés.
- Effectuer la récupération de l’antigène avant la coloration. Les marqueurs des voies respiratoires comprennent KRT5, MUC5AC et SCGB3A2. Les marqueurs alvéolaires comprennent SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 et HOPX (Figure 3).
8. Retrait d’organoïdes pulmonaires entiers du milieu de la matrice de la membrane basale DU DFG pour le passage, le FACS ou la cryoconservation
- Pour dissocier les organoïdes du milieu de la matrice de la membrane basale GFR, retirez le milieu de la chambre basale et ajoutez 2 μg/mL de dispase (1 mL) dans la chambre apicale.
- Triturez délicatement le mélange milieu/dispase avec une pipette P1000 et placez-le dans l’incubateur pendant 15 min. Triturez doucement le mélange à nouveau et incubez pendant encore 15 min.
- Ajouter 1 mL de PBS réfrigéré (4 °C) et transférer les organoïdes avec le milieu matriciel dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. Tourner à 400 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant pour ne pas déranger la pastille cellulaire.
- Laver une fois de plus avec 1 mL de PBS réfrigéré et tourner à 400 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant pour ne pas perturber le mélange milieu/cellule.
- Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire au tube de centrifugeuse conique, rallumer doucement le mélange de matrice de membrane GFR-Basal/ cellule. Placer dans l’incubateur pendant 12 min pour les cellules de passage sous forme d’agrégats ou pour la cryoconservation), ou 20 min pour la suspension monocellulaire.
- Ajouter un volume égal de support de trempe et tourner vers le bas à 400 x g pendant 5 min. Remise en suspension dans un milieu de trempe + 10 μM de l’inhibiteur de ROCK Y-27632.
REMARQUE: À cette étape, aucun milieu résiduel de la membrane basale ne doit être vu dans le tube. S’il reste du milieu résiduel, répétez les étapes 8.5 et 8.6. - Effectuez un comptage de cellules. Calculez le volume nécessaire pour les applications en aval.
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Representative Results
24 heures après le placage, jour 1, les CSPi doivent être confluents à 50% à 90%. Le jour 2, DE devrait être confluent à 90% à 95%. Au cours de l’induction de DE, il est courant d’observer une mort cellulaire importante au jour 4, mais les cellules attachées conserveront une morphologie pavée compacte (Figure 2b). Arrêter la différenciation si la majorité des cellules adhérentes se détachent et envisager de raccourcir l’exposition aux milieux DE avec l’activine A de 6 à 12 h. Pendant l’induction de l’AFE, la mort cellulaire est minime et les cellules restent adhérentes, mais apparaîtront plus petites et plus hétérogènes. Le passage des cellules au jour 7 ne doit être effectué que si le rendement de SOX2 et FOXA2 double positif est de >80%. Après avoir passé dans la matrice de la membrane basale pour l’induction LPC 3D, de petits sphéroïdes apparaîtront d’abord, puis se développeront et certains peuvent commencer à se ramifier. Les profils d’expression génique pour une différenciation endodermique réussie comprennent une augmentation de SOX17 à DE, une augmentation de FOXA2 et SOX2 avec une diminution de SOX17 et la première apparition de NKX2-1, et une augmentation de NKX2-1, ainsi que la présence de SOX2 et FOXA2. Conformément au développement embryonnaire précoce, la ventralisation de l’AFE se produit pour le développement des bourgeons pulmonaires (NKX2-1+) et la dorsalisation de l’AFE se produit pour le développement gastro-intestinal (SOX2+). Les cultures au LPC auront un mélange de progéniteurs pulmonaires et gastriques.
