Summary
Artikeln beskriver steg klokt riktade differentiering av inducerade pluripotenta stamceller till tredimensionella hela lung organoider som innehåller både proximal och distala epitelial lungceller tillsammans med mesenchyme.
Abstract
Mänsklig lungutveckling och sjukdom har varit svår att studera på grund av bristen på biologiskt relevanta in vitro-modellsystem . Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) kan differentieras stegvis i 3D multicellulära lungorganoider, gjorda av både epitelial och mesenchymala cellpopulationer. Vi rekapitulerar embryonala utvecklingsmässiga ledtrådar genom att tidsmässigt införa en mängd olika tillväxtfaktorer och små molekyler för att effektivt generera slutgiltig endoderm, främre foregut endoderm och därefter lung stamceller. Dessa celler är sedan inbäddade i tillväxtfaktor reducerad (GFR)-källare membranmatris medium, så att de spontant kan utvecklas till 3D lungorganoider som svar på externa tillväxtfaktorer. Dessa hela lungorganoider (WLO) genomgår tidiga lungutvecklingsstadier inklusive förgrening av morfenes och mognad efter exponering för dexametason, cyklisk AMP och isobutylxanthine. WLOs har luftvägsepitetelceller som uttrycker markörerna KRT5 (basal), SCGB3A2 (klubba) och MUC5AC (bägare) samt alveolar epitelceller som uttrycker HOPX (alveolar typ I) och SP-C (alveolar typ II). Mesenkymala celler finns också, inklusive glatt muskelaktin (SMA) och trombocyt-härledda tillväxtfaktorreceptor A (PDGFRα). iPSC-härledda WLOs kan bibehållas under 3D-odlingsförhållanden i många månader och kan sorteras för ytmarkörer för att rena en viss cellpopulation. iPSC härledda WLOs kan också användas för att studera mänsklig lungutveckling, inklusive signalering mellan lungepitelet och mesenkym, för att modellera genetiska mutationer på människans lungcellsfunktion och utveckling och för att bestämma cytotoxiciteten hos smittsamma medel.
Introduction
Lungan är ett komplicerat, heterogent, dynamiskt organ som utvecklas i sex distinkta stadier - embryonala, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar och mikrovaskulära mognad1,2. De två senare faserna förekommer pre och postnatally i mänsklig utveckling medan de första fyra stadierna inträffar uteslutande under fetala utveckling om inte prematur födsel inträffar3. Den embryonala fasen börjar i det endodermala bakterieskiktet och avslutas med att luftstrupen och lungknopparna spirar. Lungutveckling sker delvis via signalering mellan epitelial och mesenkymala celler4. Dessa interaktioner resulterar i lung förgrening, spridning, cellulär ödebestämning och cellulär differentiering av den utvecklande lungan. Lungan är indelad i ledande zoner (luftstrupe till de terminala bronkiolerna) och andningszoner (respiratoriska bronkioler till alveolerna). Varje zon innehåller unika epitelcelltyper. inklusive basala, sekretoriska, ciliated, borste, neuroendokrina och jonocytceller i den ledande luftvägarna5, följt av alveolar typ I och II celler i luftvägarna epitel6. Mycket är fortfarande okänt om utvecklingen och svaret på skador av de olika celltyperna. iPSC härledda lungorganoidmodeller möjliggör studier av mekanismer som driver mänsklig lungutveckling, effekterna av genetiska mutationer på lungfunktionen och svaret från både epitel och mesenkime på smittämnen utan behov av primär mänsklig lungvävnad.
Markörer som motsvarar de olika stadierna av embryonal differentiering inkluderar CXCR4, cKit, FOXA2 och SOX17 för slutgiltig endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 och SOX2 för främre foregut endoderm (AFE)8 och NKX2-1 för tidiga lungprogenitorceller9. I embryonal lungutveckling delar foreguten in i dorsala matstrupen och ventrala luftstrupen. Knopparna i höger och vänster lungor visas som två oberoende utpouchings runt trakeal knopp10. Under förgrening morphogenesis producerar mesenkymen som omger epitelet elastisk vävnad, glatt muskel, brosk och vaskulatur11. Interaktionen mellan epitel och mesenchyme är avgörande för normal lungutveckling. Detta inkluderar utsöndringen av FGF1012 av mesenchymen och SHH13 som produceras av epitelet.
