Summary
该协议专门用于通过EB3蛋白转染进行微管加端可视化，以研究它们在原代细胞培养物中的动态特性。该协议是在从亨廷顿舞蹈症患者获得的人类原发性皮肤成纤维细胞上实施的。
Abstract
用荧光标记的感兴趣标记蛋白转染并结合延时视频显微镜是研究细胞骨架动态特性的经典方法。该协议为人原发性成纤维细胞转染提供了一种技术，由于原代细胞培养条件的特殊性，这可能很困难。此外，细胞骨架动态性能维持需要低水平的转染才能获得良好的信噪比，而不会导致微管稳定。重要的是要采取措施保护细胞免受光诱导的应激和荧光染料褪色的影响。在我们的工作过程中，我们测试了不同的转染方法和方案以及不同的载体，以选择适合人类原发性成纤维细胞研究的最佳条件组合。我们分析了生成的延时视频，并使用ImageJ计算了微管动力学。微管在不同细胞部分的正端动力学并不相似，因此我们将分析分为亚组 - 中心体区域，薄片和成纤维细胞的尾部。值得注意的是，该协议可用于患者样本中细胞骨架动力学的 体外 分析，从而为了解各种疾病发展的动力学迈出了下一步。
Introduction
亨廷顿舞蹈症（HD）是一种无法治愈的神经退行性病理学，由编码亨廷顿蛋白（HTT）的基因突变引起。HTT主要与囊泡和微管有关，可能参与微管依赖性转运过程1，2。为了研究突变HTT对微管动力学的影响，我们使用EB3蛋白的体外可视化，通过结合和稳定生长的正端来调节微管的动态特性。为了将荧光标记的EB3加载到人皮肤成纤维细胞中，应用质粒转染。在本研究中，我们使用从HD患者皮肤活检中获得的原发性成纤维细胞培养物。
HTT蛋白基因的突变导致聚谷氨酰胺束3的伸长。HTT在细胞内吞作用4、细胞转运1、2、蛋白质降解5等细胞过程中起作用。这些过程的很大一部分涉及细胞骨架的各种元件，包括微管。
人类原代细胞是尽可能密切地再现患者细胞中发生的事件的最佳模型。要创建这样的模型，需要从人体活检材料（例如，从手术样本中）分离细胞。所得原代细胞系适合于使用各种遗传、生化、分子和细胞生物学方法研究发病机制。此外，人类原代细胞培养物可作为创建各种转分和转基因培养物的前体6。
然而，与永生化细胞培养物相比，原代细胞的显着缺点是其传代能力有限。因此，我们建议在早期传代阶段（最多15个）使用细胞。较老的文化退化得非常快，失去了它们独特的属性。因此，新获得的原代细胞应保持冷冻以长期储存。
原代细胞培养物易受培养条件的影响。因此，它们通常需要独特的方法和生长条件的优化。特别是，我们实验中使用的人体皮肤原发性成纤维细胞对底物的要求很高。因此，我们根据实验类型使用了各种附加涂层（例如明胶或纤连蛋白）。
细胞细胞骨架决定了细胞的形状、迁移率和运动。细胞骨架的动力学对于相间和有丝分裂中的许多细胞内过程至关重要。特别是，由微管蛋白聚合的细胞骨架是高度动态和极性的结构，能够使运动蛋白介导的定向细胞内转运。微管的末端处于不断的重排中，它们的组装阶段与拆卸阶段交替，这种行为被称为"动态不稳定性"7，8，9。各种相关蛋白质改变了聚合反应的平衡，导致聚合物形成或蛋白质单体形成。微管蛋白亚基的添加主要发生在微管10的正端 。终结合（EB）蛋白家族由三个成员组成：EB1，EB2和EB3。它们充当加端跟踪蛋白（+TIPs），并通过结合和稳定其生长的正端来调节微管的动态特性11。
许多研究使用荧光分子标记的微管蛋白显微注射或转染以及延时成像和视频分析，以 在体外可视化微管 。这些方法可能是侵入性的，对细胞有害，尤其是原代人类细胞。最具挑战性的步骤是找到细胞转染的条件。我们试图在不影响活力和天然细胞形态的情况下达到尽可能高的转染水平。本研究应用经典方法研究健康供体和亨廷顿舞蹈症患者皮肤成纤维细胞微管动力学的差异。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该协议遵循2015年9月8日联邦医学生物局物理化学医学研究和临床中心的指南。
