Summary
Различные модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAo) используются в экспериментальных исследованиях инсульта. Здесь описана экспериментальная модель инсульта транзиторного MCAo через наружную сонную артерию (ECA), целью которой является имитация инсульта человека, при котором цереброваскулярный тромб удаляется из-за спонтанного лизиса сгустка или терапии.
Abstract
Инсульт является третьей наиболее распространенной причиной смертности и основной причиной приобретенной инвалидности взрослых в развитых странах. На сегодняшний день терапевтические возможности ограничены небольшой долей пациентов с инсультом в течение первых часов после инсульта. Новые терапевтические стратегии широко исследуются, особенно для продления терапевтического временного окна. Эти текущие исследования включают изучение важных патофизиологических путей после инсульта, таких как постинсультное воспаление, ангиогенез, пластичность нейронов и регенерация. В последнее десятилетие растет обеспокоенность по поводу плохой воспроизводимости экспериментальных результатов и научных результатов среди независимых исследовательских групп. Для преодоления так называемого «кризиса репликации» срочно необходимы подробные стандартизированные модели для всех процедур. В рамках исследовательского консорциума «ImmunoStroke» (https://immunostroke.de/) предложена стандартизированная мышиная модель транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (MCAo). Эта модель позволяет полностью восстановить кровоток при удалении нити, имитируя терапевтический или спонтанный лизис сгустка, который происходит при значительной части инсультов человека. Хирургическая процедура этой модели инсульта «нити» и инструменты для ее функционального анализа демонстрируются в сопроводительном видео.
Introduction
Инсульт является одной из наиболее распространенных причин смерти и инвалидности во всем мире. Хотя существует в основном две различные формы инсульта, ишемическая и геморрагическая, 80-85% всех случаев инсульта являются ишемическими1. В настоящее время для пациентов с ишемическим инсультом доступны только два метода лечения: фармакологическое лечение активатором рекомбинантного тканевого плазминогена (rtPA) или механическая тромбэктомия. Однако из-за узкого терапевтического временного окна и нескольких критериев исключения только избранное число пациентов может извлечь выгоду из этих конкретных вариантов лечения. За последние два десятилетия доклинические и трансляционные исследования инсульта были сосредоточены на изучении нейропротекторных подходов. Тем не менее, все соединения, которые достигли клинических испытаний, до сих пор не показали никаких улучшений для пациента2.
Поскольку модели in vitro не могут точно воспроизвести все взаимодействия мозга и патофизиологические механизмы инсульта, животные модели имеют решающее значение для доклинических исследований инсульта. Однако имитация всех аспектов ишемического инсульта человека на одной животной модели невозможна, поскольку ишемический инсульт является очень сложным и гетерогенным заболеванием. По этой причине различные модели ишемического инсульта были разработаны с течением времени у разных видов. Фототромбоз артериол головного мозга или постоянная дистальная окклюзия средней мозговой артерии (MCA) являются широко используемыми моделями, которые индуцируют небольшие и локально определяемые поражения в неокортексе3,4. Кроме того, наиболее часто используемой моделью инсульта, вероятно, является так называемая «модель нити», в которой достигается преходящая окклюзия MCA. Данная модель состоит из преходящего введения шовной нити к источнику МКА, приводящего к резкому снижению мозгового кровотока и последующему большому инфаркту подкорковой и корковой областей мозга5. Хотя большинство моделей инсульта имитируют окклюзии MCA 6,«модель нити» позволяет точно разграничить ишемическое время. Реперфузия путем удаления нити имитирует клинический сценарий восстановления мозгового кровотока человека после спонтанного или терапевтического (rtPA или механическая тромбэктомия) лизиса сгустка. На сегодняшний день описаны различные модификации этой "модели нити накаливания". В наиболее распространенном подходе, впервые описанном Longa et al. в 1989году 5нить с силиконовым покрытием вводится через общую сонную артерию (CCA) к происхождению MCA7. Хотя это широко используемый подход, эта модель не позволяет полностью восстановить кровоток во время реперфузии, так как ОАС постоянно перевязывается после удаления нити.
