Summary
Mitokondri, iskelet kasında yüksek düzeyde fenotipik plastisite gösteren anahtar metabolik organellerdir. Sitozolden protein ithalatı, retikülün genişlemesi ve mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesi için gerekli olan organel biyogenez için kritik bir yoldur. Bu nedenle, protein ithalatı hücresel sağlığın barometresi olarak hizmet eder.
Abstract
Mitokondri, enerji arzını ve hücrenin genel sağlığını belirleyen önemli metabolik ve düzenleyici organellerdir. İskelet kasında mitokondri, küçük oval organellerden geniş, retikülum benzeri bir ağa kadar bir dizi karmaşık morfolojide bulunur. Mitokondriyal retikülün enerji talebindeki değişiklikler gibi çeşitli uyaranlara yanıt olarak nasıl genişlediğini ve geliştiğini anlamak uzun zamandır bir araştırma konusudur. Bu büyümenin veya biyogenezin önemli bir yönü, başlangıçta nükleer genom tarafından kodlanan, sitozolde sentezlenen ve çeşitli mitokondriyal alt bölmelere dönüştürülen öncül proteinlerin ithalatıdır. Mitokondri, protein ithalat makineleri (PIM) olarak bilinen birçok seçici iç ve dış zar kanalını içeren bu ithalat süreci için sofistike bir mekanizma geliştirmiştir. Mitokondryona ithalat, uygulanabilir membran potansiyeline ve oksidatif fosforilasyon yoluyla organel türevi ATP'nin mevcudiyetine bağlıdır. Bu nedenle ölçümü organel sağlığının bir ölçüsü olarak hizmet edebilir. PIM ayrıca iskelet kasında hücrenin enerji durumuna sıkıca bağlı yüksek düzeyde adaptif plastisite sergiler. Örneğin, egzersiz eğitiminin ithalat kapasitesini artırdığı, kas disuse'un ise mitokondriyal içerik belirteçlerindeki değişikliklerle çakıştığı gösterilmiştir. Protein ithalatı mitokondrilerin biyogenezinde ve genişlemesinde kritik bir adım olmasına rağmen, iskelet kasında süreç yaygın olarak incelenmemektedir. Bu nedenle, bu makale, ilgili yöntemlerin daha iyi anlaşılmasını ve egzersiz, sağlık ve hastalıkta organel ciro için yolun öneminin takdirini teşvik etmek için protein ithalat kapasitesini ölçmek için iskelet kasından izole edilmiş ve tamamen işlevsel mitokondrilerin nasıl kullanılacağını özetlemektedir.
Introduction
Mitokondriler, farklı hücre tiplerindeki karmaşık morfolojilerde bulunan ve hücresel sağlık için kritik olan artan bir işlev dizisine sahip olduğu kabul edilen organellerdir. Bu nedenle, artık sadece enerji üreten organellere indirgenemezler. Mitokondriler, temel metabolik düzenleyiciler, hücre kaderinin belirleyicileri ve işlevleri genel hücresel sağlığın yararlı göstergeleri olarak hizmet edebilecek sinyal merkezleridir. İskelet kas hücrelerinde elektron mikroskopi çalışmaları, şu anda iskelet kası aktivite düzeylerindeki değişikliklerin yanı sıra yaş ve hastalıkla birlikte son derece dinamik ve uyarlanabilir olduğu kabul edilen bir bağlantı derecesi sergileyen coğrafi olarak farklı subsarkolemal (SS) ve intermyofibriller (IMF) mitokondrilerin varlığını ortaya koymaktadır. Kastaki mitokondriyal içerik ve fonksiyon çok sayıda şekilde değerlendirilebilir5,6 ve hücresel milieu7,8'in etkisinden farklı mitokondrilerin solunum ve enzimatik kapasitelerini (Vmax) daha iyi anlamak için geleneksel organel izolasyon yöntemleri uygulanmıştır. Özellikle, bu geleneksel yöntemler, subsarkolemal ve intermiyofibriller bölgelerden izole edilen mitokondriler arasındaki ince biyokimyasal ayrımları ortaya çıkarmış ve bu hücre altı bölgelerde metabolizma için olası fonksiyonel etkileri ortaya çıkarmıştır8,9,10,11.