Här beskriver vi ett protokoll för riktad differentiering av hiPSCs till tredimensionella (3D) hela lungorganoider (WLO). Medan det finns liknande metoder som införlivar isolering av lungprogenitorceller via sortering på LPC-stadiet för att göra alveolarliknande 14,15 (distala) organoider eller luftvägsceller16 (proximala) organoider, eller generera ventral-främre foregut-sfäroider för att göra mänskliga lungorganoider som uttrycker alveolarcell- och mesenkymala markörer och knoppspetsprogenitororganoider17 , styrkan i denna metod är införandet av både lung epitelial och mesenchymal celltyper att mönster och orkestrera lunggrenande morfogogenes, mognad och expansion in vitro.
Detta protokoll använder små molekyler och tillväxtfaktorer för att styra differentiering av pluripotenta stamceller genom slutgiltig endoderm, främre foregut endoderm och lung stamceller. Dessa celler induceras sedan till 3D hela lungorganoider genom viktiga utvecklingssteg, inklusive förgrening och mognad. Sammanfattningen av differentieringsprotokollet visas i figur 1a med representativa brightfieldbilder av endodermal och organoid differentiering som visas i figur 1b. Figur 1c,d visar genuttryck detaljer om endodermal differentiering samt genuttryck av både proximala och distala populationer av lung epitelial celler efter avslutad differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta studieprotokoll godkändes av Institutional Review Board för UCSD:s human research protections program (181180).
1. Definitiv endoderminduktion från inducerade pluripotenta stamceller (dag 1 - 3)
- Tina långsamt tillväxtfaktor reducerat (GFR)-källarmembran (BM) matrismedium på is 30 minuter före användning. Vid kall DMEM/F12, späd GFR BM matrismedium 1:1 så att det utgör 50% av detta medium. Placera P1000 pipettspetsar i frysen för att kyla före användning.
- Täck varje brunn på en 12-brunnsplatta med 500 μL 50% GFR-källarmembranmatrismedium som framställs i iskall DMEM/F12. När önskat antal brunnar är belagda, ta bort eventuell överflödig mediumblandning och/eller bubblor från brunnar och placera plattan på is eller kylskåp vid 4 °C i 20 minuter för att ställa in. Flytta sedan plattan till inkubatorn vid 37 °C över natten för att gel och torka.
- När hiPSCs når 70-90% confluency, tillsätt 10 μM Rho-associerade kinashämmare (ROCK) Inhibitor Y-27632 en timme före dissociation. Aspirera av mediet och tvätta en gång med Fosfat buffrad saltlösning (PBS). Dissociera hiPSCs genom att tillsätta cellavlossningsmedel (0,5 ml/ brunn på en 12-välplatta) och inkubera i 20 min vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- Ta bort plattor från inkubatorn och tillsätt 0,5 ml/12-brunn av stamcells passaging medium (tabell 1) till brunnarna; triturera försiktigt celler med en P1000-spets för att få encellig suspension. Överför dissocierade celler till ett koniskt centrifugrör på 15 ml. centrifug i 5 min vid 300 x g.
- Aspirera av mediet och återsuspend cellpelleten med 1 ml mTeSR Plus media kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare (Y-27632). Utför ett cellantal. Tillsätt 2,0 x 105 hiPSCs i 1 ml mTeSR kompletterat med ROCK Inhibitor Y-27632 per brunn av en 12-väl GFR-källare membran mediumbelagd platta. Inkubera vid 37 °C över natten.
OBS: Cellutsäde måste optimeras per cellinje. 24 h efter plätering bör brunnar vara 50-70% sammanflöde. - På dag 1 aspirera av mTeSR Plus och tillsätt Definitive Endoderm (DE) induktionsmedium (tabell 1) kompletterat med 100 ng/ml human aktivin A och 5 μM GSK3β inhibitor/Wnt aktivator CHIR99021.
OBS: DE-media med GSK3β-hämmare/Wnt aktivator CHIR99021 ska avlägsnas inom 20-24 h dag 1 DE-induktion för framgångsrik differentiering. - På dag 2 och dag 3, ändra till DE induktionsmedia kompletteras med 100 ng/mL aktivin A endast.
OBS: DE-differentiering bör inte överstiga totalt 72 h, annars kommer effekten att minska. På dag 4, om stora celldöd observeras, minska den totala DE-mediaexponeringstiden med 6-12 h. - För att analysera DE-effektiviteten, bekräfta mer än 90% CXCR4 och/eller cKit uttryck via flödescytometri eller immunofluorescensanalys av FOXA2 och/eller SOX17 (figur 2a).
2. Främre foregut endoderm (AFE) induktion (dag 4 - 6)
- På dag 4, byt media till serumfritt basalt medium (SFBM) (tabell 1) kompletterat med 10 μM SB431542 och 2 μM Dorsomorphin för AFE induktion. Byt AFE-media dagligen i 3 dagar (dag 4, dag 5 och dag 6).
