Summary
Этот протокол предназначен для визуализации микротрубочек плюс конец путем трансфекции белка EB3 для изучения их динамических свойств в первичной клеточной культуре. Протокол был реализован на первичных фибробластах кожи человека, полученных от пациентов с болезнью Гентингтона.
Abstract
Трансфекция флуоресцентно меченым маркерным белком, представляющим интерес, в сочетании с покадровой видеомикроскопией является классическим методом изучения динамических свойств цитоскелета. Этот протокол предлагает технику первичной трансфекции фибробластов человека, которая может быть затруднена из-за специфики условий культивирования первичных клеток. Кроме того, поддержание динамических свойств цитоскелета требует низкого уровня трансфекции для получения хорошего отношения сигнал/шум, не вызывая стабилизации микротрубочек. Важно принять меры по защите клеток от светового стресса и флуоресцентного затухания красителей. В ходе нашей работы мы протестировали различные методы и протоколы трансфекции, а также различные векторы, чтобы выбрать наилучшую комбинацию условий, подходящих для исследований первичных фибробластов на людях. Мы проанализировали полученные покадровые видео и рассчитали динамику микротрубочек с помощью ImageJ. Динамика плюсов микротрубочек в разных частях клеток не одинакова, поэтому мы разделили анализ на подгруппы — центросомную область, пластинку и хвост фибробластов. Примечательно, что этот протокол может быть использован для анализа in vitro динамики цитоскелетов в образцах пациентов, что позволяет сделать следующий шаг к пониманию динамики развития различных заболеваний.
Introduction
Болезнь Гентингтона (БГ) является неизлечимой нейродегенеративной патологией, вызванной геном мутации, кодирующим белок хунтингтина (HTT). HTT в первую очередь связан с везикулами и микротрубочками и, вероятно, участвует в микротрубочезависимых транспортных процессах1,2. Для изучения влияния мутантного HTT на динамику микротрубочек мы использовали визуализацию in vitro белка EB3, который регулирует динамические свойства микротрубочек путем связывания и стабилизации растущих плюсов. Для загрузки флуоресцентно меченого EB3 в фибробласты кожи человека применяли плазмидную трансфекцию. Для этого исследования мы использовали первичную культуру фибробластов, полученную из биопсии кожи пациентов с БГ.
Мутация в гене белка HTT приводит к удлинению полиглутаминового тракта3. HTT играет роль в таких клеточных процессах, как эндоцитоз4,клеточный транспорт1,2,деградация белка5и др. Существенная часть этих процессов включает в себя различные элементы клеточного цитоскелета, в том числе и микротрубочки.
Первичные клетки человека являются лучшей моделью для максимально точного воспроизведения событий, происходящих в клетках пациента. Для создания таких моделей необходимо изолировать клетки из биопсийного материала человека (например, из хирургических образцов). Полученная первичная клеточная линия подходит для изучения патогенеза с использованием различных генетических, биохимических, молекулярных и клеточных методов биологии. Также первичные клеточные культуры человека служат предшественником для создания различных трансдифференцированных и трансгенных культур6.
Однако, в отличие от увековеченных клеточных культур, существенным недостатком первичных клеток является их ограниченная проходная способность. Поэтому мы рекомендуем использовать клетки на ранней стадии прохождения (до 15). Старые культуры очень быстро вырождаются, теряя свои уникальные свойства. Таким образом, вновь полученные первичные клетки следует хранить замороженными для длительного хранения.
Первичные клеточные культуры восприимчивы к условиям культивирования. Поэтому они часто требуют уникальных подходов и оптимизации условий выращивания. В частности, первичные фибробласты кожи человека, используемые в наших экспериментах, требовательны к субстрату. Следовательно, мы использовали различные дополнительные покрытия (например, желатин или фибронектин) в зависимости от типа эксперимента.