Mitokondri biyogenez, hem nükleer hem de mitokondriyal DNA'dan gen ürünlerinin katkısını gerektirmede benzersizdir. Bununla birlikte, bunların büyük çoğunluğu çekirdekten türetilmiştir, çünkü mtDNA transkripsiyonu sadece 13 proteinin sentezine yol açar. Mitokondri normalde çeşitli metabolik yollarda yer alan >1000 proteinden oluştuğundan, organel biyogenez, uygun stoichiometry ve fonksiyonu korumak için sitozolden çeşitli mitokondriyal alt bölmelere öncül proteinlerin sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir ithalat ve montaj aracı gerektirir12,13. Mitokondrilere yönelik nükleer kodlanmış proteinler normalde onları organellere hedefleyen ve alt bölümler arası lokalizasyonlarını kolaylaştıran bir mitokondriyal hedefleme dizisi (MTS) taşırlar. Matrise bağlı proteinlerin çoğu bölünebilir bir N-terminal MTS içerirken, dış veya iç mitokondriyal membran için uygun olanlar genellikle iç hedefleme alanlarına sahiptir14. İthalat işlemi, organel13'e giriş için birden fazla yol sağlayan bir dizi farklı kanal tarafından gerçekleştirilir. Dış membran (TOM) kompleksinin translokazı, sitozolden iç zar (Tİm) kompleksinin translokazı tarafından tanındıkları intermembran uzayına öncüller. Bu kompleks, proteazların N-terminali hedefleme ön sırasını ayırdığı matrise nükleer kodlanmış öncüllerin içe aktarıcılarından sorumludur. Dış zara yönelik proteinler tom kompleksi aracılığıyla doğrudan bu zara yerleştirilebilirken, iç zara yönelik olanlar bir TIM proteini, özellikle TIM22 tarafından yerleştirilir. İthalatlarından sonra, proteinler yerleşik proteazlar ve refakatçiler tarafından daha fazla işlenir ve genellikle elektron taşıma zincirinde bulunanlar gibi daha büyük kompleksler oluşturmak için birleştirilir.
Mitokondriyal protein ithalatının kendisi de mitokondriyal sağlığın bir ölçümü olarak hizmet eder, çünkü bu işlem membran potansiyelinin varlığına ve ATP15 şeklinde bir enerji kaynağına dayanır. Örneğin, membran potansiyeli dağıldığında, protein kinaz PINK1 organel tarafından alınamaz ve bu, mitophagy16,17 adı verilen bir yoldan organeldeki bozulmanın başlangıcını tetikleyen fosforilasyon sinyallerine yol açar. Benzer durumlarda, ithalat engellendiğinde, ATF5 proteini organel içine giremez ve daha sonra UPR gen ekspresyonunun yukarı regülasyonu için bir transkripsiyon faktörü olarak hizmet ettiği çekirdeğe yer değişir18,19. Bu nedenle, protein ithalat verimliliğini ölçmek organel sağlığı hakkında kapsamlı bir içgörü sağlarken, gen ekspresyon yanıtı çekirdeğe retrograd sinyal verme derecesini belirtmek için kullanılabilir.
Mitokondri biyogenezinin ve genel olarak hücresel sağlığın bariz önemine rağmen, memeli mitokondrilerinde ithalat yolu dikkat çekici bir şekilde yetersizdir. Bu raporda, öncül proteinlerin iskelet kası mitokondrilerine ithalatının ölçülmesinde yer alan belirli adımları açıklar ve ithalat sisteminin kas ve disuse değişikliklere adaptif tepkisini göstermek için veriler sağlayarak, protein ithalatının iskelet kasının adaptif plastisitesine katkısını gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneylerde kullanılan tüm hayvanların bakımı York Üniversitesi'ndeki hayvan bakımevindedir. Deneyler, York Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nin onayıyla Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilir (İzin: 2017-08).
1. İskelet kasından subsarkolemal ve intermyofibriller mitokondrilerin fonksiyonel izolasyonu
- Reaktif hazırlama:
- Tablo 1'de belirtildiği gibi tüm arabellekleri ve ortamları hazırlayın.
