Summary
Мы сообщаем о методе мезоскопической реконструкции всего сердца мыши, сочетая новые достижения в области трансформации и окрашивания тканей с разработкой осевого сканируемого светового листового микроскопа.
Abstract
Как генетические, так и негенетические сердечные заболевания могут вызывать тяжелые процессы ремоделирования в сердце. Структурное ремоделирование, такое как отложение коллагена (фиброз) и клеточное смещение, может повлиять на электрическую проводимость, привести к электромеханическим дисфункциям и, в конечном итоге, привести к аритмии. Современные прогностические модели этих функциональных изменений основаны на неинтегрированной структурной информации с низким разрешением. Размещение этой структуры на другом порядке величины является сложной задачей из-за неэффективности стандартных методов визуализации при выполнении визуализации высокого разрешения в массивной ткани. В этой работе мы описываем методологическую основу, которая позволяет визуализировать целые сердца мыши с микрометрическим разрешением. Достижение этой цели потребовало технологических усилий, в которых были объединены достижения в области трансформации тканей и методов визуализации. Во-первых, мы описываем оптимизированный протокол CLARITY, способный превращать неповрежденное сердце в нанопористую, гидрогеле-гибридизированную, безлипидную форму, которая обеспечивает высокую прозрачность и глубокое окрашивание. Затем описывается флуоресцентный световой микроскоп, способный быстро получать изображения мезоскопического поля зрения (в масштабе мм) с микронным разрешением. Следуя проекту mesoSPIM, задуманный микроскоп позволяет реконструировать все сердце мыши с микрометрическим разрешением в одном томографическом сканировании. Мы считаем, что эта методологическая основа позволит прояснить участие цитоархитектуры в электрических дисфункциях и проложить путь к комплексной модели, которая учитывает как функциональные, так и структурные данные, что позволит провести единое исследование структурных причин, которые приводят к электрическим и механическим изменениям после ремоделирования тканей.
Introduction
Структурное ремоделирование, связанное с сердечными заболеваниями, может влиять на электропроводность и вводить электромеханические дисфункции органа 1,2. Современные подходы, используемые для прогнозирования функциональных изменений, обычно используют МРТ и DT-МРТ для получения общей реконструкции отложения фиброза, сосудистого дерева и распределения волокон сердца, и они используются для моделирования путей распространения потенциала предпочтительного действия (APP) через орган 3,4. Эти стратегии могут дать прекрасный обзор организации сердца. Однако их пространственное разрешение недостаточно для исследования влияния структурного ремоделирования на сердечную функцию на клеточном уровне.
Размещение этой структуры в другом порядке величины, где отдельные клетки могут играть индивидуальные роли в распространении потенциала действия, является сложной задачей. Основным ограничением является неэффективность стандартных методов визуализации для выполнения визуализации с высоким разрешением (микрометрическое разрешение) в массивных (сантиметровых) тканях. На самом деле, визуализация биологических тканей в 3D с высоким разрешением очень сложна из-за непрозрачности тканей. Наиболее распространенным подходом к выполнению 3D-реконструкций целых органов является подготовка тонких срезов. Однако точное секционирование, сборка и визуализация требуют значительных усилий и времени. Альтернативный подход, который не требует разрезания образца, заключается в создании прозрачной ткани. За последние годы было предложено несколько методик осветления тканей 5,6,7,8. Задача производства массивных, прозрачных и флуоресцентно меченых тканей была недавно достигнута путем разработки истинных подходов к трансформации тканей (CLARITY9, SHIELD10). В частности, метод CLARITY основан на превращении интактной ткани в нанопористую, гидрогелегибридизированную, безлипидную форму, что позволяет придать высокую прозрачность путем селективного удаления мембранных липидных бислоев. Примечательно, что этот метод был признан успешным также в кардиологической подготовке 11,12,13,14. Однако, поскольку сердце слишком хрупко, чтобы быть пригодным для активного очищения, оно должно быть очищено с использованием пассивного подхода, который требует длительного времени для придания полной прозрачности.