L’induction organoïde pulmonaire à partir de LPC a été réalisée en utilisant diverses méthodes. Certains groupes trient les cellules à l’aide de rapporteurs fluorescents NKX2-1 ou d’un proxy d’antigène de surface (CPM, CD26lowCD47high). Mais ces organoïdes pulmonaires contiennent des cellules alvéolaires de type II sans cellules alvéolaires de type I ni mésenchyme. D’autres groupes ont recueilli des amas de cellules qui bourgeonnent sur la monocouche AFE/LPC et les ont incorporés dans la matrice de la membrane basale. Ces organoïdes contiennent une population mixte de cellules épithéliales et mésenchymateuses pulmonaires, mais il faut des mois pour les mettre en culture19. Notre protocole inclut à la fois la présence de cellules épithéliales et mésenchymateuses. Les WHO expriment les marqueurs cellulaires épithéliaux proximaux p63 et KRT5 (cellules basales) et SCGB3A2 (cellules club) ainsi que les marqueurs cellulaires épithéliaux distaux HOPX (ATI) et proSPC, SPB et NKX2-1 (ATII). Ils expriment également le marqueur mésenchymateux Vimentin au stade LPC, ainsi que dans l’ensemble des organoïdes pulmonaires. PDGFRα est un marqueur pour les fibroblastes qui ont une fonction importante dans le poumon pendant la sacculation et l’alvéolarisation20 et est co-exprimé avec le facteur de transcription important dans la différenciation des cellules distales, SOX9 (Figure 3).
Notre méthode génère efficacement des cultures LPC 3D exprimant NKX2-1 en utilisant des molécules de signalisation qui se produisent dans le développement pulmonaire fœtal pour former des organoïdes pulmonaires précoces. Lors du passage des LPC dans un milieu de matrice membranaire basale GFR pour l’induction organoïde pulmonaire, il est impératif de ne pas trop se dissocier en une suspension à cellule unique, mais plutôt de conserver de petits amas de cellules (10 cellules / amas). Le comptage cellulaire ne sera pas complètement précis, mais toujours nécessaire pour éviter une confluence excessive pendant la différenciation organoïde pulmonaire de 3 semaines.
L’induction organoïde pulmonaire devrait donner de petits organoïdes ramifiés au jour 6 de l’induction (jour 23 de la différenciation). Ceux-ci devraient continuer à croître pendant l’étape de ramification organoïde et l’étape de maturation. Vingt-quatre heures après l’introduction de la dexaméthasone, de l’AMPc et de l’IBMX, les branches devraient s’étendre dans des sphères transparentes. L’analyse des organoïdes pulmonaires entiers peut être effectuée à la fin de la différenciation, ou les WHO peuvent être passés dans une matrice de membrane basale fraîche avec DFG ou cryoconservés par congélation dans 10% de DMSO.
Figure 1: Schéma global de la différenciation des organoïdes pulmonaires entiers (WLO) à partir des hiPSC et des données représentatives. (a) Schéma de la différenciation WLO des hiPSC. Les cercles représentent le type de cellule endodermique avec des marqueurs d’identification. La chronologie de la différenciation est indiquée dans des barres noires. Facteurs de croissance et/ou petites molécules pour l’induction de populations organoïdes endodermiques et pulmonaires. En résumé, les cellules souches sont différenciées en endoderme définitif, en endoderme de l’intestin antérieur et en cellules progénitrices pulmonaires en environ 16 jours. Ces cellules sont ensuite passées dans un milieu de matrice membranaire basale GFR contenant des inserts de milieu et subissent une induction, une ramification et une maturation organoïdes pulmonaires. La différenciation totale prend environ 35 jours. b) Images représentatives en phase contrastée des cellules aux principaux stades endodermiques et images 3D d’organoïdes pulmonaires entiers. Taille de la barre d’échelle comme indiqué dans le panneau. c) analyse qRT-PCR des marqueurs du développement pulmonaire au cours de l’endoderme et d) différenciation organoïde pulmonaire entière des marqueurs cellulaires proximaux et distaux. Toutes les données représentent en moyenne 3 à 5 réplications biologiques. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne et sont normalisées en actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation de la différenciation des endodermes par cytométrie en flux et immunocytochimie. (a) Cytométrie en flux du marqueur endodermique définitif CXCR4. Le panneau de gauche montre la barrière contre la population non tachée tandis que le panneau du milieu montre la population positive CXCR4. Le panneau de droite montre l’image immunocytochimique de SOX17 (rouge) recouverte de noyaux (bleu). (b) Image immunocytochimique des marqueurs AFE FOXA2 et SOX2 superposés avec des noyaux (bleu). c) Expression endogène de NKX2-1-GFP dans une lignée cellulaire rapporteure en LPC 3D. Images prises à partir d’une culture de cellules vivantes en champ clair et GFP. Cytométrie en flux du marqueur intracellulaire du progéniteur pulmonaire NKX2-1 après fixation et perméabilisation. Taille de la barre d’échelle = 50 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Caractérisation d’organoïdes pulmonaires entiers 3D après 3 semaines de différenciation par immunocytochimie. (a) Marqueurs pulmonaires proximaux. Le panneau de gauche montre SOX2 (blanc) et SOX9 (rouge) superposés par des noyaux (bleu). Ces marqueurs sont importants dans la morphogenèse ramifiée et représentent les populations épithéliales proximales et distales. Les panneaux du milieu montrent P63 (rouge) et KRT5 (rouge), deux marqueurs des cellules basales. Le panneau de droite montre SCGB3A2, un marqueur de cellules de club. b) Marqueurs pulmonaires distaux. Le panneau de gauche représente des marqueurs pro-SPC (PSPC) (vert) et HOPX (rouge), des marqueurs de cellules alvéolaires de type II et I, respectivement, recouverts de noyaux (bleu). Le panneau du milieu montre des marqueurs pro-SPC (PSPC) (vert) et SPB (rouge), des cellules alvéolaires de type II, recouvertes de noyaux (bleu). Le panneau de droite montre NKX2-1 (rouge) et ZO1 (vert) recouverts de noyaux (bleu). c) Marqueurs du mésenchyme pulmonaire. Le panneau de gauche montre PDGFRA (rouge) et SOX9 (blanc), représentant le mésenchyme distal. Le panneau de droite montre Vimentin (rouge), qui est dispersé dans tout le poumon. Taille de la barre d’échelle = 50 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| RÉACTIFS ET SOLUTIONS - Pour les noms de sociétés, veuillez consulter la liste des matériaux du tableau des matériaux |
| Milieu d’induction organoïde 3D (jour 17-22) |
| Milieu basal sans sérum (voir recette) complété par : |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| FEM (10 ng/mL) |
| Milieu de ramification organoïde 3D (jour 23-28) |
| Milieu basal sans sérum (voir recette) complété par : |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Acide rétinoïque tout trans (0,1 μM) |
| FEM (10 ng/mL) |
| VEGF/PIGF (10 ng/mL) |
| Milieu de maturation organoïde 3D (jour 29-34) |
| Milieu basal sans sérum (voir recette) complété par : |
| Dexaméthasone (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| Milieu d’induction AFE (jour 4-6) |
| Milieu basal sans sérum (voir recette) complété par : |
| SB431542 (10 μM) |
| Dorsomorphine (2 μM) |
| Milieu d’induction DE (jour 1-3) |
| 48,5 mL RPMI1640 + Glutamax |
| 1 mL B27 sans acide rétinoïque |
| 500 μl HEPES (1 %) |
| Stylo/streptocoque de 500 μl |
| Activité humaine A (100 ng/mL) |
| CHIR99021 (5 μM) - seulement dans les premières 24 heures |
| Milieu d’induction LPC (jour 7-16) |
| Milieu basal sans sérum (voir recette) complété par : |
| BMP4 (10 ng/mL) |
| Acide rétinoïque (PR) tout trans (0,1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Milieu de trempe |
| 49 mL DMEM/F12 |
| 1 mL FBS |
| Milieu basal sans sérum (SFBM) |
| 375 mL Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax |
| 125 mL F12 de Ham |
| 5 mL B27 sans acide rétinoïque |
| 2,5 mL N2 |
| 500 μl d’acide ascorbique, 50 mg/mL |
| 13 μl de monothioglycérol/1 ml d’IMDM » utiliser 300 ul de 0,4 mM de monothioglycérol par 100 ml de milieu libre sérique |
| 3,75 mL d’albumine sérique bovine (BSA) Fraction V, solution à 7,5 % |
| Stylo/streptocoque de 500 μl |
| Milieu de passage des cellules souches (jour 0) |
| 500 mL DMEM/F12 |
| 129 mL De remplacement sérique Knockout (KSR) |
| 6,5 mL glutamax |
| 6,5 mL NEAA |
| 1,3 mL de 2-mercaptoéthanol |
| Stylo/streptocoque de 6,5 mL |
Tableau 1 : Tableau des médias.