- Tamponları pH 7.4 olarak ayarlayın ve nagrase proteaz hariç 4 °C'de (2 haftaya kadar) saklayın.
- Her seferinde taze nagarse proteaz (Tablo 1) hazırlayın.
- Doku alma ve kıyma
NOT: Mitokondrilerin izolasyonu için aşağıdaki adımların bir akış çizelgesi Şekil 1'de verilmiştir.- Bir cam scintillation şişeyi ~20 mL Tampon 1 (Tablo 1) ile doldurun ve buza yerleştirin.
- Fare anestezi altındayken, iskelet kaslarını (tibialis ön, kuadriseps, gastrocnemius vb.), yaklaşık 500-1000 mg hasat edin ve kasları soğutulmuş Tampon 1 içeren scintillation şişesine yerleştirin.
NOT: Gazlı izofluran, 0,4 L O2/dk akış hızında %2,5 oranında anestezik olarak kullanılır. Hayvanın yanıt vermemesini sağlamak için bir çimdik testi yapılır. - Doku toplanmasından sonra, servikal çıkık yoluyla hayvanı ötenazi yapın.
- Buzda bir saat bardağı önceden soğutun. Kaslardan herhangi bir yağ veya bağ dokusunu çıkarın ve homojen bir bulamaç olana kadar saat camındaki dokuyu kıydırın.
- Kıyılmış dokuyu önceden soğutulmuş 50 mL plastik santrifüj tüpüne yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve tam ağırlığı kaydedin.
- Kıyılmış dokuyu Tampon 1 + ATP (Tablo 1) ile 10 kat seyreltin.
- 10 s için 9,8 Hz güç çıkışında 8 mm çift bıçaklı homojenizatör (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak kas örneğini homojenize edin ve görünür kas parçalarının kalmamasını sağlayın.
- Numuneleri 800 x g'da yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak 10 dakika boyunca santrifüj edin (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Bu adımın amacı SS ve IMF mitokondriyal fraksiyonlarını ayırmaktır. Süpernat SS mitokondri içerirken, pelet IMF mitokondri içerir.
- SS mitokondriyal izolasyonu
- Büyük kalıntıları veya kirleticileri gidermek için üst tabakayı tek bir peynir örtüsü tabakasından başka bir 50 mL plastik santrifüj tüpü kümesine filtreleyin.
- Yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.000 x g'da süpernatı santrifüj edin.
- Üstnatı atın ve peletin 3,5 mL Tampon 1 + ATP'de yeniden kullanılabilir.
NOT: P1000 ile yeniden biriktirin ve bunu dikkatlice yapın. Mitokondriler kırılgan organellerdir. Hafifçe gerçekleştirin ve pipet ucuyla peletin dokunmasını önlayın. - Numuneyi 9.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak santrifüj edin.
- Çekirdek, mitokondri ve diğer organellerden yoksun bir sitosolik fraksiyonu izole etmek için daha fazla işlem istenmediği sürece süpernatı atın. Peletin P200 pipet kullanarak resüspenzyon ortamının (Tablo 1) kabaca 95 μL'sinde dikkatlice yeniden biriktirin.
NOT: 1.3.3. adıma benzer şekilde, pipet ucuyla peletin dokunmasından kaçının. Resüspensyon ortamının hacmi peletin büyüklüğüne bağlı olarak değiştirilebilir. Bu, IMF fraksiyonu izole edilene kadar buz üzerinde saklanabilen SS mitokondriyal fraksiyonudur. İstenirse, organellerden yoksun sitosolik fraksiyon, süpernatı bir ultrasantrifüjde 100.000 x g'da santrifüj ederek izole edilebilir (bkz. Malzeme Tablosu) ve daha sonra pelet atılabilir.
- IMF mitokondriyal izolasyonu
- Tampon 1 + ATP'de peleti adım 1.2.8'den 10 kat seyreltin. Numune tutarlı olana kadar pelet ve tamponu hafifçe karıştırarak bir Teflon pestle kullanarak yeniden depolayın.
- Numuneyi 10 sn için 9,8 Hz güç çıkışında 8 mm çift bıçaklı homojenizatör (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak homojenize edin.