Клеточный цитоскелет определяет форму клетки, подвижность и локомоцию. Динамика цитоскелета имеет решающее значение для многих внутриклеточных процессов как в интерфазе, так и при митозе. В частности, цитоскелеты, полимеризованные из тубулина, обладают высокодинамичными и полярными структурами, обеспечивающими моторный белково-опосредованный направленный внутриклеточный транспорт. Концы микротрубочек находятся в постоянной перестановке, фазы их сборки чередуются с фазами разборки, и такое поведение называется «динамической нестабильностью»7,8,9. Различные ассоциированные белки смещают равновесие реакции полимеризации, приводя либо к образованию полимера, либо к образованию белкового мономера. Добавление субъединиц тубулина происходит в основном на плюс-конце микротрубочек10. Семейство конечных связывающих (EB) белков состоит из трех членов: EB1, EB2 и EB3. Они служат плюс-концевыми белками (+ТИПы) и регулируют динамические свойства микротрубочек, связывая и стабилизируя их растущие плюс-концы11.
Во многих исследованиях используется микроинъекция или трансфекция флуоресцентных молекул тубулина с покадровой визуализацией и видеоанализом для визуализации микротрубочек in vitro. Эти методы могут быть инвазивными и вредными для клеток, особенно первичных клеток человека. Наиболее сложным шагом является поиск условий для трансфекции клеток. Мы попытались достичь максимально возможного уровня трансфекции, не влияя на жизнеспособность и морфологию нативных клеток. В данном исследовании применяется классический метод изучения различий в динамике микротрубочек в фибробластах кожи здоровых доноров и пациентов с болезнью Гентингтона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данный протокол соответствует рекомендациям Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства от 08 сентября 2015 года.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола.
1. Получение первичной культуры фибробластов кожи человека(рисунок 2)
- Доставьте биопсию в лабораторию в течение нескольких часов в среде Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM), дополненной 50 мкг / мл пенициллина и 50 Ед / мл стрептомицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия кожи должна быть выполнена в стерильных условиях врачом после того, как пациент подписывает информированное согласие. - Поместите биопсийную ткань в чашку Петри 6 см вместе с небольшим количеством среды.
- Используя стерильный скальпель, разрежьте образец биопсии на кусочки размером около 0,5-1 мм. Поместите 1-2 полученных фрагмента в чашку Петри размером 3,5 см и поместите стерильную крышку поверх кусочков биопсии. Медленно добавляют 1,5 мл питательной среды в следующую композицию: ДМЭМ, 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Культивировать фибробласты в питательной среде внутри инкубатораСО2 поддерживается при 5%СО2,37 °С, влажности 80%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 4-7 дней сначала кератиноциты, затем фибробласты, начинают мигрировать из ткани на дно блюда.
2. Хранение, замораживание и размораживание первичной культуры
- Удалите клетки из чашки для культивирования (см. пункты 3.2-3.4).
- Переложите клеточную суспензию на коническую трубку объемом 15 мл и центрифугу в течение 5 мин при 200 х г. Затем выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 900 мкл охлажденного FBS.
- Переложить в криоконсервационную трубку капля за каплей и добавить 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
- Поместите криозонд в низкотемпературную морозильную камеру при -80 °C. Через двадцать четыре часа переводят криовиал в жидкий азот (−196 °C) для длительного хранения.
- Чтобы разморозить криоконсервированные клетки, извлекают криовиал из хранилища азота и в течение 1 мин переносят 1 мл содержимого в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл транспортной среды, предварительно нагретой до 37 °C.
- Осторожно повторно суспендировать, а затем центрифугировать трубку в течение 5 мин при 200 х г. Выбросьте супернатант, повторно суспендируйте ячейки гранулы в необходимом объеме питательной среды и поместите их на чашку Петри необходимого диаметра.
3. Культивирование клеток
- Накройте дно тарелки автоклавным 0,1% раствором желатина, приготовленным в дистиллированной воде. Инкубировать в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансфекционной визуализации следует использовать посуду со стеклянным дном (конфокальные тарелки толщиной стекла 170 мкм). - Готовят культуральную среду следующего состава: ДМЭМ, дополненную 10% ФБС, 2 мМ L-аланил-L-глутамина, 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина. Тщательно перемешать и хранить при температуре 4 °C. Прогрейте среду до 37 °C перед добавлением в ячейки.
