Summary
I roditori non sono in grado di segnalare sintomi di emicrania. Qui, descriviamo un paradigma di test gestibile (test luce / buio e campo aperto) per misurare l'avversione alla luce, uno dei sintomi più comuni e fastidiosi nei pazienti con emicrania.
Abstract
L'emicrania è un disturbo neurologico complesso caratterizzato da cefalea e anomalie sensoriali, come l'ipersensibilità alla luce, osservata come fotofobia. Mentre è impossibile confermare che un topo sta vivendo l'emicrania, l'avversione alla luce può essere utilizzata come surrogato comportamentale per il sintomo emicranico della fotofobia. Per testare l'avversione alla luce, utilizziamo il test luce / buio per misurare il tempo che i topi scelgono liberamente di trascorrere in un ambiente chiaro o scuro. Il test è stato perfezionato introducendo due modifiche critiche: pre-esposizioni alla camera prima dell'esecuzione della procedura di prova e illuminazione della camera regolabile, consentendo l'uso di una gamma di intensità luminose da 55 lux a 27.000 lux. Poiché la scelta di trascorrere più tempo al buio è anche indicativa di ansia, utilizziamo anche un test di ansia indipendente dalla luce, il test in campo aperto, per distinguere l'ansia dal comportamento avversivo alla luce. Qui, descriviamo un paradigma di test modificato per i saggi di luce / buio e campo aperto. L'applicazione di questi saggi è descritta per l'iniezione intraperitoneale di peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) in due ceppi di topo e per studi di stimolazione cerebrale optogenetica.
Introduction
L'emicrania è una malattia neurologica prevalente, che colpisce circa il 17% degli americani1 ed è la seconda causa di disabilità a livello globale2,3. I pazienti manifestano cefalea che dura 4-72 ore accompagnata da almeno uno dei seguenti sintomi: nausea e/o vomito, o fotofobia e fonofobia4. I recenti progressi nello sviluppo di anticorpi peptidici correlati al gene della calcitonina (CGRP) che sono ora approvati dalla FDA hanno iniziato una nuova era per il trattamento dell'emicrania5,6,7. Questi anticorpi bloccano il CGRP o il suo recettore e prevengono i sintomi dell'emicrania in circa il 50% dei pazienti con emicrania7. Nell'ultimo anno, due antagonisti a piccole molecole del recettore CGRP sono stati approvati dalla FDA per il trattamento abortivo dell'emicrania e altri due sono in cantiere8. Nonostante questo progresso terapeutico, i meccanismi con cui si verificano gli attacchi di emicrania rimangono ancora sfuggenti. Ad esempio, i siti di azione CGRP non sono noti. L'efficacia degli anticorpi terapeutici che non attraversano sensibilmente la barriera emato-encefalica suggerisce che il CGRP agisce in siti periferici, come le meningi e/o i gangli trigemini. Tuttavia, non possiamo escludere azioni centrali contro gli organi circumventriculari, che mancano di una barriera emato-encefalica9. Almeno per la fotofobia, pensiamo che questo sia meno probabile dati i nostri risultati con l'avversione alla luce usando topi transgenici nestin/ hRAMP1 in cui hRAMP1 è sovraespresso nel tessuto nervoso10. Comprendere i meccanismi della fisiopatologia dell'emicrania fornirà nuove strade per lo sviluppo di terapie per l'emicrania.
I modelli animali preclinici sono fondamentali per comprendere i meccanismi della malattia e lo sviluppo di nuovi farmaci. Tuttavia, la valutazione dell'emicrania negli animali è impegnativa poiché gli animali non possono riferire verbalmente le loro sensazioni di dolore. Dato che l'80-90% dei pazienti con emicrania presenta fotofobia11, l'avversione alla luce è considerata un indicatore di emicrania nei modelli animali. Ciò ha portato alla necessità di sviluppare un test per valutare l'avversione alla luce nei topi.
Il saggio chiaro/scuro contiene una zona chiara e una zona scura. È ampiamente usato per misurare l'ansia nei topi in base alla loro esplorazione spontanea di nuovi ambienti che è contrastata dalla loro innata avversione alla luce12. Alcuni studi impostano 1/3 della camera come zona scura, mentre altri impostano 1/2 della camera come zona scura. La prima impostazione viene spesso utilizzata per rilevare l'ansia13. Mentre inizialmente abbiamo scelto camere chiare / scure di dimensioni uguali, non abbiamo confrontato le due dimensioni relative. Possiamo commentare che la dimensione complessiva di entrambe le camere non è un fattore importante poiché la scatola di prova iniziale14 era considerevolmente più grande dell'apparato successivo15, ma i risultati erano essenzialmente gli stessi.
Due modifiche critiche a questo test luce/buio per valutare l'avversione alla luce sono state: la condizione di test e l'intensità della luce (Figura 1). In primo luogo, i topi sono pre-esposti alla camera chiaro/scura per ridurre l'unità esplorativa16 (Figura 1A). La necessità e i tempi delle pre-esposizioni dipendono dai ceppi e dai modelli murini. I topi wildtype C57BL/6J di solito richiedono due pre-esposizioni10, mentre è sufficiente una sola pre-esposizione per i topi CD117. In questo modo, il comportamento avversivo alla luce può essere smascherato in questi due ceppi di topo. In secondo luogo, l'illuminazione della camera è stata adattata per includere una gamma regolabile di intensità luminose da fioca (55 lux) a luminosa (27.000 lux) dove 55 lux è paragonabile a una giornata nuvolosa e 27.000 lux è paragonabile a una luminosa giornata di sole all'ombra10. Abbiamo scoperto che l'intensità luminosa richiesta varia con il ceppo e il modello genetico. Per questo motivo, gli individui dovrebbero prima valutare l'intensità minima della luce per il loro paradigma sperimentale.
Anche con queste modifiche al test, che possono rivelare un fenotipo avversivo alla luce, è necessario testare il comportamento ansioso per distinguere tra avversione alla luce dovuta alla sola luce rispetto all'ansia. Il test in campo aperto è un modo tradizionale per misurare l'ansia basato sull'esplorazione spontanea di nuovi ambienti. Si differenzia dal saggio luce/buio in quanto l'unità esplorativa è contrastata dall'innata avversione verso gli spazi aperti non protetti. Sia il centro che i bordi della camera sono nella luce, quindi il test in campo aperto è un test di ansia indipendente dalla luce. Pertanto, la combinazione dei saggi luce/buio e campo aperto ci consente di distinguere tra l'avversione alla luce dovuta all'evitamento della luce rispetto a un aumento complessivo dell'ansia.
