Summary
Detta protokoll är dedikerat till microtubule plus-end visualisering av EB3 proteintransfektion för att studera deras dynamiska egenskaper i primärcellskultur. Protokollet genomfördes på mänskliga primära huden fibroblaster som erhållits från Huntingtons sjukdom patienter.
Abstract
Transfektion med ett fluorescerande märkt markörprotein av intresse i kombination med timelapse videomikroskopi är en klassisk metod för att studera cytoskelettets dynamiska egenskaper. Detta protokoll erbjuder en teknik för mänskliga primära fibroblast transfection, som kan vara svårt på grund av detaljerna i primära cell odling villkor. Dessutom kräver cytoskeleton dynamiskt fastighetsunderhåll en låg nivå av transfektion för att få ett bra signal-till-brus-förhållande utan att orsaka mikrotubulestabilisering. Det är viktigt att vidta åtgärder för att skydda cellerna från ljusinducerad stress och fluorescerande färgtoning. Under vårt arbete testade vi olika transfekteringsmetoder och protokoll samt olika vektorer för att välja den bästa kombinationen av förhållanden som lämpar sig för mänskliga primära fibroblaststudier. Vi analyserade de resulterande timelapse-videorna och beräknade mikrotubuledynamiken med ImageJ. Dynamiken hos mikrotubules plus-ändar i de olika celldelarna är inte liknande, så vi delade analysen i undergrupper - centrosomeregionen, lamellen och svansen av fibroblaster. Detta protokoll kan särskilt användas för in vitro-analys av cytoskeletondynamik i patientprover, vilket möjliggör nästa steg mot att förstå dynamiken i de olika sjukdomsutvecklingarna.
Introduction
Huntingtons sjukdom (HD) är en obotlig neurodegenerativ patologi orsakas av en mutationin gen kodningtin protein (HTT). HTT är främst förknippat med blåsor och mikrotubuli och är troligen involverat i mikrotubuleberoende transportprocesser1,2. För att studera mutant HTT:s påverkan på mikrotubuledynamiken använde vi in vitro-visualisering av EB3-proteinet, som reglerar mikrotubulis dynamiska egenskaper genom att binda och stabilisera de växande plus-ändarna. För att ladda fluorescerande märkt EB3 i mänskliga huden fibroblaster, plasmid transfection tillämpades. Vi använde den primära fibroblast kultur som erhållits från HD patienter huden biopsi för denna studie.
Mutationen i HTT-proteingenen leder till förlängning av polyglutaminkanalen3. HTT har en roll i sådana cellulära processer som endocytos4,celltransport1,2,proteinnedbrytning5, etc. Väsentlig del av dessa processer involverar olika delar av cellen cytoskeleton, inklusive mikrotubulerna.
Mänskliga primärceller är den bästa modellen för att reproducera händelser som inträffar i patientceller så nära som möjligt. För att skapa sådana modeller måste man isolera celler från mänskligt biopsimaterial (t.ex. från kirurgiska prover). Den resulterande primära cellinjen är lämplig att studera patogenes med hjälp av olika genetiska, biokemiska, molekylära och cellbiologiska metoder. Mänskliga primära cellkulturer tjänar också som en föregångare för att skapa olika transdifferentierade och transgena kulturer6.
Men i motsats till odödliga cellkulturer är den betydande nackdelen med primärceller deras begränsade passagekapacitet. Därför rekommenderar vi att du använder celler i det tidiga passagestadiet (upp till 15). Äldre kulturer degenererar mycket snabbt och förlorar sina unika egenskaper. De nyligen erhållna primärcellerna bör därför hållas frysta för långtidslagring.
Primära cellkulturer är mottagliga för odlingsförhållanden. Därför kräver de ofta unika tillvägagångssätt och optimering av odlingsförhållanden. I synnerhet kräver den mänskliga hudens primära fibroblaster som används i våra experiment på substratet. Därför använde vi olika ytterligare beläggningar (t.ex. gelatin eller fibronectin) beroende på experimenttyp.