- Оцените культуру под микроскопом. Удалите среду и промойте фибробласты фосфатно-солевым раствором Dulbecco (DPBS).
- Добавьте в клетки 1 мл предварительно подогретого 0,25% раствора трипсина. Проверьте клетки под микроскопом, если они полностью отсоединяются от подложки. Деактивировать трипсин 1 мл питательной среды.
- Переложите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл. Центрифугируют пробирку при 200 х г в течение 5 мин, удаляют надосадочную массу и повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл питательной среды.
- Подсчитайте количество ячеек. Рассчитают необходимое количество клеток для засева их плотностью 8-15 х 103/см2и повторно суспендируют в 2 мл питательной среды.
- Удалите желатиновый раствор из чашки для культивирования и сразу же добавьте 2 мл клеточной суспензии. Культивируйте фибробласты при 37 °C в инкубатореCO2.
- Обновляйте среду каждые 2-4 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов используйте ячейки из 4-11 проходов.
4. Трансфекция
- Заменить культуральную среду свежей питательной средой за 24 ч до трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние клеток должно составлять 70-80%. - Готовят ДНК-липидный комплекс исходя из площади и плотности посева клеток. Используйте трансфекционный агент на основе липосом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте плотность посева клеток как 1 х 104 ячейки / см2. - Добавьте 3 мкл коммерческого трансфекционного реагента к 125 мкл оптимальной минимальной существенной среды (Opti-MEM), не содержащей антибиотиков, не касаясь стенок трубки. Осторожно повторно суспендировать.
- Разбавляют плазмидную ДНК (GFP-EB3), добавляя 1 мкг плазмидной ДНК к 125 мкл Opti-MEM. Осторожно повторно суспендировать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Векторная кодировка экспрессии GFP-EB311 была получена в качестве любезного подарка от доктора И. Каверина (Университет Вандербильта, Нэшвилл) с разрешения доктора А. Ахмановой (Университет Эразма, Роттердам)11. - Добавьте разбавленную плазмидную ДНК в каждую пробирку разбавленного трансфекционного реагента (1:1). Инкубировать в течение 30 мин.
- Добавьте ДНК-липидный комплекс в 6 см чашку Петри, содержащую клетки, и перемешайте крестообразным взмахом в течение 30 с. Инкубировать клетки с трансфекционным агентом в течение 24 ч, а затем перейти на свежую среду. Анализируют эффективность трансфекции через 24 ч и 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: через 24 ч после трансфекции КПД составил 10-15%, а через 48 ч до 40%.
5. Подготовка к визуализации
- Перед живой визуализацией клеток измените культуральную среду на среду без рН-индикаторного красителя для снижения автофлуоресценции.
- Осторожно нанесите минеральное масло на поверхность среды, чтобы полностью покрыть среду, изолируя ее от внешней среды, чтобы уменьшить проникновениеО2 и испарение среды.
- Используйте ртутную лампу и масляный погружной объектив 60x или 100x с высокой числовой диафрагмой для получения изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдений in vivo микроскоп должен быть оснащен инкубатором для поддержания необходимых условий для клеток, включая нагрев стола объекта и линзы до +37 °C, закрытую камеру с подачей CO2 и поддержку уровня влажности. Используйте двойную дистиллированную воду для создания влажности. Проверьте уровень двойной дистиллированной воды перед съемкой. - Поместите конфокальную чашку с клетками в держатель микроскопа перед визуализацией. Убедитесь, что тарелка и камера надежно прикреплены к держателю, чтобы избежать дрейфа во время съемки.