注： 图 1 概述了该协议。
1. 获得人皮肤成纤维细胞的初级培养物（图2）
- 在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）培养基中，补充50μg/ mL青霉素和50 U / mL链霉素，在几个小时内将活检送至实验室。
注意：在患者签署知情同意书后，医生必须在无菌条件下进行皮肤活检。 - 将活检组织与少量培养基一起放入6厘米培养皿中。
- 使用无菌手术刀，将活检样本切成约0.5-1毫米大小的碎片。将1-2个获得的片段放入3.5cm培养皿中，并在活检片上放置无菌盖玻片。缓慢加入1.5mL生长培养基到以下组合物中：DMEM，50 U / mL青霉素链霉素和10%胎牛血清（FBS）。
- 在CO2培养箱内的生长培养基中培养成纤维细胞，保持在5%CO 2，37°C，80%湿度。
注意：4-7天后，首先是角质形成细胞，然后是成纤维细胞，开始从组织迁移到培养皿的底部。
2. 初级培养物的储存、冷冻和解冻
- 从培养皿中取出细胞（见第3.2-3.4点）。
- 将细胞悬浮液转移到15mL锥形管中，并在200×g下离心5分钟。 然后弃去上清液并将细胞沉淀重悬于900μL冷却的FBS中。
- 一滴一滴地转移到冷冻保存管中，加入100μL二甲基亚砜（DMSO）。
- 将冷冻探头置于-80°C的低温冰箱中。 二十四小时后，将冷冻管转移到液氮（-196°C）中长期储存。
- 为了解冻冷冻保存的细胞，从氮气储存中除去冷冻液，并在1分钟内将1mL内容物转移到含有9mL转运介质的15mL锥形管中，预热至37°C。
- 小心地重悬，然后在200×g下离心管5分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于所需体积的生长培养基中，并将它们放在所需直径的培养皿上。
3. 细胞培养
- 用蒸馏水中制备的高压灭菌的0.1%明胶溶液盖住盘子底部。孵育15分钟。
注意：对于转染可视化，应使用玻璃底板皿（玻璃厚度为170μm的共聚焦培养皿）。 - 制备具有以下组成的培养基：补充有10%FBS，2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，50 U / mL青霉素链霉素的DMEM。充分混合并储存在4°C。 在加入细胞之前，将培养基加热至37°C。
- 在显微镜下评估培养物。取出培养基并用Dulbecco的磷酸盐溶液（DPBS）洗涤成纤维细胞。
- 向细胞中加入1mL预热的0.25%胰蛋白酶溶液。在显微镜下检查细胞是否完全脱离底物。用1mL培养基使胰蛋白酶失活。
- 将细胞悬浮液转移到15mL锥形管中。将管以200×g离心5分钟，除去上清液，并将细胞沉淀重悬于1mL培养基中。
- 计算单元格的数量。计算所需的细胞数量，以8-15 x 103/ cm2 的密度接种它们，并重悬于2mL培养基中。
- 从培养皿中取出明胶溶液，并立即加入2mL细胞悬浮液。在CO2 培养箱中在37°C培养成纤维细胞。
- 每 2-4 天刷新一次培养基。
注意：对于实验，使用4-11个传代的细胞。
4. 转染
- 转染前24小时用新鲜培养基替换培养基。
注意：细胞汇合度应为70-80%。 - 根据细胞接种的面积和密度制备DNA-脂质复合物。使用脂质体基转染剂。
注意：使用细胞接种密度为1 x 104个细胞/ cm2。 - 将3μL商业转染试剂加入125μL不含任何抗生素的最佳最小必需培养基（Opti-MEM）中，而不接触管壁。轻轻重悬。
- 通过将1μg质粒DNA加入125μLOpti-MEM来稀释质粒DNA（GFP-EB3）。轻轻重悬。
