Summary
Bu protokol, birincil hücre kültüründeki dinamik özelliklerini incelemek için EB3 protein transfeksiyonu ile mikrotübül artı-uç görselleştirmesine adanmıştır. Protokol, Huntington hastalığı hastalarından elde edilen insan primer deri fibroblastları üzerinde uygulandı.
Abstract
Zaman atlamalı video mikroskopisi ile birlikte ilgi çekici floresan etiketli bir işaret proteini ile transfection, sitoskeletonun dinamik özelliklerini incelemek için klasik bir yöntemdir. Bu protokol, birincil hücre ekim koşullarının özellikleri nedeniyle zor olabilen insan primer fibroblast transfeksiyonu için bir teknik sunmaktadır. Ek olarak, sitoskeleton dinamik özellik bakımı, mikrotübül stabilizasyonuna neden olmadan iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için düşük düzeyde transfeksiyon gerektirir. Hücreleri ışık kaynaklı stresten ve floresan boya solmasından korumak için önlemler almak önemlidir. Çalışmalarımız boyunca, insan birincil fibroblast çalışmalarına uygun koşulların en iyi kombinasyonunu seçmek için farklı transfeksiyon yöntemlerini ve protokollerini ve farklı vektörleri test ettik. Ortaya çıkan hızlandırılmış videoları analiz ettik ve ImageJ kullanarak mikrotübül dinamiklerini hesapladık. Mikrotübüllerin farklı hücre parçalarındaki artı uçlarının dinamikleri benzer değildir, bu nedenle analizi alt gruplara ayırdık - merkezkant bölge, lamel ve fibroblastların kuyruğu. Özellikle, bu protokol hasta örneklerinde sitoskeleton dinamiklerinin in vitro analizi için kullanılabilir ve çeşitli hastalık gelişiminin dinamiklerini anlamaya yönelik bir sonraki adımı sağlar.
Introduction
Huntington hastalığı (HD), mutasyonin gen kodlamasıhuntingtin proteini (HTT) nedeniyle tedavi edilemez bir nörodejeneratif patolojidir. HTT öncelikle veziklinler ve mikrotübüllerle ilişkilidir ve muhtemelen mikrotübül bağımlı taşıma süreçlerinde yer almaktadır1,2. Mutant HTT'nin mikrotübül dinamikleri üzerindeki etkisini incelemek için, büyüyen artı uçları bağlayarak ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerini düzenleyen EB3 proteininin in vitro görselleştirmesini kullandık. Floresan etiketli EB3'ü insan derisi fibroblastlarına yüklemek için plazmid transfeksiyon uygulandı. Bu çalışma için HD hastalarının cilt biyopsisinden elde edilen primer fibroblast kültürünü kullandık.
HTT protein geninde mutasyon poliglutamin sisteminin uzaması3. HTT, endositoz4,hücre taşıma1,2,protein bozulması5,vb. Bu süreçlerin önemli bir kısmı, mikrotübüller de dahil olmak üzere hücre sitoskeletonunun çeşitli unsurlarını içerir.
İnsan birincil hücreleri, hasta hücrelerinde meydana gelen olayları mümkün olduğunca yakından yeniden üretmek için en iyi modeldir. Bu tür modeller oluşturmak için, hücreleri insan biyopsi malzemesinden (örneğin cerrahi örneklerden) izole etmek gerekir. Ortaya çıkan primer hücre hattı, çeşitli genetik, biyokimyasal, moleküler ve hücre biyolojisi yöntemlerini kullanarak patogenez çalışmak için uygundur. Ayrıca, insan birincil hücre kültürleri çeşitli transdifferentiated ve transgenik kültürler oluşturmak için bir öncü olarak hizmet vermektedir6.