- Numuneyi 800 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak santrifüj edin.
- Süpernate atın ve Tampon 2 kullanarak IMF mitokondriyal pelet 10 kat seyreltin ve homojen olana kadar hafifçe karıştırarak Teflon pestle kullanarak yeniden dürt.
- 10 mg/mL nagarse proteaz (Tablo 1) için 25 μL/g doku ekleyin ve santrifüj tüpünü buzun üzerine yerleştirin, tüpü yan yana sallayarak her dakika hafifçe karıştırın.
NOT: Nagarse ilavesi, miyofibrillerin sınırlı sindirimini gerçekleştirerek IMF mitokondrisinin özgürleştirilmesine yardımcı olur. - 5 dakika sonra, nagarse proteazını hareketsizlik noktasına seyreltmek ve sindirimi durdurmak için 20 mL Tampon 2 (Tablo 1) ekleyin.
- Numuneyi yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g'da hemen santrifüj edin.
- Üstnat atın ve Tampon 2 kullanarak peleti 10 kat seyreltin ve hafifçe karıştırarak bir Teflon pestle kullanarak yeniden ıslatın.
- Lifli malzemeyi peletmek için numuneyi 800 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin.
- Süpernatı 50 mL plastik santrifüj tüplerinden oluşan yeni bir sete dökün, atılabilen peletin bozulmamasına dikkat edin.
- Numuneyi 1.4.7 adımında olduğu gibi 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.000 x g'da santrifüj edin.
- Üstnat atın, 3,5 mL Tampon 2 ekleyin ve peleti bir P1000 pipet kullanarak hafifçe yeniden biriktirin.
- Numuneyi 1.4.7 adımında olduğu gibi 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.000 x g'da santrifüj edin.
- Süpernate atın ve peleti bir P200 pipet kullanarak kabaca 180 μL resüspenzyon ortamı ile hafifçe yeniden biriktirin.
NOT: Resüspensyon ortamının hacmi peletin boyutuna bağlı olarak değiştirilebilir. Bu, ithalat tahlilinde kullanılacak kadar buz üzerinde saklanabilen IMF mitokondriyal fraksiyonudur.
2. Mitokondriyal protein ithalatı
- In vitro transkripsiyon
NOT: Bu sonraki adımlar, radyo etiketli bir proteinin ithalat için nasıl hazırlanacağını özetler. Araştırılan ithalat yolu, örneğin mitokondriyal matrise ithalatı değerlendirmek için hedef protein seçimini dikte edebilir, ornitin karbamil transferaz, OCT ve malat dehidrogenaz, MDH yaygın olarak kullanılırken, Tom40 genellikle dış mitokondriyal membran içine ithalatın bir göstergesi olarak kullanılır. Aşağıdaki adımlar için, tercih edilen proteini kodlayan plazmid DNA gereklidir. Plazmid DNA'sının transkripsiyonu ayrı bir günde mitokondriyal izolasyondan önce yapılabilir ve bu deneyden toplanan mRNA gelecekteki çeviri ve ithalat deneylerinde saklanabilir ve kullanılabilir.- DNA'yı doğrusallaştırın: 40 μL plazmid DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x enzim tamponu ve 5 μL kısıtlama enzimini birleştirin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatın.
NOT: Kullanılan kısıtlama enzimleri plazmidlere göre değişebilir, bu da farklı bir enzim tamponu gerektirebilir ve şablon yukarı veya aşağı ölçeklendirilebildiği için deneysel koşullar DNA herhangi bir miktarda / hacimde kullanılabilir. - Fenol ve etanol kullanarak doğrusallaştırılmış DNA'yı arındırın ve çökeltin. Sonraki tüm adımları (2.1.3-2.1.15) steril 1.5 mL tüplerde gerçekleştirin ve santrifüj adımları için bir masa üstü santrifüj kullanın (bkz. Malzeme Masası).
- Son hacmin 400 μL'ye eşit olması için uygun steril H2O hacmini ekleyin. Ardından, 400 μL fenol ekleyin.
- ~10 sn için ters çevirme ile kuvvetlice karıştırın ve 4 °C'de 1 dakika boyunca 17.000 x g'da santrifüj. Geri çekilin ve üst aşamayı kaydedin.