- För att analysera AFE-effektiviteten, bekräfta robust uttryck för SOX2, TBX1 och FOXA2 via immunofluorescensfärgning (figur 2b).
3. Lungprogenitorcell (LPC) differentiering (Dag 7 - 16)
- På dag 7 tinar GFR-källaren membranmatrismedium på is. Aspirera av AFE-media och tvätta väl med 1x PBS. Tillsätt 1 ml cellavlossningslösning och inkubera i 10 min vid 37 °C.
- Tillsätt 1 ml släckmedel (2% FBS i DMEM/F12) till brunnarna som innehåller cellavlossningslösning. Håll cellerna som aggregat genom att försiktigt pipettera upp och ner. Se till att alla celler lossas och överförs till ett koniskt centrifugrör på 15 mL. Centrifugera i 5 min vid 300 x g.
- Ta bort supernatanten och återsuspend cellpelleten i släckmedel kompletterat med 10 ng/ml humant rekombinant benmorfogent protein-4 (BMP4), 0,1 μM all-trans retinsyra (RA), 3 μM GSK3β-hämmare/Wnt aktivator CHIR99021 och 10 μM av berghämmare Y- 26.
- Utför ett cellantal. Tillsätt 2,5 x 105 celler till 100 μL kallt GFR-källarmembranmatrismedium, blanda väl och placera droppen i en brunn på en 12-välplatta. Inkubera plattan vid 37 °C i 30-60 min så att mediet kan polymeriseras. Tillsätt 1 ml LPC-media kompletterat med 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 per brunn, vilket säkerställer att den medelstora droppen är helt nedsänkt och inkuberar vid 37 °C över natten.
- På dag 8, 24 h efter LPC-induktion, byt LPC medium för att ta bort ROCK Inhibitor Y-27632. Byt LPC-medium varannan dag i totalt 9-11 dagar.
OBS: Om mediet blir gult inom 24 timmar, byt medium varje dag. - För att analysera LPC-effektiviteten, bekräfta robust uttryck för den intracellulära transkriptionsfaktorn NKX2-1 eller utför flödescytometri för ytmarkörer CD47hi/CD26low15 eller CPM18 (figur 2c). Grovt bör LPC-sfäroiderna vara runda och transparenta (figur 2c).
OBS: Fortsätt inte med lungorganoid differentiering om effektiviteten hos NKX2-1 är under 30%.
4.3D lungorganoid induktion (dag 16 - 22)
- På dag 17 tinar GFR-källare membranmatris medium på is. Aspirera LPC-induktionsmediet. Tillsätt sedan 2 μg/ml dispase (1 ml) till brunnen och återanvänd medium/dispase-blandningen med en P1000-pipett. Inkubera vid 37 °C i 15 min. Triturera blandningen igen och inkubera vid 37 °C i ytterligare 15 min.
- Överför dispase och celler till ett 15 ml koniskt centrifugrör. Använd kyld PBS (2-3 ml) för att tvätta brunnen och återanvända dispase/cellblandningen. Centrifugera i 5 min vid 400 x g. Ta bort supernatanten manuellt och var försiktig så att du inte distuberar medie-/cellpelletskiktet. Upprepa den kylda PBS-tvätten och centrifugera det koniska centrifugröret i ytterligare 5 minuter vid 400 x g.
- Ta bort supernatanten manuellt och tillsätt sedan 2 ml trypsinbaserad dissociationslösning till det koniska centrifugröret. Inkubera vid 37 °C i 12 min.
- Efter inkubation, återanvänd celler med en P1000 pipettspets. Tillsätt sedan en lika stor mängd släckmedel till det koniska centrifugröret och snurra ner vid 400 x g i 5 min. Aspirera supernatant- och resuspendcellerna i släckmedel + 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632.
OBS: Framgångsrik lungorganoidinduktion sker när celler bäddas in som aggregat, inte enstaka celler, justera pipettering i enlighet därmed. - Utför ett cellantal. Beräkna den volym som behövs för att erhålla 5,0-8,0 x 104 celler per brunn. Aliquot LPC-cellaggregaten i 1,5 ml mikrocentrifugerör och centrifug i 5 min vid 400 x g. Ta bort överflödig supernatant, var försiktig så att du inte agiterar cellpelleten. Lämna endast 10 μL restmedium.
- Suspendera cellpelleten i 200 μL kallt GFR-källarmembranmatrismedium och lägg till cellodlingsmembraninsatser (6,5 mm diameter, 0,4 μm por, polyestermembran). Inkubera plattan vid 37 °C i 30-60 min för att GFR-källarmembranmatrismedium ska kunna polymeriseras.