В сочетании с передовыми методами визуализации, такими как микроскопия светового листа, CLARITY имеет потенциал для изображения 3D-массивных тканей сердца с микрометрическим разрешением. В световой микроскопии освещение образца выполняется тонким листом света, ограниченным в фокальной плоскости объекта обнаружения. Флуоресцентное излучение собирается вдоль оси, перпендикулярной плоскости15 освещения. Архитектура обнаружения похожа на широкоугольную микроскопию, что делает сбор намного быстрее, чем лазерные сканирующие микроскопы. Перемещение образца по световому листу позволяет получить полную томографию крупных образцов, размером до сантиметра. Однако из-за внутренних свойств пучка Гаусса можно получить очень тонкий (порядка нескольких микрон) световой лист только для ограниченного пространственного расширения, тем самым резко ограничивая поле зрения (FoV). Недавно была введена новая схема возбуждения для преодоления этого ограничения и применена для визуализации мозга, позволяющая проводить 3D-реконструкции с изотропным разрешением16.
В настоящем документе представлен пассивный клиринговый подход, позволяющий значительно сократить сроки клиринга, необходимые в соответствии с протоколом CLARITY. Описанная здесь методологическая основа позволяет реконструировать целое сердце мыши с микрометрическим разрешением в одном томографическом сканировании со временем получения порядка минут.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры по обращению с животными были выполнены в соответствии с руководящими принципами Директивы 2010/63/ЕС Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях, и соответствовали принципам и правилам Министерства здравоохранения Италии. Протокол эксперимента был одобрен Министерством здравоохранения Италии (протокол No 647/2015-PR). Все животные были предоставлены КОМПАНИЕЙ ENVIGO, Италия. Для этих экспериментов использовались 5 самцов мышей C57BL/6J 6-месячного возраста.
1. Приготовление раствора
- Приготовьте 4% параформальдегида (PFA) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) (pH 7,6) в химической вытяжке. Храните 4% аликвоты PFA при -20 °C в течение нескольких месяцев.
- Приготовить раствор гидрогеля: смешать 4% акриламид, 0,05% бис-акриламид, 0,25% инициатор AV-044 в 0,01 М PBS в химической вытяжке. Держите реагенты и раствор на льду в течение всего приготовления. Хранить гидрогелевые аликвоты при -20 °C в течение нескольких месяцев.
- Приготовление очищающего раствора: Смешайте 200 мМ борной кислоты, 4% додецилсульфата натрия (SDS) в деионизированной воде; pH 8,6 в химической вытяжке. Храните раствор при температуре от 21 до 37 °C, чтобы избежать осаждения SDS.
- Готовят свежий раствор тирода в день эксперимента: добавляют 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 113 мМ NaCl, 1,2 мМ MgCl2 и 4,7 мМ KCl; титровать до рН 7,4 с помощью 1 М NaOH.
2. Изоляция сердца
- Вводят 0,1 мл 500 МЕ гепарина подкожно за 30 мин до процедуры изоляции сердца.
- Наполните шприц объемом 30 мл и три 6-сантиметровые чашки Петри свежим раствором Tyrode. Сделайте небольшой разлом (глубиной 3-4 мм) на границе одной из чашек Петри и поместите его под стереоскопический микроскоп.
- Прикрепите к шприцу канюлю диаметром 1 мм и вставьте ее в разлом чашки Петри. Убедитесь, что в шприце нет пузырьков воздуха.
- Наполните шприц объемом 20 мл 4% PFA и держите его в химической вытяжке. Приготовьте пустую чашку Петри под капотом.
- Обезболить мышь 3% изофлураном/кислородом со скоростью потока 1,0 л/мин и принести его в жертву при вывихе шейки матки в соответствии с действующими правилами благополучия животных.
- После жертвоприношения удалите мех над грудью и откройте грудь, чтобы иметь полный доступ к сердцу.
- Изолируйте сердце, погрузите его в чашку Петри, предварительно заполненную 50 мл раствора тирода. Используйте хирургические ножницы, чтобы разрезать аорту непосредственно возле дуги аорты, чтобы обнажить сердце.
- Перенесите сердце под стереоскопический микроскоп и аккуратно выполните канюляцию. Не вставляйте канюлю слишком глубоко в аорту (не более 2 мм), чтобы избежать повреждения тканей.
- Используйте небольшой зажим и шов (размер 5/0), чтобы зафиксировать сердце к канюле.
- Перфузируйте сердце 30 мл раствора Тирода с постоянным давлением 10 мл/мин для удаления крови из сосудов.
- Отсоедините канюлю от шприца и поместите сердце в чашку Петри, наполненную раствором Тирода. Будьте осторожны, чтобы в канюле не было пузырьков воздуха; в противном случае удалите пузырьки воздуха должным образом.
- Прикрепите шприц объемом 20 мл, наполненный холодным 4% PFA, к канюле и перфузируйте сердце при том же постоянном давлении.