Cellens cytoskeleton bestämmer cellformen, rörligheten och rörelse. Dynamiken i cytoskeleton är avgörande för många intracellulära processer både i interfas och mitos. I synnerhet är cytoskeleton polymeriserad från tubulin, mycket dynamiska och polära strukturer, vilket möjliggör motorproteinmedierad riktad riktad intracellulär transport. Mikrotubulis ändar är i konstant omorganisering, deras monteringsfaser växlar med demonteringsfaserna, och detta beteende kallas "dynamisk instabilitet"7,8,9. Olika associerade proteiner skiftar jämvikten i polymerisationsreaktionen, vilket leder antingen till polymerbildningen eller proteinmonombildningen. Tillsatsen av tubulinunderenheter sker huvudsakligen vid plus-änden av mikrotubuli10. Den slutbindande (EB) proteinfamiljen består av tre medlemmar: EB1, EB2 och EB3. De fungerar som plus-end-tracking proteiner (+TIPs) och reglerar de dynamiska egenskaperna hos mikrotubuli genom att binda och stabilisera deras växande plus-ändar11.
Många studier använder fluorescerande molekylmärkt tubulin mikroinjektion eller transfektion med timelapse imaging och videoanalys för att visualisera mikrotubuli in vitro. Dessa metoder kan vara invasiva och skadliga för celler, särskilt primära mänskliga celler. Det mest utmanande steget är att hitta förutsättningar för celltransfektion. Vi försökte nå högsta möjliga nivå av transfektion utan att påverka livskraft och inhemska cellmorfologi. Denna studie tillämpar den klassiska metoden för att studera skillnaderna i mikrotubuledynamik i hudfibblaster hos friska donatorer och patienter med Huntingtons sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna från Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency daterad 08 september 2015.
OBS: Figur 1 ger en översikt över protokollet.
1. Erhålla en primär kultur av human hud fibroblaster (figur2)
- Leverera biopsin till ett laboratorium inom några timmar i Dulbeccos modified eagle media (DMEM) medium kompletterat med 50 μg/ml penicillin och 50 U/ml streptomycin.
OBS: En hudbiopsi måste utföras under sterila förhållanden av en läkare efter att en patient har signalerat ett informerat samtycke. - Placera biopsivävnaden i en 6 cm Petriskål tillsammans med en liten mängd av mediet.
- Skär biopsiprovet i bitar om ca 0,5-1 mm med hjälp av en steril skalpell. Placera 1-2 erhållna fragment i en 3,5 cm Petriskål och placera ett sterilt täckblad över biopsibitarna. Tillsätt långsamt 1,5 ml tillväxtmedium till följande sammansättning: DMEM, 50 U/ml penicillin-streptomycin och 10% fetalt bovinserum (FBS).
- Kulturfibblaster i tillväxtmediet inuti en CO2 inkubator bibehållen vid 5% CO2,37 °C, 80% luftfuktighet.
OBS: Efter 4-7 dagar börjar först keratinocyter, sedan fibroblaster, migrera från vävnaden till botten av skålen.
2. Lagring, frysning och frysning av primärkulturen
- Ta bort celler från odlingsfatet (se punkterna 3.2-3.4).
- Överför cellfjädringen till ett koniskt rör på 15 ml och centrifugera i 5 minuter vid 200 x g. Kassera sedan supernatanten och återanvänd cellpelleten i 900 μL kyld FBS.
- Överför till ett kryopreservationsrör droppe för droppe och tillsätt 100 μL dimetylsulfoxid (DMSO).
- Placera kryoproben i en frys med låg temperatur vid -80 °C. Tjugofyra timmar senare överför du kryovialen till flytande kväve (−196 °C) för långtidsförvaring.
- För att tina upp de kryopreserverade cellerna, ta bort kryovialen från kvävelagret och överför inom 1 min 1 ml av innehållet till ett koniskt rör på 15 ml som innehåller 9 ml av transportmediet förvärmt till 37 °C.
- Använd försiktigt om och centrifugera sedan röret i 5 min vid 200 x g. Kassera supernatanten, återanvänd cellpelleten i önskad volym av tillväxtmediet och placera dem på en Petriskål med önskad diameter.
3. Cellodling
- Täck skålbotten med autoklaverad 0,1% gelatinlösning beredd i destillerat vatten. Inkubera i 15 min.
OBS: För transfectionvisualisering bör glasbottenplåträtter (konfokala rätter med glastjocklek 170 μm) användas. - Förbered ett odlingsmedium med följande sammansättning: DMEM kompletterat med 10% FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 50 U/mL penicillin-streptomycin. Blanda noggrant och förvara vid 4 °C. Värm mediet till 37 °C innan du lägger till cellerna.