- Tillsätt 1 ml 3D-organoidinduktionsmedel (tabell 1) kompletterat med fibroblasttillväxtfaktor-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), GSK3β-hämmare/Wnt aktivator CHIR (3 μM), epidermal tillväxtfaktor (EGF) (10 ng/mL) och 10 μM ROCK Inhibitor Y-27. Byt medium varannan dag i 6 dagar.
5.3D Lungorganoid förgrening (Dag 23 - 28)
- På dag 23 förändring till 3D förgreningsmedium (tabell 1) kompletterat med FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), GSK3β-hämmare/Wnt aktivator CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) och vaskulär endothelial tillväxtfaktor (VEGF) / moderkakan( 10 ng/mL) och vaskulär endothelial tillväxtfaktor (VEGF) / moderkakan( PlGF) / moderkakan( plgf). Byt medium varannan dag i 6 dagar.
OBS: På dag 6 av 3D-förgrening differentiering bör det finnas flera förgrenande organoider (figur 2).
6.3D lungorganoid mognad (Dag 29 - 34)
- På dag 29, byt till 3D-mognadsmedel (tabell 1), vilket är detsamma som 3D-förgreningsmedium men med tillsats av dexametason (50 nM), cAMP (100 μM) och 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), en fosfodiesterashämmare även kallat isobutylxanthine (100 μM). Byt medium varannan dag i 6 dagar.
OBS: Inom 24 timmar efter 3D-mognad bör de förgrenande organoiderna expandera och förändras till genomskinliga sfärer.
7.3D Lungorganoid immunocytokemi
- För 3D hela lungorganoid analys, fixa GFR-källare membranmatris medium i membranet insatser med 4% paraformaldehyd (PFA) för 1 h vid 4 °C. Bädda in i paraffinvax och montera på diabilder enligt standardpublicerade protokoll.
- Utför antigenhämtning före färgning. Luftvägsmarkörer inkluderar KRT5, MUC5AC och SCGB3A2. Alveolar markörer inkluderar SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 och HOPX (bild 3).
8. Avlägsnande av hela lungorganoider från GFR-källare membranmatris medium för passage, FACS eller kryopreservation
- För att separera organoiderna från GFR-källarmembranmatrismediet, ta bort media från basalkammaren och tillsätt 2 μg/ml dispase (1 ml) i den apikala kammaren.
- Triturera försiktigt medium /dispase-blandningen med en P1000-pipett och placera i inkubatorn i 15 min. Triturera försiktigt blandningen igen och inkubera i ytterligare 15 min.
- Tillsätt 1 ml kyld PBS (4 °C) och överför organoider med matrismediet till ett koniskt centrifugrör på 15 mL. Snurra vid 400 x g i 5 min. Ta bort supernatanten försiktigt, för att inte störa cellpelleten.
- Tvätta en gång till med 1 ml kyld PBS och snurra ner vid 400 x g i 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten för att inte störa medium/cellblandningen.
- Tillsätt 1 ml cellavlossningslösning till det koniska centrifugröret, triturera försiktigt GFR-Basement membranmatrisens medium/cellblandning. Placera i inkubatorn i 12 min för passaging celler som aggregat eller för cryopreservation), eller 20 min för encellig suspension.
- Lägg till lika stor volym av släckmedel och snurra ner vid 400 x g i 5 min. Resuspend i släckmedel + 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632.
OBS: I detta steg bör inget restkällarmembranmedium ses i röret. Om restmediet återstår, upprepa steg 8.5 och 8.6. - Utför ett cellantal. Beräkna den volym som behövs för nedströms program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 timmar efter plätering, dag 1, bör iPSCs vara 50%-90% confluent. På dag 2 bör DE vara 90%-95% sammanflöde. Under DE-induktion är det vanligt att observera betydande celldöd på dag 4 men bifogade celler kommer att behålla en kompakt kullerstensmorfologi (figur 2b). Avbryt differentiering om majoriteten av vidhäftande celler lossnar och överväger att förkorta exponeringen för DE-media med aktivin A med 6-12 h. Under AFE-induktion är celldöden minimal, och cellerna förblir vidhäftande, men kommer att verka mindre och mer heterogena. Passaging cellerna på dag 7 får endast göras om utbytet av dubbla positiva SOX2 och FOXA2 är >80%. Efter att ha passat in i källarmembranmatris för 3D LPC-induktion kommer små sfäroider först att dyka upp, sedan växa och vissa kan börja förgrena sig. Genuttrycksprofiler för framgångsrik endodermal differentiering inkluderar ökad SOX17 vid DE, ökad FOXA2 och SOX2 med minskande SOX17 och det första utseendet på NKX2-1, och ökad NKX2-1, tillsammans med närvaron av SOX2 och FOXA2. I överensstämmelse med tidig embryonal utveckling sker ventralisering av AFE för lungknopputveckling (NKX2-1+) och dorsalisering av AFE sker för gastrointestinal utveckling (SOX2+). Kulturer på LPC kommer att ha en blandning av både lung- och magprogenitorer.