CGRP è un neuropeptide multifunzionale che regola la vasodilatazione, la nocicezione e l'infiammazione18. È ampiamente espresso nel sistema nervoso periferico e centrale. Svolge un ruolo importante nella fisiopatologia dell'emicrania18. Tuttavia, il meccanismo alla base dell'azione CGRP nell'emicrania non è chiaro. Utilizzando i saggi di luce/buio e campo aperto con questo paradigma di test modificato, siamo stati in grado di identificare il comportamento avversivo alla luce nei topi dopo somministrazione periferica10,16 (Figura 2) e centrale14,15,16,19 CGRP. Oltre ai neuropeptidi, anche l'identificazione delle regioni cerebrali coinvolte nell'avversione alla luce è importante per comprendere la fisiopatologia dell'emicrania. I nuclei talamici posteriori sono una regione cerebrale integrativa per il dolore e l'elaborazione della luce19 e il talamo viene attivato durante l'emicrania20. Pertanto, abbiamo preso di mira i nuclei talamici posteriori iniettando virus adeno-associato (AAV) contenente channelrhodopsin-2 (ChR2) o eYFP in questa regione. Combinando questo approccio optogenetico con questi due saggi, abbiamo dimostrato che la stimolazione ottica dei neuroni che esprimono ChR2 nei nuclei talamici posteriori ha indotto l'avversione alla luce19 (Figura 3). In questo esperimento, dato l'effetto drammatico sull'avversione alla luce evocata in questi topi manipolati optogeneticamente, le pre-esposizioni alla camera sono state saltate.
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Protocol
Le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Iowa ed eseguite in conformità con gli standard stabiliti dal National Institutes of Health.
1. Saggio chiaro/scuro
- Configurazione dell'apparato a camera chiara/scura (vedi Tabella dei materiali). Tutte le attrezzature in questa sezione sono disponibili in commercio.
- Su uno scaffale, posizionare la cabina fonoassorbente (interno: 59,7 x 38 x 35,6 cm in L x A x P) contenente un cassetto estraibile per un facile accesso alla camera e all'inserto scuro.
- Collegare l'alimentatore CC e un alimentatore regolato CC al cubicolo di attenuazione del suono.
- Posizionare la camera trasparente a campo aperto senza cuciture (27,31 x 27,31 x 20,32 cm in L x P x A) sul cassetto estraibile del cubicolo.
- Posizionare l'inserto in plastica scura nera trasparente a infrarossi (IR) (28,7 X 15 X 20,6 cm in L x P x A) nella camera a campo aperto. Assicurarsi che la camera sia divisa in due zone di uguali dimensioni: una zona scura e una zona chiara.
- Collegare tre serie di array IR a 16 fasci sugli assi X, Y e Z della camera a campo aperto al controller USB IR tramite cavi.
- Collegare il controller USB IR a un computer.
- Installare il software di tracciamento sul computer che può registrare e raccogliere la posizione e l'attività del mouse.
- Per la configurazione del pannello luminoso, rimuovere innanzitutto il pannello luminoso a diodi emettitori di luce (LED) (27,70 x 27,70 cm in L x L; 360 LED, colore bilanciato alla luce diurna, 5600K, diffusione del fascio di inondazione a 60 °) dal suo alloggiamento originale.
- Assemblare il pannello luminoso con il driver LED, il dissipatore di calore e l'alimentatore. Più pannelli luminosi a LED possono essere collegati a un alimentatore, un dissipatore di calore e un driver LED per ottenere un controllo uniforme del pannello luminoso.
- Costruisci una piattaforma acrilica personalizzata (29,77 x 27,70 x 8,10 cm in L x P x A) composta da 7 ripiani identici a intervalli di 0,53 cm (Figura 1B). Applicare in modo permanente il ripiano acrilico personalizzato al soffitto all'interno del cubicolo sopra la camera.
- Inserire il pannello luminoso a LED nella fessura tra i due ripiani inferiori. Regolare il pannello luminoso a diverse altezze (Figura 1B, C), se necessario (ad esempio, se si utilizzano topi optogenetici. I dettagli sono discussi nella Sezione 3).
- Accendere il dissipatore di calore, il driver LED e l'alimentatore. Verificare che il driver LED sia in grado di dettare l'intensità della luce LED misurando l'intensità luminosa sul pavimento della camera e verificare che il pavimento sia illuminato in modo uniforme.
- Procedura di test comportamentale
NOTA: i mouse sono alloggiati su un ciclo di luce di 12 ore. Tutti gli esperimenti comportamentali vengono eseguiti durante il ciclo di luce. Vengono utilizzati topi, inclusi maschi e femmine, di età compresa tra 10 e 20 settimane. In questo protocollo, i topi naïve wildtype CD1 e C57BL/6J sperimentano due pre-esposizioni alla camera chiara/scura seguite dall'esposizione con trattamento e da un'esposizione post-trattamento. C'è un intervallo di tre giorni tra ogni esposizione per consentire ai topi di recuperare (Giorno 1, 4, 7 e 10 come descritto di seguito e Figura 1A). Tuttavia, i topi CD1 non richiedono la 2a pre-esposizione e possono essere testati in penombra.- Il giorno 1 (pretrattamento 1), accendere l'apparecchiatura di analisi luce/buio e impostare l'intensità della luce a 27.000 lux.
- Aprire il software di tracciamento e impostare un nuovo protocollo. Nell'impostazione Nuovo protocollo , impostare Durata su 30 min. Nell'impostazione Nuova analisi , impostare Raccoglitori dati per durata su 300 s.
- Nell'impostazione Nuova zona , scegliere Zone predefinite. Scegliere 2 e quindi Orizzontale. Controllare se la camera è divisa in due zone di uguali dimensioni orizzontalmente per la registrazione.
