Summary
Der Artikel beschreibt die schrittweise gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu dreidimensionalen ganzen Lungenorganoiden, die sowohl proximale als auch distale epitheliale Lungenzellen zusammen mit Mesenchym enthalten.
Abstract
Die Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Lunge war aufgrund des Mangels an biologisch relevanten In-vitro-Modellsystemen schwer zu untersuchen. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) können schrittweise in mehrzellige 3D-Lungenorganoide differenziert werden, die sowohl aus epithelialen als auch aus mesenchymalen Zellpopulationen bestehen. Wir rekapitulieren embryonale Entwicklungssignale, indem wir zeitlich eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen einführen, um effizient definitive Endoderm-, anteriore Vorderdarm-Endoderm- und anschließend Lungen-Vorläuferzellen zu erzeugen. Diese Zellen werden dann in ein wachstumsfaktorreduziertes (GFR)-Basalmembranmatrixmedium eingebettet, so dass sie sich als Reaktion auf externe Wachstumsfaktoren spontan zu 3D-Lungenorganoiden entwickeln können. Diese ganzen Lungenorganoide (WLO) durchlaufen frühe Entwicklungsstadien der Lunge, einschließlich verzweigter Morphogenese und Reifung nach Exposition gegenüber Dexamethason, zyklischem AMP und Isobutylxanthin. WLOs besitzen Atemwegsepithelzellen, die die Marker KRT5 (basal), SCGB3A2 (Club) und MUC5AC (Kelch) exprimieren, sowie alveoläre Epithelzellen, die HOPX (alveolarer Typ I) und SP-C (alveolarer Typ II) exprimieren. Mesenchymalzellen sind ebenfalls vorhanden, einschließlich Aktin der glatten Muskulatur (SMA) und des von Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors A (PDGFRα). iPSC-abgeleitete WLOs können unter 3D-Kulturbedingungen für viele Monate aufbewahrt und nach Oberflächenmarkern sortiert werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu reinigen. iPSC-abgeleitete WLOs können auch verwendet werden, um die menschliche Lungenentwicklung zu untersuchen, einschließlich der Signalübertragung zwischen dem Lungenepithel und dem Mesenchym, um genetische Mutationen auf die Funktion und Entwicklung menschlicher Lungenzellen zu modellieren und die Zytotoxizität von Infektionserregern zu bestimmen.
Introduction
Die Lunge ist ein kompliziertes, heterogenes, dynamisches Organ, das sich in sechs verschiedenen Stadien entwickelt - embryonaler, pseudoglandulärer, kanalikulärer, sackulärer, alveolärer und mikrovaskulärer Reifung1,2. Die beiden letztgenannten Phasen treten prä- und postnatal in der menschlichen Entwicklung auf, während die ersten vier Phasen ausschließlich während der fetalen Entwicklung auftreten, es sei denn, es tritt eine Frühgeburt auf3. Die embryonale Phase beginnt in der endodermalen Keimschicht und endet mit dem Austrieb der Luftröhre und der Lungenknospen. Die Lungenentwicklung erfolgt zum Teil über die Signalübertragung zwischen den Epithel- und Mesenchymzellen4. Diese Wechselwirkungen führen zu Lungenverzweigung, Proliferation, Bestimmung des zellulären Schicksals und zellulärer Differenzierung der sich entwickelnden Lunge. Die Lunge ist in leitende Zonen (Luftröhre zu den terminalen Bronchiolen) und Atemzonen (respiratorische Bronchiolen zu den Alveolen) unterteilt. Jede Zone enthält einzigartige Epithelzelltypen; einschließlich basaler, sekretorischer, flimmerförmiger, Bürsten-, neuroendokriner und Ionozytenzellen im leitenden Atemweg5, gefolgt von alveolären Typ-I- und -II-Zellen im respiratorischen Epithel6. Über die Entstehung und Reaktion auf Verletzungen der verschiedenen Zelltypen ist noch viel unbekannt. iPSC-abgeleitete Lungenorganoidmodelle ermöglichen die Untersuchung von Mechanismen, die die Entwicklung der menschlichen Lunge vorantreiben, der Auswirkungen genetischer Mutationen auf die Lungenfunktion und der Reaktion sowohl des Epithels als auch des Mesenchyms auf Infektionserreger, ohne dass primäres menschliches Lungengewebe erforderlich ist.
Zu den Markern, die den verschiedenen Stadien der embryonalen Differenzierung entsprechen, gehören CXCR4, cKit, FOXA2 und SOX17 für das definitive Endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 und SOX2 für das vordere Vorderdarmendoderm (AFE)8 und NKX2-1 für frühe Lungenvorläuferzellen9. Bei der embryonalen Lungenentwicklung teilt sich der Vorderdarm in die dorsale Speiseröhre und die ventrale Luftröhre. Die Knospen der rechten und linken Lunge erscheinen als zwei unabhängige Ausscheidungen um die Trachealknospe10. Während der Verzweigung der Morphogenese produziert das Mesenchym, das das Epithel umgibt, elastisches Gewebe, glatte Muskulatur, Knorpel und Gefäßkulatur11. Die Wechselwirkung zwischen Epithel und Mesenchym ist essentiell für eine normale Lungenentwicklung. Dazu gehört die Sekretion von FGF1012 durch das Mesenchym und SHH13, das vom Epithel produziert wird.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gerichteten Differenzierung von hiPS-Zellen in dreidimensionale (3D) ganze Lungenorganoide (WLO). Während es ähnliche Ansätze gibt, die die Isolierung von Lungenvorläuferzellen durch Sortierung im LPC-Stadium beinhalten, um alveolär-ähnliche 14,15 (distale) Organoide oder Atemwege16 (proximale) Organoide herzustellen oder ventral-anteriore Vorderdarm-Sphäroide zu erzeugen, um menschliche Lungenorganoide herzustellen, die alveoläre Zell- und mesenchymale Marker und Knospenspitzen-Vorläuferorganoide exprimieren17 Die Stärke dieser Methode ist die Einbeziehung sowohl von Lungenepithel- als auch von mesenchymalen Zelltypen, um die Morphogenese, Reifung und Expansion der Lunge in vitro zu strukturieren und zu orchestrieren.