- 400 μL fenol ekleyin:kloroform:izoamylalcohol (25:24:1, v:v:v).
- ~10 sn için ters çevirme ile kuvvetlice karıştırın ve 4 °C'de 1 dakika boyunca 17.000 g'da santrifüj. Geri çekilin ve üst aşamayı kaydedin.
- 400 μL kloroform ekleyin:izoamylalcohol (24:1, v:v).
- ~10 sn için ters çevirme ile kuvvetlice karıştırın ve 4 °C'de 1 dakika boyunca 17.000 g'da santrifüj. Geri çekilin ve üst aşamayı kaydedin.
- 40 μL 3M sodyum asetat (pH 7.0) ekleyin ve 1 mL% 95 etanol ekleyin.
- Steril 1,5 mL tüpleri -80 °C dondurucuya 15 dakika boyunca yanlarına yerleştirin.
- Numuneleri 17.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.
- Süpernate atın ve peletin% 80 etanol 300 μL ile yıkayın.
- Numuneleri 17.000 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin.
- Üst salnat atın ve peletin havayla kurutun. Pelet kurudıktan sonra net olmalıdır.
- Peletin 20 μL steril H2O'da yeniden süzülmesi
- Spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün (bkz. Malzeme Tablosu) ve A260:280 oranının 1,8'in üzerinde olduğundan emin olun.
- DNA'yı steril H2O'da 0,8 μg/μL konsantrasyona seyreltin.
- DNA'yı yazıya dökün: Plazmidi birleştirin (0,8 μg/μL, 60,8 μL), steril H2O (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP ( 10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), belirtildiği gibi karışım adım 2.1.19 (15.6 μL), RNAsin (5.2 μL) ve uygun bir RNA polimeraz (4.8 μL) "bir reaksiyon karışımı" (toplam hacim = 121,6 μL) oluşturur ve polimeraz için optimum sıcaklıkta 90 dakika kuluçkaya yaslayın (T7 polimeraz için 37 °C); SP6 polimeraz için 40 °C)
- Karışımı hazırlamak için 200 μL 1M HEPES (pH 7.9), 100 μL 1 M MgAc2, 500 μL 4 M KAc, 100 μL 20 mM spermidin, 100 μL 0.5 M DTT ve 200 μL steril H20 ekleyin.
NOT: Reaktiflerin sağlanan oranları korunduğunda reaksiyon hacim olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Kullanılan RNA polimeraz, kullanılan plazmid içindeki bakteriyel promotör dizisi tarafından dikte edilir. - Daha sonra, 2.1.2-2.1.15 adımlarında olduğu gibi fenol ve etanol kullanarak mRNA'yı arındırın ve çökeltin. Steril H2O ile hacmi 400 μL'ye kadar getirin (280 μL ekleyin) ve 2.1.2-2.1.15 adımlarında açıklandığı gibi devam edin. Son peletin 20 μL steril H2O'da yeniden süzülmesi.
- Spektrofotometre kullanarak mRNA konsantrasyonunu ölçün, A260:280 oranının ~2.0 olduğundan emin olun.
- mRNA'yı steril H2O'da 2,8 μg/μL'ye seyreltin ve 50 μL aliquots'ta -20 °C'de saklayın.
- DNA'yı doğrusallaştırın: 40 μL plazmid DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x enzim tamponu ve 5 μL kısıtlama enzimini birleştirin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatın.
- In vitro çeviri
NOT: İstenilen DNA'nın çevirisi ithalat deneyinin aynı günü yapılmalıdır. Bu deney radyolabelli amino asitlerin kullanılmasını gerektirir ve bu nedenle kullanıcının radyoisotopların kullanımı için bir izni olmalıdır ve tüm kullanım ve bertaraf kurumun politikalarına / gereksinimlerine uygun olmalıdır. Radyoizotop güvenlik önlemlerini içeren adımlar, büyük olasılıkla kuruma göre farklılık gösterecekleri için kısa bir süre atlanmış veya tanımlanmıştır.- İthalat deneyinde kullanılacak mitokondri örneği başına ~20 μL sağlamak ve bir çeviri şeridi için aynı hacmi dahil etmek için yeterli çeviri reaksiyon karışımı (Tablo 2) hazırlayın.