6. Настройка параметров изображения
- Выберите низкие значения экспозиции, так как свет индуцирует повреждающие клетки активные формы кислорода (АФК).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения динамики микротрубочек в фибробластах кожи человека было выбрано воздействие 300 мс. - Сосредоточьтесь на интересующем объекте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для долгосрочной покадровой съемки используйте автоматическую систему стабилизации фокусировки для компенсации возможного сдвига вдоль оси Z. - Выберите оптимальные условия визуализации в зависимости от фоточувствительности клеток и скорости затухания фторхрома.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку микротрубочки являются высокодинамичными структурами, можно выбрать достаточно короткий временной интервал, а частота кадров должна быть достаточно высокой. Для исследования динамики микротрубочек в фибробластах кожи мы использовали с частотой 1 кадр/с в течение 3-5 мин. - При выборе следующего объекта для получения изображения отойдите от уже изображенной области. Так как эта область находилась под воздействием света, будет заметно фотоотбеливание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку использовалась относительно высокая частота изображения, затвор не закрывался между изображениями, и лампа горела в течение всего периода изображения, из-за чего затухание увеличивалось. - Выбрать оптимальное видео для визуального изучения динамики микротрубочек с учетом качества трансфекции, качества изображений микротрубочек (оптимальное отношение сигнал/шум) и отсутствия дрейфа в случае анализируемой ячейки(рисунок 3).
- Используйте выбранные видео для изучения динамики плюсов микротрубочек, отслеживая их в программе ImageJ или Fiji(рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по количественному анализу см. в дополнительном рисунке 2 и дополнительном файле 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Полученные фильмы GFP-EB3, созданные с использованием протокола(рисунок 1),иллюстрируют динамические свойства микротрубочек. Микротрубочки участвуют в различных клеточных процессах, и их динамические свойства влияют на различные жизненные характеристики первичной культуры клеток человека из биопсийного материала пациента(рисунок 2).
Динамическую нестабильность микротрубочек определяют следующие параметры: темпы роста (полимеризация) и усадки (деполимеризация); частота катастроф (переход от полимеризации к деполимеризации); частота спасений (переход от деполимеризации к полимеризации); а также паузы – состояния, когда микротрубочка не полимеризуется и не деполимеризуется 12. Все параметры жестко регламентированы, а скорости полимеризации и деполимеризации отдельных микротрубочек могут существенно варьироваться как в одних и тех же, так и в разных типах клеток13,14,15,16,17.
Для анализа необходимо учитывать, что микротрубочки могут иметь разную динамику в зависимости от их положения в клетке. Микротрубочки, расположенные в области ядра и центросомы, ведут себя иначе по сравнению с микротрубочками на периферии клетки19. Поэтому для получения достоверного результата мы произвели динамические измерения микротрубочек в трех отдельных областях ячейки: центральной части, передней кромке и хвостовой части(рисунок 3). Для контроля правильного распределения метки GFP-EB3 в различных клеточных частях мы использовали эндотелиальные клетки легочной артерии человека (HPAEC)(см. Дополнительный рисунок 1).
Специализированные программы, такие как ImageJ или Fiji (ImageJ 2 v1. 53i), позволяют анализировать видео по следующим параметрам: (1) скорость роста микротрубочек; 2) частота катастроф; 3) частота спасательных операций; 4) частота пауз; и 5) продолжительность пауз. Кроме того, уникальные опции программы и плагины позволяют автоматически отслеживать18 или вручную19 (рисунок 4). Ручной метод трассировки работал лучше в наших экспериментах, поскольку автоматические измерения подвержены большим ошибкам и требуют большего количества повторений для более точного результата. Подробные инструкции по анализу динамических данных микротрубочек можно найти в Дополнительном рисунке 2 и Дополнительном файле 1.
Параметры визуализации могут потребовать корректировки в процессе визуализации. Например, продолжительность визуализации одной клетки и значения экспозиции могут быть изменены. Такие настройки полезны, если происходит быстрое выгорание сигнала, или клетка сжимается(рисунок 5).