Dieses Protokoll verwendet kleine Moleküle und Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung pluripotenter Stammzellen durch definitive Endoderm-, vordere Vorderdarm-Endoderm- und Lungenvorläuferzellen zu steuern. Diese Zellen werden dann durch wichtige Entwicklungsschritte, einschließlich Verzweigung und Reifung, in 3D-Ganze Lungenorganoide induziert. Die Zusammenfassung des Differenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1a mit repräsentativen Hellfeldbildern der endodermalen und organoiden Differenzierung in Abbildung 1b dargestellt. Abbildung 1c,d zeigt die Genexpressionsdetails der endodermalen Differenzierung sowie die Genexpression sowohl der proximalen als auch der distalen Populationen von Lungenepithelzellen nach Abschluss der Differenzierung.
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Protocol
Dieses Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Human Research Protections Program der UCSD (181180) genehmigt.
1. Definitive Endoderm-Induktion aus induzierten pluripotenten Stammzellen (Tag 1 - 3)
- Langsames Auftauen des Wachstumsfaktors reduziert (GFR)-Basalmembran (BM) Matrixmedium auf Eis 30 Minuten vor Gebrauch. In kaltem DMEM/F12-Gemisch das GFR BM-Matrixmedium 1:1 so verdünnen, dass es 50% dieses Mediums ausmacht. Legen Sie die P1000-Pipettenspitzen in den Gefrierschrank, um sie vor gebrauchen zu kühlen.
- Beschichten Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 500 μL 50% GFR-Basalmembranmatrixmedium, das in eiskaltem DMEM/F12 hergestellt wurde. Sobald die gewünschte Anzahl von Vertiefungen beschichtet ist, entfernen Sie überschüssiges Mediumsgemisch und/oder Blasen aus den Vertiefungen und stellen Sie die Platte bei 4 °C für 20 minuten auf Eis oder Kühlschrank. Dann die Platte über Nacht bei 37 °C zum Gelieren und Trocknen in den Inkubator bringen.
- Sobald hiPSCs eine Konfluenz von 70-90% erreicht haben, fügen Sie eine Stunde vor der Dissoziation 10 μM Rho-assoziierten Kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632 hinzu. Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie es einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Dissoziieren Sie hiPS-Zellen durch Zugabe von Zellablösungsmedium (0,5 ml / Vertiefung einer 12-Well-Platte) und inkubieren Sie für 20 min bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator.
- Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und geben Sie 0,5 ml/12-Well Stammzell-Passaging-Medium (Tabelle 1) in die Vertiefungen; Zellen mit einer P1000-Spitze sanft verdrängen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie dissoziierte Zellen in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen; Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
- Aspirieren Sie das Medium ab und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml mTeSR Plus-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632). Führen Sie eine Zellenzählung durch. Fügen Sie 2,0 x 105 hiPSCs in 1 ml mTeSR, ergänzt mit ROCK-Inhibitor Y-27632, pro Vertiefung einer 12-Well GFR-Basement-Membran medium coated Plate hinzu. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Anzahl der Zellaussaatzellen muss pro Zelllinie optimiert werden. 24 h nach dem Plattieren sollten die Vertiefungen 50% -70% konfluent sein. - An Tag 1 das mTeSR Plus absaugen und definitive Endoderm (DE)-Induktionsmedien (Tabelle 1) hinzufügen, die mit 100 ng/ml humanem Aktivin A und 5 μM GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 ergänzt werden.
HINWEIS: DE-Medien mit GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 sollten innerhalb von 20-24 h nach Tag 1 DE-Induktion für eine erfolgreiche Differenzierung entfernt werden. - Wechseln Sie an Tag 2 und Tag 3 zu DE-Induktionsmedien, die nur mit 100 ng /ml Aktivin A ergänzt werden.
HINWEIS: Die DE-Differenzierung sollte insgesamt 72 h nicht überschreiten, da sonst die Wirksamkeit abnimmt. Wenn an Tag 4 ein Absterben großer Zellen beobachtet wird, verringern Sie die gesamte DE-Medienexpositionszeit um 6-12 h. - Um die DE-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie mehr als 90% CXCR4- und/oder cKit-Expression mittels Durchflusszytometrie oder Immunfluoreszenzanalyse von FOXA2 und/oder SOX17 (Abbildung 2a).
2. Induktion des vorderen Vorderdarmendoderms (AFE) (Tag 4 - 6)
- Wechseln Sie an Tag 4 das Medium zu serumfreiem Basalmedium (SFBM) (Tabelle 1), ergänzt mit 10 μM SB431542 und 2 μM Dorsomorphin zur AFE-Induktion. Wechseln Sie die AFE-Medien täglich für 3 Tage (Tag 4, Tag 5 und Tag 6).
- Um die AFE-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie die robuste Expression von SOX2, TBX1 und FOXA2 durch Immunfluoreszenzfärbung (Abbildung 2b).