- Reaksiyonun 30 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatması (zaman mRNA ile değişebilir, 25-60 dk).
- 35S-metiyonin kullanımını kurumun radyoaktif güvenlik gereksinimlerine göre kaydedin ve kurumun yönergelerine göre radyoizotopla temas eden her şeyi atın.
- Protein ithalatı
NOT: Sonraki adımlar için yeni izole mitokondri gereklidir. Mitokondriyal izolasyon protokolüne bakın. Mitokondriler uygulanabilir ve işlevsel olduğu sürece diğer izolasyon yöntemleri kullanılabilir. Sonraki adımlar için, kullanılan mitokondriyal örnekler yukarıda açıklandığı gibi bir resüspenzyon tamponunda yeniden kullanılır (Tablo 1). İthalat testine başlamadan önce mitokondriyal numunenin protein konsantrasyonu da ölçülmelidir.- Çeviri reaksiyonunun başlamasından yaklaşık 15 dakika sonra, steril 1,5 mL tüplere aliquot 90 μg mitokondri ve ~10 dakika boyunca 30 °C'de önceden kuluçkaya yatır.
NOT: Aliquot deneyde gerçekten kullanılacak olandan daha fazla mitokondri; sadece 75 μg gerçekten kullanılacaktır. Ancak, fazla miktarda aliquoting bir gereklilik değildir. - Steril 1,5 mL tüplerden oluşan yeni bir sette, 75 μg mitokondriyi 18 μL çeviri reaksiyonla birleştirin ve istenen süre boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Çeviri reaksiyonunun kalan hacmini buzda tutun; bu daha sonra kullanılacaktır.
NOT: İthalat zamana bağlı bir süreçtir, bu nedenle kuluçka süreleri 1-60 dakika arasında değişen bir zaman kursu denemesi ile başlamak ihtiyatlı olabilir. Tipik bir reaksiyon süresi 30 dakikadır. - Bu süre zarfında, 1 g sakkaroz, 200 μL 2,5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL 1 M HEPES (pH 7,4) birleştirerek sakkaroz yastığını hazırlayın ve steril H2O kullanarak hacmi 5 mL'ye getirin.
- İthalat reaksiyonunda her tüpe karşılık gelen yeni bir steril 1,5 mL tüp seti hazırlayın. Sakkaroz yastığının aliquot 600 μL'si her tüpe girer ve ithalat reaksiyonu bitene kadar buzda tutun.
- İthalat reaksiyonunu uygun kuluçka süresinden sonra sonlandırmak için, tüpü 30 ° C'den çıkarın, buza yerleştirin ve ardından ithalat reaksiyonunu sakkaroz yastığı ile tüpün üzerine dikkatlice aktarın.
NOT: Mitokondrilerin zarar görmemesi/yırtılması için bu adımın çok yavaş yapılması gerekir. Sakkaroz yastığı, mitokondrilerin göçünü yavaşlatmaya yardımcı olur ve sonraki santrifüj adımı sırasında tüpün dibine inişini "yastıklar". - Numuneleri santrifüj + sakkaroz yastığı 17.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
- 25 mL 2,4 M sorbitol, 2 mL 1 M HEPES (pH 7,4) ve 72 mL çift damıtılmış H2O birleştirerek kırılma tamponu hazırlayın.
- SDS-PAGE jel elektroforezi için lizis tamponu hazırlayın: 50 mL ısıtılmış gliserol, 11,5 g SDS, 31,25 mL 1 M Tris (pH 6,8) birleştirin ve hacmi çift damıtılmış H2O ile 500 mL'ye getirin.
- Numune hazırlama için, 475 μL lizis tamponu daha sonraki bir adımda kullanılmak üzere 25 μL β-mercaptoethanol ile karıştırın.
NOT: Lizis tamponu önceden yapılabilir ve oda sıcaklığında saklanabilir; ancak, β-mercaptoethanol ilavesi taze yapılmalıdır. - Bir P1000 pipet kullanarak, süpernat'ı dikkatlice çıkarın ve peletin rahatsız etmeyin. Süpernatı uygun bir radyoaktif atık kabına atın.