Рисунок 1:Общая схема протокола трансфекции GFP-EB3 для культуры первичных фибробластов кожи человека. Протокол включает следующие этапы: отслоение клеток раствором трипсина; инактивация трипсина добавлением среды; центрифугирование полученного соединения; расчет концентрации клеток; посев клеток на стеклянную нижнюю посуду (конфокальную посуду), покрытую желатином; трансфекция клеточной культуры плазмидной ДНК (с GFP-EB3) липосомальным трансфекционным реагентом; инкубация 24-48 ч; и анализ под микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Схема подготовки первичной культуры фибробластов кожи человека. Биопсия кожи должна быть выполнена в стерильных условиях врачом после того, как пациент подписывает информированное согласие. Затем кусочек ткани транспортируется в небольшом количестве среды без FBS в лабораторию в чашке Петри. Крупный фрагмент ткани разрезают на куски размером 0,5-1 мм, и они покрываются покровным стеклом с добавлением среды с ФБС. Затем чашку Петри помещают в инкубаторСО2, где через 4-7 дней фибробласты мигрируют от фрагмента ткани к стеклянному дну. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Маркер GFP-EB3 (зеленый) в различных областях трансфектированных фибробластов человека, полученный из биопсии кожи пациентов с БГ: передний край (верхняя панель); хвост (средняя панель); центральная часть фибробластов (зона вокруг центросомы) (нижняя панель). Шкала шкалы = 10 мкм. Частота изображения составляет 1 кадр/с. Широкоугольная флуоресцентная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:GFP-EB3 ручное отслеживание с помощью плагина ImageJ MTrackJ. Следы, отражающие рост микротрубочек, были получены в результате покадровой ручной маркировки наконечников этикеток GFP-EB3 на плюсовых концах в течение 20 с визуализации. Трансфектированные культивируемые фибробласты, полученные из биопсии кожи пациентов с БГ. Частота изображения составляет 1 кадр/с. Широкоугольная флуоресцентная микроскопия. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Устранение неполадок во время визуализации микротрубочек, меченных GFP-EB3. (A) Флуоресцентно-меченые микротрубочки находятся вне фокуса из-за отсутствия системы фокусировки. (B)Микротрубочки стабилизируются и теряют свои динамические свойства из-за сверхэкспрессии GFP-EB3 в клетке из-за длительной инкубации с трансфектирующей смесью. (C)Уменьшение клеточной пластинки в результате фототоксичности из-за высвобождения АФК. (D) Интенсивность сигнала падает во время визуализации - быстрого фотоотбеливания. Трансфектированные культивируемые фибробласты, полученные из биопсии кожи пациентов с БГ. Частота изображения составляет 1 кадр в секунду. Широкоугольная флуоресцентная микроскопия. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Селективная визуализация растущих микротрубочек плюс-эндов. Маркер GFP-EB3 (зеленый) в различных областях трансфектированных эндотелиальных клеток человека (культура HPAEC: Эндотелиальные клетки легочной артерии человека) в передней кромке, хвосте и центральной области (зона вокруг центросомы). Шкала стержней 10 мкм. Частота изображения составляет 1 кадр/с Широкоугольная флуоресцентная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Анализ динамики микротрубочек по метке GFP-EB3 после ручного отслеживания с помощью плагина ImageJ MTrackJ. (А,Б) Треки EB3, полученные путем смещения пластырей EB3-GFP на покадровых сериях трансфектированных культивируемых фибробластов, полученных из биопсии кожи пациентов с БГ (окрашиваются индивидуально). (A)трек EB3 (фиолетовый, No46), полученный путем смещения патчей EB3-GFP в течение 18 секунд. (B) Трек EB3 (красный, No37), полученный путем смещения патчей EB3-GFP в течение 9 секунд. (C) Количественная оценка смещения плюсовых концов микротрубочек фибробластов кожи пациентов с БГ человека показана в (A). (D)Количественная оценка смещения микротрубочек с плюсовыми концами показана в(B). На графике видно, что между 6-8 секундами происходит пауза в росте микротрубочки (отсутствует движение плюс-конца). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 1: Количественный анализ динамики плюсов микротрубочек, меченых EB3-GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Более качественные результаты анализа динамики микротрубочек могут быть получены из высококачественных микроскопических изображений. Важно соблюдать все необходимые условия для покадровой визуализации живых клеток и правильно корректировать параметры визуализации. Важно использовать специальные блюда для клеточных культур со стеклянным дном (конфокальные блюда), так как стекло имеет иной показатель преломления света, чем пластик. Толщина стекла и его однородность по всей площади также чрезвычайно важны, так как эти параметры имеют решающее значение для нормальной фокусировки образца. Нарушение этих параметров неизбежно приводит к выходу из строя идеальной системы фокусировки, что приводит к плохой фокусировке, что делает невозможным использование такого расфокусированного видео для анализа(рисунок 5А). Другим важным условием визуализации живых клеток является их защита от АФК. Для таких целей могут быть использованы различные реагенты20. В своей работе мы используем минеральное масло, которое полностью изолирует питательную среду от атмосферы и препятствует газообмену. Таким же образом можно использовать АФК-восстанавливающую оксиразу, но этот фермент подходит не для всех типов клеток и чаще применим к визуализации с увеличенным временем.
