Summary
Denne protokollen er dedikert til mikrotubule plus-end visualisering av EB3 proteintransfeksjon for å studere deres dynamiske egenskaper i primærcellekulturen. Protokollen ble implementert på humane primære hudfibroblaster hentet fra pasienter med Huntington sykdom.
Abstract
Transfeksjon med et fluorescerende merket markørprotein av interesse i kombinasjon med tidsforløp videomikroskopi er en klassisk metode for å studere de dynamiske egenskapene til cytoskjelettet. Denne protokollen tilbyr en teknikk for menneskelig primær fibroblasttransfeksjon, noe som kan være vanskelig på grunn av spesifikasjonene til primære cellekultiveringsforhold. I tillegg krever cytoskeleton dynamisk egenskapsvedlikehold et lavt nivå av transfeksjon for å oppnå et godt signal-til-støy-forhold uten å forårsake mikrotubul stabilisering. Det er viktig å ta tiltak for å beskytte cellene mot lysindusert stress og fluorescerende fargestofffading. I løpet av vårt arbeid testet vi forskjellige transfeksjonsmetoder og protokoller, samt forskjellige vektorer for å velge den beste kombinasjonen av forhold som passer for menneskelige primære fibroblaststudier. Vi analyserte de resulterende intervallvideoene og beregnet mikrotubuldynamikk ved hjelp av ImageJ. Dynamikken i mikrotubulenes pluss-ender i de forskjellige celledelene er ikke like, så vi delte analysen i undergrupper - sentrosomområdet, lamellen og halen av fibroblaster. Spesielt kan denne protokollen brukes til in vitro-analyse av cytoskjelettdynamikk i pasientprøver, noe som muliggjør neste skritt mot å forstå dynamikken i de ulike sykdomsutviklingene.
Introduction
Huntingtons sykdom (HS) er en uhelbredelig nevrodegenerativ patologi forårsaket av et mutasjonsgenkodinghuntingtinprotein (HTT). HTT er primært forbundet med vesicles og mikrotubuler og er sannsynligvis involvert i mikrotubuleavhengige transportprosesser1,2. For å studere påvirkning av mutant HTT på mikrotubuldynamikken brukte vi in vitro-visualisering av EB3-proteinet, som regulerer mikrotubulens dynamiske egenskaper ved å binde og stabilisere de voksende pluss endene. For å laste fluorescerende merket EB3 inn i humane hudfibroblaster, ble plasmidtransfeksjon påført. Vi brukte den primære fibroblastkulturen hentet fra HS-pasientenes hudbiopsi for denne studien.
Mutasjonen i HTT-proteingenet fører til forlengelse av polyglutaminkanalen3. HTT har en rolle i slike cellulære prosesser som endokytose4, celletransport1,2, proteinforringelse5, etc. En betydelig del av disse prosessene involverer ulike elementer i cellecytoskjelettet, inkludert mikrotubulene.
Menneskelige primærceller er den beste modellen for å reprodusere hendelser som forekommer i pasientceller så nært som mulig. For å lage slike modeller må man isolere celler fra humant biopsimateriale (f.eks. fra kirurgiske prøver). Den resulterende primære cellelinjen er egnet til å studere patogenese ved hjelp av ulike genetiske, biokjemiske, molekylære og cellebiologiske metoder. Også menneskelige primære cellekulturer tjener som en forløper for å skape ulike transdifferensierte og transgene kulturer6.
Men i motsetning til udødelige cellekulturer er den betydelige ulempen ved primærceller deres begrensede passasjekapasitet. Derfor anbefaler vi å bruke celler i de tidlige passasjene (opptil 15). Eldre kulturer degener veldig raskt og mister sine unike egenskaper. Dermed bør de nylig oppnådde primærcellene holdes frosset for langsiktig lagring.
Primærcellekulturer er utsatt for dyrkingsforhold. Derfor krever de ofte unike tilnærminger og optimalisering av vekstforhold. Spesielt krever den menneskelige huden primære fibroblaster som brukes i våre eksperimenter på substratet. Derfor brukte vi forskjellige ekstra belegg (f.eks. gelatin eller fibronectin) avhengig av eksperimenttypen.