- Abituare i topi alla sala di prova per 1 ora prima del test. Durante l'assuefazione, tenere accesa la luce della stanza per non interrompere il ritmo circadiano del mouse. Assicurarsi che tutte le apparecchiature per il test chiaro/scuro siano accese, consentendo ai mouse di acclimatarsi completamente all'ambiente della sala prove.
- Seleziona Acquisisci dati. Immettere gli ID del mouse. Avviare il protocollo.
- Tirare il cassetto all'esterno della cabina fonoassorbente per accedere alla camera chiara/scura e all'inserto scuro. Sollevare delicatamente il mouse dalla base della coda, posizionarlo nella zona luminosa della camera e spingere il cassetto all'interno del cubicolo. Assicurarsi che il software rilevi immediatamente il mouse e inizi a registrare l'attività.
- Attendi che la registrazione si interrompa automaticamente dopo 30 minuti. Riporta il mouse nella sua gabbia di casa.
- Pulire la camera e l'inserto scuro utilizzando salviette monouso germicide di odore di alcol contenenti il 55,0% di alcol isopropilico, lo 0,25% di alchil C12-18 dimetil etilbenzilo ammonio e lo 0,25% di alchil C12-18 dimetil benzil ammonio cloruro come principi attivi antimicrobici per sradicare eventuali segnali olfattivi lasciati dal topo precedente.
- Il giorno 4 (pretrattamento 2), ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.8.
- Il giorno 7 (il giorno del trattamento), ripetere i passaggi 1.2.1 e 1.2.4. Dopo l'assuefazione, somministrare CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g in base al peso corporeo del topo, iniezione intraperitoneale (i.p.)), inclinando la testa del mouse in avanti e iniettando nel quadrante inferiore destro. Riportare il mouse nella gabbia di casa.
- Dopo 30 minuti, avviare il protocollo ed eseguire il mouse nella camera chiara/scura come indicato nei passaggi da 1.2.5 a 1.2.7. Il tempo di recupero nelle gabbie domestiche dopo le iniezioni può essere ridotto o allungato a seconda del trattamento21.
- Pulire la camera e l'inserto scuro come descritto al punto 1.2.8.
- Il giorno 10 (giorno post-trattamento), ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.8. L'esperimento può essere sospeso al passaggio 1.2.13 prima di iniziare il test in campo aperto.
2. Test a campo aperto
- La configurazione dell'apparato
- Configurazione della camera a campo aperto: utilizzare la stessa cabina di attenuazione del suono e la stessa camera a campo aperto utilizzate nel test luce/buio, senza utilizzare l'inserto scuro.
- Configurazione del pannello luminoso: utilizzare la stessa configurazione utilizzata nel test chiaro/scuro. Assicurarsi che l'intensità della luce sia la stessa utilizzata nel test luce/buio.
- Procedura di test comportamentale
- Accendere l'apparecchio. Impostare l'intensità della luce su 27.000 lux.
- Apri il software di tracciamento.
- Impostare un nuovo protocollo, lo stesso utilizzato nel test chiaro/scuro, ad eccezione delle impostazioni Nuova zona . Scegliere 1 seguito dal Centro nelle impostazioni Nuova zona . Impostare la periferia a 3,97 cm dal perimetro e il centro a 19,05 × 19,05 cm.
- Abituare i topi alla sala prove come descritto al punto 1.2.4.
- Somministrare CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g in base al peso corporeo del topo, cioè), inclinando la testa del mouse in avanti e iniettando nel quadrante inferiore destro. Riportare il mouse nella gabbia di casa.
- Dopo 30 minuti, avviare il protocollo. Estrarre il cassetto estraibile all'esterno della cabina di attenuazione del suono e posizionare delicatamente il mouse al centro della camera a campo aperto. Spingere il cassetto all'interno del cubicolo.
- Tieni traccia del comportamento per 30 minuti. Quindi riporta i topi nelle loro gabbie di casa.
- Pulire l'apparecchio come descritto al punto 1.2.8.
3. Test chiaro/scuro modificato per topi optogenetici
- La configurazione dell'apparato
- Apportate due modifiche all'inserto scuro.
- Modificare l'apertura dell'inserto scuro a 5,08 x 5,08 cm (L x A) con una piccola fessura 0,95 x 10,16 cm (L X A) tra la parte superiore e l'apertura dell'inserto scuro (Figura 1D in alto a sinistra).
NOTA: questa modifica consente a un mouse di accedere alla zona buia senza difficoltà quando la cannula in fibra ottica sulla testa del mouse è collegata al cavo patch. - Estendere la parte superiore dell'inserto scuro sopra l'area chiara come un portico triangolare (H = 6,5 cm) (Figura 1D in alto a destra e in basso a sinistra). Tagliare un foro circolare (D = 1,7 cm) dal portico e inserire un supporto nel foro per posizionare e stabilizzare il giunto rotante, che collega il laser e i cavi patch in fibra ottica (Figura 1D in alto a sinistra e in basso a sinistra).
NOTA: Le modifiche comportano un piccolo cambiamento nell'intensità della luce che raggiunge il pavimento della zona scura (17 lux con modifiche contro 14 lux senza modifiche, misurato nell'angolo posteriore destro della zona scura sotto i 27.000 lux).
- Modificare l'apertura dell'inserto scuro a 5,08 x 5,08 cm (L x A) con una piccola fessura 0,95 x 10,16 cm (L X A) tra la parte superiore e l'apertura dell'inserto scuro (Figura 1D in alto a sinistra).
- Inserire il giunto rotante nel supporto sull'inserto scuro.
- Collegare il cavo patch in fibra ottica da 30,5 cm al giunto rotante. Verificare che il giunto rotante possa ruotare senza intoppi in modo che il cavo patch possa ruotare senza difficoltà mentre il mouse attraversa la camera.
- Per il resto della configurazione, utilizzare la stessa configurazione dell'apparecchio utilizzata nella sezione 1 (saggio chiaro/scuro).
- Apportate due modifiche all'inserto scuro.
- Procedura di test comportamentale
NOTA: A differenza dei topi wildtype, i topi optogenetici non ricevono pre-esposizioni (pretrattamento 1 e 2).- Il giorno del test, inserire il pannello luminoso a LED nel secondo slot più basso (28,23 cm dal pavimento del camber) per consentire lo spazio per il collegamento del cavo patch. Accendere l'apparecchiatura di analisi luce/buio e impostare l'intensità della luce su 55 lux.