За последнее десятилетие все большее число исследовательских групп были заинтересованы в моделировании инсульта у мышей с использованием этой «модели нити». Однако значительная изменчивость этой модели и отсутствие стандартизации процедур являются одними из причин высокой изменчивости и плохой воспроизводимости экспериментальных результатов и научных выводов, о которых сообщалось до сих пор2,8. Потенциальной причиной нынешнего «кризиса репликации», относящегося к низкой воспроизводимости среди исследовательских лабораторий, являются несопоставимые объемы инфаркта инсульта между исследовательскими группами, использующими одну и ту же экспериментальную методологию9. Фактически, проведя первое доклиническое рандомизированное контролируемое многоцентровое исследование10,мы смогли подтвердить, что отсутствие достаточной стандартизации этой экспериментальной модели инсульта и последующих параметров исхода были основными причинами неспособности воспроизводимости в доклинических исследованиях между независимыми лабораториями11 . Эти резкие различия в результирующих размерах инфаркта, несмотря на использование одной и той же модели инсульта, справедливо представляют угрозу не только для подтверждающих исследований, но и для научного сотрудничества из-за отсутствия надежных и воспроизводимых моделей.
В свете этих проблем мы стремились разработать и подробно описать процедуру стандартизированной переходной модели MCAo, используемой для совместных исследований в рамках исследовательского консорциума «ImmunoStroke» (https://immunostroke.de/). Этот консорциум стремится понять мозг-иммунные взаимодействия, лежащие в основе механистических принципов восстановления после инсульта. Кроме того, представлены гистологические и связанные с ними функциональные методы анализа исходов инсульта. Все методы основаны на установленных стандартных операционных процедурах, используемых во всех исследовательских лабораториях консорциума ImmunoStroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты, о которых сообщается в этом видео, проводились в соответствии с национальными руководящими принципами использования экспериментальных животных, а протоколы были одобрены немецкими правительственными комитетами (Regierung von Oberbayern, Мюнхен, Германия). Десятинедельные самцы мышей C57Bl/6J использовались и содержались при контролируемой температуре (22 ± 2 ° C), с периодом 12-часового светло-темного цикла и доступом к гранулированной пище и воде ad libitum.
1. Подготовка материала и инструментов
- Подключите тепловое одеяло для поддержания температуры рабочей зоны и температуры тела мыши во время анестезии при 37 °C.
- Автоклавные ножницы и щипцы, приготовьте 70% раствор этанола и держите в наличии глазную мазь декспантенола, несколько кусочков хлопка и 5-0 покрытый плетеным полиэфирным швом готовым к использованию. Приготовьте шприц объемом 1 мл с 0,9% физиологическим раствором (без иглы), чтобы сохранить место разреза животного гидратированным. Готовят анестезиологический газ (100% O2 + изофлуран).
- Подготовьте держатель для лазерного доплеровского зонда, разрезав наконечник пипетки объемом 10 мкл (длина 3-5 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты стерилизуются с помощью горячего стерилизатора. Поверхности также дезинфицируются до и после операции с помощью микробного дезинфицирующего спрея. Перед операцией области, окружающие голову и грудь мышей, дезинфицируются спреем для дезинфекции ран.
2. Подготовка лазерного допплера
- Вводят анальгезию мыши за 30 мин до операции (4 мг/кг карпрофена и 0,1 мг/кг бупренорфина, внутрибрюшинно).
- Обезболивают мышь, помещая ее в индукционную камеру со скоростью потока изофлунана 4% до прекращения спонтанных движений тела и вибрисс.
- Поместите мышь в положение лежа в зоне операции носом в анестезиологической маске. Поддерживайте концентрацию изофлурана на уровне 4% в течение еще одной минуты, затем уменьшите ее и сохраните на уровне 2%.
- Установите соответствующую грелку с обратной связью для поддержания температуры тела мыши на уровне 37 °C и осторожно вставьте ректальный зонд для контроля температуры на протяжении всех хирургических процедур.
- Нанесите декспантенол глазную мазь на оба глаза.
- Продезинфицируйте кожу и волосы, окружающие левый глаз и ухо, 70% этанолом.
- Разрезайте кожу головы между левым ухом и глазом (длиной 1 см), чтобы обнажить кость черепа.
- Отрежьте и уберите височную мышцу, чтобы визуализировать MCA под черепом.