3. Differenzierung der Lungenvorläuferzellen (LPC) (Tag 7 - 16)
- An Tag 7 das GFR-Basalmembran-Matrixmedium auf Eis auftauen. Saugen Sie das AFE-Medium ab und waschen Sie es gut mit 1x PBS. 1 ml Zellablösung zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren.
- 1 ml Abschreckmedium (2 % FBS in DMEM/F12) in die Vertiefungen geben, die Zellablösung enthalten. Halten Sie Zellen als Aggregate, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen entfernt und in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt werden. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in Quenching-Medium, ergänzt mit 10 ng/ml humanem rekombinantem knochenmorphogenem Protein-4 (BMP4), 0,1 μM All-trans-Retinsäure (RA), 3 μM GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 und 10 μM Gesteinsinhibitor Y-27632.
- Führen Sie eine Zellenzählung durch. Fügen Sie 2,5 x 105 Zellen zu 100 μL kaltem GFR-Basement-Membranmatrixmedium hinzu, mischen Sie gut und geben Sie das Tröpfchen in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Die Platte bei 37 °C für 30-60 min inkubieren, damit das Medium polymerisieren kann. Fügen Sie 1 ml LPC-Medien, ergänzt mit 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 pro Vertiefung, hinzu, um sicherzustellen, dass der mittlere Tropfen vollständig eingetaucht ist, und inkubieren Sie bei 37 ° C über Nacht.
- Wechseln Sie am Tag 8, 24 h nach der LPC-Induktion, das LPC-Medium, um den ROCK-Inhibitor Y-27632 zu entfernen. Wechseln Sie das LPC-Medium jeden zweiten Tag für insgesamt 9-11 Tage.
HINWEIS: Wenn das Medium innerhalb von 24 Stunden gelb wird, wechseln Sie das Medium jeden Tag. - Um die LPC-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie die robuste Expression des intrazellulären Transkriptionsfaktors NKX2-1 oder führen Sie eine Durchflusszytometrie für die Oberflächenmarker CD47hi/CD26low15 oder CPM18 durch (Abbildung 2c). Grob gesagt sollten die LPC-Sphäroide rund und transparent sein (Abbildung 2c).
HINWEIS: Fahren Sie nicht mit der Differenzierung der Lungenorganoide fort, wenn die Effizienz von NKX2-1 unter 30% liegt.
4.3D Lungenorganoid-Induktion (Tag 16 - 22)
- Am Tag 17 das GFR-Basalmembran-Matrixmedium auf Eis auftauen. Aspirieren Sie das LPC-Induktionsmedium. Anschließend werden 2 μg/ml Dispase (1 ml) in die Vertiefung gegeben und das Medium/Dispase-Gemisch mit einer P1000-Pipette resuspendiert. Bei 37 °C für 15 min inkubieren. Die Mischung erneut verdränken und bei 37 °C weitere 15 min inkubieren.
- Übertragen Sie die Dispase und die Zellen in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie gekühltes PBS (2-3 ml), um den Brunnen zu waschen und die Dispase / Zell-Mischung wieder zu verstopfen. Zentrifuge für 5 min bei 400 x g. Entfernen Sie den Überstand manuell und achten Sie darauf, die Medium- / Zellpelletschicht nicht zu entstuben. Wiederholen Sie die gekühlte PBS-Wäsche und zentrifugieren Sie das konische Zentrifugenröhrchen für weitere 5 minuten bei 400 x g.
- Entfernen Sie den Überstand manuell und geben Sie dann 2 ml Trypsin-basierte Dissoziationslösung in das konische Zentrifugenröhrchen. Bei 37 °C für 12 min inkubieren.
- Nach der Inkubation resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipettenspitze. Dann ein gleiches Volumen Abschreckmittel in das konische Zentrifugenröhrchen geben und bei 400 x g für 5 min herunterdrehen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in Löschmedium + 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632.
HINWEIS: Eine erfolgreiche Lungenorganoidinduktion tritt auf, wenn Zellen als Aggregate eingebettet sind, nicht einzelne Zellen, passen Sie das Pipettieren entsprechend an. - Führen Sie eine Zellenzählung durch. Berechnen Sie das Volumen, das benötigt wird, um 5,0-8,0 x 104 Zellen pro Bohrloch zu erhalten. Aliquot aggregiert die LPC-Zelle zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert für 5 min bei 400 x g. Entfernen Sie überschüssigen Überstand und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu rühren. Lassen Sie nur 10 μL Restmedien.
- Suspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL kaltem GFR-Basalmembranmatrixmedium erneut und fügen Sie sie den Zellkulturmembraneinsätzen hinzu (6,5 mm Durchmesser, 0,4 μm Pore, Polyestermembran). Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 30-60 min, damit das GFR-Basalmembranmatrixmedium polymerisieren kann.
- 1 ml 3D-Organoid-Induktionsmedium (Tabelle 1), ergänzt mit Fibroblasten-Wachstumsfaktor-7 (FGF7) (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR (3 μM), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (10 ng/ml) und 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 in die basolaterale Kammer des Membraneinsatzes geben. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.
5.3D Lungenorganoidverzweigung (Tag 23 - 28)
- Am Tag 23 Wechsel zu 3D-Verzweigungsmedium (Tabelle 1), ergänzt mit FGF7 (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/ml) und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) / Plazentawachstumsfaktor (PlGF) (10 ng/ml). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.