Cellecytoskjelettet bestemmer celleformen, mobiliteten og bevegelse. Dynamikken i cytoskjelettet er avgjørende for mange intracellulære prosesser både i interfase og mitose. Spesielt er cytoskjelettpolymerert fra tubulin svært dynamiske og polare strukturer, noe som muliggjør motorproteinmediert rettet intracellulær transport. Mikrotubulenes ender er i konstant omorganisering, monteringsfasene veksler med demonteringsfasene, og denne virkemåten kalles "dynamisk ustabilitet"7,8,9. Ulike tilknyttede proteiner skifter likevekten av polymerisasjonsreaksjonen, noe som fører enten til polymerformasjonen eller proteinmonomerformasjonen. Tilsetningen av tubulinunderenheter skjer hovedsakelig i pluss-enden av mikrotubuler10. End-bindende (EB) proteinfamilien består av tre medlemmer: EB1, EB2 og EB3. De tjener som plus-end-tracking proteiner (+TIPs) og regulerer de dynamiske egenskapene til mikrotubuler ved å binde og stabilisere deres voksende pluss-ender11.
Mange studier bruker fluorescerende molekyl-merket tubulin mikroinjeksjon eller transfeksjon med tidsforløp avbildning og videoanalyse for å visualisere mikrotubuler in vitro. Disse metodene kan være invasive og skadelige for celler, spesielt primære menneskelige celler. Det mest utfordrende trinnet er å finne forhold for celletransfeksjon. Vi prøvde å nå høyest mulig nivå av transfeksjon uten å påvirke levedyktighet og innfødt cellemorfologi. Denne studien bruker den klassiske metoden for å studere forskjellene i mikrotubuldynamikk i hudfibroblaster av friske donorer og pasienter med Huntingtons sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene fra Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine fra Federal Medical Biological Agency datert 8.
MERK: Figur 1 gir en oversikt over protokollen.
1. Oppnå en primærkultur av humane hudfibroblaster (Figur 2)
- Lever biopsien til et laboratorium innen få timer i Dulbeccos Modified Eagle Media (DMEM) medium supplert med 50 μg/ml penicillin og 50 U/ml streptomycin.
MERK: En hudbiopsi må utføres under sterile forhold av en lege etter at en pasient har signert et informert samtykke. - Legg biopsivevet i en 6 cm Petri-tallerken sammen med en liten mengde av mediet.
- Bruk en steril skalpell, kutt biopsiprøven i stykker på ca. 0,5-1 mm i størrelse. Legg 1-2 oppnådde fragmenter i en 3,5 cm Petri-tallerken og legg en steril deksle over biopsistykkene. Tilsett sakte 1,5 ml av et vekstmedium til følgende sammensetning: DMEM, 50 U/ml penicillin-streptomycin og 10 % foster bovint serum (FBS).
- Kulturfibroblaster i vekstmediet inne i en CO 2-inkubator opprettholdt ved 5% CO2,37 °C, 80 % fuktighet.
MERK: Etter 4-7 dager begynner først keratinocytter, deretter fibroblaster, å migrere fra vevet til bunnen av parabolen.
2. Lagring, frysing ogfrysing av primærkultur
- Fjern celler fra kulturretten (se punkt 3.2-3.4).
- Overfør cellefjæringen til et konisk rør på 15 ml og sentrifuger i 5 minutter ved 200 x g. Kast deretter supernatanten og resuspend cellepellet i 900 μL avkjølt FBS.
- Overfør til et kryopreserveringsrør dråpe for dråpe og tilsett 100 μL dimetylsulfoksid (DMSO).
- Plasser kryobeskyttelsen i en fryser med lav temperatur ved -80 °C. Tjuefire timer senere overfører du kryonalen til flytende nitrogen (−196 °C) for langtidslagring.
- For å tine de kryopreserverte cellene, fjern kryonalen fra nitrogenlagringen og overfør 1 ml av innholdet innen 1 min til et konisk rør på 15 ml som inneholder 9 ml av transportmediet forvarmet til 37 °C.
- Resuspend forsiktig og sentrifuger deretter røret i 5 min ved 200 x g. Kast den supernatante, resuspend cellepellet i ønsket volum av vekstmediet og legg dem på en Petri-tallerken med ønsket diameter.
3. Celle dyrking
- Dekk parabolbunnen med autoklavert 0,1% gelatinoppløsning tilberedt i destillert vann. Inkuber i 15 min.
MERK: For transfeksjonsvisualisering bør glassbunnplateretter (konfektretter med glasstykkelse 170 μm) brukes. - Forbered et kulturmedium med følgende sammensetning: DMEM supplert med 10% FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 50 U / ml penicillin-streptomycin. Bland grundig og oppbevar ved 4 °C. Varm mediet til 37 °C før du legger til cellene.