- Utvärdera kulturen under mikroskopet. Ta bort mediet och tvätta fibroblaster med Dulbeccos fosfatsaltlösning (DPBS).
- Tillsätt 1 ml förvärmd 0,25% trypsinlösning till cellerna. Kontrollera cellerna under mikroskopet om de lossnar helt från substratet. Inaktivera trypsin med 1 ml kulturmedium.
- Överför cellfjädringen till ett koniskt rör på 15 ml. Centrifugera röret vid 200 x g i 5 minuter, ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i 1 ml av odlingsmediet.
- Räkna antalet celler. Beräkna det önskade antalet celler för att så dem med en densitet på 8-15 x 103/ cm2 och återanvända i 2 ml av odlingsmediet.
- Ta bort gelatinlösningen från odlingsskålen och tillsätt omedelbart 2 ml av cellupphängningen. Odla fibroblaster vid 37 °C i en CO2 inkubator.
- Uppdatera mediet var 2-4 dagar.
OBS: För experiment, använd cellerna i 4-11 passager.
4. Transfection
- Byt ut odlingsmediet mot ett friskt odlingsmedium 24 h före transfektion.
OBS: Cellkonflödet ska vara 70-80%. - Förbered ett DNA-lipidkomplex baserat på cellsåddens område och densitet. Använd liposombaserat transfekteringsmedel.
OBS: Använd cellsåddstätheten som 1 x 104 celler/cm2. - Tillsätt 3 μL kommersiellt transfekteringsreagens till 125 μL optimalt minimalt essentiellt medium (Opti-MEM) som inte innehåller antibiotika, utan att röra vid rörets väggar. Försiktigt återanvända.
- Späd ut plasmid-DNA (GFP-EB3) genom att tillsätta 1 μg av plasmid-DNA till 125 μL Opti-MEM. Försiktigt återanvända.
OBS: Uttryck vektor kodning GFP-EB311 mottogs som en vänlig gåva från Dr. I. Kaverina (Vanderbilt University, Nashville) med tillstånd från Dr. A. Akhmanova (Erasmus University, Rotterdam)11. - Tillsätt utspädd plasmid-DNA till varje rör av utspädd transfekteringsreagens (1:1). Inkubera i 30 min.
- Tillsätt DNA-lipidkomplexet till 6 cm Petri-skålen som innehåller celler och blanda med en korsformad gunga i 30 s. Inkubera celler med ett transfekteringsmedel i 24 timmar och byt sedan till färskt medium. Analysera effektiviteten av transfektion efter 24 h och 48 h.
OBS: 24 h efter transfection var effektiviteten 10-15%, och efter 48 h upp till 40%.
5. Förberedelser för avbildning
- Innan levande avbildning av celler, ändra odlingsmediet till ett medium utan pH-indikatorfärg för att minska autofluorescens.
- Applicera försiktigt mineralolja på den medelstora ytan för att helt täcka mediet och isolera det från den yttre miljön för att minska O2-penetrationen och den medelstora avdunstningen.
- Använd en kvicksilverlampa och oljesänkning 60x eller 100x objektiv med en hög siffra bländare för att ta bilderna.
OBS: För in vivo-observationer måste mikroskopet vara utrustat med en inkubator för att upprätthålla de nödvändiga förutsättningarna för cellerna, inklusive uppvärmning av objektbordet och linsen till +37 °C, en sluten kammare medCO 2-tillförsel och fuktnivåstöd. Använd dubbeldestillerat vatten för att skapa fuktighet. Kontrollera nivån på dubbeldestillerat vatten innan du filmar. - Placera den konfokala skålen med cellerna i mikroskophållaren före avbildning. Se till att skålen och kameran är ordentligt fastsatta på hållaren för att undvika drifting när du tar bilder.
6. Ställa in bildparametrarna
- Välj låga exponeringsvärden eftersom ljus inducerar cellskadande reaktiva syrearter (ROS).
OBS: För att studera dynamiken hos mikrotubuli i human hud fibroblaster valdes en 300 ms exponering. - Fokusera på föremålet för intresse.
OBS: För långsiktig tidsfördröjning, använd det automatiska fokusstabiliseringssystemet för att kompensera för en eventuell förskjutning längs z-axeln. - Välj optimala bildförhållanden beroende på cellernas ljuskänslighet och fluorokromens blekning.