HINWEIS: An Tag 6 der 3D-Verzweigungsdifferenzierung sollten mehrere verzweigte Organoide vorhanden sein (Abbildung 2).
6.3D Reifung der Lungenorganoide (Tag 29 - 34)
- Wechseln Sie am Tag 29 zu einem 3D-Reifungsmedium (Tabelle 1), das mit dem 3D-Verzweigungsmedium identisch ist, jedoch mit dem Zusatz von Dexamethason (50 nM), cAMP (100 μM) und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), einem Phosphodiesterase-Inhibitor, der auch isobutylxanthin (100 μM) genannt wird. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.
HINWEIS: Innerhalb von 24 h nach der 3D-Reifung sollten sich die verzweigten Organoide ausdehnen und in transparente Kugeln übergehen.
7.3D Immunzytozytochemie des Lungenorganoids
- Für die 3D-Analyse des gesamten Lungenorganoids das GFR-Basalmembranmatrixmedium in den Membraneinsätzen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei 4 °C fixieren. In Paraffinwachs einbetten und gemäß den standardmäßig veröffentlichten Protokollen auf Objektträger montieren.
- Führen Sie vor der Färbung einen Antigenabruf durch. Zu den Atemwegsmarkierungen gehören KRT5, MUC5AC und SCGB3A2. Alveolare Marker umfassen SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 und HOPX (Abbildung 3).
8. Entfernung ganzer Lungenorganoide aus dem GFR-Basalmembranmatrixmedium für Passage, FACS oder Kryokonservierung
- Um die Organoide vom GFR-Basalmembranmatrixmedium zu dissoziieren, entfernen Sie Medien aus der Basalkammer und fügen Sie 2 μg/ml Dispase (1 ml) in die apikale Kammer hinzu.
- Das Medium/Dispase-Gemisch mit einer P1000-Pipette vorsichtig verdrängen und für 15 min in den Inkubator geben. Die Mischung noch einmal vorsichtig veredeln und weitere 15 min inkubieren.
- 1 mL gekühltes PBS (4 °C) zugeben und Organoide mit dem Matrixmedium in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen. Bei 400 x g für 5 min drehen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Zellpellet nicht zu stören.
- Noch einmal mit 1 ml gekühltem PBS waschen und bei 400 x g für 5 min herunterdrehen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Medium/Zell-Gemisch nicht zu stören.
- 1 ml Zellablösung in das konische Zentrifugenröhrchen geben, vorsichtig verdreinigen und das GFR-Basement-Membranmatrix-Medium/Zell-Gemisch vorsichtig resuspendieren. Für 12 min in den Inkubator geben, um Zellen als Aggregate oder zur Kryokonservierung zu überreichen) oder 20 min für Einzelzellsuspensionen.
- Fügen Sie das gleiche Volumen an Löschmedien hinzu und drehen Sie es bei 400 x g für 5 min herunter. Resuspend in Abschreckmedium + 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632.
HINWEIS: Bei diesem Schritt sollte kein Restmedium der Basalmembran im Rohr zu sehen sein. Wenn das Restmedium übrig bleibt, wiederholen Sie die Schritte 8.5 und 8.6. - Führen Sie eine Zellenzählung durch. Berechnen Sie das für nachgelagerte Anwendungen benötigte Volumen.
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Representative Results
24 Stunden nach dem Plattieren, Tag 1, sollten iPS-Zellen 50% -90% konfluent sein. An Tag 2 sollte DE zu 90%-95% konfluent sein. Während der DE-Induktion ist es üblich, am Tag 4 einen signifikanten Zelltod zu beobachten, aber die angeschlossenen Zellen behalten eine kompakte Kopfsteinpflastermorphologie bei (Abbildung 2b). Brechen Sie die Differenzierung ab, wenn sich die Mehrheit der adhärenten Zellen löst, und erwägen Sie, die Exposition gegenüber DE-Medien mit Activin A um 6-12 h zu verkürzen. Während der AFE-Induktion ist der Zelltod minimal und die Zellen bleiben adhärent, erscheinen aber kleiner und heterogener. Das Passieren der Zellen am Tag 7 darf nur erfolgen, wenn die Ausbeute von doppelt positivem SOX2 und FOXA2 >80% beträgt. Nach dem Übergang in die Basalmembranmatrix für die 3D-LPC-Induktion erscheinen zuerst kleine Sphäroide, wachsen dann und einige können sich verzweigen. Genexpressionsprofile für eine erfolgreiche endodermale Differenzierung umfassen erhöhtes SOX17 bei DE, erhöhtes FOXA2 und SOX2 mit abnehmendem SOX17 und dem ersten Auftreten von NKX2-1 und erhöhtem NKX2-1 zusammen mit dem Vorhandensein von SOX2 und FOXA2. Im Einklang mit der frühen Embryonalentwicklung erfolgt die Ventralisierung von AFE für die Entwicklung der Lungenknospen (NKX2-1+) und die Dorsalisierung von AFE für die gastrointestinale Entwicklung (SOX2+). Kulturen bei LPC haben eine Mischung aus Lungen- und Magenvorläufern.