注：编码GFP-EB311的表达载体是I. Kaverina博士（纳什维尔范德比尔特大学）在A. Akhmanova博士（鹿特丹伊拉斯谟大学）的许可下收到的实物礼物11。 - 将稀释的质粒DNA加入每管稀释的转染试剂（1：1）。孵育30分钟。
- 将DNA-脂质复合物加入含有细胞的6厘米培养皿中，并与十字形摆动混合30秒。用转染剂孵育细胞24小时，然后换成新鲜培养基。分析24 h和48 h后转染效率。
注：转染后24 h，效率为10-15%，48 h后可达40%。
5. 准备成像
- 在细胞活体成像之前，将培养基更换为没有pH指示剂染料的培养基，以减少自发荧光。
- 小心地将矿物油涂在介质表面以完全覆盖介质，将其与外部环境隔离，以减少O2 渗透和介质蒸发。
- 使用汞灯和具有高数字光圈的60倍或100倍物镜进行油浸拍摄图像。
注意：对于 体内 观察，显微镜必须配备培养箱以保持细胞的必要条件，包括将物体台和透镜加热至+37°C，具有CO2 供应的封闭室以及湿度水平支持。使用双蒸馏水来产生湿度。拍摄前检查双蒸馏水的液位。 - 在成像之前，将共聚焦培养皿与细胞一起置于显微镜支架中。确保碟形天线和相机牢固地固定在支架上，以避免在拍照时漂移。
6. 设置成像参数
- 选择低曝光值，因为光会诱发破坏细胞的活性氧（ROS）。
注意：为了研究人皮肤成纤维细胞中微管的动力学，选择了300 ms的暴露。 - 专注于感兴趣的对象。
注：对于长期延时成像，请使用自动对焦稳定系统来补偿沿z轴可能偏移的情况。 - 根据细胞的光敏性和荧光染料褪色的速率选择最佳成像条件。
注意：由于微管是高度动态的结构，因此可以选择相当短的时间间隔，并且帧速率必须足够高。为了研究皮肤成纤维细胞中的微管动力学，我们以1帧/秒的频率使用3-5分钟。 - 选择下一个对象获取图像时，请远离已成像区域。由于这个区域受到光线的影响，因此会出现明显的光漂白。
注：由于使用了相对较高的成像频率，因此快门在图像之间没有关闭，并且灯在整个成像期间都亮起，这就是褪色增加的原因。 - 选择最佳视频，以直观地研究微管的动力学，同时考虑转染的质量，微管图像的质量（最佳信噪比）以及分析细胞时没有漂移（图3）。
- 使用选定的视频，通过在ImageJ或Fiji程序中跟踪微管的加端动力学来研究它们（图4）。
注：有关定量分析说明，请参见补充图2和补充文件1。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用该协议产生的GFP-EB3电影（图1）说明了微管的动态特性。微管参与不同的细胞过程，它们的动态特性影响来自患者活检材料的原代人细胞培养物的各种生命特征（图2）。
以下参数决定了微管的动态不稳定性：生长速率（聚合）和收缩速率（解聚）;灾难的频率（从聚合到解聚的转变）;救援的频率（从解聚到聚合的过渡）;以及停顿 - 当微管不聚合并且不解聚时的状态12。所有参数都受到严格调节，单个微管的聚合和解聚速率在相同和不同的细胞类型13，14，15，16，17中可以显着变化。
有必要考虑分析微管可以根据其在细胞中的位置而具有不同的动力学。与细胞外围19相比，位于细胞核和中心体区域的微管的行为不同。因此，为了获得可靠的结果，我们在细胞的三个独立区域进行了微管的动态测量：中心部分，前缘和尾部（图3）。为了控制GFP-EB3标签在各个细胞部分的正确分布，我们使用人肺动脉内皮细胞（HPAEC）（见补充图1）。
专门的程序，如ImageJ或Fiji（ImageJ 2 v1. 53i），允许通过以下参数分析视频：（1）微管的生长速度;（二）巨灾发生频率;（三）救援频率;（4）停顿的频率;和（5）暂停的持续时间。此外，独特的程序选项和插件允许自动跟踪18或手动跟踪19（图4）。手动跟踪方法在我们的实验中效果更好，因为自动测量容易出现更大的误差，并且需要更多的重复才能获得更准确的结果。有关微管动力学数据分析的详细说明，请参见补充图2和补充文件1。