- Utilizzare la stessa configurazione del protocollo di cui alle versioni 1.2.2 e 1.2.3, ad eccezione del fatto che i raccoglitori di dati per durata sono impostati su 60 s nell'impostazione Nuova analisi in modo che sia congruente con il protocollo di stimolazione laser nel passaggio 3.2.3.
- Accendere il pulsante di accensione laser. Impostare il controller dell'impulso laser per stimolare per 1 minuto seguito da 1 minuto senza stimolazione oltre 30 minuti.
- Abituare i topi alla sala prove con la luce accesa per 1 ora prima del test.
- Avviare il protocollo. Estrarre il cassetto estraibile all'esterno del cubicolo fonoassorbente per accedere alla camera chiara/scura e all'inserto scuro.
- Trattenere delicatamente il mouse e accoppiare la cannula in fibra ottica sulla testa del mouse al cavo patch in fibra ottica tramite un manicotto di accoppiamento (Figura 1D in basso a destra). Posizionare delicatamente il mouse nella zona luminosa e spingere il cassetto all'interno del cubicolo. Assicurarsi che il protocollo inizi a registrare automaticamente il comportamento del mouse.
- A 1 minuto, accendere il controller di impulsi e quindi accendere il tasto failsafe su ON. Assicurati che la stimolazione laser della regione del cervello mirata si verifichi ogni due minuti.
- Dopo 30 minuti, quando il protocollo si arresta automaticamente, ruotare la chiave failsafe su OFF. Quindi spegnere il controller degli impulsi.
- Disaccoppia il mouse e il cavo patch in fibra ottica. Riportare il mouse nella gabbia di casa.
- Pulire la camera e l'inserto scuro come descritto al punto 1.2.8.
4. Test in campo aperto modificato per topi optogenetici
- La configurazione dell'apparato
- Stabilizzare il giunto rotante sopra la camera utilizzando un supporto e un morsetto (Figura 1E).
- Collegare il cavo patch in fibra ottica con una lunghezza di 50 cm al giunto rotante. Controllare se il giunto rotante può ruotare senza intoppi.
- Impostare il giunto rotante all'altezza appropriata sul supporto: assicurarsi che il cavo patch in fibra ottica possa raggiungere solo ogni angolo della camera, il che contribuirà a evitare qualsiasi interferenza con il movimento del mouse.
- Per il resto della configurazione, utilizzare la stessa configurazione dell'apparecchio utilizzata nella sezione 1 (saggio chiaro/scuro), ma senza l'inserto scuro.
- Procedura di test comportamentale
- Accendere l'apparecchiatura di analisi luce/buio e impostare l'intensità della luce su 55 lux.
- Utilizzare la stessa configurazione del protocollo utilizzata nel test luce/buio modificato (sezione 3), ad eccezione delle impostazioni Nuova zona . Scegliere 1 in base al centro nelle impostazioni Nuova zona . Impostare la periferia a 3,97 cm dal perimetro e il centro a 19,05 × 19,05 cm.
- Accendere il pulsante di accensione laser. Impostare il controller dell'impulso laser per stimolare per 1 minuto seguito da 1 minuto senza stimolazione oltre 30 minuti.
- Eseguire l'assuefazione e il resto della prova come descritto nei passaggi da 3.2.4 a 3.2.10 ad eccezione di due modifiche al punto 3.2.6: posizionare delicatamente il mouse al centro della camera anziché nella zona di luce; tenere il cassetto estraibile all'esterno del cubicolo a causa del cavo patch che si collega alla testa del mouse.
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Representative Results
Questo paradigma di test comportamentale è progettato per testare il comportamento avversivo alla luce. Può essere eseguito utilizzando sia topi wildtype naïve che topi optogenetici per studiare l'avversione alla luce in tempo reale durante la stimolazione di una popolazione neuronale mirata.
Questa procedura è stata utilizzata per studiare l'effetto del trattamento periferico con CGRP nei topi CD1 e C57BL/6J10,16 e la stimolazione ottica dei neuroni nei nuclei talamici posteriori nei topi C57BL/6J19 sul comportamento avversivo alla luce. I topi, inclusi maschi e femmine, di età compresa tra 10 e 20 settimane, sono stati utilizzati negli esperimenti (Figura 2A, Figura 2B-D e Figura 3). I risultati hanno rivelato che l'iniezione i.p. di CGRP ha ridotto significativamente la durata del tempo trascorso nella zona luce nel saggio luce/buio nei topi CD1 (Figura 2A) e C57BL/6J (Figura 2B), ma non ha influenzato il tempo trascorso dai topi al centro nel test in campo aperto nei topi CD1 (dati non mostrati) e C57BL/6J (Figura 2D)10, 16. Ciò suggerisce che il CGRP periferico induce avversione alla luce ma non ansia generale. Il trattamento con CGRP ha anche aumentato la quantità di tempo in cui i topi hanno riposato nella zona scura ma non nella zona di luce sia nei topi CD1 (dati non mostrati) che in quelli C57BL / 6J (Figura 2C).
Per il protocollo optogenetico, abbiamo preso di mira i neuroni che esprimono calmodulina chinasi II alfa (CaMKIIa) nei nuclei talamici posteriori iniettando AAV2-CaMKIIa-hChR2(E123A)-eYFP o il virus di controllo AAV2-CaMKIIa-eYFP19. Allo stesso tempo, una cannula in fibra ottica è stata impiantata nei nuclei talamici posteriori. Tre settimane dopo l'iniezione per consentire un tempo sufficiente per l'espressione di ChR2, abbiamo eseguito la stimolazione ottica dei neuroni nei nuclei talamici posteriori e abbiamo notato una corrispondente diminuzione della durata dei topi trascorsi nella zona luce nel test luce/buio nei topi iniettati con ChR2 rispetto ai topi iniettati da virus di controllo (eYFP) (Figura 3A). Non è stata notata alcuna differenza nel tempo al centro nel test in campo aperto tra ChR2 e topi eYFP di controllo (Figura 3C), indicativa di una risposta avversiva alla luce che non era guidata esclusivamente dall'ansia19. Inoltre, è stato notato anche un aumento del tempo di riposo nella zona scura, ma non nella zona chiara (Figura 3B). Gli stessi risultati sono stati ottenuti utilizzando 55 lux e 27.000 lux (Figura 3). La procedura a 55 lux è stata inclusa perché i pazienti con emicrania sono sensibili anche alla luce fioca.