Die Lungenorganoidinduktion von LPC wurde mit verschiedenen Methoden durchgeführt. Einige Gruppen sortieren die Zellen mit NKX2-1 Fluoreszenzreportern oder einem Oberflächenantigen-Proxy (CPM, CD26lowCD47high). Aber diese Lungenorganoide enthalten alveoläre Typ-II-ähnliche Zellen ohne alveoläre Typ-I-Zellen oder Mesenchym. Andere Gruppen haben Zellklumpen gesammelt, die von der AFE / LPC-Monoschicht knospen, und sie in die Basalmembranmatrix eingebettet. Diese Organoide enthalten eine gemischte Population von Lungenepithel- und mesenchymalen Zellen, brauchen aber Monate bis zur Kultivierung19. Unser Protokoll umfasst sowohl das Vorhandensein von Epithel- als auch mesenchymalen Zellen. Die WLOs exprimieren die proximalen Epithelzellmarker p63 und KRT5 (Basalzellen) und SCGB3A2 (Clubzellen) sowie die distalen Epithelzellmarker HOPX (ATI) und proSPC, SPB und NKX2-1 (ATII). Sie exprimieren auch den mesenchymalen Marker Vimentin im LPC-Stadium sowie in den gesamten Lungenorganoiden. PDGFRα ist ein Marker für Fibroblasten, die während der Sakkulation und Alveolarisation20 eine wichtige Funktion in der Lunge haben und mit dem für die distale Zelldifferenzierung wichtigen Transkriptionsfaktor SOX9 koexprimiert werden (Abbildung 3).
Unsere Methode erzeugt effizient NKX2-1-exprimierende LPC-3D-Kulturen unter Verwendung von Signalmolekülen, die in der fetalen Lungenentwicklung auftreten, um frühe Lungenorganoide zu bilden. Bei der Übertragung von LPCs in das GFR-Basalmembranmatrixmedium zur Induktion von Lungenorganoiden ist es unerlässlich, nicht in eine einzelne Zellsuspension zu dissoziieren, sondern stattdessen kleine Zellklumpen (10 Zellen / Klumpen) zurückzuhalten. Die Zellzählung wird nicht vollständig genau sein, aber immer noch notwendig, um eine Überkonfluenz während der 3-wöchigen Lungenorganoiddifferenzierung zu vermeiden.
Die Lungenorganoidinduktion sollte bis zum Tag 6 der Induktion (Tag 23 der Differenzierung) kleine, verzweigte Organoide ergeben. Diese sollten während des Organoidverzweigungsschritts und des Reifeschritts weiter wachsen. Vierundzwanzig Stunden nach der Einführung von Dexamethason, cAMP und IBMX sollten sich die Zweige zu transparenten Kugeln ausdehnen. Die Analyse des gesamten Lungenorganoids kann am Ende der Differenzierung durchgeführt werden, oder die WLOs können mit GFR in eine frische Basalmembranmatrix übergehen oder durch Einfrieren in 10% DMSO kryokonserviert werden.
Abbildung 1: Gesamtschema der Differenzierung des gesamten Lungenorganoids (WLO) von hiPS-Zellen und repräsentativen Daten. (a) Schematische Darstellung der WLO-Differenzierung von hiPS-Zellen. Kreise stellen den endodermalen Zelltyp mit identifizierenden Markern dar. Die Zeitleiste der Differenzierung ist in schwarzen Balken angezeigt. Wachstumsfaktoren und/oder kleine Moleküle zur Induktion von endodermalen und lungenorganoiden Populationen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Stammzellen in etwa 16 Tagen in ein definitives Endoderm, ein vorderes Vorderdarmendoderm und in Lungenvorläuferzellen differenziert werden. Diese Zellen werden dann in das GFR-Basalmembranmatrixmedium mit Mediumseinsätzen überführt und durchlaufen eine Lungenorganoidinduktion, Verzweigung und Reifung. Die gesamte Differenzierung dauert ca. 35 Tage. (b) Repräsentative Phasenkontrastbilder der Zellen in den wichtigsten endodermalen Stadien und 3D-Bilder ganzer Lungenorganoide. Skalieren Sie die Größe der Leiste wie im Bedienfeld angegeben. (c) qRT-PCR-Analyse von Lungenentwicklungsmarkern während des Endoderms und (d) Differenzierung des gesamten Lungenorganoids von proximalen und distalen Zellmarkern. Alle Daten stellen durchschnittlich 3-5 biologische Replikate dar. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar und werden zu Aktin normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Charakterisierung der Endodermdifferenzierung durch Durchflusszytometrie und Immunzytochemie. (a) Durchflusszytometrie des definitiven Endodermmarkers CXCR4. Das linke Feld zeigt das Gating gegen die nicht gefärbte Population, während das mittlere Feld die CXCR4-positive Population zeigt. Das rechte Feld zeigt das immunzytochemische Bild von SOX17 (rot), das mit Kernen (blau) überlagert ist. (b) Immunzytochemisches Bild der AFE-Marker FOXA2 und SOX2, die mit Kernen überlagert sind (blau). (c) Endogene Expression von NKX2-1-GFP in einer Reporterzelllinie in 3D LPC. Bilder aus lebender Zellkultur in Hellfeld und GFP. Durchflusszytometrie des intrazellulären Lungenvorläufers NKX2-1 nach Fixierung und Permeabilisierung. Maßstabsleistengröße = 50 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Charakterisierung von 3D-Ganzlungenorganoiden nach 3-wöchiger