- Закрепите клеем внешнюю часть наконечника, удерживая лазерный доплеровский зонд/волокно поверх левого MCA с помощью клея. Затем приклейте кожу, чтобы закрыть рану вокруг держателя наконечника. Нанесите 2-3 капли клея отвердителя для ускорения процесса. Убедитесь, что лазерное допплеровское волокно не склеено и может быть легко удалено из держателя наконечника в любое время.
3. Переходная модель MCAo (окклюзия)
- Поверните мышь в положение лежа на спине. Вставьте морду в конус анестезии и зафиксируйте лапы скотчем.
- Продезинфицируйте кожу и волосы, окружающие грудь, и сделайте разрез средней линии длиной 2 см на шее.
- Используйте щипцы, чтобы раздвинуть кожу и подчелюстные железы. Используйте втягивающие средства, чтобы удерживать грудиномастоидную мышцу, обнажать хирургическое поле и находить левую общую сонную артерию (CCA). Рассекните ККА свободным от соединительной ткани и окружающих нервов (без вреда для блуждающего нерва) и выполните преходящую перевязку перед бифуркацией.
- Рассекните наружную сонную артерию (ЭКА) и завяжите постоянный узел в самой дистальной видимой части. Поместите еще один шов под ЭКА, близко к бифуркации, и подготовьте свободный узел для последующего использования.
- Рассекните внутреннюю сонную артерию (ИКА) и поместите на нее микрососудистый клипс, на 5 мм над бифуркацией. Следите за тем, чтобы не повредить блуждающий нерв.
- Вырежьте небольшое отверстие в ЭКА между плотной и рыхлой лигациями; будьте осторожны, чтобы не сократить всю ЭКА.
- Введите нить накала и продвигайте ее к ОАС. Затяните свободную перевязку в ЭКА вокруг просвета, чтобы быстро закрепить нить в этом положении и избежать кровотечения при удалении микрососудистого клипса.
- Удалите микрососудистый зажим и вставьте нить через ICA до тех пор, пока происхождение MCA не будет достигнуто путем обнаружения резкого снижения (>80%) мозгового кровотока, измеренного лазерным допплером. Зафиксируйте нить в этом положении, дополнительно затянув узел вокруг ЭКА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда нить накала идет в соответствующем направлении, она плавно продвигается, и никакого сопротивления не должно наблюдаться. - Запись значений лазерной допплерографии до и после введения нити накаливания.
- Удалите втягивающий нерв и переместите грудиномастоидную мышцу и подчелюстные железы перед наложением швов на рану. Удалите лазерный допплеровский зонд и поместите животное в камеру восстановления при 37 °C на 1 ч (до удаления нити накаливания).
4. Переходная модель MCAo (реперфузия)
- Обезболивают мышь, помещая ее в индукционную камеру со скоростью потока изофлунана 4% до прекращения спонтанных движений тела и вибрисс.
- Нанесите декспантенол глазную мазь на оба глаза.
- Поместите мышь в положение лежа в зоне операции мордой в анестезиологической маске. Поддерживайте концентрацию изофлурана на уровне 4% в течение еще одной минуты, затем уменьшите ее и сохраните на уровне 2%. Зафиксируйте лапы животного скотчем.
- Вставьте лазерный доплеровский зонд в держатель зонда.
- Снимите раневой шов, используйте щипцы, чтобы раздвинуть кожу и подчелюстные железы. Используйте втягивающие устройства, чтобы осторожно вытянуть грудино-сосцевидную мышцу и обнажить хирургическое поле.
- Ослабьте шов ECA, который затягивает нить, и осторожно потяните нить. Избегайте повреждения силиконово-резинового покрытия нити накала во время удаления.
- Плотно завяжите шов ЭКА.
- Подтверждают усиление мозгового кровотока в лазерном допплеровском аппарате (>80% от исходного значения перед реперфузией).
- Запись значений лазерной допплерографии до и после удаления нити.
- Вскрываем переходную перевязку перед бифуркацией от ОАС.
- Удалите втягивающее устройство и переместите грудиномастоидную мышцу и подчелюстные железы перед наложением швов на рану. Поместите животное в восстановительную камеру при 37 °C в течение 1 ч, чтобы восстановиться после анестезии.
- После выздоровления верните мышей в клетки в комнату с контролируемой температурой.