- Vurder kulturen under mikroskopet. Fjern mediet og vask fibroblaster med Dulbeccos fosfatsaltoppløsning (DPBS).
- Tilsett 1 ml forvarmet 0,25% trypsinoppløsning til cellene. Kontroller cellene under mikroskopet hvis de løsner helt fra substratet. Deaktiver trypsin med 1 ml av kulturmediet.
- Overfør celleopphenget til et konisk rør på 15 ml. Sentrifuger røret ved 200 x g i 5 min, fjern supernatanten og resuspend cellepelleten i 1 ml av kulturmediet.
- Tell antall celler. Beregn det nødvendige antall celler for å så dem med en tetthet på 8-15 x 103/cm2 og resuspend i 2 ml av kulturmediet.
- Fjern gelatinoppløsningen fra kulturretten og tilsett umiddelbart 2 ml cellefjæring. Dyrk fibroblaster ved 37 °C i en CO 2-inkubator.
- Oppdater mediet hver 2-4 dager.
MERK: For eksperimenter, bruk cellene i 4-11 passasjer.
4. Transfeksjon
- Bytt ut kulturmediet med et friskt kulturmedium 24 timer før transfeksjon.
MERK: Cellesamløpet skal være 70-80%. - Forbered et DNA-lipidkompleks basert på området og tettheten av cellesåingen. Bruk liposombasert transfeksjonsmiddel.
MERK: Bruk cellefrøtettheten som 1 x 104 celler/cm2. - Tilsett 3 μL kommersielt transfeksjonsreagens til 125 μL optimalt minimalt viktig medium (Opti-MEM) som ikke inneholder antibiotika, uten å berøre rørveggene. Forsiktig resuspend.
- Fortynn plasmid-DNA (GFP-EB3) ved å tilsette 1 μg av plasmid-DNA til 125 μL Opti-MEM. Forsiktig resuspend.
MERK: Expression vector koding GFP-EB311 ble mottatt som en vennlig gave fra Dr. I. Kaverina (Vanderbilt University, Nashville) med tillatelse fra Dr. A. Akhmanova (Erasmus University, Rotterdam)11. - Tilsett fortynnet plasmid DNA til hvert rør med fortynnet transfeksjonsreagens (1:1). Inkuber i 30 min.
- Tilsett DNA-lipidkomplekset til 6 cm Petri-tallerkenen som inneholder celler, og bland med en korsformet sving i 30 s. Inkuber celler med transfeksjonsmiddel i 24 timer og bytt deretter til friskt medium. Analyser effektiviteten av transfeksjon etter 24 timer og 48 timer.
MERK: 24 timer etter transfeksjon var effektiviteten 10-15%, og etter 48 timer opptil 40%.
5. Forberedelse til avbildning
- Før levende avbildning av celler, endre kulturmediet til et medium uten pH-indikatorfargestoff for å redusere autofluorescence.
- Påfør mineralolje forsiktig på den mellomstore overflaten for å dekke mediet helt, isolere det fra det ytre miljø for å redusere O2-penetrasjonen og middels fordampning.
- Bruk en kvikksølvlampe og en objektivlinse med olje nedsenking 60x eller 100x med høy tallåpning for å ta bildene.
MERK: For in vivo-observasjoner må mikroskopet være utstyrt med en inkubator for å opprettholde de nødvendige forholdene for cellene, inkludert oppvarming av objektbordet og linsen til +37 °C, et lukket kammer med CO2-tilførsel og støtte for fuktighetsnivå. Bruk dobbelt destillert vann for å skape fuktighet. Kontroller nivået på dobbelt destillert vann før du filmer. - Plasser den konfekte parabolen med cellene i mikroskopholderen før avbildning. Pass på at parabolen og kameraet er godt festet til holderen for å unngå å drive mens du tar bilder.
6. Stille inn bildeparameterne
- Velg de lave eksponeringsverdiene siden lys induserer celleskadelige reaktive oksygenarter (ROS).
MERK: For å studere dynamikken i mikrotubuler i humane hudfibroblaster, ble det valgt en eksponering på 300 ms. - Fokuser på gjenstanden av interesse.
MERK: For langvarig tidsforløpavbildning, bruk det automatiske fokusstabiliseringssystemet for å kompensere for et mulig skifte langs z-aksen. - Velg de optimale bildeforholdene avhengig av cellenes fotosensitivitet og hastigheten på fluorokromfadingen.