| Problème | Solution |
| La différenciation DE n’est pas efficace | 24 heures après le placage dans un milieu de cellules souches, les cellules doivent être confluentes à 50-70% |
| L’inhibiteur de GSK3β / activateur Wnt CHIR99021 doit être retiré dans les 20 à 24 heures suivant le jour 1 de l’induction DE | |
| La différenciation DE ne doit pas dépasser un total de 72 heures | |
| La différenciation AFE n’est pas efficace | S’assurer que la différenciation DE a réussi et que les cellules expriment > 80% de CXCR4 |
| S’assurer que de nouveaux facteurs de croissance / petites molécules sont ajoutés quotidiennement aux médias | |
| La différenciation LPC n’est pas efficace | S’assurer que la différenciation AFE a réussi et que les cellules expriment > 80% FOXA2 / SOX2 |
| Assurez-vous que les cellules AFE sont passées sous forme d’agrégats de 4 à 10 cellules et non d’une seule cellule | |
| Organoïdes pulmonaires 3D ne se développent pas ou ne se différencient pas | Assurez-vous que la différenciation LPC a réussi et que les cellules expriment > 30% NKX2-1 |
| S’assurer que les LPC ont été passés sous forme d’agrégats de 4 à 10 cellules et non d’une seule cellule | |
| S’assurer qu’il n’y a pas de matrigel résiduel provenant des LPC pendant le passage | |
| Ajouter l’inhibiteur de ROCK Y-27632 à chaque changement de support | |
| S’assurer que le milieu est changé à temps et que de nouveaux facteurs de croissance / petites molécules sont ajoutés | |
| S’assurer que la concentration des facteurs de croissance/petites molécules est correcte |
Tableau 2 : Dépannage.
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Discussion
La différenciation réussie des organoïdes pulmonaires entiers (WLO) 3D repose sur un protocole en plusieurs étapes de 6 semaines avec une attention aux détails, y compris le temps d’exposition aux facteurs de croissance et aux petites molécules, la densité cellulaire après le passage et la qualité des hiPSC. Pour le dépannage, reportez-vous au Tableau 2. Les csahah doivent être confluents à environ 70 % à 80 %, avec moins de 5 % de différenciation spontanée avant la dissociation. Ce protocole fait appel à un support « mTeSR plus » ; cependant, le support simple « mTeSR » a également été utilisé avec des résultats comparables et est moins coûteux. Pour la matrice extracellulaire, nous utilisons un milieu de matrice de membrane basale GFR. Nous passons les hiPSC en utilisant ReLesR (voir Tableau des matériaux) pour réduire la différenciation.
Au cours de la différenciation endodermique, les cellules doivent être visualisées quotidiennement avant et après les changements de milieu. Les facteurs de croissance spécifiés / petites molécules doivent être ajoutés tous les jours frais au milieu de base pour éviter une dégradation prématurée. La mort cellulaire dans l’endoderme définitif (DE) est fréquente, mais devrait être limitée lors de l’induction de l’endoderme de l’intestin antérieur (AFE) et des cellules progénitrices pulmonaires (LPC). S’il y a un décès important le troisième jour de DE (jour 4), diminuez le temps total de DE de 6 à 12 h. De nouvelles lignées cellulaires iPSC pourraient devoir être optimisées pour une différenciation endodermique réussie. Effectuer une cytométrie en flux à DE pour CXCR4 afin de confirmer une induction réussie (>85% de cellules CXCR4 +). Les cellules doivent être relativement stables à l’AFE et changeront morphologiquement avec peu de mort.