Bununla birlikte, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürlerinin aksine, birincil hücrelerin önemli dezavantajı sınırlı geçiş kapasiteleridir. Bu nedenle, hücreleri erken geçiş aşamasında (15'e kadar) kullanmanızı öneririz. Eski kültürler çok hızlı bir şekilde dejenere lanır ve benzersiz özelliklerini kaybeder. Bu nedenle, yeni elde edilen birincil hücreler uzun süreli depolama için dondurulmalıdır.
Birincil hücre kültürleri yetiştirme koşullarına karşı hassastır. Bu nedenle, genellikle benzersiz yaklaşımlar ve büyüme koşullarının optimizasyonu gerektirirler. Özellikle, deneylerimizde kullanılan insan derisi birincil fibroblastları substrat üzerinde talep ediyor. Bu nedenle, deney türüne bağlı olarak çeşitli ek kaplamalar (örneğin jelatin veya fibronektin) kullandık.
Hücre sitoskeleton hücre şeklini, hareketliliğini ve hareketliliğini belirler. Sitoskeletonun dinamikleri hem interfaz hem de mitozda birçok hücre içi süreç için çok önemlidir. Özellikle, tübulinden polimerize edilen sitoskeleton, motor protein aracılı hücre içi taşımayı sağlayan son derece dinamik ve polar yapılardır. Mikrotübüllerin uçları sürekli yeniden düzenlenir, montaj aşamaları sökme aşamalarıyla değişir ve bu davranışa "dinamik kararsızlık"7,8,9denir. Çeşitli ilişkili proteinler polimerizasyon reaksiyonunun dengesini değiştirerek polimer oluşumuna veya protein monomer oluşumuna yol açtı. Tübulin alt ünüllerinin eklenmesi esas olarak mikrotübüllerin artı ucunda meydana gelir10. Son bağlayıcı (EB) protein ailesi üç üyeden oluşur: EB1, EB2 ve EB3. Artı uç izleme proteinleri (+TIP' ler) görevi gösterirler ve büyüyen artı uçlarını bağlayarak ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerinidüzenlerler 11.
Birçok çalışma, mikrotübülleri in vitroolarak görselleştirmek için zaman atlamalı görüntüleme ve video analizi ile floresan molekül etiketli tübulin mikroenjeksiyonu veya transfeksiyonu kullanır. Bu yöntemler istilacı ve hücrelere, özellikle birincil insan hücrelerine zararlı olabilir. En zorlu adım hücre transfeksiyon için koşulları bulmaktır. Canlılığı ve doğal hücre morfolojisini etkilemeden mümkün olan en yüksek transfeksiyon seviyesine ulaşmaya çalıştık. Bu çalışma, sağlıklı donörlerin ve Huntington hastalığı olan hastaların cilt fibroblastlarındaki mikrotübül dinamiklerindeki farklılıkları incelemek için klasik yöntemi uygular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Federal Tıbbi Biyolojik Ajansı Fiziksel-Kimyasal Tıp Federal Araştırma ve Klinik Merkezi'nin 08 Eylül 2015 tarihli yönergelerini takip eder.
NOT: Şekil 1 protokole genel bir bakış sağlar.
1. İnsan derisi fibroblastlarının birincil kültürünü elde etmek (Şekil2)
- Biyopsiyi Dulbecco'nun Modifiye Eagle Media (DMEM) ortamında 50 μg/mL penisilin ve 50 U/mL streptomisin ile desteklenmiş olarak birkaç saat içinde bir laboratuvara teslim edin.
NOT: Bir hasta bilgilendirilmiş bir onay verdikten sonra bir doktor tarafından steril koşullarda cilt biyopsisi yapılmalıdır. - Biyopsi dokusunu az miktarda ortamla birlikte 6 cm Petri kabına yerleştirin.
- Steril bir neşter kullanarak biyopsi örneğini yaklaşık 0,5-1 mm büyüklüğünde parçalar halinde kesin. Elde edilen 1-2 parçayı 3,5 cm Petri kabına yerleştirin ve biyopsi parçalarının üzerine steril bir kapak parçası yerleştirin. Aşağıdaki bileşime yavaşça 1,5 mL büyüme ortamı ekleyin: DMEM, 50 U/mL penisilin-streptomisidin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS).