- Dış zara ithal etmek için, Tom40 kullanarak bunu gerçekleştirin, peletin 50 μL taze hazırlanmış 0,1 M sodyum karbonat (pH 11,5) ile yeniden biriktirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, numuneyi 4 °C'de 5 dakika boyunca 14.000 x g santrifüj edin. Bu adım sadece dış zar içe aktarma reaksiyonları için yapılır.
- SDS-PAGE elektroforezi için numuneleri hazırlamak için, 20 μL kırma tamponu, 20 μL lizis tamponu ve β-mercaptoethanol ekleyin ve iyice yeniden kullanın. 5 μL numune boyası ekleyin.
- 2.3.3 adımından kalan çeviri reaksiyonunun 3 μL'sini 37 μL lizis tamponu ve 5 μL numune boyası ile birleştirerek kontrol/çeviri şeridini hazırlayın. İyice karıştırın.
- Numuneleri 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve mitokondrileri saçmaktan kaçınmak için düşük hızda hafifçe aşağı doğru döndürün.
- Numuneleri bir SDS poliakrilamid jeline uygulayın.
NOT: Jel yüzdesi ve sonraki çalışma süresi, hangi proteinin ithal edildiğine bağlı olacaktır. Örneğin, OCT 37 kDa'dır ve olgun işlenmiş bandı biraz daha küçüktür; bu nedenle,% 12 jel bu bantların iyi ayrılmasını sağlar. - Elektroforez tamamlandıktan sonra jeli çıkarın ve çift damıtılmış H2O'ya yerleştirin.
- Jeli% 5 TCA'da 5 dakika boyunca duman kaputunda kaynatın, çatlamayı önlemek için jeli sürekli karıştırın / hareket ettinin.
NOT: TCA, görselleştirme için jelin katılaşmasına yardımcı olur; bu, Bunsen brülörü üzerinde metal bir tepside yapılabilir. Jeli cömertçe örtmek için yeterli TCA kullanın, ~1/2 dolu. - Jeli çıkarın ve çift damıtılmış H2O'ya geri yerleştirin.
- Jeli 10 mM Tris'te ~ 50 rpm'de 5 dakika dönen bir plakada yıkayın, yine jeli cömertçe örtmek için yeterli kullanarak, kabın ~ 1/2'si.
- Jeli 1 M Salisiklik asit içinde 30 dakika boyunca dönen bir plakada yıkayarak, yine jeli cömertçe örtmek için yeterli Salisilik asit kullanarak proteini çökeltin, kullanılan kabın ~ 1/2'si.
- 2.3.24-2.3.31 adımlarında açıklandığı gibi jeli susuzlun.
NOT: Bu çeşitli şekillerde yapılabilir. Jel kurutucu (bkz. Malzeme Tablosu) zaman verimli bir seçenek sunar (aşağıda açıklanmıştır); ancak daha uygun maliyetli ancak daha zaman alıcı olabilecek diğer ticari yöntemler/kitler kullanılabilir. Jel kurutma kitleri, ısı veya emme uygulaması gerektirmeyen, bunun yerine bozulmayı önlemek için jelin selofan levhalar arasında havayla kurumasını sağlayan bir alternatif olarak kullanılabilir. - Jel kurutucunun gözenekli yatağına büyük bir lekeleme kağıdı yerleştirin. Jelin uygulanacağı alana bir yaprak kağıt havlu yerleştirin.
- 15 cm x 20 cm'lik bir şişkinlik kağıdı kesin ve kağıt havluya yerleştirin.
- 15 cm x 20 cm'lik ikinci bir kağıt parçası kullanarak jeli kaptan çıkar ve ilk parçanın üzerine düz bir şekilde yerleştirin.
- Biraz daha büyük bir plastik sargı parçası olan ~20 cm x 25 cm kesin ve jel üzerine yerleştirin, sargının altında kırışıklık veya kabarcık olmamasını sağlayın.
NOT: Bu birkaç deneme sürebilir, ancak sıkışmış hava ceplerinin olmaması zorunludur. - Jel kurutucunun plastik kapağını yavaşça sargının üzerine koyun, tekrar kabarcık veya kırışıklık olmamasını sağlayın.