Le passage en LPC est un autre processus qui doit être optimisé pour le type de cellule. La replaquage de cellules à une densité trop faible (<50%) entraînera une différenciation inefficace. Confirmer la réussite de l’induction du LPC avec immunocytochimie pour NKX2-1 ou cytométrie en flux pour CPM18 ou CD26low/CD47high15. L’induction réussie du LPC doit avoir >40% de NKX2-1, sinon les organoïdes auront une plus grande abondance d’AFE dorsal. Pour l’induction LPC, des facteurs de croissance doivent être ajoutés aux supports de base à chaque changement de support. Si le média devient jaune plus tard dans l’induction LPC, envisagez d’augmenter le volume de médias frais ou changez le média tous les jours. Au cours de l’induction organoïde pulmonaire entière en 3D, le nombre de placages et le maintien des grappes de cellules sont la clé d’une croissance organoïde réussie. Le milieu de la matrice de membrane basale GFR est difficile à manipuler et très sensible à la température, alors gardez-le toujours sur la glace. Si le milieu de la matrice de la membrane basale GFR se gélifie trop tôt, les cellules LPC ne s’y intégreront pas. Nous recommandons de décongeler 1 mL d’aliquotes de milieu de matrice de membrane basale GFR sur de la glace 30 minutes avant le passage. Une fois que les cellules/grappes ont été comptées et que les aliquotes appropriées ont été faites, placez la pastille cellulaire sur la glace. Nous suggérons de préparer des plaques, d’étiqueter et d’ajouter des inserts de membrane de culture cellulaire avant la manipulation du milieu de matrice membranaire basale GFR.
Utilisez des embouts de pipette pour ajouter immédiatement le volume correct de milieu de matrice de membrane basale gfR liquide à la pastille cellulaire, en restant sur la glace. Pipettez de haut en bas rapidement mais doucement (manipulation nuancée) pour ne pas introduire de bulles, puis replacez le tube sur la glace. Ajouter le mélange de milieu de matrice cellulaire et de matrice de membrane basale GFR à la partie apicale du transpuit dans des plaques préparées. Le mélange doit étaler et recouvrir l’ensemble du transwell; inclinez doucement la plaque pour assurer le revêtement. Après la gélification dans l’incubateur pendant 30 à 60 minutes, il devrait y avoir des amas de cellules visibles dans le milieu de la matrice de la membrane basale GFR. Ajouter un milieu d’induction pulmonaire approprié à la chambre basale complété par un inhibiteur de ROCK Y-27632 de 10 μM et surveiller la croissance organoïde tous les deux jours.
Les applications futures des organoïdes générés par ce protocole comprennent l’étude des voies moléculaires qui contrôlent l’engagement précoce de la lignée pulmonaire et la spécification du devenir cellulaire21,22,23. L’interaction entre l’épithélium et le mésenchyme peut être déterminée en utilisant des modèles d’élimination génique24. Les organoïdes pourraient également être co-cultivés avec des cellules endothéliales pour déterminer l’importance de la signalisation de co-motifs tissulaires spécifiques entre l’épithélium pulmonaire, le mésenchyme et l’endothélium25. Le développement pulmonaire se produit parallèlement au développement vasculaire et cette relation peut provoquer d’importants mécanismes moléculaires nécessaires au bon développement pulmonaire. Nous avons également montré que ces organoïdes pulmonaires entiers sont fonctionnels par des tests de sécrétion de tensioactifs après l’élimination du milieu de la matrice de la membrane basale GFR, suivis d’une culture à court terme dans des puits à très faible fixation26. D’autres stratégies comprennent le tri des cellules pour les marqueurs de surface cellulaire tels que NGFR (cellules basales)27 et HTII-280 (cellules ATII)28 et leur remplacement en tant qu’organoïdes homogènes ou monocouche dans des conditions de culture interphasique liquide air. Des organoïdes pulmonaires entiers, proximaux et distaux ont également été utilisés pour étudier les cibles cellulaires et la physiopathologie de l’infection virale par le SRAS-CoV-2 afin de mieux comprendre et dépister les médicaments qui pourraient combattre la COVID-19.