- Bir CO2 inkübatörü içindeki büyüme ortamındaki kültür fibroblastları% 5 CO2, 37 ° C,% 80 nemde tutulur.
NOT: 4-7 gün sonra, önce keratinositler, sonra fibroblastlar, dokudan yemeğin dibine göç etmeye başlar.
2. Birincil kültürün depolanmasını, dondurulmasını ve dondurulmasını
- Kültür çanaktan hücreleri çıkarın (bkz. noktalar 3.2-3.4).
- Hücre süspansiyonu 200 x g'da 5 dakika boyunca 15 mL konik tüpe ve santrifüje aktarın. Daha sonra süpernatantı atın ve hücre peletini 900 μL soğutulmuş FBS'de yeniden diriltin.
- Damla damla bir kriyoprezervasyon tüpüne aktarın ve 100 μL dimetil sülfit (DMSO) ekleyin.
- Kriyoprobe'u -80 °C'de düşük sıcaklıktaki bir dondurucuya yerleştirin. Yirmi dört saat sonra, uzun süreli depolama için cryovial'ı sıvı nitrojene (−196 °C) aktarın.
- Kriyoprezer korunmuş hücrelerin buzunu çıkarmak için, cryovial'ı azot deposundan çıkarın ve 1 dakika içinde, içeriğin 1 mL'lik kısmını önceden 37 °C'ye ısıtılmış taşıma ortamının 9 mL'lik bir kısmını içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- Tüpü dikkatlice yeniden dirildi ve ardından 200 x g'da 5 dakika santrifüj edin. Üst tabakayı atın, hücre peletini büyüme ortamının gerekli hacmine yeniden koyun ve gerekli çapta bir Petri kabına yerleştirin.
3. Hücre ekimi
- Bulaşık tabanını damıtılmış suda hazırlanan otomatik kapatılmış% 0.1 jelatin çözeltisi ile örtün. 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
NOT: Transfeksiyon görselleştirme için cam tabanlı tabaklar (cam kalınlığı 170 μm olan konfokal yemekler) kullanılmalıdır. - Aşağıdaki bileşime sahip bir kültür ortamı hazırlayın: %10 FBS, 2 mM L-alanil-L-glutamin, 50 U/mL penisilin-streptomisidin ile desteklenmiş DMEM. İyice karıştırın ve 4 °C'de saklayın. Hücrelere eklemeden önce ortamı 37 °C'ye ısıtın.
- Kültürü mikroskop altında değerlendirin. Ortamı çıkarın ve fibroblastları Dulbecco'nun fosfat-tuz çözeltisi (DPBS) ile yıkayın.
- Hücrelere 1 mL önceden ısıtılmış %0,25 tripsin çözeltisi ekleyin. Mikroskop altındaki hücreleri, alt tabakadan tamamen ayrılırlarsa kontrol edin. Tripini 1 mL kültür ortamı ile devre dışı bırak.
- Hücre süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Tüpü 200 x g'da 5 dakika santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini kültür ortamının 1 mL'sinde yeniden diriltin.
- Hücre sayısını sayın. 8-15 x 103/cm2 yoğunlukta tohumlamak için gerekli hücre sayısını hesaplayın ve kültür ortamının 2 mL'sinde yeniden biriktirin.
- Jelatin çözeltisini kültür çanaktan çıkarın ve hemen hücre süspansiyonunun 2 mL'lik kısmını ekleyin. Co2 inkübatörde 37 °C'de fibroblast yetiştirin.
- Ortamı her 2-4 günde bir yenileyin.
NOT: Deneyler için 4-11 pasajın hücrelerini kullanın.