MERK: Siden mikrotubuler er svært dynamiske strukturer, kan et rimelig kort tidsintervall velges, og bildefrekvensen må være tilstrekkelig høy. For å undersøke mikrotubuldynamikken i hudfibroblaster, brukte vi med en frekvens på 1 ramme / s i 3-5 min. - Når du velger det neste objektet for å hente bildet, flytter du bort fra det allerede avbildede området. Siden dette området var påvirket av lys, vil det være merkbar fotobleking.
MERK: Siden en relativt høy bildefrekvens ble brukt, lukket lukkeren ikke mellom bildene, og lampen ble tent i hele bildeperioden, og derfor økte falmingen. - Velg den optimale videoen for å studere mikrotubulenes dynamikk visuelt, med tanke på kvaliteten på transfeksjonen, kvaliteten på mikrotubulenes bilder (optimalt signal-til-støy-forhold), og fraværet av drifting i tilfelle den analyserte cellen (Figur 3).
- Bruk de valgte videoene til å studere mikrotubulenes pluss-ender-dynamikk ved å spore dem i ImageJ- eller Fiji-programmet (Figur 4).
MERK: For instruksjoner for kvantitativ analyse, se Supplerende figur 2 og tilleggsfil 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resulterende GFP-EB3-filmene som produseres ved hjelp av protokollen (figur 1), illustrerer mikrotubulenes dynamiske egenskaper. Mikrotubuler er involvert i ulike celleprosesser, og deres dynamiske egenskaper påvirker ulike livskarakteristikker for den primære menneskelige cellekulturen fra pasientens biopsimateriale (figur 2).
Følgende parametere bestemmer mikrotubulens dynamisk ustabilitet: veksthastigheten (polymerisasjon) og krymping (depolymerisering); frekvensen av katastrofer (overgang fra polymerisasjon til depolymerisering); frekvensen av redninger (overgang fra depolymerisering til polymerisering); så vel som pauser - tilstander når mikrotubulen ikke polymeriserer og ikke depolymererer 12. Alle parametere er tett regulert, og polymerisasjons- og depolymeriseringshastighetene for individuelle mikrotubuler kan variere betydelig både i samme og forskjellige celletyper13,14,15,16,17.
Det er nødvendig å vurdere for analysen at mikrotubuler kan ha forskjellig dynamikk avhengig av deres posisjon i cellen. Mikrotubuler som ligger i kjernen og sentrosomet oppfører seg annerledes sammenlignet med de på celleperiphery19. Derfor, for å oppnå et pålitelig resultat, gjorde vi mikrotubulenes dynamiske målinger i tre separate regioner i cellen: den sentrale delen, forkanten og haledelen (Figur 3). For å kontrollere riktig fordeling av GFP-EB3-etiketten i ulike celledeler, brukte vi endotelceller (HPAEC) for human lungearterie (HPAEC) (se Tilleggs figur 1).
Spesialiserte programmer, for eksempel ImageJ eller Fiji (ImageJ 2 v1. 53i), tillater analyse av videoene ved følgende parametere: (1) hastigheten på mikrotubulenes vekst; (2) hyppigheten av katastrofer; (3) frekvensen av redninger; (4) hyppigheten av pauser; og (5) varighet av pauser. I tillegg tillater unike programalternativer og plugins sporing automatisk18 eller manuelt19 (figur 4). Den manuelle sporingsmetoden fungerte bedre i våre eksperimenter siden automatiske målinger er utsatt for større feil og krever flere repetisjoner for et mer nøyaktig resultat. Detaljerte instruksjoner om mikrotubuler dynamikk dataanalyse finnes i Supplerende figur 2 og supplerende fil 1.
Bildebehandlingsparameterne kan kreve justeringer under bildebehandlingsprosessen. Varigheten til ett cellebilde og eksponeringsverdiene kan for eksempel endres. Slike innstillinger er nyttige hvis det er en rask signalutbrenthet, eller cellen krymper (Figur 5).