Lungorganoid induktion från LPC har utförts med olika metoder. Vissa grupper sorterar cellerna med NKX2-1 fluorescerande reportrar eller en ytantigenproxy (CPM, CD26lowCD47high). Men dessa lungorganoider innehåller alveolar typ II som celler utan alveolar typ I-celler eller mesenkym. Andra grupper har samlat cellklumpar som knoppar av AFE / LPC-monolagret och inbäddat dem i källarmembranmatrisen. Dessa organoider innehåller en blandad population av lung epitelial och mesenchymal celler men tar månader att kultur19. Vårt protokoll omfattar både förekomst av epitelial och mesenkymala celler. WLOs uttrycker proximal epitelial cell markörer p63 och KRT5 (basala celler) och SCGB3A2 (klubbceller) samt distala epitelial cell markörer HOPX (ATI) och proSPC, SPB och NKX2-1 (ATII). De uttrycker också den mesenkymala markören Vimentin på LPC-stadiet, liksom i hela lungorganoiderna. PDGFRα är en markör för fibroblaster som har en viktig funktion i lungan under sacculation och alveolarization20 och uttrycks tillsammans med transkriptionsfaktorn som är viktig vid distala celldifferentiering, SOX9 (figur 3).
Vår metod genererar effektivt NKX2-1-uttrycka LPC 3D kulturer med hjälp av signalmolekyler som förekommer i fetala lungutveckling för att bilda tidiga lungorganoider. När du passar LPCs i GFR-källare membranmatris medium för lungorganoid induktion, är det absolut nödvändigt att inte över-dissociera i en enda cell suspension, men att istället behålla små klumpar av celler (10 celler /klump). Cellräkning kommer inte att vara helt korrekt, men fortfarande nödvändigt för att undvika överflöde under 3-veckors lungorganoid differentiering.
Lungorganoid induktion bör ge små, förgrenande organoider dag 6 av induktion (dag 23 av differentiering). Dessa bör fortsätta att växa under organoid förgreningssteget och mognadssteget. Tjugofyra timmar efter införandet av dexametason, cAMP och IBMX bör grenarna expandera till transparenta sfärer. Hela lungorganoid analys kan utföras i slutet av differentieringen, eller WLOs kan passera in i färsk källare membran matris med GFR eller cryopreserved genom frysning ner i 10% DMSO.
Figur 1: Övergripande schematisk av hela lungorganoid (WLO) differentiering från hiPSCs och representativa data. a) Schematic av WLO differentiering från hiPSCs. Cirklar representerar endodermal celltyp med identifierande markörer. Differentieringslinjen anges i svarta staplar. Tillväxtfaktorer och/eller små molekyler för induktion av endodermala och lungorganoida populationer. Sammanfattningsvis differentieras stamceller till slutgiltig endoderm, främre foregut endoderm och i lungprogenitorceller på cirka 16 dagar. Dessa celler passage sedan in i GFR-källare membran matris medium som innehåller medelstora insatser och genomgår lung organoid induktion, förgrening och mognad. Den totala differentieringen tar cirka 35 dagar. b) Representativa faskontrastbilder av cellerna i större endodermala stadier och 3D-bilder av hela lungorganoider. Skala stapelstorlek enligt vad som anges på panelen. c) qRT-PCR-analys av lungutvecklingsmarkörer under endoderm och d) hel lungorganoid differentiering av proximala och distala cellmarkörer. Alla data representerar i genomsnitt 3-5 biologiska replikat. Felstaplar representerar standardfel i medelvärdet och normaliseras till aktin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Karakterisering av endoderm differentiering genom flöde cytometri och immunocytochemistry. (a) Flöde cytometri av slutgiltig endoderm markör CXCR4. Vänster panel visar