При выборе оптимального времени инкубации клеток после трансфекции (24 или 48 ч) следует обращать внимание на количество трансфектированных клеток. Количество, меньшее максимального числа клеток, экспрессирующих меченый белок, уже достаточно для анализа. Сверхэкспрессия не должна допускаться, поскольку микротрубочки в таких случаях стабилизируются и их динамические свойства не могут быть проанализированы(рисунок 5В).
В некоторых случаях может потребоваться корректировка параметров визуализации в соответствии с реакцией клеток после начала видеозаписи. Например, можно наблюдать сжатие клеточных ламелей из-за высокой чувствительности к свету (фототоксичности)(рисунок 5С). При возбуждении флуоресцентные молекулы обычно реагируют с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить клеточные компоненты21. При проектировании экспериментов следует подбирать флуорофоры с максимально возможной длиной волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток при коротковолновом освещении. Кроме того, имеются сообщения о том, что некоторые компоненты стандартных питательных сред, включая витамин рибофлавин и аминокислоту триптофана, также могут способствовать неблагоприятному воздействию света на культивируемые клетки22. Среди прочего, это может быть вызвано чрезмерным количеством флуоресцентных меток в одной клетке. В этих случаях возникает необходимость уменьшить продолжительность записи и интенсивность освещения. Другой возможной проблемой также может быть быстрое фотоотбеливание - уменьшение интенсивности сигнала во время записи(рисунок 5D). Этот эффект следует учитывать при выборе следующего объекта на той же экспериментальной тарелке, так как соседние клетки вокруг изображенной области также выгорают.
Следует отметить, что существуют и другие методы визуализации микротрубочек в живых клетках, такие как микроинъекция флуоресцентно меченого тубулина в клетку или клеточная трансдукция с использованием вирусов. Как и у любого другого метода, у метода трансфекции есть свои преимущества и недостатки. Однако, с нашей точки зрения, по сравнению с инъекционным методом, трансфекция более эффективна и позволяет добиться массового включения векторов экспрессии в клетки, в результате чего появляется большое количество флуоресцентных клеток для анализа. Также метод трансфекции не требует от исследователя специального оборудования и навыков. Метод вирусной трансдукции показывает хорошие результаты и может применяться. Тем не менее, он не подходит для всех клеточных культур (в частности, он менее подходит для фибробластов человека, полученных из биопсии кожи пациентов с БГ).
Наиболее важным этапом в этом протоколе является трансфекция, выполняемая для обеспечения достаточной экспрессии белка. Хорошее соотношение сигнал/шум, отсутствие фотоотбеливания микротрубочек и отсутствие дрейфа клеток во время покадровой видеозаписи абсолютно необходимы для эффективной визуализации микротрубочек. В нашемэксперименте визуализация микротрубочек и динамический анализ дают жизненно важную информацию о свойствах и поведении микротрубочек в клетках с мутантным HTT. Наш протокол применим для исследований других заболеваний, для которых патология подразумевает динамические свойства микротрубочек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Данное исследование финансировалось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации, грант No 075-15-2019-1669 (трансфекция фибробластов), Российским научным фондом, грант No 19-15-00425 (все остальные работы по выращиванию фибробластов in vitro). Она была частично поддержана программой развития МГУ им. М.В. Ломоносова PNR5.13 (визуализация и анализ). Авторы признают поддержку Центра передового опыта «Никон» при Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского. Мы хотим выразить особую благодарность Екатерине Таран за помощь в озвучивании. Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созданы с BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