OBS: Eftersom mikrotubuli är mycket dynamiska strukturer kan ett ganska kort tidsintervall väljas och bildhastigheten måste vara tillräckligt hög. För att undersöka mikrotubuledynamiken i hudfibblaster använde vi med en frekvens av 1 ram/s i 3-5 min. - När du markerar nästa objekt för att hämta bilden flyttar du bort från det redan avbildade området. Eftersom detta område var under påverkan av ljus kommer det att finnas märkbar fotoblekning.
OBS: Eftersom en relativt hög bildfrekvens användes stängdes inte slutaren mellan bilderna, och lampan tändes under hela bildperioden, varför blekningen ökade. - Välj den optimala videon för att studera mikrotubulis dynamik visuellt, med hänsyn till kvaliteten på transfektionen, kvaliteten på mikrotubulernas bilder (optimalt signal-till-brus-förhållande) och frånvaron av drifting vid den analyserade cellen(figur 3).
- Använd de valda videorna för att studera mikrotubulernas plus-ends dynamik genom att spåra dem i ImageJ- eller Fiji-programmet (figur 4).
Obs: För kvantitativa analysinstruktioner se Kompletterande figur 2 och kompletterande akt 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resulterande GFP-EB3-filmerna som produceras med protokollet (bild 1) illustrerar mikrotubulis dynamiska egenskaper. Mikrotubuli är involverade i olika cellprocesser, och deras dynamiska egenskaper påverkar olika livsegenskaper hos den primära mänskliga cellkulturen från patienternas biopsimaterial (figur 2).
Följande parametrar bestämmer den dynamiska instabiliteten hos mikrotubuli: tillväxttakten (polymerisation) och krympning (depolymerisering); frekvensen av katastrofer (övergång från polymerisation till depolymerisering); frekvensen av räddningar (övergång från depolymerisering till polymerisation); samt pauser - tillstånd när mikrotubule inte polymeriserar och inte depolymeriserar 12. Alla parametrar är hårt reglerade, och polymerisationshastigheterna och depolymeriseringen av enskilda mikrotubuli kan variera avsevärt både i samma och olika celltyper13,14,15,16,17.
Det är nödvändigt att för analysen överväga att mikrotubuli kan ha olika dynamik beroende på deras position i cellen. Mikrotubuli som ligger i kärnans region och centrosom beter sig annorlunda jämfört med de i cellens periferi19. För att få ett tillförlitligt resultat gjorde vi därför mikrotubulernas dynamiska mätningar i tre separata delar av cellen: den centrala delen, framkanten och svansdelen (figur 3). För att kontrollera korrekt fördelning av GFP-EB3-etiketten i olika celldelar använde vi mänskliga lungartärendotelceller (HPAEC)(se kompletterande figur 1).
Specialiserade program, såsom ImageJ eller Fiji (ImageJ 2 v1. 53i), tillåter analys av videorna med följande parametrar: (1) hastigheten på mikrotubulernas tillväxt; 2. Katastroffrekvensen. 3. Räddningsfrekvensen. 4. Frekvensen av pauser. och (5) pausernas varaktighet. Dessutom tillåter unika programalternativ och plugins spårning automatiskt18 eller manuellt19 (bild 4). Den manuella spårningsmetoden fungerade bättre i våra experiment eftersom automatiska mätningar är benägna att större fel och kräver fler upprepningar för ett mer exakt resultat. Detaljerade instruktioner om analys av mikrotubulidynamik finns i kompletterande figur 2 och kompletterande fil 1.
Avbildningsparametrarna kan kräva justeringar under avbildningsprocessen. Till exempel kan varaktigheten för en cellavbildning och exponeringsvärdena ändras. Sådana inställningar är användbara om det finns en snabb signalutbrändning eller om cellen krymper (bild 5).