gating mot den oförstörda befolkningen medan mittenpanelen visar CXCR4 positiv befolkning. Den högra panelen visar immunocytokemi bild av SOX17 (röd) överlagrad med atomkärnor (blå). b) Immunocytokemi bild av AFE markörer FOXA2 och SOX2 överlagrad med atomkärnor (blå). c) Endogent uttryck av NKX2-1-GFP i en reporter cellinje i 3D LPC. Bilder tagna från livecellskultur i brightfield och GFP. Flöde cytometri av lung stamfader intracellulär markör NKX2-1 efter fixering och permeabilization. Skala stapelstorlek = 50 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Karakterisering av 3D hela lungorganoider efter 3 veckors differentiering genom immunocytokemi. a) Proximala lungmarkörer. Vänster panel visar SOX2 (vit) och SOX9 (röd) överlagrad av kärnor (blå). Dessa markörer är viktiga i förgrena morfogenes och representerar proximal och distala epitelpopulationer. Mellanpaneler visar P63 (röd) och KRT5 (röd), båda markörer för basala celler. Den högra panelen visar SCGB3A2, en markör för klubbceller. b) Distala lungmarkörer. Den vänstra panelen visar pro-SPC (PSPC), (grön) och HOPX (röd), markörer för alveolar typ II ad I-celler, överlagrade med kärnor (blå). På den mellersta panelen visas pro-SPC (PSPC) (grön) och SPB (röd), markörer för alveolar typ II-celler, överlagrade med kärnor (blå). Den högra panelen visar NKX2-1 (röd) och ZO1 (grön) överlagrad med kärnor (blå). c) Markörer för lungmesenkym. Vänster panel visar PDGFRA (röd) och SOX9 (vit), som representerar distala mesenchyme. Höger panel visar Vimentin (röd), som är spridd över hela lungan. Skala stapelstorlek = 50 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| REAGENSER OCH LÖSNINGAR - För företagsnamn, se listan över materialförteckningar |
| 3D-organoid induktionsmedium (dag 17-22) |
| Serumfritt basalt medium (se recept) kompletterat med: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Fonden (10 ng/ml) |
| 3D-organoid förgreningsmedium (dag 23-28) |
| Serumfritt basalt medium (se recept) kompletterat med: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| All-trans retinsyra (0,1 μM) |
| Fonden (10 ng/ml) |
| VEGF/PIGF (10 ng/mL) |
| 3D organoid mognadsmedel (dag 29-34) |
| Serumfritt basalt medium (se recept) kompletterat med: |
| Dexametason (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| AFE induktionsmedium (dag 4-6) |
| Serumfritt basalt medium (se recept) kompletterat med: |
| SB431542 (10 μM) |
| Dorsomorphin (2 μM) |
| DE-induktionsmedium (dag 1-3) |
| 48,5 mL RPMI1640 + Glutamax |
| 1 ml B27 utan retinsyra |
| 500 μl HEPES (1 %) |
| 500 μl penna/strep |
| Mänsklig aktivin A (100 ng/mL) |
| CHIR99021 (5 μM) - endast under de första 24 timmarna |
| LPC induktionsmedium (dag 7-16) |
| Serumfritt basalt medium (se recept) kompletterat med: |
| BMP4 (10 ng/mL) |
| All-trans retinsyra (RA) (0,1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Släckmedel |
| 49 ml DMEM/F12 |
| 1 ml FBS |
| Serumfritt basalt medium (SFBM) |
| 375 mL Iscoves modifierade Dulbecco's Medium (IMDM) + Glutamax |
| 125 mL Hams F12 |
| 5 ml B27 utan retinsyra |
| 2,5 ml N2 |
| 500 μl askorbinsyra, 50 mg/ml |
| 13 μl monotioglycerol/1 ml IMDM" använd 300ul av 0,4 mM monotioglycerol per 100 ml serumfritt medium |
| 3,75 ml bovint serumalbumin (BSA) Fraction V, 7,5% lösning |
| 500 μl penna/strep |
| Stamcells passaging medium (dag 0) |
| 500 ml DMEM/F12 |
| 129 ml Knockout serum ersättning (KSR) |
| 6,5 ml Glutamax |
| 6,5 mL NEAA |
| 1.3 mL 2-mercaptoethanol |
| 6,5 ml penna/strep |
Tabell 1: Medietabell.