在成像过程中，可能需要调整成像参数。例如，可以更改一个细胞成像的持续时间和曝光值。如果存在快速的信号倦怠或细胞收缩，则此类设置是有帮助的（图5）。
图1：GFP-EB3转染方案用于人皮肤原发性成纤维细胞培养的一般方案。 该协议包括以下步骤：通过胰蛋白酶溶液分离细胞;胰蛋白酶通过培养基添加失活;所得化合物的离心;计算细胞浓度;将细胞接种到涂有明胶的玻璃底皿（共聚焦皿）中;通过质粒DNA（用GFP-EB3）与脂质体转染试剂进行细胞培养转染;孵育24-48小时;并在显微镜下进行分析。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：人皮肤成纤维细胞初级培养方案。 在患者签署知情同意书后，医生必须在无菌条件下进行皮肤活检。然后将一块组织在没有FBS的培养基中以少量的培养基运输到培养皿中的实验室。将大块组织切成0.5-1毫米大小的碎片，并用盖玻片覆盖，并添加FBS介质。然后将培养皿置于CO2 培养箱中，4-7天后成纤维细胞从组织碎片迁移到玻璃底部。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：转染人成纤维细胞不同区域的GFP-EB3标志物（绿色），从HD患者皮肤活检中获得： 前缘（上图）;尾部（中间面板）;成纤维细胞的中心部分（中心体周围的区域）（底部）。比例尺 = 10 μm。成像频率为1帧/秒。宽视场荧光显微镜。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：通过ImageJ插件MTrackJ进行GFP-EB3手动跟踪。 在成像20秒内，通过对GFP-EB3标签尖端的加端进行逐帧手动标记，获得了反映微管生长的轨迹。转染培养的成纤维细胞，从HD患者的皮肤活检中获得。成像频率为1帧/秒。宽视场荧光显微镜。比例尺 = 10 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图5：GFP-EB3标记的微管的正端成像过程中的故障排除（A）荧光标记的微管由于缺乏聚焦系统而失焦。（B）微管稳定并由于与转染混合物长时间孵育，由于GFP-EB3在细胞中的过表达而失去其动态特性。（C） 由于ROS释放引起的光毒性导致细胞薄片收缩。（D） 成像过程中信号强度下降 - 快速光漂白。转染培养的成纤维细胞，从HD患者的皮肤活检中获得。成像频率为每秒1帧。宽视场荧光显微镜。比例尺 = 10 μm。请单击此处查看此图的放大版本。
补充图1：生长微管加端的选择性可视化。 GFP-EB3标志物（绿色）在前缘，尾部和中心区域（中心体周围的区域）中转染的人内皮细胞（HPAEC培养物：人肺动脉内皮细胞）的不同区域。比例尺 10 μm。成像频率为1帧/秒宽视场荧光显微镜。 请点击此处下载此文件。
补充图2：使用ImageJ插件MTrackJ手动跟踪后，通过GFP-EB3标签进行微管动力学分析。（A，B）EB3-GFP贴片在移时系列转染培养成纤维细胞上移位获得的EB3轨迹，从HD患者的皮肤活检中获得（单独着色）。（A）EB3轨道（紫色，No46）通过EB3-GFP贴片在18秒内位移获得。（B） EB3-GFP贴片在9秒内位移得到的EB3轨道（红色，No37）。（C）人类HD患者皮肤成纤维细胞的多端位移的定量，如（A）所示。（D） 微管的正端位移的定量，如（B）所示。该图显示，在6-8秒之间，微管的生长有停顿（没有正端的运动）。请点击此处下载此文件。