- Инкубируют сердце в 10 мл 4% PFA при 4 °C в течение ночи (O/N). Чтобы избежать деградации тканей, выполните шаги 2.6-2.13 в кратчайшие сроки.
3. Очищение сердца
- На следующий день промыть сердце по 0,01 М PBS 3 раза при 4 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа сердце можно хранить в PBS + 0,01% азида натрия (NaN3) при 4 °C в течение нескольких месяцев. - Инкубируют сердце в 30 мл раствора гидрогеля в тряске (15 об/мин) при 4 °C в течение 3 дней.
- Дегазация образца при комнатной температуре с помощью сушилки, вакуумного насоса и трубчатой системы, которая соединяет сушилку как с насосом, так и с азотным трубопроводом.
- Поместите образец в сушилку и откройте флакон, держа на нем колпачок.
- Закройте сушилку и извлеките кислород из трубки, открыв азотный трубопровод.
- Включите вакуумный насос, чтобы удалить кислород из сушилки на 10 минут.
- Выключите насос и используйте ручку сушилки, чтобы открыть азотный трубопровод. Как только давление сравняется с атмосферным, осторожно откройте сушилку и быстро закройте флакон.
- Держите сердце в дегазированном растворе гидрогеля при 37 °C в течение 3 ч в состоянии покоя.
- Когда гидрогель будет правильно полимеризован и окажется полностью желатиновым, осторожно извлеките из него сердце и поместите его в держатель для образцов.
- Вставьте держатель образца с сердцем в одну из очистительных камер и закройте его должным образом, чтобы избежать утечки раствора для очистки.
- Включите водяную баню, где размещен контейнер для очищающего раствора, и перистальтический насос, чтобы начать рециркуляцию очищающего раствора.
- Меняйте очищающий раствор в контейнере раз в неделю, чтобы ускорить процедуру осветления.
4. Окрашивание клеточной мембраны
- Как только сердце полностью прояснится, извлеките его из держателя образца и промыте в 50 мл разогретого PBS в течение 24 часов. Снова промыть в 50 мл PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) в течение 24 ч.
- Инкубируют образец в 0,01 мг/мл агглютинина зародышей пшеницы (WGA) - Alexa Fluor 633 в 3 мл PBS-T 1x в тряске (50 об/мин) при комнатной температуре в течение 7 дней.
- После 7-дневной инкубации промыть образец в 50 мл PBS-T 1x при комнатной температуре при встряхивании в течение 24 ч.
- Инкубируйте образец в 4% PFA в течение 15 мин, а затем промывайте его 3 раза в PBS в течение 5 минут каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага сердце можно хранить в PBS + 0,01% NaN3 при 4 °C в течение нескольких месяцев. - Инкубируют сердце в возрастающих концентрациях 2,2'-тиодиэтанола (ТДЭ) в 0,01 М PBS (20% и 47% TDE/PBS) в течение 8 ч каждый, до конечной концентрации 68% TDE в 0,01 М PBS для обеспечения требуемого показателя преломления (RI = 1,46). Это ri-соответствующая среда (RI-среда) для получения изображений16.
5. Монтаж и приобретение сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: Все компоненты оптической системы подробно перечислены в Таблице материалов.
- Аккуратно заполните около 80% наружной кюветы (кварцевая, 45 мм × 45 мм × 42,5 мм) RI-средой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно использовать различные энергонезависимые решения, которые гарантируют RI 1,46. - Аккуратно наполните внутреннюю кювету (кварцевую, 45 мм × 12,5 мм × 12,5 мм) той же RI-средой.
- Погрузите образец внутрь внутренней кюветы. Инкубации образцов, описанные выше, позволяют образцу оставаться стабильным внутри RI-среды без удержания.
- Осторожно переместите образец в нижнюю часть кюветы с помощью тонкого пинцета и расположите сердце с его продольной осью параллельно главной оси кюветы, чтобы свести к минимуму световой путь возбуждения через ткань во время сканирования.
- Аккуратно закрепите специальную заглушку над внутренней кюветой двумя винтами.
- Установите образец на ступень микроскопа с помощью магнитов.
- Переведите вертикальный этап образца вручную, чтобы погрузить внутреннюю кювету во внешнюю.
- Включите источник света возбуждения (длина волны 638 нм), установив низкую мощность (порядка 3 мВт).
- Переместите образец с помощью моторизованного транслятора, чтобы осветить внутреннюю плоскость ткани.
- Включите программное обеспечение для обработки изображений (HCImageLive) и установите триггер камеры во внешний (световой лист) режим, чтобы управлять триггером сбора данных камеры пользовательским программным обеспечением, управляющим всей настройкой.