4. Transfection
- Transfection öncesi kültür ortamını 24 saat taze bir kültür ortamıyla değiştirin.
NOT: Hücre birleşmesi %70-80 olmalıdır. - Hücre tohumlama alanına ve yoğunluğuna göre bir DNA lipit kompleksi hazırlayın. Lipozom bazlı transfeksiyon maddesi kullanın.
NOT: Hücre tohumlama yoğunluğunu 1 x 104 hücre/cm2olarak kullanın. - Tüpün duvarlarına dokunmadan, antibiyotik içermeyen 125 μL optimal minimum esansiyel ortama (Opti-MEM) 3 μL ticari transfeksiyon reaktifi ekleyin. Yavaşça yeniden dirilt.
- Plazmid DNA'sını (GFP-EB3) 125 μL Opti-MEM'e 1 μg ekleyerek seyreltin. Yavaşça yeniden dirilt.
NOT: GFP-EB311'i kodlayan ifade vektörü, Dr. A. Akhmanova'nın (Erasmus Üniversitesi, Rotterdam) izniyle Dr. I. Kaverina'dan (Vanderbilt Üniversitesi, Nashville) nazik bir hediye olarakalınmıştır. - Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin her tüpüne seyreltilmiş plazmid DNA ekleyin (1:1). 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
- DNA lipit kompleksini hücre içeren 6 cm Petri kabına ekleyin ve 30 sn boyunca bir haç salınımı ile karıştırın. Hücreleri 24 saat boyunca bir transfeksiyon ajanı ile kuluçkaya yatırın ve sonra taze ortama değiştirin. 24 saat ve 48 saat sonra transfeksiyonun verimliliğini analiz edin.
NOT: Transfeksiyondan 24 saat sonra verimlilik% 10-15 ve 48 saat sonra% 40'a kadardı.
5. Görüntülemeye hazırlık
- Hücrelerin canlı görüntülenmesinden önce, otofluoresansı azaltmak için kültür ortamını pH göstergesi boyası olmayan bir ortama değiştirin.
- Orta yüzeyi tamamen örtmek için orta yüzeye mineral yağı dikkatlice uygulayın, O2 penetrasyonunu ve orta buharlaşmayı azaltmak için dış ortamdan izole edin.
- Görüntüleri çekmek için yüksek rakamlı diyafram açıklığına sahip bir cıva lambası ve yağ daldırma 60x veya 100x objektif lens kullanın.
NOT: In vivo gözlemler için mikroskop, nesne tablosunu ve lensi +37 °C'ye ısıtmak, CO2 beslemeli kapalı bir oda ve nem seviyesi desteği de dahil olmak üzere hücreler için gerekli koşulları korumak için bir inkübatör ile donatılmalıdır. Nem oluşturmak için çift damıtılmış su kullanın. Çekimden önce çift damıtılmış su seviyesini kontrol edin. - Konfokal kabı görüntülemeden önce mikroskop tutucusuna hücrelerle yerleştirin. Görüntü çekerken sürüklenmeyi önlemek için çanağın ve kameranın tutucuya güvenli bir şekilde takıldığından emin olun.
6. Görüntüleme parametrelerini ayarlama
- Işık hücreye zarar veren reaktif oksijen türlerine (ROS) neden olduğundan düşük pozlama değerlerini seçin.
NOT: İnsan derisi fibroblastlarındaki mikrotübüllerin dinamiklerini incelemek için 300 ms'lik bir maruziyet seçilmiştir. - İlgi çekici nesneye odaklanın.
NOT: Uzun süreli zaman atlamalı görüntüleme için, z ekseni boyunca olası bir kaymayı telafi etmek için otomatik odak sabitleme sistemini kullanın. - Hücrelerin ışığa duyarlılığına ve florokrom solma hızına bağlı olarak en uygun görüntüleme koşullarını seçin.