- Позаботьтесь о животных, добавив гранулы влажного корма и гидрогель в небольшие чашки Петри на полу клетки до 3-го дня после операции.
- Вводят анальгезию каждые 12 ч в течение 3 сут после операции (4 мг/кг карпрофена и 0,1 мг/кг бупренорфина).
5. Фиктивная операция
- Выполните все процедуры, как описано выше, включая перевязку артерий и введение нити накаливания (этапы 1-3.7).
- Удалите нить накала сразу после ее введения. Затем поместите животное в восстановительную камеру на 1 ч.
- Поместите животное в зону операции снова и удалите преходящую перевязку CCA, чтобы обеспечить полное восстановление мозгового кровотока.
- Зашить рану и поместить животное в восстановительную камеру при 37 °C в течение 1 ч, чтобы восстановиться после анестезии. После выздоровления верните мышей в клетки в комнату с контролируемой температурой.
- Позаботьтесь о животных, добавив гранулы влажного корма и гидрогель в небольшие чашки Петри на полу клетки до 3-го дня после операции.
- Вводят анальгезию каждые 12 ч в течение 3 сут после операции (4 мг/кг карпрофена и 0,1 мг/кг бупренорфина).
6. Нейрооценка
- Выполняйте Neuroscore всегда в одно и то же время суток и используйте хирургическую одежду для поддержания «нейтрального запаха» между отдельными хирургами.
- Дайте мышам отдохнуть в течение 30 минут в комнате с «открытой» клеткой перед тестом.
- Наблюдайте за каждым элементом в Таблице 1 и Таблице 2 в течение 30 с.
7. Внутрисердечная перфузия
- Подготовьте шприц объемом 20 мл, содержащий фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)-гепарин (2 ЕД/мл), и поместите его на 1 м над стендом, чтобы облегчить гравитационную перфузию. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Выполните внутрисердечную перфузию с 4% параформальдегидом (PFA) с использованием шприца 20 мл, содержащего 4% PFA в PBS, рН 7,4).
- Вводят интрперитонеально 100 мкл кетамина и ксилазина (120 и 16 мг/кг массы тела соответственно). Подождите 5 мин и подтвердите прекращение спонтанных движений тела и вибрисс.
- Зафиксируйте животное в положении лежа на спине, и продезинфицируйте поверхность брюшного тела 70% этанолом.
- Сделайте 3-сантиметровый разрез в живот; разрезать диафрагму, ребра и грудину, чтобы полностью визуализировать сердце.
- Сделайте небольшой разрез в правом предсердии и вставьте перфузионную канюлю в левый желудочек.
- Перфуз с 20 мл PBS-гепарина.
- После перфузии обезглавить животное и удалить мозг.
- Заморозьте мозг на порошкообразном сухом льду и храните при -80 °C до дальнейшего использования.
8. Объем инфаркта
- Для криосекции используйте криостат, чтобы разрезать мозг на участки толщиной 20 мкм каждые 400 мкм. Поместите секции на слайды и храните слайды при температуре −80 °C до использования.
- Окрашивание крезиловой фиалкой (CV)
- Готовят окрашивающий раствор путем перемешивания и нагревания (60 °C) 0,5 г CV ацетата в 500 млH2Oдо растворения кристаллов. После того, как раствор остынет, храните его в темном флаконе. Разогревайте до 60 °C и фильтруйте перед каждым использованием.
- Дайте горкам высохнуть при комнатной температуре в течение 30 минут. Погружают их в 95% этанол на 15 мин, в 70% этанол на 1 мин, а затем в 50% этанол на 1 мин.
- Погрузить горки в дистиллированную воду на 2 мин; освежите дистиллированную воду и поместите горки в воду на 1 мин. После этого погрузите слайды в предварительно нагретый раствор для окрашивания на 10 мин при 60 °C. Дважды промойте горки в дистиллированной воде в течение 1 мин.
- Погрузите слайды в 95% этанол на 2 мин. Поместите их в 100% этанол на 5 мин; освежите 100% этанол и снова поместите слайды в этанол на 2 мин. После этого накройте слайды монтажным носителем.