- Включите функцию «Автосохранения » на панели «Параметры сканирования» и задайте выходную папку, в которой необходимо сохранить изображения.
- Вручную отрегулируйте положение образца в плоскости XY с помощью линейных трансляторов, чтобы переместить образец в центр FoV датчика камеры.
- Переместите образец вдоль оси Z с помощью линейного моторизованного транслятора для определения границ сердца для томографической реконструкции.
- Увеличьте мощность лазера до ~20 мВт, готового к сеансу визуализации.
- Запустите томографическое получение, нажмите кнопку «Пуск» на панели последовательностей программного обеспечения для визуализации и одновременно переместите образец по оси Z с постоянной скоростью 6 мкм/с с помощью моторизованного транслятора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Разработанная пассивная очистительная установка позволяет получить очищенное сердце взрослой мыши (размером порядка 10 мм х 6 мм х 6 мм) примерно за 3 месяца. Все компоненты установки монтируются, как показано на рисунке 1. Незначительный температурный градиент между каждой клиринговой камерой (порядка 3°C) позволяет поддерживать температуру в правильном диапазоне во всех камерах.
Рисунок 1: Схема установки пассивной очистки. Очищающий раствор (после фильтрации) последовательно циркулирует через пробные камеры с помощью перистальтического насоса. Поддержание контейнера для раствора на водяной бане, установленной при 50 °C, позволяет температуре раствора находиться в пределах 37-45 °C в камерах. Изображение создано с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На рисунке 2 показан результат процесса очищения всего сердца. Как уже сообщали Costantini et al.16, сочетание методологии CLARITY с TDE в качестве RI-среды существенно не изменяет конечный объем образца и не приводит к анизотропной деформации образца.
Рисунок 2: Репрезентативное изображение сердца до (слева) и после (справа) протокола CLARITY. Сердца становятся полностью прозрачными и слегка негабаритными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Как только сердце было очищено, клеточные мембраны были окрашены Alexa Fluor 633-конъюгированным WGA для выполнения реконструкции цитоархитектуры всего органа. Изготовленный на заказ флуоресцентный световой микроскоп (рисунок 3) смог обеспечить разрешение в масштабе 3D-микронов по всему FoV.
Рисунок 3: МезоСПИМ. CAD рендеринг изготовленного на заказ флуоресцентного светового листового микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Учитывая числовую апертуру (NA = 0,1) оптики детектирования, радиальная (XY) функция точечного разброса (PSF) системы может быть оценена в порядке 4-5 мкм. С другой стороны, оптика возбуждения производит световой лист с минимальной талией около 6 мкм (full width half maximum, FWHM), который расходится до 175 мкм на краю FoV (рисунок 4A-C). Синхронизация скользящего затвора камеры с осевым сканированием лазерного луча обеспечивала сбор эмиссионного сигнала только в части образца, возбуждаемой талией светового листа, в результате чего средний FWHM составлял около 6,7 мкм вдоль всего FoV (рисунок 4B-D).
Рисунок 4: Генерация и характеристика светового листа. (A) Световой лист возбуждения, генерируемый лазерным источником 638 нм, фокусируется на центре поля зрения (FoV) и приобретается с размером пикселя 3,25 мкм и временем экспозиции 10 мс. Интенсивность света нормализуется и сообщается с помощью цветовой карты. Полумаксимальный полумаксималь полной ширины (FWHM) профиля интенсивности света оценивается в 15 различных положениях вдоль FoV. Результаты отображаются в формате C. (B) Изображение светового листа возбуждения, генерируемого синхронизацией между скользящим затвором камеры, работающим на частоте 1,92 Гц, и положением светового пучка, приводимым в действие настраиваемым объективом. FWHM профиля интенсивности света оценивается вдоль FoV, и результаты показаны в D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Z-PSF микроскопа также оценивали томографической реконструкцией флуоресцентной наносферы (рисунок 5). FWHM 6,4 мкм может быть оценен по соответствию, в хорошем соответствии с предыдущей оценкой.