Figura 1: La linea temporale e l'apparato del saggio luce/buio. (A) Cronologia del paradigma di test: dopo due pre-esposizioni alla camera chiaro/scura (Pre 1 e Pre 2), ai topi viene somministrato CGRP (0,1 mg/kg, i.p.) seguito da una misurazione post-trattamento (Post). Almeno un giorno dopo il test chiaro/scuro, ai topi viene somministrato nuovamente CGRP (0,1 mg/kg, cioè) e vengono eseguiti nel test in campo aperto. Pre: pretrattamento; Tx: trattamento; Post: post-trattamento (B) Il pannello LED è tenuto nella parte superiore della camera da un ripiano acrilico e illumina l'area di prova. L'altezza del pannello luminoso può essere regolata utilizzando slot a diverse altezze. (C) La camera chiaro/scuro contiene un inserto scuro con una piccola apertura. Un pannello luminoso a LED si trova sopra la camera. (D) Viste frontali, laterali e superiori dell'inserto scuro modificato. L'apertura nell'inserto scuro è estesa con una piccola fessura per il movimento del cavo patch (in alto a sinistra). La parte superiore dell'inserto scuro si estende sulla zona chiara come un portico triangolare con un supporto per il giunto rotatorio (in alto a destra e in basso a sinistra). Il cavo patch in fibra ottica è collegato alla cannula in fibra ottica tramite un manicotto di accoppiamento (in basso a destra). (E) Il saggio in campo aperto modificato. Il supporto e il morsetto tengono il giunto rotatorio. La camera viene estratta nella parte anteriore del cubicolo con le porte lasciate aperte per consentire il libero movimento del mouse con il cavo patch attaccato alla testa del mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La somministrazione periferica di CGRP evoca l'avversione alla luce in piena luce in due ceppi di topi wildtype. I topi CD1 e C57/BL6J sono stati testati secondo la linea temporale descritta nella Figura 1A. (A) Il tempo trascorso dai topi CD1 nella zona di luce per un intervallo di 5 minuti su 30 minuti (27.000 lux). I dati di time in light vengono mostrati nel tempo durante il test (pannello di sinistra) e come tempo medio per intervallo di 5 minuti per i singoli mouse (pannello di destra). Sono stati effettuati confronti tra veicolo e CGRP in ogni punto temporale e tra Tx e Pre2 o Post come indicato dalle parentesi. (Veh, n=19; 0,1 mg/kg CGRP, n=19) (B) Tempo di topi C57BL/6J trascorsi nella zona di luce per intervallo di 5 minuti su 30 minuti (27.000 lux). I dati relativi al tempo nella luce vengono mostrati nel tempo durante il test (pannello di sinistra) e come tempo medio per intervallo di 5 minuti per i singoli topi (pannello di destra) (Veh, n = 42; 0,1 mg / kg CGRP, n = 44). (C) I topi del pannello B sono stati anche analizzati per il comportamento a riposo nelle zone scure e chiare durante il test luce/ buio. (D) I topi del pannello B sono stati successivamente testati nel test in campo aperto. La percentuale di tempo trascorso al centro della camera per un intervallo di 5 minuti oltre 30 minuti dopo il trattamento con veicolo o CGRP (0,1 mg/kg, i.p.) (Veh, n=9; 0,1 mg/kg CGRP, n=9). La percentuale di tempo nei dati del centro viene mostrata nel tempo durante il test (pannello di sinistra) e come percentuale media del tempo al centro per intervallo di 5 minuti per i singoli mouse (pannello di destra). Per tutti i pannelli, viene mostrato mean±SEM, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Questa cifra è stata modificata da Mason et al. 201710. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La stimolazione ottica dei neuroni che esprimono CaMKIIa nei nuclei talamici posteriori induce l'avversione alla luce sia in penombra che in luce intensa. (A) I nuclei talamici posteriori di topi C57BL/6J iniettati con AAV che codifica ChR2 o eYFP (a 55 lux: eYFP n = 8, ChR2 n = 11; a 27.000 lux: eYFP n = 12, ChR2 n = 18) sono stati stimolati dal laser blu (473 nm, 20 Hz, larghezza di impulso di 5 ms, 10 mW/mm2). Il pannello di sinistra mostra il tempo trascorso dai topi nella zona di luce per un intervallo di 5 minuti su 30 minuti a 55 o 27.000 lux. Sono stati effettuati confronti tra i gruppi eYFP e ChR2 in ogni punto temporale. Il pannello di destra mostra il tempo medio per intervallo di 5 minuti per i singoli topi. (B) I topi del pannello A sono stati anche analizzati per il comportamento a riposo nelle zone di luce (pannello di sinistra) e buio (pannello di destra) durante il test chiaro / scuro. (C) I topi del pannello A sono stati successivamente testati nel test in campo aperto. Percentuale media del tempo trascorso al centro della camera in campo aperto per intervallo di 5 minuti su 30 min (Laser: 473 nm, 20 Hz, larghezza di impulso di 5 ms, 10 mW/mm2). (eYFP n = 8, ChR2 n = 9). Per tutti i pannelli, viene mostrato mean±SEM, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Questa cifra è modificata da Sowers et al. 202019. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il test luce/buio è ampiamente utilizzato per valutare il comportamento ansiolitico12. Il test si basa sull'innata avversione dei topi alla luce e sulla loro spinta ad esplorare quando collocati in un nuovo ambiente (zona di luce). Tuttavia, come riportiamo qui, questo test può anche essere utilizzato per valutare il comportamento avversivo alla luce.