补充文件1：EB3-GFP标记微管加端动态的定量分析。请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
从高质量的显微图像中可以获得更高质量的微管动力学分析结果。重要的是要观察活细胞延时成像的所有必要条件，并正确调整成像参数。使用带有玻璃底的特殊细胞培养皿（共聚焦培养皿）很重要，因为玻璃具有与塑料不同的光折射率。玻璃的厚度及其在整个区域内的均匀性也非常重要，因为这些参数对于正常的样品聚焦至关重要。违反这些参数不可避免地会导致完美对焦系统故障，从而导致对焦不良，从而无法使用这种失焦视频进行分析（图5A）。活细胞成像的另一个重要条件是它们对ROS的保护。各种试剂可用于这样的目的20。在我们的工作中，我们使用矿物油，它将培养基与大气完全隔离并防止气体交换。以同样的方式，可以使用ROS还原氧化酶，但这种酶并不适合所有细胞类型，并且更常用于增加时间的成像。
在选择转染后细胞的最佳孵育时间（24或48小时）时，应注意转染细胞的数量。小于表达标记蛋白质的最大细胞数量的数字已经足以进行分析。不应允许过表达，因为在这种情况下，微管是稳定的，并且无法分析其动态特性（图5B）。
在某些情况下，可能需要在视频录制开始后根据细胞的反应调整成像参数。例如，由于对光的高敏感性（光毒性），可以观察到细胞薄片收缩（图5C）。当被激发时，荧光分子通常与分子氧反应形成自由基，从而破坏细胞组分21。在设计实验时，应选择具有最大可能激发波长的荧光团，以尽量减少短波照明下的细胞损伤。此外，有报道称，标准培养基的某些成分，包括核黄素维生素和色氨酸氨基酸，也可能导致光对培养细胞22的不利影响。除其他事项外，这可能是由一个细胞中过量的荧光标记引起的。在这些情况下，有必要减少记录的持续时间和照明强度。另一个可能的问题也可能是快速光漂白 - 记录期间信号强度降低（图5D）。在选择同一实验皿上的下一个物体时，应考虑这种效应，因为成像区域周围的相邻细胞也会被烧毁。
应该提到的是，还有其他方法可用于活细胞中的微管可视化，例如将荧光标记的微管蛋白微注入细胞或使用病毒进行细胞转导。与任何其他方法一样，转染方法有优点和缺点。然而，从我们的角度来看，与注射方法相比，转染更有效，并且可以实现表达载体的质量包涵体到细胞中，从而产生大量的荧光细胞进行分析。此外，转染方法不需要研究人员的特殊设备和技能。病毒转导方法显示出良好的效果，可以应用。尽管如此，它并不适合所有细胞培养物（特别是，它不太适合从HD患者皮肤活检中获得的人成纤维细胞）。
该协议中最关键的步骤是进行转染以确保足够的蛋白质表达。良好的信噪比，微管无光漂白，以及在延时视频记录期间没有细胞漂移对于有效的微管成像绝对至关重要。在我们的实验中， 微管的可视化和动态分析提供了关于突变HTT细胞中微管特性和行为的重要信息。我们的方案适用于病理学涉及微管动态特性的其他疾病的研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该研究由俄罗斯联邦科学和高等教育部资助，拨款号为075-15-2019-1669（成纤维细胞转染），由俄罗斯科学基金会资助，拨款号为19-15-00425（所有其他关于 体外培养成纤维细胞的工作）。它得到了莫斯科国立罗蒙诺索夫大学发展计划PNR5.13（成像和分析）的部分支持。作者感谢尼康卓越中心在A. N. Belozersky物理化学生物学研究所的支持。我们要特别感谢叶卡捷琳娜·塔兰（Ekaterina Taran）在配音方面的帮助。作者还感谢Pavel Belikov在视频编辑方面的帮助。手稿中的人物是用 BioRender.com 创作的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