NOT: Mikrotübüller son derece dinamik yapılar olduğundan, oldukça kısa bir zaman aralığı seçilebilir ve kare hızı yeterince yüksek olmalıdır. Cilt fibroblastlarındaki mikrotübül dinamiklerini araştırmak için 3-5 dakika boyunca 1 kare/s frekansta kullandık. - Görüntüyü almak için bir sonraki nesneyi seçerken, zaten görüntülenmiş alandan uzaklaşın. Bu alan ışığın etkisi altında olduğu için gözle görülür bir fotoğraf ağartma olacaktır.
NOT: Nispeten yüksek bir görüntüleme frekansı kullanıldığından, deklanşör görüntüler arasında kapanmadı ve lamba tüm görüntüleme süresi boyunca yandı, bu yüzden solgunluk arttı. - Transeksiyon kalitesini, mikrotübüllerin görüntülerinin kalitesini (optimum sinyal-gürültü oranı) ve analiz edilen hücre durumunda sürüklenmenin olmamasını dikkate alarak mikrotübüllerin dinamiklerini görsel olarak incelemek için en uygun videoyu seçin (Şekil 3).
- Seçilen videoları ImageJ veya Fiji programında izleyerek mikrotübüllerin artı uç dinamiklerini incelemek için kullanın (Şekil 4).
NOT: Nicel analiz talimatları için ek şekil 2 ve tamamlayıcı dosya 1 'ebakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol kullanılarak üretilen GFP-EB3 filmleri (Şekil 1) mikrotübüllerin dinamik özelliklerini göstermektedir. Mikrotübüller farklı hücre süreçlerine dahil olur ve dinamik özellikleri hastaların biyopsi materyalinden birincil insan hücre kültürünün çeşitli yaşam özelliklerini etkiler (Şekil 2).
Aşağıdaki parametreler mikrotübüllerin dinamik kararsızlığını belirler: büyüme (polimerizasyon) ve küçülme (depolimerizasyon) oranları; felaketlerin sıklığı (polimerizasyondan depolimerizasyona geçiş); kurtarma sıklığı (depolimerizasyondan polimerizasyona geçiş); duraklatmaların yanı sıra - mikrotübülün polimerize olmadığını ve 12depolymerize etmediğini belirtir. Tüm parametreler sıkı bir şekilde düzenlenir ve bireysel mikrotübüllerin polimerizasyon ve depolimerizasyon oranları hem aynı hem de farklı hücre tiplerinde13 , 14,15,16,17'de önemli ölçüde değişebilir.
Analiz için mikrotübüllerin hücredeki konumlarına bağlı olarak farklı dinamiklere sahip olabileceğini göz önünde bulundurmak gerekir. Çekirdek ve centrosome bölgesinde bulunan mikrotübüller hücre çevresindekilere göre farklı davranır19. Bu nedenle, güvenilir bir sonuç elde etmek için, mikrotübüllerin dinamik ölçümlerini hücrenin üç ayrı bölgesinde yaptık: orta kısım, öncü kenar ve kuyruk kısmı (Şekil 3). GFP-EB3 etiketinin çeşitli hücre parçalarında doğru dağılımını kontrol etmek için insan pulmoner arter endotel hücrelerini (HPAEC) kullandık(bkz. Ek Şekil 1).
ImageJ veya Fiji (ImageJ 2 v1. 53i) gibi özel programlar, videoların aşağıdaki parametrelerle analizine izin verir: (1) mikrotübüllerin büyüme hızı; (2) felaketlerin sıklığı; (3) kurtarma sıklığı; (4) duraklama sıklığı; ve (5) duraklama süresi. Ek olarak, benzersiz program seçenekleri ve eklentileri otomatik olarak18 veya manuel olarak19 izleme sağlar (Şekil 4). Manuel izleme yöntemi, otomatik ölçümler daha büyük hatalara eğilimli olduğundan ve daha doğru bir sonuç için daha fazla tekrar gerektirdiğinden, denemelerimizde daha iyi çalıştı. Mikrotübül dinamikleri veri analizi ile ilgili ayrıntılı talimatlar Ek Şekil 2 ve Tamamlayıcı Dosya 1'debulunabilir.