Figur 1: Den generelle ordningen med GFP-EB3 transfeksjonsprotokoll for primær fibroblasterkultur for menneskelig hud. Protokollen inneholder følgende trinn: løsrivelse av celler ved trypsin-løsningen; trypsin inaktivering av medium addisjon; sentrifugering av den resulterende forbindelsen; beregning av cellekonsentrasjon; celle sådd til glassbunnsfatet (konfektrett) belagt med gelatin; cellekulturtransfeksjon av plasmid DNA (med GFP-EB3) med liposomal transfeksjonsreagens; inkubasjon 24-48 h; og analyse under et mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Human hudfibroblaster primærkultur forberedelse ordningen. En hudbiopsi må utføres under sterile forhold av en lege etter at en pasient har signert et informert samtykke. Deretter transporteres et stykke vev i en liten mengde av mediet uten FBS til laboratoriet i en Petri-tallerken. Et stort fragment av vev er kuttet i stykker på 0,5-1 mm i størrelse, og de er dekket med et dekselglass med tilsetning av mediet med FBS. Deretter plasseres Petri-parabolen i en CO 2-inkubator, hvor etter 4-7 dager migrerer fibroblaster fra vevsfragmentet til glassbunnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: GFP-EB3-merket (grønn) på forskjellige områder av transfekerte humane fibroblaster, hentet fra HS-pasienters hudbiopsi: forkant (topppanel); hale (midtre panel); sentral del av fibroblast (sone rundt sentrosomet) (bunnpanel). Skalastang = 10 μm. Bildefrekvensen er 1 bilde/s. Bredfelt fluorescerende mikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: GFP-EB3 manuell sporing av ImageJ plugin MTrackJ. Spor som reflekterer veksten av mikrotubuler ble oppnådd som et resultat av ramme-for-ramme manuell merking av GFP-EB3 etiketter tips på plus-ends under 20 s av bildebehandling. Transfected kultivert fibroblaster, hentet fra HS-pasienters hudbiopsi. Bildefrekvensen er 1 bilde/s. Bredfelt fluorescerende mikroskopi. Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Feilsøking under avbildning av GFP-EB3 merket mikrotubules pluss-ender. (A) Fluorescerende merkede mikrotubuler er ute av fokus på grunn av fravær av et fokuseringssystem. (B) Mikrotubuler stabiliseres og mister sine dynamiske egenskaper på grunn av overtrykk av GFP-EB3 i cellen på grunn av lang inkubasjon med transfekteringsblandingen. (C) Krymping av cellelamellen som følge av fototoksisitet på grunn av frigjøring av ROS. (D) Signalintensiteten synker under bildebehandling - rask fotobleking. Transfected kultivert fibroblaster, hentet fra HS-pasienters hudbiopsi. Bildefrekvensen er 1 bilde per sekund. Bredfelt fluorescerende mikroskopi. Skalastenger = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Selektiv visualisering av voksende mikrotubul pluss ender. GFP-EB3-markør (grønn) i forskjellige områder av transfektert human endotelcelle (kultur av HPAEC: Human lungearterie endotelceller) i forkant, hale og sentralt område (sone rundt sentrosomet). Skalastenger 10 μm. Bildefrekvensen er 1 ramme/s vidvinkelmikroskopi. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Mikrotubule dynamics analyse av GFP-EB3 etikett etter manuell sporing ved hjelp av ImageJ plugin MTrackJ. (A,B) EB3-spor oppnådd ved EB3-GFP patcher forskyvning på tidsforløp serie av transfected kultivert fibroblaster, hentet fra HS-pasienter hudbiopsi (er farget individuelt). (A) EB3-spor (lilla, No46) oppnådd ved EB3-GFP-patchforskyvning i løpet av 18 sekunder. (B) EB3-spor (rød, No37) oppnådd ved EB3-GFP-patchforskyvning i løpet av 9 sekunder. (C) Kvantifisering av plus-ends forskyvning av mikrotubuler av humane HS-pasienters hudfibroblast vist i (A). (D) Kvantifisering av pluss-ender forskyvning av mikrotubuler vist i (B). Grafen viser at mellom 6-8 sekunder er det en pause i veksten av mikrotubulen (det er ingen bevegelse av plus-end). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Kvantitativ analyse av dynamikken i EB3-GFP merket mikrotubules pluss-ender. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedre kvalitetsresultater for mikrotubules dynamikkanalyse kan fås fra mikroskopiske bilder av høy kvalitet. Det er viktig å observere alle nødvendige forhold for tidsforløpavbildning av levende celler og for å justere bildeparametrene riktig. Bruk av spesielle cellekulturretter med glassbunn (konfokale retter) er viktig, siden glass har en annen brytningsindeks av lys enn plast. Tykkelsen på glasset og dets ensartethet over hele området er også ekstremt viktig, siden disse parametrene er avgjørende for normal prøvefokusering. Brudd på disse parametrene fører uunngåelig til en svikt i det perfekte fokussystemet, noe som resulterer i dårlig fokus og dermed gjør det umulig å bruke en slik out-of-focus video til analyse (Figur 5A). En annen viktig betingelse for levende celleavbildning er deres beskyttelse mot ROS. Ulike reagenser kan brukes til slike formål20. I vårt arbeid bruker vi mineralolje, som fullstendig isolerer kulturmediet fra atmosfæren og forhindrer gassutveksling. På samme måte kan ros-reduserende oksyrase brukes, men dette enzymet er ikke egnet for alle celletyper og gjelder oftere for avbildning med økt tid.