Figur 1: Det allmänna systemet för GFP-EB3 transfection protokoll för human hud primära fibroblaster kultur. Protokollet innehåller följande steg: lösgöring av celler med trypsinlösningen; trypsin inaktivering av medeltillägget; centrifugering av den resulterande föreningen. Beräkning av cellkoncentrationen. Cellsådd till glasbottenskålen (confokal skål) belagd med gelatin; Cellodling transfection av plasmid DNA (med GFP-EB3) med liposomal transfection reagens; inkubation 24-48 h; och analys under ett mikroskop. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Human hud fibroblasts primära kulturberedningsprogram. En hudbiopsi måste utföras under sterila förhållanden av en läkare efter att en patient har meddelat ett informerat samtycke. Därefter transporteras en bit vävnad i en liten mängd av mediet utan FBS till laboratoriet i en Petri-maträtt. Ett stort fragment av vävnad skärs i bitar av 0,5-1 mm i storlek, och de är täckta med ett täckglas med tillsats av mediet med FBS. Sedan placeras Petri-skålen i en CO2-inkubator, där fibroblaster efter 4-7 dagar migrerar från vävnadsfragmentet till glasbotten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: GFP-EB3-markör (grön) i olika områden av transfekterade humana fibroblaster, erhållna från HD-patienters hudbiopsi: framkant (övre panel); svans (mittpanel); centrala delen av fibroblast (zon runt centrosomen) (nedre panelen). Skalstång = 10 μm. Bildfrekvensen är 1 bildruta/s. Bredfälts fluorescerande mikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: GFP-EB3 manuell spårning av ImageJ plugin MTrackJ. Spår som återspeglar tillväxten av mikrotubuler erhölls som ett resultat av ram-för-ram manuell märkning av GFP-EB3 etiketter tips vid plus-ändarna under 20 s avbildning. Transfected odlade fibroblaster, erhållna från HD patienters huden biopsi. Bildfrekvensen är 1 bildruta/s. Bredfälts fluorescerande mikroskopi. Skalningslist = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Felsökning vid avbildning av GFP-EB3-märkta mikrotubuli plusändar. (A) Fluorescerande märkta mikrotubuli är ur fokus på grund av avsaknaden av ett fokuseringssystem. (B) Mikrotubuli stabiliseras och förlorar sina dynamiska egenskaper på grund av överuttryck av GFP-EB3 i cellen på grund av lång inkubation med transfektblandningen. c)Krympning av celllamellen till följd av fototoxicitet på grund av utsläpp av ROS. (D) Signalintensiteten sjunker under avbildning - snabb fotoblekning. Transfected odlade fibroblaster, erhållna från HD patienters huden biopsi. Bildfrekvensen är 1 bildruta per sekund. Bredfälts fluorescerande mikroskopi. Skalningsstaplar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Selektiv visualisering av växande mikrotubule plus-ändar. GFP-EB3-markör (grön) i olika områden av transfekterad mänsklig endotelcell (hpaec- kultur: Human Pulmonary Artery Endothelial Cells) i framkant, svans och centralt område (zon runt centrosom). Skalstänger 10 μm. Bildfrekvensen är 1 ram/s Bredfälts fluorescerande mikroskopi. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Mikrotubuledynamikanalys med GFP-EB3-etikett efter manuell spårning med ImageJ plugin MTrackJ. (A,B) EB3 spår erhålls av EB3-GFP plåster förskjutning på time-lapse serie av transfected odlade fibroblasts, erhållna från HD patienters huden biopsi (är färgade individuellt). (A) EB3-spår (lila, nr 46) som erhålls genom EB3-GFP-plåster deplacement under 18 sekunder. b) EB3-spår (rött, nr 37) som erhålls genom EB3-GFP-plåster förskjutning under 9 sekunder. (C) Kvantifiering av plus-ends förskjutning av mikrotubuli av humana HD-patienters hudfibblas som visas i (A). d)Kvantifiering av plus-ends förskjutning av mikrotubuli som visas ib. Diagrammet visar att mellan 6-8 sekunder finns det en paus i mikrotubuleens tillväxt (det finns ingen rörelse av plus-end). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1: Kvantitativ analys av dynamiken i EB3-GFP märkta mikrotubuli plus-ändar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bättre kvalitetsresultat för mikrotubulis dynamikanalys kan erhållas från högkvalitativa mikroskopiska bilder. Det är viktigt att iaktta alla nödvändiga förutsättningar för tidsfördröjning av levande celler och att korrekt justera bildparametrarna. Att använda speciella cellodlingsrätter med en glasbotten (konfokala rätter) är viktigt, eftersom glas har ett annat brytningsindex av ljus än plast. Glasets tjocklek och dess enhetlighet över hela dess område är också extremt viktigt, eftersom dessa parametrar är avgörande för normal provfokusering. Brott mot dessa parametrar leder oundvikligen till ett misslyckande med det perfekta fokussystemet som resulterar i dålig fokusering, vilket gör det omöjligt att använda sådan video utanför fokus för analys (figur 5A). Ett annat viktigt villkor för live-cell imaging är deras skydd mot ROS. Olika reagenser kan användas för sådana ändamål20. I vårt arbete använder vi mineralolja, som helt isolerar odlingsmediet från atmosfären och förhindrar gasutbyte. På samma sätt kan den ROS-reducerande oxyrasen användas, men detta enzym är inte lämpligt för alla celltyper och är oftare tillämpligt på avbildning med ökad tid.