- Анализ (Рисунок 4C)
- Отсканируйте слайды и проанализируйте объем непрямого инфаркта методом12 Суонсона, чтобы исправить отек с помощью следующего уравнения:
(Ишемическая область) = (ишемическая область)-((ипсилатеральное полушарие)-(контралатеральное полушарие))
- Отсканируйте слайды и проанализируйте объем непрямого инфаркта методом12 Суонсона, чтобы исправить отек с помощью следующего уравнения:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель, описанная здесь, является модификацией широко используемой модели штриха «нити», которая состоит из введения нити накаливания с силиконовым покрытием через ECA для временного блокирования происхождения MCA(рисунок 1). После удаления нити накала только кровоток в ЭКА навсегда прекращается, что позволяет полностью реканализировать ОАС и МКА. Это позволяет провести адекватную реперфузию головного мозга(рисунок 2),аналогичную ситуации, наблюдаемой после успешного фармакологического тромболизиса или механической тромбэктомии у пациентов с человеческими заболеваниями. Кроме того, в этой работе также описывается метод измерения мозгового кровотока во время процедур окклюзии и реперфузии путем фиксации канюли, подключенной к лазерному допплеровскому зонду в черепе над территорией MCA.
Общая смертность от хирургической процедуры составляет <5% при выполнении квалифицированным хирургом. В ранние моменты времени после MCAo у животных обычно наблюдаются серьезные постуральные и двигательные дефициты, общая слабость и потеря массы тела13. Эти серьезные дефициты являются преходящими, и животные показывают улучшенную активность примерно через 1 неделю; таким образом, дефицит более специфичен для очаговых неврологических симптомов.
Поведенческие дефициты после окклюзии MCA оценивались по композитному Neuroscore14; общий и очаговый дефицит измеряли через 24 ч и 3 ч после операции. Общий Neuroscore объединяет 5 пунктов(таблица 1),включая оценку меха, ушей, глаз, осанки и спонтанной активности, с максимальным баллом 18. Фокусная нейрооценка включает в себя 7 пунктов(таблица 2),включая оценку симметрии тела, походки, скалолазания, кругового поведения, симметрии передней конечности, обязательной цикличности и реакции усов, с максимальным баллом 28. Составная шкала колеблется от 0 (отсутствие дефицита) до 46 (тяжелые нарушения). Животные, перенесшие инсульт, показали значительные изменения в составном и фокальном Neuroscore, но не в общем Neuroscore, по сравнению с фиктивными животными(рисунок 3).
Объемная обработка инфаркта также проводилась с использованием крезилового фиолетового окрашивания корональных последовательных участков мозга через 24 ч после индукции инсульта. Средний объем инфаркта составил 61,69мм3,что составляет 48% пораженного полушария головного мозга(рисунок 4). При выполнении квалифицированным хирургом общая вариабельность данной модели инсульта низкая, с коэффициентом вариации <6%. Область поражения включает соматосенсорную и моторную кору, а также подкорковые структуры, такие как полосатое тело(рисунок 4).
Рисунок 1:Схема доступа и внутрипросветной окклюзии MCA. Нить накала (пунктирная линия) вставляется между проксимальным и дистальным шовным узлами в ЭКА и продвигается вдоль МКА до тех пор, пока не достигнет начала MCA (см. вставку). После того, как ECA на месте, ECA перевязывается швом, чтобы зафиксировать нить. Сокращения: ACA = передняя мозговая артерия; БА = базилярная артерия; CCA = общая сонная артерия; ЭКА = наружная сонная артерия; ICA = внутренняя сонная артерия; MCA = средняя мозговая артерия; PCA = задняя сообщающаяся артерия; PTG = крылопалатиновая артерия. Эта цифра была изменена