Når du velger den optimale inkubasjonstiden for celler etter transfeksjon (24 eller 48 t), bør det tas hensyn til antall transfekterte celler. Et tall som er mindre enn maksimalt antall celler som uttrykker det merkede proteinet, er allerede tilstrekkelig for analysen. Overekspressering bør ikke tillates fordi mikrotubuler i slike tilfeller stabiliseres og deres dynamiske egenskaper ikke kan analyseres (Figur 5B).
I noen tilfeller kan det være nødvendig å justere bildeparametrene i samsvar med reaksjonen av celler etter starten av videoopptak. For eksempel er det mulig å observere cellelamellkrymping på grunn av høy følsomhet for lys (fototoksisitet) (Figur 5C). Når de er begeistret, reagerer de fluorescerende molekylene vanligvis med molekylært oksygen for å danne frie radikaler som kan skade cellekomponenter21. Ved utforming av eksperimenter bør fluoroforer med maksimal mulig eksitasjonsbølgelengde velges for å minimere celleskader under kortbølgebelysning. I tillegg er det rapporter om at visse komponenter i standard kulturmedier, inkludert riboflavin-vitaminet og tryptofan aminosyren, også kan bidra til de negative effektene av lys på dyrkede celler22. Dette kan blant annet skyldes for mye fluorescerende etiketter i en celle. I disse tilfellene blir det nødvendig å redusere varigheten av opptaket og intensiteten av belysningen. Et annet mulig problem kan også være rask fotobleaching - redusere signalintensiteten under opptak (Figur 5D). Denne effekten bør tas i betraktning når du velger neste objekt på samme eksperimentelle tallerken, siden nabocellene rundt det avbildede området også brennes ut.
Det skal nevnes at det finnes andre metoder for mikrotubul visualisering i levende celler som mikroinjeksjon av fluorescerende merket tubulin i cellen eller celletransduksjon ved hjelp av virus. Som med alle andre metoder, er det fordeler og ulemper ved transfeksjonsmetoden. Men fra vårt synspunkt, i forhold til injeksjonsmetoden, er transfeksjon mer effektiv og gjør det mulig å oppnå masseinkludering av uttrykksvektorer i cellene, noe som resulterer i et stort antall fluorescerende celler for analyse. Transfeksjonsmetoden krever heller ikke spesialutstyr og ferdigheter fra forskeren. Metoden for viral transduksjon viser gode resultater og kan brukes. Likevel er den ikke egnet for alle cellekulturer (spesielt er den mindre egnet for menneskelige fibroblaster, hentet fra HS-pasienters hudbiopsi).
Det mest kritiske trinnet i denne protokollen er transfeksjonen som utføres for å sikre tilstrekkelig proteinuttrykk. Et godt signal-til-støy-forhold, ingen fotobleaching av mikrotubuler, og fraværet av celledrift under videoopptak av tidsforløp er helt avgjørende for effektiv mikrotubuleravbildning. I vårteksperiment gir visualisering av mikrotubuler og den dynamiske analysen viktig informasjon om mikrotubule egenskaper og oppførsel i cellene med mutant HTT. Vår protokoll gjelder for studier av andre sykdommer som patologi impliserer dynamiske egenskaper av mikrotubuler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Departementet for vitenskap og høyere utdanning i Russland, gi No. 075-15-2019-1669 (transfeksjon av fibroblaster), av Den russiske vitenskapsstiftelsen, gi Nr. 19-15-00425 (alle andre arbeider om dyrking av fibroblaster in vitro). Det ble delvis støttet av Lomonosov Moscow State University Development program PNR5.13 (avbildning og analyse). Forfatterne anerkjenner støtten fra Nikon Center of Excellence ved A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Vi ønsker å tilby vår spesielle takk til Ekaterina Taran for hennes hjelp med stemmeskuespill. Forfatterne takker også Pavel Belikov for hans hjelp med videoredigering. Figurer i manuskriptet ble laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