När man väljer den optimala inkubationstiden för celler efter transfektion (24 eller 48 h) bör man uppmärksamma antalet transfekterade celler. Ett tal som är mindre än det maximala antalet celler som uttrycker det märkta proteinet är redan tillräckligt för analysen. Överuttryck bör inte tillåtas eftersom mikrotubuli i sådana fall stabiliseras och deras dynamiska egenskaper inte kan analyseras (figur 5B).
I vissa fall kan det vara nödvändigt att justera bildparametrarna i enlighet med cellernas reaktion efter att videoinspelningen har startats. Det är till exempel möjligt att observera att celllamellerna krymper på grund av hög ljuskänslighet (fototoxicitet) (figur 5C). När de är upphetsade reagerar fluorescerande molekyler vanligtvis med molekylärt syre för att bilda fria radikaler som kan skadacellkomponenterna 21. Vid utformning av experiment bör fluoroforer med maximal excitationsvåglängd väljas för att minimera cellskador under kortvågsbelysning. Dessutom finns det rapporter om att vissa komponenter i standardkulturmedier, inklusive riboflavin-vitamin och tryptofanaminsyran, också kan bidra till ljusets negativa effekter på odlade celler22. Detta kan bland annat orsakas av en överdriven mängd fluorescerande etiketter i en cell. I dessa fall blir det nödvändigt att minska inspelningens varaktighet och belysningens intensitet. Ett annat möjligt problem kan också vara snabb fotobleaching - minskning av signalintensiteten under inspelningen (figur 5D). Denna effekt bör beaktas när du väljer nästa objekt på samma experimentella maträtt, eftersom de närliggande cellerna runt det avbildade området också är utbrända.
Det bör nämnas att det finns andra metoder för mikrotubulevisualisering i levande celler som mikroinjektion av fluorescerande märkt tubulin i cellen eller celltransduktion med hjälp av virus. Som med alla andra metoder finns det fördelar och nackdelar med transfectionmetoden. Men ur vår synvinkel, i jämförelse med injektionsmetoden, är transfektion effektivare och gör det möjligt att uppnå massinkludering av uttrycksvektorer i cellerna, vilket resulterar i ett stort antal fluorescerande celler för analys. Transfectionmetoden kräver inte heller särskild utrustning och färdigheter från forskaren. Metoden för viral transduktion visar goda resultat och kan tillämpas. Ändå är det inte lämpligt för alla cellkulturer (i synnerhet är det mindre lämpligt för mänskliga fibroblaster, erhållna från HD-patienters hudbiopsi).
Det mest kritiska steget i detta protokoll är transfektionen som utförs för att säkerställa tillräckligt proteinuttryck. Ett bra signal-till-brus-förhållande, ingen fotobleaching av mikrotubuli och frånvaron av celldriftning under timelapse-videoinspelning är helt avgörande för effektiv mikrotubuler imaging. I vårtexperiment ger visualisering av mikrotubuli och den dynamiska analysen viktig information om mikrotubuleegenskaper och beteende i cellerna med mutant HTT. Vårt protokoll är tillämpligt för studier av andra sjukdomar för vilka patologi involverar dynamiska egenskaper hos mikrotubuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning, anslag nr 075-15-2019-1669 (transfection av fibroblaster), av Ryska vetenskapsstiftelsen, bidrag nr 19-15-00425 (alla andra arbeten om odling av fibroblaster in vitro). Det stöddes delvis av Lomonosov Moskva State University Development program PNR5.13 (imaging och analys). Författarna erkänner stödet från Nikon Center of Excellence vid A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Vi vill framföra vårt speciella tack till Ekaterina Taran för hennes hjälp med röstskådespeleri. Författarna tackar också Pavel Belikov för hans hjälp med videoredigeringen. Figurer i manuskriptet skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