È fondamentale considerare il numero e la necessità di pre-esposizioni prima del test. Questo dipende dal ceppo o dal modello del topo. Ad esempio, nel nostro protocollo di analisi luce/buio, i topi naïve wildtype CD1 e C57BL/6J sono pre-esposti alla camera chiara/scura due volte prima di sottoporsi alla procedura di test di trattamento, mentre i topi optogenetici non subiscono pre-esposizione. Una recente pubblicazione ha riportato che una pre-esposizione è sufficiente per i topi CD1 per mostrare avversione alla luce dopo somministrazione di i.p. CGRP17. Di conseguenza, la significatività del parametro novità sarà diminuita all'arrivo del giorno di trattamento10,16. Le pre-esposizioni possono smascherare i fenotipi avversivi alla luce riducendo la spinta esplorativa e alterando così l'equilibrio tra esplorazione e avversione. In alcuni casi, la pre-esposizione non è necessaria. Ad esempio, con topi geneticamente modificati con aumento dei recettori CGRP nel sistema nervoso, la pre-esposizione non era necessaria14. Allo stesso modo, con topi manipolati optogeneticamente, in cui i neuroni che esprimono CaMKIIa nei nuclei talamici posteriori sono stati presi di mira per la stimolazione ottica, la pre-esposizione non era necessaria, presumibilmente perché la risposta avversiva alla luce era così robusta dopo la stimolazione diretta del cervello19. Pertanto, il numero e la necessità di pre-esposizioni alla camera devono essere attentamente considerati quando si utilizzano diversi ceppi o modelli di topo. In effetti, la sovraesposizione dei topi alla camera può ridurre il comportamento esplorativo. Ciò porterà i topi a occupare preferenzialmente la zona scura, indipendentemente dal trattamento, riducendo così la capacità di osservare una risposta avversiva alla luce. Al contrario, un'insufficiente pre-esposizione al test può portare a un comportamento esplorativo che maschera il potenziale comportamento avversivo alla luce.
Un'esposizione post-trattamento serve a identificare se un topo si è completamente ripreso dall'iniezione di CGRP somministrata 2 giorni prima. Questo è essenziale prima di eseguire il test in campo aperto o qualsiasi altro test per confermare che non è presente alcun effetto di trattamento prolungato che influenzerà i futuri test comportamentali.
Abbiamo optato per una durata del protocollo di 30 minuti sulla base di osservazioni precedenti10. Abbiamo testato i topi nel test chiaro / scuro per 10 min15, 20 min16 e 30 min10 separatamente. CGRP ha ridotto la quantità di tempo che i topi hanno trascorso alla luce tra 0-30 minuti, ma oltre i 30 minuti i topi di controllo hanno preferito trascorrere più tempo al buio rispetto a 0-30 minuti, portando così alla decisione di testare per 30 minuti. Allo stesso modo, la durata del test può essere regolata con riferimento alla curva tempo-risposta per diversi modelli murini. Va notato che l'allungamento del tempo di esposizione alla camera chiara / scura può ridurre la motivazione ad esplorare la zona di luce.
Abbiamo analizzato molti parametri diversi per valutare il comportamento degli animali. Una caratteristica essenziale del test luce/buio è una misurazione del tempo che un mouse trascorre nella zona di luce, riflettendo direttamente l'avversione alla luce. La percentuale di tempo trascorso a riposo, il numero di interruzioni verticali del fascio (per misurare l'attività di allevamento) in zone chiare o scure e il numero di transizioni tra le due zone vengono utilizzati per valutare la motilità. Il tempo di riposo e le interruzioni verticali del fascio sono normalizzati al tempo trascorso in ciascuna zona al fine di evitare false conclusioni sul movimento. Includiamo tutti i topi nelle analisi tranne: topi che rimangono nella zona di luce per tutti i 30 minuti di test, topi che trascorrono oltre il 90% del tempo a riposare in totale (sia zone chiare che scure) e valori anomali statistici (>3 SD dalla media). Il numero di topi esclusi è generalmente inferiore all'1%. Per il test in campo aperto, la percentuale di tempo al centro è la principale misurazione utilizzata per valutare il comportamento simile all'ansia.
Nel test chiaro/scuro modificato, il posizionamento della cannula a fibre ottiche in alcune regioni del cervello può limitare notevolmente il movimento del mouse e, in alcuni casi, impedire al mouse di raggiungere la zona scura. Di conseguenza, l'ingresso nella zona scura sarà rinforzato negativamente e, dopo più tentativi, il mouse potrebbe mostrare una preferenza appresa per la luce, pur rimanendo nella zona di luce durante l'intero periodo di prova. Questo può essere rettificato modificando le dimensioni e la forma dell'apertura nell'inserto scuro. Ad esempio, quando le cannule in fibra ottica sono state installate nel cervelletto di topi C57BL / 6J di tipo selvaggio, i topi hanno avuto difficoltà ad attraversare l'apertura dell'inserto scuro. Dopo aver modificato la larghezza dell'apertura a 6,10 cm invece di 5,08 cm, i topi sono stati in grado di attraversare liberamente l'apertura.
Un cavo patch in fibra ottica da 30,5 cm viene utilizzato nel test di luce /buio modificato, in base alle dimensioni della camera a campo aperto, consentendo al mouse di muoversi liberamente. Una lunghezza del cavo più corta impedirà a un mouse di muoversi verso gli angoli, mentre un cavo più lungo potrebbe aggrovigliarsi e ostacolare il movimento. La lunghezza del cavo patch in fibra ottica utilizzato per il test a campo aperto modificato è di 50 cm. La lunghezza non è così rigida come quella nel test chiaro/scuro poiché l'altezza del giunto rotante può essere regolata in base alla lunghezza del cavo patch in fibra ottica, assicurando che il mouse sia in grado di raggiungere solo gli angoli della camera.
Sulla base di analisi di potenza, sono necessari 10-12 topi per gruppo per topi CD1 e C57BL / 6J con i.p. CGRP e per topi optogenetici C57BL / 6J per rilevare una significativa avversione alla luce. Tuttavia, la dimensione del gruppo C57BL / 6J era considerevolmente più grande della dimensione del gruppo CD1 (Figura 2A, B) perché i topi C57BL / 6J non rispondevano al CGRP in un sottoinsieme dei test10, il che significa che sono stati condotti più test per tenere conto di questa elevata variabilità nel comportamento avversivo alla luce in questi topi. In particolare, due esperimenti sono stati combinati per i topi CD1 e quattro esperimenti sono stati combinati per topi C57BL / 6J con i.p. CGRP (Figura 2A, B) 10. La ragione di questa variabilità non è nota, ma gli esseri umani mostrano anche variabilità nelle loro risposte al CGRP e alla luce. L'iniezione endovenosa (e.v.) di attacchi di emicrania indotti da CGRP in circa il 63 ~ 75% dei pazienti con emicrania, con il 70 ~ 90% dei pazienti che hanno mostrato attacchi di emicrania che mostravano fotofobia22,23,24,25. Complessivamente, il test ha una notevole variabilità e oltre al numero di topi, è essenziale fare almeno due e preferibilmente tre esperimenti completamente indipendenti con diverse coorti di topi.