Differenzierung durch Immunzytochemie. (a) Proximale Lungenmarker. Das linke Feld zeigt SOX2 (weiß) und SOX9 (rot), überlagert von Kernen (blau). Diese Marker sind wichtig für die verzweigte Morphogenese und repräsentieren die proximalen und distalen Epithelpopulationen. Die mittleren Felder zeigen P63 (rot) und KRT5 (rot), beides Marker von Basalzellen. Das rechte Feld zeigt SCGB3A2, einen Marker für Clubzellen. b) Distale Lungenmarker. Das linke Feld zeigt Pro-SPC (PSPC), (grün) und HOPX (rot), Marker von alveolären Typ-II-Ad-I-Zellen, die mit Kernen (blau) überlagert sind. Das mittlere Feld zeigt Pro-SPC (PSPC) (grün) und SPB (rot), Marker von alveolären Typ-II-Zellen, die mit Kernen (blau) überlagert sind. Das rechte Feld zeigt NKX2-1 (rot) und ZO1 (grün) mit Kernen überlagert (blau). c) Marker des Lungenmesenchyms. Das linke Feld zeigt PDGFRA (rot) und SOX9 (weiß), die das distale Mesenchym darstellen. Das rechte Bild zeigt Vimentin (rot), das in der Lunge verteilt ist. Maßstabsleistengröße = 50 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| REAGENZIEN UND LÖSUNGEN - Firmennamen finden Sie in der Materialtabelle |
| 3D-Organoid-Induktionsmedium (Tag 17-22) |
| Serumfreies Basalmedium (siehe Rezept) ergänzt durch: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/ml) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| EGF (10 ng/ml) |
| 3D-Organoid-Verzweigungsmedium (Tag 23-28) |
| Serumfreies Basalmedium (siehe Rezept) ergänzt durch: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/ml) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| All-trans-Retinsäure (0,1 μM) |
| EGF (10 ng/ml) |
| VEGF/PIGF (10 ng/ml) |
| 3D-Organoid-Reifungsmedium (Tag 29-34) |
| Serumfreies Basalmedium (siehe Rezept) ergänzt durch: |
| Dexamethason (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| AFE-Induktionsmedium (Tag 4-6) |
| Serumfreies Basalmedium (siehe Rezept) ergänzt durch: |
| SB431542 (10 μM) |
| Dorsomorphin (2 μM) |
| DE-Induktionsmedium (Tag 1-3) |
| 48,5 ml RPMI1640 + Glutamax |
| 1 ml B27 ohne Retinsäure |
| 500 μl HEPES (1%) |
| 500 μl Stift/Streptokokken |
| Humanes Aktivin A (100 ng/ml) |
| CHIR99021 (5 μM) - nur in den ersten 24 Stunden |
| LPC-Induktionsmedium (Tag 7-16) |
| Serumfreies Basalmedium (siehe Rezept) ergänzt durch: |
| BMP4 (10 ng/ml) |
| All-trans-Retinsäure (RA) (0,1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Abschreckmedium |
| 49 ml DMEM/F12 |
| 1 ml FBS |
| Serumfreies Basalmedium (SFBM) |
| 375 ml Iscoves modifiziertes Dulbecco's Medium (IMDM) + Glutamax |
| 125 ml Schinken F12 |
| 5 ml B27 ohne Retinsäure |
| 2,5 ml N2 |
| 500 μl Ascorbinsäure, 50 mg/ml |
| 13 μl Monothioglycerin/ 1 ml IMDM" verwenden 300 μl 0,4 mM Monothioglycerin pro 100 ml serumfreie Medien |
| 3,75 ml Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V, 7,5% ige Lösung |
| 500 μl Stift/Streptokokken |
| Stammzell-Passaging-Medium (Tag 0) |
| 500 ml DMEM/F12 |
| 129 ml Knockout Serum Ersatz (KSR) |
| 6,5 ml Glutamax |
| 6,5 ml NEAA |
| 1,3 ml 2-Mercaptoethanol |
| 6,5 ml Stift / Streptokokken |
Tabelle 1: Tabelle der Medien.
| Problem | Lösung |
| DE-Differenzierung nicht effizient | 24 Stunden nach der Beschichtung in Stammzellmedium sollten die Zellen zu 50-70% konfluent sein |
| GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 sollte innerhalb von 20-24 Stunden nach Tag 1 DE-Induktion entfernt werden | |
| DIE DE-Differenzierung sollte insgesamt 72 Stunden nicht überschreiten | |
| AFE-Differenzierung nicht effizient | Stellen Sie sicher, dass die DE-Differenzierung erfolgreich war und die Zellen > 80% CXCR4 exprimieren |
| Stellen Sie sicher, dass täglich frische Wachstumsfaktoren / kleine Moleküle zu den Medien hinzugefügt werden | |
| LPC-Differenzierung nicht effizient | Stellen Sie sicher, dass die AFE-Differenzierung erfolgreich war und die Zellen > 80% FOXA2/SOX2 exprimieren |
| Stellen Sie sicher, dass die AFE-Zellen als Aggregate von 4-10 Zellen und nicht einzellig durchlaufen werden | |
| 3D-Lungenorganoide, die nicht wachsen oder differenzieren | Stellen Sie sicher, dass die LPC-Differenzierung erfolgreich war und die Zellen > 30% NKX2-1 exprimieren |
| Stellen Sie sicher, dass die LPCs als Aggregate von 4-10 Zellen und nicht einzellig durchlaufen wurden | |
| Stellen Sie sicher, dass während des Passierens kein Restmatrigel aus den LPCs vorhanden ist | |
| Fügen Sie ROCK Inhibitor Y-27632 bei jedem Medienwechsel hinzu | |
| Stellen Sie sicher, dass die Medien rechtzeitig gewechselt werden und frische Wachstumsfaktoren / kleine Moleküle hinzugefügt werden | |
| Sicherstellen, dass die Konzentration von Wachstumsfaktoren/kleinen Molekülen korrekt ist |
Tabelle 2: Problembehandlung.