Ce protocole est robuste et reproductible, mais de nombreux défis subsistent. De nombreuses lignées iPSC et ESC différentes ont été testées (>20 lignes) mais le protocole doit être optimisé pour chaque lignée cellulaire. Malgré une induction ROBUSTE de DE et DA, l’induction LPC peut être difficile à obtenir >40% des cellules NKX2-1 +. D’autres protocoles incluent une étape de tri pour les marqueurs de surface des cellules NKX2-115,18, mais ceux-ci ne donnent que des organoïdes alvéolaires de type II sans mésenchyme et contiennent toujours des populations de cellules gastriques et hépatiques malgré la purification de la population de progéniteurs pulmonaires29. Nous avons également noté une petite quantité de cellules gastriques et hépatiques dans le LPC et les organoïdes pulmonaires entiers, peut-être en raison de la présence de cellules antérieures dorsales de l’intestin antérieur contaminant les LPC. Par conséquent, la différenciation des organoïdes pulmonaires purs n’a pas encore été réalisée et davantage de recherches sur le développement des cellules progénitrices pulmonaires dans les tissus humains doivent être achevées. Les essais en aval doivent être rigoureusement comparés à l’expression des gènes et des protéines du tissu pulmonaire humain primaire. Alors qu’à ce jour, l’utilisation la plus fructueuse des organoïdes pulmonaires a été dans la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments in vitro, la transplantation d’organoïdes pulmonaires dérivés de hiPSC chez les patients pour la médecine régénérative a été envisagée comme une thérapie future pour une gamme de conditions. Cependant, avant d’envisager de telles interventions, une bonne partie du contrôle de la qualité doit être perfectionnée, y compris l’identification et l’élimination des dérivés contaminants, indésirables et potentiellement tumorigènes de l’hiPSC. En outre, de meilleurs tests fonctionnels in vitro et de meilleurs modèles animaux de maladie pulmonaire doivent encore être développés.
Plus précisément, la fonctionnalité et la sécurité des cellules dérivées de hiPSC doivent être confirmées. Les cellules indifférenciées doivent être exclues car elles ont la capacité de générer des tératomes. Une méthode pour déterminer les cellules souches indifférenciées dans l’endoderme définitif consiste à trier les cellules à l’aide du marqueur de pluripotence SSEA4. Des gènes marqueurs pour les CSHh indifférenciés ont récemment été détectés à l’aide du séquençage de l’ARN unicellulaire30. ESRG, CNMD et SFRP2 peuvent être utilisés pour valider des cellules indifférenciées à n’importe quelle étape de différenciation. Une fois la pureté confirmée, l’avantage des thérapies autologues dérivées de l’iPSC est la capacité des cellules transplantées à éviter le rejet puisqu’elles proviennent des propres cellules du patient. Les inconvénients comprennent le temps qu’il faut pour différencier complètement les cellules, subir des tests cliniques rigoureux et transplanter les cellules chez un patient présentant une lésion aiguë (syndrome de détresse respiratoire, infarctus du myocarde ou lésion de la colonne vertébrale). L’alternative consiste à utiliser des cellules allogéniques dérivées d’iPSC en banque31. Ceux-ci peuvent être stockés et facilement disponibles pour les patients avec des donneurs appariés à l’antigène leucocytaire humain (HLA) et ils auront subi des tests approfondis de contamination. Le plus gros inconvénient est la possibilité d’un rejet immunitaire. L’immunosuppression peut être nécessaire dans la transplantation de cellules allogéniques, ce qui est la réalité actuelle des greffes allogéniques de tissus entiers. Des stratégies sont en cours d’élaboration pour permettre aux cellules allogéniques dérivées de l’iPSC d’échapper à la réponse immunitaire pour les transplanter en toute sécurité chez les patients32.
Finalement, les organoïdes pulmonaires entiers dérivés de l’iPSC seront utilisés pour étudier des modèles de maladies spécifiques aux patients, adapter les thérapies et améliorer la recherche médicale régénérative.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
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