из Jackman et al. 15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Кровоток во время окклюзии и реперфузии. Кровоток регистрируется до и после введения нити, а также до и после удаления нити. Снижение кровотока наблюдалось во время окклюзии и восстановление кровотока во время реперфузии. Каждый цвет представляет одно животное. Сокращения: MCA = средняя мозговая артерия; CBF = мозговой кровоток; A.U. = произвольные единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Нейрооценка функционального дефицита после tMCAo. (A) Всего, (B) очаговой и (C) общей нейрооценки до и через 24 ч и 3 d после tMCAo. Открытые бары: бутафорские; Черные полосы: tMCAo. n=10 на группу. *p < 0,05. Сокращения: tMCAo = транзиторная окклюзия средней мозговой артерии; BL = перед tMCAo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Объемный анализ инфаркта и исход инфаркта через 24 ч после tMCAo. (A)Репрезентативные крезил-фиолетовые корональные участки мозга каждые 400 мкм через 24 ч после tMCAo. Пунктирные линии разграничивают область поражения. (B) Анализ инфарктного объема 10 мозгов (каждая точка представляет один индивидуальный мозг) через 24 ч после tMCAo. Горизонтальная красная линия представляет среднее значение (61,69 мм3),полосы погрешности указывают на стандартное отклонение (3,78 мм3). (C) Репрезентативное изображение для расчета объема инфаркта из крезильно-фиолетового коронального сечения. Синий = контралатеральное полушарие; Красный = ипсилатеральное полушарие; Бледно-полосатая область = Ишемическая область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Временная точка подсчета очков | счёт | ||
| Общая нейрооценка | Волос | 0. Волосы аккуратные и чистые | |
| 1. Локализованная пилоэрекция и грязные волосы в 2 частях тела (нос и глаза) | |||
| 2. Пилоэрекция и грязные волосы в >2 частях тела | |||
| Уши (мышь на открытой столешнице) | 0. Нормальный (уши растягиваются сбоку и сзади, они реагируют выпрямлением после шума) | ||
| 1. Растянутые сбоку, но не сзади (один или оба), они реагируют на шум | |||
| 2. То же, что и 1. НЕТ Реакции на шум. | |||
| Глаза (мышь на OBT) | 0. Открывайте, очищайте и быстро следите за окружающей средой | ||
| 1. Открытая и характеризующаяся водной слизью. Медленно следите за окружающей средой | |||
| 2. Открытая и характеризующаяся темной слизью | |||
| 3. Эллипсоидальная форма и характеризуется темной слизью | |||
| 4. Закрыто | |||
| Осанка (положите мышь на ладонь и аккуратно покачайте) | 0. Мышь стоит в вертикальном положении спиной параллельно ладони. Во время качелей он быстро стоит. | ||
| 1. Мышь стоит горбатая. Во время качелей он сплющивает тело, чтобы обрести устойчивость. | |||
| 2. Головка или часть туловища лежит на ладони. | |||
| 3. Мышь лежит с одной стороны, едва в состоянии восстановить вертикальное положение. | |||
| 4. Мышь лежит в положении лежа, не в состоянии восстановить вертикальное положение. | |||
| Активность Spontaneos (мышь на OBT) | 0.Мышь бдительна и активно исследует. | ||
| 1. Мышь кажется бдительной, но она спокойная и вялая. | |||
| 2.Мышь исследует с перерывами и вяло. | |||
| 3. Мышь сонная и онемела, мало движений на месте. | |||
| 4.No спонтанные движения | |||
| Общий балл для общего подсчета очков | |||
| (нормальный=0 макс=18) | |||
Таблица 1: Общая нейрооценка. Животные получали от 0 до 4 баллов, в зависимости от тяжести, для каждого из пяти измеренных общих дефицитов. Затем добавляются баллы по различным областям, чтобы обеспечить общий общий балл в диапазоне от 0 до 18. Эта таблица была изменена по сравнению с Clark et al.14 . Аббревиатура: OBT = открытая столешница.