| Problem | Lösning |
| DE-differentiering inte effektiv | 24 timmar efter plätering i stamcellsmedium ska cellerna vara 50-70% konfluent |
| GSK3β-hämmaren/Wnt-aktivatorn CHIR99021 ska avlägsnas inom 20-24 timmar från dag 1 DE-induktion | |
| DE-differentiering bör inte överstiga totalt 72 timmar | |
| AFE-differentiering inte effektiv | Se till att DE-differentiering lyckades och cellerna uttrycker > 80% CXCR4 |
| Se till att nya tillväxtfaktorer/små molekyler läggs till i media dagligen | |
| LPC-differentiering inte effektiv | Se till att AFE-differentieringen lyckades och cellerna uttrycker > 80% FOXA2/SOX2 |
| Se till att AFE-cellerna är passagede som aggregat av 4-10 celler och inte encelliga | |
| 3D-lungorganoider växer inte eller differentierar | Se till att LPC-differentreringen lyckades och att cellerna uttrycker > 30% NKX2-1 |
| Se till att LPC:erna var passagede som aggregat av 4-10 celler och inte encelliga | |
| Se till att det inte finns någon kvarvarande matrigel från LPCs under passaging | |
| Lägg till ROCK Inhibitor Y-27632 med varje mediebyte | |
| Se till att mediet ändras i tid och att nya tillväxtfaktorer/små molekyler tillsätts | |
| Se till att koncentrationen av tillväxtfaktorer/små molekyler är korrekt |
Tabell 2: Felsökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den framgångsrika differentieringen av 3D hela lungorganoider (WLO) förlitar sig på ett 6-veckors protokoll i flera steg med uppmärksamhet på detaljer, inklusive tid för exponering för tillväxtfaktorer och små molekyler, cellulär densitet efter passaging och kvaliteten på hiPSCs. Felsökning finns i tabell 2. hiPSCs bör vara cirka 70-80% confluent, med mindre än 5% spontan differentiering före dissociation. Detta protokoll kräver "mTeSR plus" medium; Emellertid, vanliga "mTeSR" medium har också använts med jämförbara resultat och är billigare. För den extracellulära matrisen använder vi GFR källarmembranmatrismedium. Vi passager hiPSCs med ReLesR (se tabell över material) för att minska differentiering.
Under endoderm differentiering bör cellerna visualiseras dagligen före och efter mediaförändringar. Specificerade tillväxtfaktorer/små molekyler bör tillsättas färska dagligen till basmediet för att förhindra för tidig nedbrytning. Celldöd i slutgiltig endoderm (DE) är vanligt men bör begränsas under främre foregut endoderm (AFE) och lungprogenitor cell (LPC) induktion. Om det finns en stor dö av på den tredje dagen av DE (dag 4), minska den totala tiden för DE med 6-12 h. Nya iPSC-cellinjer kan behöva optimeras för framgångsrik endoderm differentiering. Utför flödescytometri vid DE för CXCR4 för att bekräfta framgångsrik induktion (>85% CXCR4 + celler). Cellerna ska vara relativt stabila vid AFE och kommer att förändras morfologiskt med lite avdärning.
Passaging till LPC är en annan process som måste optimeras för celltyp. Omplattor av celler med för låg densitet (<50%) resulterar i ineffektiv differentiering. Bekräfta framgångsrik LPC-induktion med immunocytokemi för NKX2-1 eller flödescytometri för CPM18 eller CD26low/CD47high15. Framgångsrik LPC induktion måste ha >40% NKX2-1, annars organoiderna kommer att ha större överflöd av dorsala AFE. För LPC-induktion måste tillväxtfaktorer läggas till i basmediet vid varje medieförändring. Om mediet blir gult senare i LPC-induktion bör du överväga att öka volymen av nya medier eller byta media varje dag. Under 3D hela lung organoid induktion, plätering antal och upprätthålla cell kluster är nyckeln till framgångsrika organoid tillväxt. GFR-källare membranmatris medium är svårt att hantera och mycket temperaturkänsligt, så håll det alltid på is. Om GFR-källaren membranmatris medium geler för tidigt, kommer LPC-cellerna inte att integreras i den. Vi rekommenderar att du tinar 1 ml alikvoter GFR-källare membranmatris medium på is 30 min före passaging. När cellerna/klustren har räknats och lämpliga alikvoter har gjorts, placera cellpelleten på is. Vi föreslår att förbereda plattor, märkning och tillägg av cell kultur membran insatser före GFR-källare membran matris medium hantering.
Använd pipettspetsar för att omedelbart lägga till korrekt volym av flytande GFR-källarmembranmatrismedium till cellpellet, som håller på is. Pipettera upp och ner snabbt men försiktigt (nyanserad hantering) för att inte införa bubblor och placera sedan röret tillbaka på is. Tillsätt cellen och GFR-källaren membranmatris mediumblandningen till den apikala delen av transwell i beredda plattor. Blandningen ska sprida och täcka hela transwell; luta plattan försiktigt för att säkerställa beläggning. Efter gelering i inkubatorn i 30-60 min bör det finnas synliga cellkluster i GFR-källarens membranmatrismedium. Tillsätt lämpliga lunginduktionsmedier till basalkammaren kompletterad med 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 och övervaka organoidtillväxt varannan dag.