Рисунок 5: Функция точечного разброса по оси Z. Функция точечного распространения (PSF) оптической системы оценивается путем визуализации флуоресцентных наносфер субмикронного масштаба (возбужденных световым листом с длиной волны 638 нм) с размером пикселя 3,25 мкм × 3,25 мкм × 2,0 мкм. Профиль интенсивности PSF вдоль оптической оси (Z) представлен в виде черных точек. Профиль PSF оснащен функцией Гаусса с μ = 18,6 мкм и σ = 2,7 мкм. FWHM PSF, оцениваемый по подгонке, составляет 6,4 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Благодаря высокой прозрачности ткани удалось осветить все сердце без существенных искажений осевого сканируемого светового листа при длине волны возбуждения 638 нм. Флуоресцентный сигнал собирался датчиком sCMOS, работающим при времени экспозиции 500 мс и частоте кадров 1,92 Гц. На основе предыдущей количественной оценки томографическая съемка выполнялась с использованием скорости Z-сканирования 6 мкм/с, и при частоте кадров 1,92 Гц был получен один кадр на каждые 3,12 мкм, что привело к превышению дискретизации системы Z-PSF примерно в два раза. Две репрезентативные рамки (на корональной и поперечной плоскостях) камеры левого желудочка показаны на рисунке 6. Этот результат подтверждает потенциал системы для разрешения одиночных клеточных мембран в трех измерениях с достаточным соотношением сигнал/шум во всем органе (рисунок 6).
Рисунок 6: Реконструкция сердечной ткани мыши. Осветленное сердце было окрашено WGA, сопряженным с Alexa Fluor 633 и возбужденным лазерным источником с длиной волны 638 нм. А) корональная и В) поперечные репрезентативные секции. (С-Д) Трансформация тканей производит высокую прозрачность тканей, позволяя разрешать небольшие структуры в глубине стенки. Оптическая система показывает осевое разрешение, достаточное для разрешения микрометрических структур (панель. D). (E) 3D-рендеринг сердца с низким разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе был представлен успешный подход к очистке, окрашиванию и изображению целого сердца мыши в высоком разрешении. Сначала был оптимизирован и выполнен протокол трансформации тканей (CLARITY), слегка модифицированный для его применения на сердечной ткани. Действительно, чтобы получить эффективную реконструкцию в 3D всего сердца, важно предотвратить явление рассеяния света. Методология CLARITY позволяет получить высокопрозрачное неповрежденное сердце, но требует длительного времени инкубации при пассивном выполнении (около 5 месяцев). По отношению к мозгу сердечная ткань не подходит для активного очищения, которое использует электрическое поле. Даже при низких напряжениях электрическое поле приводит к повреждениям и поломкам тканей. Здесь пассивный подход к очистке был оптимизирован для получения полностью очищенного сердца примерно за 3 месяца. После выделения и каннюляции сердца через проксимальную аорту была выполнена методология CLARITY, как описано в разделе 3 протокола. Чтобы ускорить процедуру, была организована самодельная пассивная очистка (рисунок 1), которая в конечном итоге сократила сроки очистки тканей примерно на 40%. Установка состоит из контейнера для очистки раствора, водяной бани, перистальтического насоса, нескольких камер, содержащих различные держатели образцов, капсульных фильтров для каждой камеры и системы трубок для рециркуляции раствора. Насос извлекает и циркулирует раствор из контейнера последовательно через каждую из камер, где образцы удерживаются для очистки. Перед входом в камеры раствор проходит через капсульный фильтр, чтобы улавливать липиды, смытые из тканей во время очистки. Оптимальная температура для очищающего раствора, между 37-45 °C, поддерживается в камерах во время рециркуляции путем хранения контейнера для раствора на водяной бане при 50 °C. Во время процедуры рекомендуется менять очищающий раствор в контейнере один раз в неделю. Все используемые компоненты подробно перечислены в Таблице материалов. Представленное здесь оптимизированное решение позволяет получить целое пассивно очищенное сердце мыши за значительно более короткое время по сравнению со стандартной пассивной техникой очистки, тем самым сокращая требуемое экспериментальное время без повреждения органа. Подход окрашивания также был оптимизирован для гомогенной маркировки клеточных мембран и эндотелия с использованием флуоресцентного лектина (WGA - Alexa Fluor 633).