La lettiera non è richiesta nella camera chiara / scura e lo sperimentatore non è tenuto a pre-maneggiare o abituare i topi. Come misura precauzionale le due procedure di pre-esposizione servono allo scopo di acclimatare i topi ai segnali olfattivi e fisici dello sperimentatore; tuttavia, Ueno H. et al. hanno dimostrato che non vi è alcuna differenza nel tempo nella luce nel saggio luce/buio o nel tempo al centro nel test in campo aperto tra topi dopo manipolazione ripetuta e topi senza manipolazione26.
Il test in campo aperto può valutare il contributo dell'ansia verso un fenotipo avversivo alla luce. Esistono altri saggi correlati all'ansia ben convalidati, come il labirinto zero elevato e il labirinto plus elevato27; tuttavia, il test in campo aperto è il controllo proceduralmente più rilevante per il protocollo chiaro/scuro poiché la stessa camera di prova viene utilizzata per entrambi i test. Anche così, una valutazione dell'ansia può essere rafforzata utilizzando più test o misurando più parametri in un singolo test, dato che l'ansia è un comportamento complicato e sfaccettato. È importante sottolineare che, anche se non esiste un fenotipo di ansia nel test in campo aperto, ciò non esclude una componente di ansia per il fenotipo avversivo alla luce. Ad esempio, la luce potrebbe innescare una risposta di ansia. Il test in campo aperto indica solo che l'ansia da sola non sta guidando la risposta alla luce. Mentre un farmaco ansiolitico, come il benzodiazepame, potrebbe essere utilizzato in questo test, un tale approccio avrebbe complicazioni, ad esempio, i farmaci ansiolitici influenzano la locomozione. Invece, abbiamo optato per l'uso di farmaci clinici anti-emicrania, incluso il sumatriptan, per convalidare lo stato di emicrania del fenotipo avversivo alla luce. Sumatriptan ha invertito con successo l'avversione alla luce indotta da CGRP in entrambi i topi CD1 e C57BL/ 6J10.
A differenza del test chiaro/scuro modificato, la camera sul cassetto estraibile è all'esterno del cubicolo con le ante del cubicolo aperte nel test a campo aperto modificato a causa del cavo patch che si collega alla testa del mouse. Invece di 55 lux, la luce della stanza raggiunge il pavimento della camera a ~ 1000 lux. Anche se l'intensità della luce è diversa, il test in campo aperto è un test indipendente dalla luce. In dettaglio, l'aumento dell'intensità luminosa da 55 a 27.000 lux nel test in campo aperto ha determinato una tendenza di diminuzione del tempo al centro nei topi C57BL / 6J, suggerendo che l'intensità della luce può influenzare il comportamento del topo28. Tuttavia, la differenza tra i gruppi di controllo e sperimentali non era significativa né sotto 55 né 27.000 lux28. Inoltre, la differenza di intensità luminosa tra 55 e 1000 lux è molto più sottile che tra 55 e 27.000 lux. L'optogenetica wireless può risolvere questo problema in quanto non ci sarebbe alcun cavo patch, consentendo di spingere la camera a campo aperto all'interno del cubicolo di attenuazione del suono.
Inoltre, il cavo patch limita ancora il movimento del mouse nonostante la selezione di una lunghezza ottimale. In futuro, l'optogenetica wireless offrirà un'alternativa non invasiva alle tecniche optogenetiche basate su cavo.
Va notato che abbiamo usato l'iniezione acuta di CGRP, che replica solo in parte il rilascio prolungato di CGRP che accompagna gli attacchi di emicrania. Mentre abbiamo iniettato CGRP nei topi per modellare l'emicrania sulla base della premessa che i livelli plasmatici di CGRP sono aumentati29 e che i.v CGRP ha indotto attacchi di emicrania nei pazienti con emicrania22,23,24,25,30, questo non replicherà la condizione nel paziente in cui CGRP è mantenuto a livelli elevati per un tempo relativamente lungo (le misurazioni del paziente sono state prese a una mediana 3 ore dopo l'inizio dell'emicrania29 ), né replica l'emicrania cronica in cui i livelli sono segnalati per essere elevati anche tra gli attacchi31. Inoltre, altri mediatori indotti dal dolore non sono stati testati nel nostro paradigma.
Il gruppo Mogil ha modificato il labirinto plus elevato per misurare l'avversione alla luce nei topi, con le braccia chiuse illuminate da luce intensa e le braccia aperte che rimangono scure32. Il labirinto standard elevato plus è stato spesso utilizzato per rilevare il comportamento correlato all'ansia negli animali. Questo test si basa sul conflitto tra il desiderio innato di un topo di esplorare un nuovo ambiente e l'essere posto in una posizione compromettente nelle braccia aperte del labirinto non protetto. Nel protocollo modificato, i topi sono costretti a scegliere tra le braccia chiuse, che sono illuminate con luce intensa, e le braccia aperte non protette, che sono scure. La preferenza per il primo suggerisce che l'ansia prevale sull'avversione alla luce, mentre la preferenza per il secondo suggerisce che l'avversione alla luce ha la precedenza sull'ansia. Il gruppo Mogil ha anche condotto un labirinto standard elevato plus per valutare il comportamento simile all'ansia32. Lo scopo è lo stesso di condurre il test in campo aperto nel nostro protocollo. I topi mutanti Cacna1a, un modello di emicrania emiplegica familiare, hanno mostrato fotofobia quando le braccia chiuse erano luminose. Al contrario, il comportamento ansioso non è stato rilevato quando è stato condotto il labirinto standard elevato più32. Nei ratti, utilizzando sia il labirinto plus elevato modificato che il saggio chiaro/scuro, è stato dimostrato che la nitroglicerina (NTG) era in grado di indurre la fotofobia33,34, che è stata salvata da sumatriptan34. Nell'impostazione standard elevata del labirinto plus in cui la luce è assente all'interno delle braccia chiuse, NTG ha indotto un comportamento simile all'ansia nei ratti34, suggerendo che l'avversione alla luce indotta da NTG è accompagnata da ansia. Per quanto ne sappiamo, non ci sono pubblicazioni che utilizzano il saggio chiaro / scuro e il labirinto elevato modificato nello stesso modello murino. Tutto sommato, sia il labirinto plus elevato modificato che il saggio chiaro / scuro proposto in questo protocollo sono stati dimostrati come misure efficaci del comportamento avversivo alla luce nei topi.