Framtida tillämpningar av de organoider som genereras av detta protokoll inkluderar studier av de molekylära vägarna som styr tidiga lunglinjeåtagande och cell ödesspecifikation21,22,23. Interaktionen mellan epitel och mesenchyme kan bestämmas genom att använda gen knock out modeller24. Organoider kan också samkultureras med endotel celler för att bestämma vikten av vävnad specifika co-mönster signalering mellan lung epitel, mesenchyme och endotel25. Lungutveckling sker parallellt med vaskulär utveckling och det förhållandet kan framkalla viktiga molekylära mekanismer som är nödvändiga för korrekt lungutveckling. Vi har också visat att hela dessa lungorganoider är funktionella genom tensid utsöndring analyser efter GFR-källare membran matris medium togs bort följt av kortsiktig kultur i ultra-låg fastsättning brunnar26. Andra strategier inkluderar sortering av cellerna för cellytans markörer som NGFR (basalceller)27 och HTII-280 (ATII-celler)28 och ersätta dem som homogena organoider eller ett monoskikt i luftvätske interfaskulturförhållanden. Hela, proximala och distala lungorganoider har också använts för att studera cellulära mål och patofysiologi av SARS-CoV-2 virusinfektion för att bättre förstå och screena för läkemedel som kan bekämpa COVID-19.
Detta protokoll är robust och reproducerbart, men det finns fortfarande många utmaningar. Många olika iPSC- och ESC-linjer har testats (>20-linjer) men protokollet måste optimeras för varje cellinje. Trots robust DE- och AFE-induktion kan LPC-induktion vara svårt att uppnå >40% av NKX2-1 + celler. Andra protokoll inkluderar ett sorteringssteg för ytmarkörer av NKX2-1 celler15,18, men de ger bara alveolar typ II som organoider utan mesenchyme och innehåller fortfarande mag- och levercellpopulationer trots att de renar lungprogenitorpopulationen29. Vi har också noterat en liten mängd mag- och leverceller i både LPC och hela lungorganoider, möjligen på grund av förekomsten av dorsala främre foregut celler förorenar LPCs. Därför har differentieringen av rena lungorganoider ännu inte uppnåtts, och mer forskning om utvecklingen av lungprogenitorcellerna i mänsklig vävnad måste slutföras. Nedströmsanalyser måste starkt jämföras med gen- och proteinuttryck från primär mänsklig lungvävnad. Medan den hittills mest fruktbara användningen av lungorganoider har varit i modellering av sjukdomar och screening för läkemedel in vitro, har transplantation av hiPSC-härledda lungorganoider till patienter för regenerativ medicin övervägts som en framtida terapi för en rad villkor. Innan sådana ingrepp övervägs måste dock en hel del kvalitetskontroll förbättras, inklusive identifiering och avlägsnande av kontaminerande, oönskade, potentiellt tumörogena hiPSC-derivat. Dessutom måste bättre funktionella analyser in vitro och bättre djurmodeller av lungsjukdom fortfarande utvecklas.
Specifikt måste funktionaliteten och säkerheten hos hiPSC-härledda celler bekräftas. Odifferentierade celler måste uteslutas eftersom de har kapacitet att generera teratomas. En metod för att bestämma odifferentierade stamceller i slutgiltig endoderm är att sortera ut cellerna med hjälp av pluripotency markören SSEA4. Markör gener för odifferentierade hiPSCs upptäcktes nyligen med hjälp av encelliga RNA sekvensering30. ESRG, CNMD och SFRP2 kan användas för att validera odifferentierade celler i alla differentieringssteg. När renhet bekräftas, fördelen med autolog iPSC härledda terapier är förmågan för de transplanterade cellerna att undvika avstötning eftersom de kommer från patientens egna celler. Nackdelarna inkluderar den tid det tar att helt differentiera cellerna, genomgå rigorösa kliniska tester och transplantera cellerna till en patient med en akut skada (respiratoriskt nödsyndrom, hjärtinfarkt eller ryggradsskada). Alternativet är att använda bankade allogena iPSC-härledda celler31. Dessa kan lagras och lätt tillgängliga för patienter med humant leukocytantigen (HLA) matchade donatorer och de kommer att ha genomgått noggranna tester för kontaminering. Den största nackdelen är möjligheten till immunavstötning. Immunsuppression kan vara nödvändigt vid allogen celltransplantation, vilket är den nuvarande verkligheten för allogena hela vävnadstransplantationer. Strategier utarbetas för att göra det möjligt för de allogena iPSC härledda cellerna att undvika immunsvaret för att säkert transplantera dem till patienter32.
Så småningom kommer iPSC-härledda hela lungorganoider att användas för att studera patientspecifika sjukdomsmodeller, skräddarsy terapier och förbättra regenerativ medicinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