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Discussion
Die erfolgreiche Differenzierung von 3D-Ganzlungenorganoiden (WLO) beruht auf einem mehrstufigen, 6-wöchigen Protokoll mit Liebe zum Detail, einschließlich der Zeit der Exposition gegenüber Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen, der Zelldichte nach dem Passieren und der Qualität der hiPS-Zellen. Informationen zur Problembehandlung finden Sie in Tabelle 2. hiPS-Zellen sollten etwa 70%-80% konfluent sein, mit weniger als 5% spontaner Differenzierung vor der Dissoziation. Dieses Protokoll erfordert das Medium "mTeSR plus"; Es wurde jedoch auch ein einfaches "mTeSR" -Medium mit vergleichbaren Ergebnissen verwendet und ist kostengünstiger. Für die extrazelluläre Matrix verwenden wir GFR-Basalmembranmatrixmedium. Wir durchlaufen die hiPSCs mit ReLesR (siehe Materialtabelle), um die Differenzierung zu reduzieren.
Während der Endodermdifferenzierung sollten Zellen täglich vor und nach Medienwechseln sichtbar gemacht werden. Spezifizierte Wachstumsfaktoren/kleine Moleküle sollten täglich frisch in das Basismedium gegeben werden, um einen vorzeitigen Abbau zu verhindern. Der Zelltod im definitiven Endoderm (DE) ist häufig, sollte aber während der Induktion des vorderen Vorderdarmendosderms (AFE) und der Lungenvorläuferzellen (LPC) begrenzt sein. Wenn es am dritten Tag der DE (Tag 4) zu einem großen Absterben kommt, verringern Sie die Gesamtzeit der DE um 6-12 h. Neue iPSC-Zelllinien müssen möglicherweise für eine erfolgreiche Endodermdifferenzierung optimiert werden. Führen Sie bei DE eine Durchflusszytometrie für CXCR4 durch, um die erfolgreiche Induktion zu bestätigen (>85% CXCR4 + Zellen). Die Zellen sollten bei AFE relativ stabil sein und sich morphologisch verändern, ohne dass sie absterben.
Die Übergabe an LPC ist ein weiterer Prozess, der für den Zelltyp optimiert werden muss. Das Umschichten von Zellen mit einer zu niedrigen Dichte (<50%) führt zu einer ineffizienten Differenzierung. Bestätigen Sie die erfolgreiche LPC-Induktion mit Immunzytochemie für NKX2-1 oder Durchflusszytometrie für CPM18 oder CD26low/CD47high15. Eine erfolgreiche LPC-Induktion muss >40% NKX2-1 aufweisen, da sonst die Organoide eine größere Häufigkeit dorsaler AFE aufweisen. Für die LPC-Induktion müssen bei jedem Medienwechsel Wachstumsfaktoren zu den Basismedien hinzugefügt werden. Wenn das Medium später in der LPC-Induktion gelb wird, sollten Sie erwägen, das Volumen der frischen Medien zu erhöhen, oder wechseln Sie das Medium jeden Tag. Während der 3D-Induktion des gesamten Lungenorganoids sind die Plating-Anzahl und die Aufrechterhaltung von Zellclustern der Schlüssel zu einem erfolgreichen Organoidwachstum. GFR-Basement-Membranmatrixmedium ist schwierig zu handhaben und sehr temperaturempfindlich, also halten Sie es immer auf Eis. Wenn das GFR-Basalmembran-Matrixmedium zu früh geliert, integrieren sich die LPC-Zellen nicht in es. Wir empfehlen, 1 ml Aliquots des GFR-Basalmembranmatrixmediums 30 min vor dem Passieren auf Eis aufzutauen. Sobald die Zellen/Cluster gezählt und geeignete Aliquots hergestellt wurden, legen Sie das Zellpellet auf Eis. Wir empfehlen, Platten, Markierung und Zugabe von Zellkulturmembraneinsätzen vor der Handhabung des GFR-Basalmembranmatrixmediums vorzubereiten.
Verwenden Sie Pipettenspitzen, um das richtige Volumen des flüssigen GFR-Basalmembranmatrixmediums sofort zum Zellpellet hinzuzufügen und auf Eis zu halten. Schnell aber schonend auf und ab pipettieren (nuancierte Handhabung), um keine Blasen einzubringen, und dann das Rohr wieder auf Eis legen. Geben Sie die Zell- und GFR-Basalmembranmatrix-Mediummischung in den apikalen Teil des Transwells in vorbereiteten Platten. Die Mischung sollte das gesamte Transwell verteilen und beschichten; Kippen Sie die Platte vorsichtig, um die Beschichtung sicherzustellen. Nach dem Gelieren im Inkubator für 30-60 min sollten sichtbare Zellcluster im GFR-Basalmembranmatrixmedium vorhanden sein. Geben Sie geeignete Lungeninduktionsmedien in die Basalkammer, ergänzt mit 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632, und überwachen Sie das Organoidwachstum jeden zweiten Tag.