| Временная точка подсчета очков | счёт | ||
| Фокальная нейрооценка | Симметрия тела (мышь на OBT, наблюдение за линией нос-хвост) | 0. Нормальный (Тело: нормальная осанка, туловище приподнято от скамьи, с передними и задними конечностями, наклоненными под телом. Хвост: прямой) | |
| 1. Небольшая асимметрия (Тело: опирается на одну сторону с передними и задними конечностями, наклоненными под телом. Хвост: слегка согнутый) | |||
| 2. Умеренная асимметрия (Тело: опирается на одну сторону с вытянутыми передними и задними конечностями. Хвост: слегка согнутый) | |||
| 3. Заметная асимметрия (Корпус: изогнутый, с одной стороны лежит на ОБТ. Хвост: согнутый) | |||
| 4. Крайняя асимметрия (Корпус: сильно изогнутый, с одной стороны постоянно лежит на ОБТ. Хвост: сильно изогнутый) | |||
| Походка (мышь на OBT. Наблюдается без помех) | 0. Нормальный (походка гибкая, симметричная и быстрая) | ||
| 1. Жесткий, негибкий (горбатая ходьба, медленнее, чем обычная мышь) | |||
| 2. Хромота, с асимметричными движениями | |||
| 3. Дрожь, дрейф, падение | |||
| 4. Не ходит самопроизвольно (при стимуляции путем мягкого толкания мыши ходит не дольше 3 шагов) | |||
| Скалолазание (мышь на поверхности 45o. Поместите мышь в центр захватывающей поверхности) | 0. Нормальный (мышь быстро поднимается) | ||
| 1. Подъемы с напряжением, слабость конечностей присутствует | |||
| 2. Держится на склоне, не скользит и не поднимается | |||
| 3. Скользит вниз по склону, неудачная попытка предотвратить неудачу | |||
| 4. Слайды немедленно, без усилий, чтобы предотвратить неудачу | |||
| Круговое поведение (мышь на OBT, свободное наблюдение) | 0. Отсутствие кругового поведения | ||
| 1. Преимущественно односторонние повороты | |||
| 2. Круги в одну сторону, хотя и не постоянно | |||
| 3. Круги постоянно в одну сторону | |||
| 4. Поворот, раскачивание или отсутствие движения | |||
| Симметрия передней конечности (мышь, подвешенная на хвосте) | 0. Нормальный | ||
| 1. Световая асимметрия: умеренное сгибание контралатеральной передней конечности | |||
| 2. Выраженная асимметрия: отмечается сгибание контралатеральной конечности, тело слегка сгибается на ипсилатеральной стороне | |||
| 3. Заметная асимметрия: контралатеральная передняя конечность прилипает к туловищу | |||
| 4. Небольшая асимметрия, отсутствие движения тела / конечностей | |||
| Обязательное кружение (передние конечности на скамейке, задние конечности, подвешенные за хвост: выявляет наличие паралича контралатеральной конечности) | 0. Отсутствует. Нормальное расширение обеих передних конечностей | ||
| 1. Склонность к повороту в одну сторону (мышь вытягивает обе передние конечности, но начинает поворачиваться предпочтительно в одну сторону) | |||
| 2. Круги в одну сторону (мышь поворачивается в одну сторону более медленным движением по сравнению со здоровыми мышами) | |||
| 3. Поворачивается в одну сторону вяло (мышь поворачивается в одну сторону, не выполняя полный круг) | |||
| 4. Не продвигается (передняя часть багажника лежит на скамейке, медленные и короткие движения) | |||
| Реакция усов (мышь на OBT) | 0. Нормальный | ||
| 1. Легкая асимметрия (мышь медленно удаляется при стимуляции на контралатеральной стороне) | |||
| 2. Заметная асимметрия (отсутствие реакции при стимуляции на контралатеральную сторону) | |||
| 3. Отсутствует реакция контралатерально, медленная реакция при стимуляции ипсилатерально | |||
| 4. Отсутствие ответа на двусторонней основе | |||
| Общий балл по фокальным дефицитам | |||
| (нормальный=0 макс=28) | |||
Таблица 2: Фокальная нейрооценка. Животные получали от 0 до 4 баллов в зависимости от тяжести для каждого из семи измеренных общих дефицитов. Затем добавляются баллы по различным областям, чтобы обеспечить общий фокусный балл в диапазоне от 0 до 28. Эта таблица была изменена по сравнению с Clark et al.14 . Аббревиатура: OBT = открытая столешница.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол описывает экспериментальную модель инсульта, основанную на консенсусном соглашении немецкого многоцентрового исследовательского консорциума («ImmunoStroke») о создании стандартизированной переходной модели MCAo. Переходная модель MCAo, созданная путем введения нити с силиконовым покрытием через ECA к происхождению MCA, является одной из наиболее широко используемых моделей инсульта для достижения артериальной реперфузии после разграниченного периода окклюзии. Поэтому данную процедуру можно считать трансляционно значимой моделью обводки.