Görüntüleme parametreleri görüntüleme işlemi sırasında ayarlamalar gerektirebilir. Örneğin, bir hücre görüntüleme süresi ve pozlama değerleri değiştirilebilir. Bu tür ayarlar, hızlı bir sinyal tükenmişliği varsa veya hücre küçülürse yararlıdır (Şekil 5).
Şekil 1: İnsan derisi primer fibroblast kültürü için GFP-EB3 transfeksiyon protokolünün genel şeması. Protokol aşağıdaki adımları içerir: hücrelerin tripsin çözeltisi ile birekir; orta ilave ile tripsin inaktivasyonu; elde eden bileşiğin santrifüjlenmesi; hücre konsantrasyonunun hesaplanması; jelatin ile kaplanmış cam alt tabağa (konfokal çanak) hücre tohumlama; lipozomal transfeksiyon reaktifi ile plazmid DNA (GFP-EB3 ile) ile hücre kültürü transfeksiyonu; kuluçka 24-48 saat; ve mikroskop altında analiz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnsan derisi fibroblastları birincil kültür hazırlık şeması. Bir hasta bilgilendirilmiş bir onay verdikten sonra bir doktor tarafından steril koşullarda cilt biyopsisi yapılmalıdır. Daha sonra bir doku parçası, FBS olmadan az miktarda ortamda petri kabındaki laboratuvara taşınır. Büyük bir doku parçası 0,5-1 mm büyüklüğünde parçalar halinde kesilir ve FBS'li ortamın eklenmesiyle bir kapak camı ile kaplanır. Daha sonra Petri kabı,4-7 gün sonra fibroblastların doku parçasından cam tabana göç ettiği bir CO 2 inkübatörüne yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HD hastalarının cilt biyopsisinden elde edilen transfected insan fibroblastlarının farklı alanlarında GFP-EB3 işaretleyici (yeşil); kuyruk (orta panel); fibroblast'ın orta kısmı (merkez etrafındaki bölge) (alt panel). Ölçek çubuğu = 10 μm. Görüntüleme frekansı 1 kare/s'dir. Geniş alan floresan mikroskopisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ImageJ eklentisi MTrackJ tarafından GFP-EB3 manuel izleme. Mikrotübüllerin büyümesini yansıtan izler, 20 s görüntüleme sırasında GFP-EB3 etiket uçlarının artı uçlarda kare kare manuel olarak işaretlenmesi sonucunda elde edildi. HD hastalarının cilt biyopsisinden elde edilen transfected kültürlü fibroblastlar. Görüntüleme frekansı 1 kare/s'dir. Geniş alan floresan mikroskopisi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: GFP-EB3 etiketli mikrotübüllerin artı uçlarının görüntülenmesi sırasında sorun giderme. (A) Floresan etiketli mikrotübüller, odaklama sisteminin olmaması nedeniyle odak dışındadır. (B) Mikrotübüller stabilize edilir ve transfecting karışımı ile uzun inkübasyon nedeniyle hücredeki GFP-EB3'ün aşırı ifade edilmesi nedeniyle dinamik özelliklerini kaybeder. (C) ROS'un salınması nedeniyle fototoksilik sonucu hücre lamellasının küçülmesi. (D) Görüntüleme sırasında sinyal yoğunluğu düşer - hızlı fotobleaching. HD hastalarının cilt biyopsisinden elde edilen transfected kültürlü fibroblastlar. Görüntüleme frekansı saniyede 1 karedir. Geniş alan floresan mikroskopisi. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Şekil 1: Büyüyen mikrotübül artı uçlarının seçici görselleştirilmesi. GFP-EB3 işaretleyici (yeşil) transkoma insan endotel hücresinin farklı alanlarında (HPAEC kültürü: İnsan Pulmoner Arter Endotel Hücreleri) önde gelen kenar, kuyruk ve merkezi alanda (merkez etrafında bölge). Ölçek çubukları 10 μm. Görüntüleme sıklığı 1 kare/s Geniş alan floresan mikroskopidir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 2: ImageJ eklentisi MTrackJ kullanarak manuel izlemeden sonra GFP-EB3 etiketi ile mikrotübül dinamikleri analizi. (A,B) EB3-GFP yamalarının, HD hastalarının cilt biyopsisinden elde edilen transkrom virüslü kültürlü fibroblast serisinin zaman atlamalı yer değiştirmesinde elde ettiği EB3 izleri (ayrı ayrı renklendirilir). (A) EB3-GFP yamalarının 18 saniye boyunca yer değiştirmesi ile elde edilen EB3 parça (mor, No46). (B) EB3-GFP yamalarının 9 saniye boyunca yer değiştirmesi ile elde edilen EB3 parça (kırmızı, No37). (C) İnsan HD hastalarının cilt fibroblastının mikrotübüllerinin artı uçlu yer değiştirmesinin nicelleştirilmesi (A). (D)(B)ile gösterilen mikrotübüllerin artı uçlu yer değiştirmesinin nicelleştirilmesi. Grafik, 6-8 saniye arasında mikrotübülün büyümesinde bir duraklama olduğunu gösterir (artı ucun hareketi yoktur). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Dosya 1: Mikrotübüllerin artı uçları etiketli EB3-GFP dinamiklerinin nicel analizi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrotübüllerin dinamik analizi için daha kaliteli sonuçlar yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerden elde edilebilir. Canlı hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi için gerekli tüm koşulları gözlemlemek ve görüntüleme parametrelerini doğru ayarlamak önemlidir. Cam tabanlı özel hücre kültürü yemekleri (konfokal yemekler) kullanmak önemlidir, çünkü cam plastikten farklı bir kırılma indeksine sahiptir. Camın kalınlığı ve tüm alanı üzerindeki homojenliği de son derece önemlidir, çünkü bu parametreler normal numune odaklama için çok önemlidir. Bu parametrelerin ihlali kaçınılmaz olarak mükemmel odak sisteminin başarısız olmasına yol açar ve böylece kötü odaklanma ile sonuçlanır, böylece analiz için bu kadar odak dışı videonun kullanılmasını imkansız hale getirir (Şekil 5A). Canlı hücre görüntülemenin bir diğer önemli koşulu da ROS'dan korunmalarıdır. Çeşitli reaktifler bu amaçlar için kullanılabilir20. Çalışmalarımızda kültür ortamını atmosferden tamamen izole eden ve gaz değişimini engelleyen mineral yağ kullanıyoruz. Aynı şekilde, ROS azaltıcı oksiraz kullanılabilir, ancak bu enzim tüm hücre tipleri için uygun değildir ve daha sık artan zaman ile görüntüleme için geçerlidir.
Transfeksiyondan sonra hücrelerin optimal kuluçka süresini seçerken (24 veya 48 saat), transktaklı hücrelerin sayısına dikkat edilmelidir. Etiketli proteini ifade eden maksimum hücre sayısından daha küçük bir sayı analiz için zaten yeterlidir. Mikrotübüller bu gibi durumlarda stabilize edildiğinden ve dinamik özellikleri analiz edilemediğinden aşırı ifadeye izin verilmemelidir (Şekil 5B).