Цитоархитектура сердца была реконструирована путем разработки специального мезоСПИМА, который осевым образом перемещает световой лист по образцу (https://mesospim.org). Изготовленный на заказ флуоресцентный световой листовой микроскоп (рисунок 3) смог быстро получать изображения мезоскопического FoV (порядка миллиметров) с микрометрическим разрешением. Таким образом, отдельные кардиомиоциты могут быть разрешены и отображены в 3D-реконструкцию всего органа. Микроскоп освещает очищенный образец световым листом, динамически генерируемым путем сканирования лазерного луча на 638 нм с использованием гальванометрического зеркала. Камера sCMOS характеризует рычаг обнаружения в схеме 2-кратного увеличения, что позволяет ему получать весь FoV за одно сканирование. Флуоресцентный сигнал выбирали путем размещения длинночастотного фильтра после объектива. Камера была настроена на работу в режиме скользящего затвора: в любое время линии активных пикселей камеры (т.е. выставленных на изображение) синхронизируются с плоскостным смещением фокальной полосы светового листа, выполняемым электрически настраиваемым объективом. Этот подход максимизировал возможность оптического сечения во всем FoV, получая изображения только в самой тонкой части сфокусированного светового листа. Это решение отличается от обычных конфигураций, где захват включает в себя весь диапазон фокусной глубины светового листа, предотвращая пиковое разрешение оптического сечения в значительной части FoV. Интегрированная ступень образца поддерживает кюветы, тем самым оптимизируя позиционирование и обеспечивая осевое движение образца во время процесса визуализации. Таким образом, томографические реконструкции возможны путем приобретения последовательных внутренних срезов. Полученные изображения имеют мезоскопический FoV и микрометрическое разрешение, в то время как время сбора, необходимое для всего сердца мыши, составляет ~ 15 мин. Синхронизация между скользящим затвором камеры и световым пучком возбуждения, проносящим FoV, позволяет получить всю плоскость изображения с высоким пространственным разрешением (рисунок 4). Это позволяет напрямую реконструировать образец за один томографический захват без необходимости радиального смещения образца и визуализации на основе нескольких смежных стеков. Примечательно, что микроскоп позволил реконструировать весь орган примерно (10 мм х 6 мм х 6 мм) за один сеанс визуализации, с почти изотропным размером вокселя и достаточным соотношением сигнал/фон для потенциального разрешения отдельных клеток по всему органу.
Следует отметить, что в предлагаемом протоколе представлены некоторые важнейшие шаги, которые должны быть выполнены осторожно для достижения хороших результатов. В частности, канюляция сердца через проксимальную аорту может быть довольно сложной, но это важный шаг для правильного мытья и фиксации органа. Jadd et al.17 показали, как эффективно выполнить этот шаг. Кроме того, процедура дегазации, необходимая протоколом CLARITY, также довольно сложна, но она необходима для сохранения тканей; если этот этап не выполняется должным образом, ткань может столкнуться с повреждениями и распадом во время инкубации в очищающем растворе.
Кроме того, хотя представленный экспериментальный рабочий процесс подходит для небольших флуоресцентных зондов, использование иммуногистохимии не всегда обеспечивает хорошую эффективность в окрашивании из-за более высокой молекулярной массы антител. Каждый протокол иммуноокрашения требует надлежащей оптимизации, и были разработаны различные подходы для улучшения проникновения антител, например, расширение тканей18 и/или изменения рН и ионной силы19.
Установка mesoSPIM также имеет два основных ограничения: i) сохранение светового листа по всему образцу сильно зависит от прозрачности ткани и ii) размер датчика камеры ограничивает FoV. Гарантировать идеальное соответствие показателя преломления внутри всего сердца очень сложно, и небольшие изменения показателя преломления могут привести к рассеянию света, что приведет к ухудшению качества изображения. В связи с этим может быть введена двухсторонняя схема освещения. Два рычага возбуждения могут генерировать два отдельных и выровненных динамических световых листа с максимально сфокусированным освещением, чередуя освещение с одной стороны на другую образца. Кроме того, FoV может быть улучшен за счет использования нового поколения sCMOS с задней подсветкой высокого разрешения с очень большими датчиками в сочетании с телецентрическими объективами с высокой числовой диафрагмой с низкими искажениями поля. Эта реализация позволит нам реконструировать более крупные органы или расширенные ткани, сохраняя ту же способность оптического сечения и, таким образом, создавая микронные 3D-изображения очищенных образцов сантиметрового размера.
Хотя представленный протокол по-прежнему требует длительного времени для пробоподготовки и высокого уровня прозрачности для получения надежной цитоархитектурной реконструкции всего органа, основное значение подхода заключается в улучшении протокола очистки и возможности выполнения мезоскопической реконструкции в одном сканировании с микрометрическим разрешением. В будущем эти достижения могут быть объединены с протоколом мульти окрашивания для достижения реконструкции всего органа, объединяющей различные биологические структуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ничего не разглашать.
Acknowledgments
Этот проект получил финансирование от исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No 952166 (REPAIR), MUR в рамках программы FISR, проекта FISR2019_00320 и Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, проекта PERCARE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