«Модель нити», представленная в видео, имеет некоторые преимущества по сравнению с другими ранее описанными моделями инсульта, такими как не требующая трепанации черепа и достижение полной реперфузии временно закупоренного сосуда. Однако сложность хирургического вмешательства можно рассматривать как ограничение, так как оно включает в себя инвазивную хирургию и точное манипулирование различными артериями в непосредственной близости от трахеи и блуждающего нерва. Длительное воздействие анестетиков на животное также может быть критическим фактором для рассмотрения, поскольку влияние анестетиков на нейропротекцию и исход инсульта уже хорошо задокументировано16. Наконец, несмотря на сложность этой хирургической процедуры, она может быть завершена примерно за 20 минут при выполнении квалифицированным хирургом.
В отличие от ранее описанных «нитевидных» протоколов инсульта17,описанный здесь способ также позволяет измерять мозговой кровоток во время фаз окклюзии и реперфузии. Мониторинг кровотока во время реперфузии может быть важным параметром для предотвращения реперфузионного повреждения инсульта18,которое, как известно, вызывает вредные последствия у пациентов, проходящих фармакологические или эндоваскулярные вмешательства для реканализации тромбированных сосудов. Несмотря на расхождения между последствиями восстановления мозгового кровотока после MCAo19,вариабельность восстановления кровотока после инсульта может влиять на патофизиологические и биохимические события в головном мозге, а также на объем инфаркта и неврологический дефицит мышей с инсультом20. Поэтому в данной модели полное восстановление кровотока и его запись являются требованиями для обеспечения воспроизводимых инфарктов среди мышей, особенно в исследованиях поступательного инсульта.
Общая смертность во время хирургической процедуры составляет менее 5% и в основном вызвана анестезирующими осложнениями, кровотечениями или жертвоприношением из-за заранее определенных критериев исключения. Эта модель инсульта представляет, однако, умеренный уровень смертности в течение первых 24-48 часов после индукции инсульта, что может увеличить количество животных, необходимых для эксперимента для достижения адекватной когорты мышей, перенесших инсульт. С точки зрения объема инфаркта, эта модель вызывает большие инфаркты, с поражениями, охватывающими до 50% полушария. Он также вызывает отек мозга, поражая различные области мозга, включая корковые и подкорковые области.
Для достижения низкой изменчивости и высокой воспроизводимости модели инсульта следует учитывать несколько критериев исключения, в том числе: 1) время работы > 20 мин; 2) >20% снижения кровотока при лигировании ОАС (этап 3.3); 3) снижение кровотока при окклюзии < 80% от исходного значения предокклюзии; и 4) увеличение кровотока через 10 мин после реперфузии со скоростью <80% по сравнению с предреперфузионным значением. Для опытного и обученного хирурга животные не исключаются из-за критерия времени операции. Тем не менее, 10-15% животных показывают снижение кровотока на 20% при лигировании КЦА, а 5-10% не показывают адекватного снижения или увеличения кровотока во время окклюзии или реперфузии, соответственно. Таким образом, показатель успешности после исключения животных на основе этих критериев составляет примерно 75–85%.
Кроме того, животных ежедневно осматривают после MCAo (масса тела, температура и основное физиологическое поведение), чтобы контролировать болезнь, боль или дискомфортное поведение. В дополнение к этому общему уходу было разработано несколько тестов для специфического поведенческого анализа после очаговой ишемии головного мозга, несмотря на все известные тесты для оценки сенсомоторной дисфункции, такие как тест Ротарода21,тест липкой метки22,тест Углового23или тест цилиндра24. Здесь животные, отобранные для создания этой модели инсульта, оценивались на предмет фокального и общего дефицита, поскольку модель нити также индуцирует поведение цитокиновой болезни независимо от фокального (сенсорного или моторного) дефицита25. В совокупности модель инсульта «нити», описанная здесь, является ценной моделью для фундаментальных и трансляционных исследований инсульта. Эта модель предлагается в качестве стандартизированной модели хода, которая будет использоваться для гармонизации моделей инсульта в разных лабораториях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим всех наших партнеров по сотрудничеству консорциумов ImmunoStroke (FOR 2879, От иммунных клеток до восстановления после инсульта) за предложения и обсуждения. Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии в рамках Мюнхенского кластера системной неврологии (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) и в рамках грантов LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 и LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M.
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M.
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