Bazı durumlarda, video kaydı başladıktan sonra görüntüleme parametrelerini hücrelerin reaksiyonlarına göre ayarlamak gerekebilir. Örneğin, ışığa karşı yüksek hassasiyet (fototoksilik) nedeniyle hücre lamellarının küçüldüğünü gözlemlemek mümkündür (Şekil 5C). Heyecanlandığında, floresan moleküller tipik olarak hücre bileşenlerine zarar verebilen serbest radikaller oluşturmak için moleküler oksijenle reaksiyona gelir21. Deneyler tasarlanırken, kısa dalga aydınlatması altında hücre hasarını en aza indirmek için mümkün olan maksimum uyarılma dalga boylarına sahip floroforlar seçilmelidir. Ek olarak, riboflavin vitamini ve triptofan amino asidi de dahil olmak üzere standart kültür medyasının bazı bileşenlerinin, ışığın kültürlü hücreler üzerindeki olumsuz etkilerine de katkıda bulunabileceğine dair raporlarvardır 22. Diğer şeylerin yanı sıra, bu bir hücredeki aşırı miktarda floresan etiketten kaynaklanabilir. Bu durumlarda, kayıt süresini ve aydınlatma yoğunluğunu azaltmak gerekli hale gelir. Başka bir olası sorun da hızlı fotobleaching olabilir - kayıt sırasında sinyal yoğunluğunun azaltılması (Şekil 5D). Bu etki, aynı deneysel çanak üzerindeki bir sonraki nesneyi seçerken dikkate alınmalıdır, çünkü görüntü alan çevresindeki komşu hücreler de yanmış olur.
Canlı hücrelerde virüsler kullanılarak floresan etiketli tübulinin hücre veya hücre transdüksiyonuna mikroenjeksiyonu gibi mikrotübül görselleştirme için başka yöntemlerin de olduğu belirtilmelidir. Diğer her yöntemde olduğu gibi transfeksiyon yönteminin de avantajları ve dezavantajları vardır. Bununla birlikte, bizim açımızdan, enjeksiyon yöntemine kıyasla, transfeksiyon daha etkilidir ve ifade vektörlerinin hücrelere kitlesel olarak dahil edilmesini sağlar ve bu da analiz için çok sayıda floresan hücre ile sonuçlanır. Ayrıca, transfection yöntemi araştırmacıdan özel ekipman ve beceri gerektirmez. Viral transdüksiyon yöntemi iyi sonuçlar gösterir ve uygulanabilir. Yine de, tüm hücre kültürleri için uygun değildir (özellikle, HD hastalarının cilt biyopsisinden elde edilen insan fibroblastları için daha az uygundur).
Bu protokoldeki en kritik adım, yeterli protein ekspresyonunu sağlamak için gerçekleştirilen transfeksiyondur. İyi bir sinyal-gürültü oranı, mikrotübüllerin fotobleachingi olmaması ve zaman atlamalı video kaydı sırasında hücre sürüklenmesinin olmaması etkili mikrotübül görüntüleme için kesinlikle kritiktir. Deneyimizdemikrotübüllerin görselleştirilmesi ve dinamik analiz mutant HTT ile hücrelerdeki mikrotübül özellikleri ve davranışları hakkında hayati bilgiler sağlar. Protokolümüz, patolojinin mikrotübüllerin dinamik özelliklerini ima ettiği diğer hastalıkların çalışmaları için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı tarafından finanse edildi, Hibe No. 075-15-2019-1669 (fibroblastların transfeksiyon), Rusya Bilim Vakfı tarafından hibe 19-15-00425 (fibroblast in vitroekimi ile ilgili diğer tüm çalışmalar). Lomonosov Moskova Devlet Üniversitesi Geliştirme programı PNR5.13 (görüntüleme ve analiz) tarafından kısmen desteklendi. Yazarlar, A. N. Belozersky Fiziko-Kimyasal Biyoloji Enstitüsü'ndeki Nikon Mükemmeliyet Merkezi'nin desteğini kabul ediyor. Seslendirme konusundaki yardımları için Ekaterina Taran'a özel teşekkürlerimizi sunmak istiyoruz. Yazarlar ayrıca Pavel Belikov'a video düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür etti. El yazmasındaki figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