Utilizziamo il pannello LED diurno con un colore bilanciato dalla luce diurna (5600K), con una diffusione del fascio di 60 °, che non produce ombre ad un'altezza di ~ 30 cm dal pavimento della camera a 55 lux o 27.000 lux. Altri studi che studiano l'avversione alla luce hanno utilizzato il saggio luce/buio con varie modifiche. Ad esempio, gli studi hanno utilizzato diverse intensità luminose per la zona luminosa, che vanno da centinaia a migliaia di lux35,36,37; luce utilizzata a diverse lunghezze d'onda (ad esempio blu e giallo)38; o utilizzato diverse temperature di luce (freddo e caldo)39. Bisogna fare attenzione al calore prodotto dalla luce poiché può influenzare la temperatura delle zone scure e chiare e interferire con il comportamento dei topi, causando potenzialmente una preferenza per una zona specifica. Inoltre, è anche importante utilizzare la luce con un buon angolo di visione per evitare l'ombra sul pavimento della camera. L'intensità della luce è importante anche per il test. 25.000 -27.000 lux è approssimativamente equivalente alla luce del giorno. Conducendo il test luce/buio ad un'intensità luminosa così elevata, è possibile amplificare l'effetto del trattamento; tuttavia, è essenziale considerare il danno retinico40 e l'effetto negativo di un'intensità luminosa così elevata sulla volontà di un topo di andare in luce. Alcuni studi hanno riportato che gli occhi di topo esposti alla luce diretta41 e i topi esposti alla luce intensa per diverse ore (ad esempio 30.000 lux per 4 ore42) hanno subito danni alla retina. Nel test chiaro/scuro, c'è una zona scura in cui il mouse può sfuggire alla luce intensa se il mouse lo desidera. Inoltre, studi precedenti hanno scoperto che i topi del gruppo di controllo (topi C57BL / 6J) hanno trascorso una quantità simile di tempo nella zona di luce sotto 55, 1000 e 27.000 lux28. Per i topi CD1, il gruppo di controllo ha trascorso circa 1/3 del tempo alla luce sotto i 27.000 lux10 e dati non pubblicati avevano mostrato risultati simili a 55 lux. Suggerisce che la luce a 27.000 lux da sola non rende i topi CD1 e C57BL / 6J in difficoltà. Tuttavia, è necessario prestare attenzione quando si opta per una maggiore intensità luminosa.
Oltre alle differenze nell'impostazione della luce, i ricercatori hanno optato per una varietà di approcci nell'analisi dei dati chiari / scuri. Quando si valuta l'avversione alla luce, la quantità di tempo trascorso nella zona luminosa con la luce spenta (o con l'illuminazione a luce rossa della zona luminosa, dato che gli occhi dei topi sono meno ricettivi alla luce rossa) sono inclusi nel calcolo. Ad esempio, l'indice di avversione= (tempo in luce0 lux-tempo in lux più leggero)/ tempo in luce0 lux è stato utilizzato dal gruppo di Gorin per valutare l'avversione alla luce43. Qui, le condizioni "luce spenta" o "luce rossa" sono incluse per confermare che l'evitamento della zona luminosa è subordinato alla presenza della luce in contrasto con la semplice preferenza del luogo. Abbiamo condotto questa procedura con iniezione i.p. di CGRP e abbiamo scoperto che i topi che ricevevano CGRP non avevano una preferenza di luogo con la luce spenta nella zona di luce, confermando che l'avversione indotta da CGRP è dipendente dalla luce16. Infine, il gruppo di Gorin ha utilizzato il tempo trascorso dai topi nella periferia della zona di luce nel test luce/buio come misura dell'ansia36. Utilizziamo un test tradizionale per l'ansia, il test in campo aperto. Indipendentemente dal metodo di analisi scelto, va notato che il contributo dell'ansia all'avversione alla luce non può essere ignorato. Questo protocollo tenta di suddividere il comportamento ansioso e avversivo alla luce utilizzando i saggi luce/buio e campo aperto in tandem.
Questo protocollo affronta l'uso dei saggi di luce/buio e campo aperto per il rilevamento del comportamento avversivo alla luce nei topi. Questo fornisce uno strumento utile per identificare i meccanismi dei circuiti neurali e delle regioni cerebrali che guidano la fotofobia. Il paradigma del test può essere specifico per l'emicrania o può essere espanso in altri disturbi che coinvolgono la fotofobia. Per quanto riguarda l'emicrania, abbiamo testato altri due neuropeptidi associati alla patogenesi dell'emicrania: polipeptide attivante l'adenilato ciclasi ipofisaria (PACAP) e peptide intestinale vasoattivo (VIP). PACAP e VIP hanno dimostrato di indurre avversione alla luce nei topi CD117,21. Oltre all'emicrania, la fotofobia è anche un sintomo di molti altri disturbi, tra cui bradiopsia, lesioni oculari acute o infiammazione, sindromi cerebrali traumatiche, malattia di Lyme, albinismo e distrofia del cono36. Pertanto, questo paradigma di test fornisce uno strumento per indagare i meccanismi alla base dei disturbi correlati alla fotofobia. Inoltre, l'abbinamento di metodi optogenetici con approcci farmacologici convenzionali aiuterà senza dubbio nello sviluppo di nuove terapie per i disturbi correlati alla fotofobia.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da segnalare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH NS R01 NS075599 e RF1 NS113839. I contenuti non rappresentano le opinioni di VA o del governo degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
| Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
| Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
| DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
| DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
| Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
| Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
| Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
| IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
| IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
| Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
| Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
| Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
| Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
| Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
| Stand and clamp | |||
| Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
References
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