Zukünftige Anwendungen der durch dieses Protokoll erzeugten Organoide umfassen die Untersuchung der molekularen Signalwege, die das frühe Engagement der Lungenlinie und die Spezifikation des Zellschicksals steuern21,22,23. Die Wechselwirkung zwischen Epithel und Mesenchym kann mit Hilfe von Gen-Knock-out-Modellen bestimmt werden24. Die Organoide könnten auch mit Endothelzellen kokultiviert werden, um die Bedeutung der gewebespezifischen Co-Pattern-Signalisierung zwischen dem Lungenepithel, dem Mesenchym und dem Endothel zu bestimmen25. Die Lungenentwicklung findet parallel zur vaskulären Entwicklung statt, und diese Beziehung kann wichtige molekulare Mechanismen hervorrufen, die für die richtige Lungenentwicklung notwendig sind. Wir haben auch gezeigt, dass diese ganzen Lungenorganoide durch Tensidsekretionsassays funktionsfähig sind, nachdem das GFR-Basalmembranmatrixmedium entfernt wurde, gefolgt von einer Kurzzeitkultur in ultra-niedrigen Anheftungsbohrungen26. Andere Strategien umfassen die Sortierung der Zellen nach Zelloberflächenmarkern wie NGFR (Basalzellen)27 und HTII-280 (ATII-Zellen)28 und deren Ersatz als homogene Organoide oder Monoschicht unter Luft-Flüssig-Interphasenkulturbedingungen. Ganze, proximale und distale Lungenorganoide wurden auch verwendet, um die zellulären Ziele und die Pathophysiologie der SARS-CoV-2-Virusinfektion zu untersuchen, um Medikamente, die COVID-19 bekämpfen könnten, besser zu verstehen und danach zu suchen.
Dieses Protokoll ist robust und reproduzierbar, aber es gibt noch viele Herausforderungen. Viele verschiedene iPSC- und ESC-Leitungen wurden getestet (>20 Zeilen), aber das Protokoll muss für jede Zelllinie optimiert werden. Trotz robuster DE- und AFE-Induktion kann es schwierig sein, die LPC-Induktion >40% der NKX2-1 + -Zellen zu erreichen. Andere Protokolle beinhalten einen Sortierschritt für Oberflächenmarker von NKX2-1-Zellen15,18, aber diese liefern nur alveoläre Typ II wie Organoide ohne Mesenchym und enthalten trotz Reinigung der Lungenvorläuferpopulation immer noch Magen- und Leberzellpopulationen29. Wir haben auch eine kleine Menge von Magen- und Leberzellen sowohl im LPC als auch in den ganzen Lungenorganoiden festgestellt, möglicherweise aufgrund der Anwesenheit von dorsalen vorderen Vorderdarmzellen, die die LPCs kontaminieren. Daher ist die Differenzierung reiner Lungenorganoide noch nicht erreicht, und weitere Forschungen zur Entwicklung der Lungenvorläuferzellen im menschlichen Gewebe müssen abgeschlossen sein. Downstream-Assays müssen energisch mit gen- und proteinexpression aus primärem menschlichem Lungengewebe verglichen werden. Während die bisher fruchtbarste Verwendung von Lungenorganoiden bei der Modellierung von Krankheiten und dem Screening auf Medikamente in vitro lag, wurde die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Lungenorganoiden in Patienten für die regenerative Medizin als zukünftige Therapie für eine Reihe von Erkrankungen in Betracht gezogen. Bevor solche Eingriffe in Betracht gezogen werden, muss jedoch ein Großteil der Qualitätskontrolle perfektioniert werden, einschließlich der Identifizierung und Entfernung von kontaminierenden, unerwünschten, potenziell tumorigenen hiPSC-Derivaten. Darüber hinaus müssen noch bessere funktionelle Assays in vitro und bessere Tiermodelle für Lungenerkrankungen entwickelt werden.
Insbesondere muss die Funktionalität und Sicherheit von hiPSC-abgeleiteten Zellen bestätigt werden. Undifferenzierte Zellen müssen ausgeschlossen werden, da sie die Fähigkeit haben, Teratome zu erzeugen. Eine Methode zur Bestimmung undifferenzierter Stammzellen im definitiven Endoderm besteht darin, die Zellen mit dem Pluripotenzmarker SSEA4 auszusortieren. Markergene für undifferenzierte hiPS-Zellen wurden kürzlich mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung30 nachgewiesen. ESRG, CNMD und SFRP2 können verwendet werden, um undifferenzierte Zellen in jedem Differenzierungsschritt zu validieren. Sobald die Reinheit bestätigt ist, besteht der Vorteil autologer iPSC-abgeleiteter Therapien in der Fähigkeit der transplantierten Zellen, eine Abstoßung zu vermeiden, da sie aus den eigenen Zellen des Patienten stammen. Zu den Nachteilen gehört die Zeit, die benötigt wird, um die Zellen vollständig zu differenzieren, strengen klinischen Tests unterzogen zu werden und die Zellen in einen Patienten mit einer akuten Verletzung (Atemnotsyndrom, Myokardinfarkt oder Wirbelsäulenverletzung) zu transplantieren. Die Alternative besteht darin, bankierte allogene iPSC-abgeleitete Zellen zu verwenden31. Diese können für Patienten mit humanem Leukozytenantigen (HLA) gelagert und leicht verfügbar sein und sie werden gründlichen Tests auf Kontamination unterzogen worden sein. Der größte Nachteil ist die Möglichkeit der Immunabstoßung. Immunsuppression kann bei der allogenen Zelltransplantation notwendig sein, was die derzeitige Realität allogener Ganzgewebstransplantationen ist. Es werden Strategien entwickelt, die es den allogenen iPSC-abgeleiteten Zellen ermöglichen, die Immunantwort zu umgehen, um sie sicher in Patienten zu transplantieren32.
Schließlich werden iPSC-abgeleitete ganze Lungenorganoide verwendet, um patientenspezifische Krankheitsmodelle zu untersuchen, Therapeutika anzupassen und die regenerative medizinische Forschung zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
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