- Pompayı/vakumyu açın ve plastik kapağın bir conta oluşturduğundan emin olun. Plastik kapağın bir köşesini kaldırarak mührü test edin ve yeniden mühürlemesini bekleyin.
- Jel kurutucuyu kapatın ve 90 dakika çalıştırın. Sıcaklığı 30 °C'de başlayacak şekilde ayarlayın, kademeli olarak 80 °C'ye ulaşın ve koşunun sonunda 30 °C'ye geri dönün.
- Susuz kaldıktan sonra jel katılaşmalı ve kağıt inceliğinde hissedecektir. Jeli kurutma işleminde kullanılan plastik sargıya sarın.
- Susuz jeli fosfor filmi olan bir film kasetine yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu), beyaz tarafı jelle bakacak şekilde. Pozlama süreleri değişir, ancak bantların görselleştirilmesi için 24-48 saat olabilir.
- Fosfor görüntüleme yapabilen uygun bir görüntüleyiç kullanarak otoradyografi kullanarak görselleştirin.
- Çeviri reaksiyonunun başlamasından yaklaşık 15 dakika sonra, steril 1,5 mL tüplere aliquot 90 μg mitokondri ve ~10 dakika boyunca 30 °C'de önceden kuluçkaya yatır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün fonksiyonel ve sağlam izole iskelet kası mitokondrilerine ithalat oranını belirlemek için geçerli bir test olduğunu kapsamlı bir şekilde gösterdik. Tedavi edilmeyen koşullara kıyasla, malat dehidrogenaz (MDH) gibi tipik öncül proteinlerin matrise ithal edilmesi membran potansiyeline duyarlıdır, çünkü bir solunum zinciri uncoupler olan valinomycin tarafından inhibe edilebilir (Şekil 2A). Triton X-100 deterjanı varlığında mitokondriyal iç ve dış zarlar çözündüğünde ithalat da engellenir. İthalat işlemi, membranlar arasında translokasyon için öncül proteinlerin ortaya çıkmasına hizmet eden harici ATP'nin varlığına duyarlıdır ve solunum ve ATP sağlama oranı (veriler gösterilmez20) tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilir. İthalatta, kısmen protein ithalat makineleri ifadesindeki değişimlerin yanı sıra bu mitokondriler arasındaki solunum hızı nedeniyle intermyofibriller ve subsarcolemmal mitokondriyal fraksiyonlar arasında belirgin farklılıklar da gözlenmektedir (Şekil 2B).
İskelet kasındaki mitokondriler, enerji talebindeki değişikliklere kolayca yanıt veren son derece dinamik organellerdir. Kastaki mitokondriyal içerik kronik egzersiz dönemlerinden sonra veya elektriksel stimülasyona bağlı kontrtil aktiviteye yanıt olarak artar (bkz. gözden geçirme21). Örneğin, sıçan iskelet kasının 7 günlük kronik kontnaktil aktivitesi, OM ve matrise ithalatı sırasıyla 1,6 kat ve 1,4 kat artırır, sırasıyla22 (Şekil 3A, 3B). Mitokondriyal içerikteki bu değişiklikler, kısmen mitokondriyal protein ithalat sisteminin kapasitesindeki değişikliklerle meydana getirilir. Nitekim, öncül proteinlerin ithalat oranı ile kontrol altındaki karmaşık IV işaretleyici sitokrom oksidaz veya denervated koşullarla ölçülen mitokondriyal içeriğin iyi bir tahmini arasında yakın bir ilişki gösterilebilir23 (Şekil 3C).
Kastaki ithalat sisteminin kontrendikasyon aktivitesindeki değişikliklere uyarlanabilirliği, egzersizin tespit edilirse ithalat yolundaki kusurları çözmek için bir tedavi olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bax-Bak çift nakavt hayvanları kullanılarak mitokondriyal aracılı apoptozun araştırılması sırasında, bu deney hayvanlarının kaslarındaki azaltılmış mitokondriyal içeriğin matrise öncül protein ithalatında bir azalmaya eşlik ettiğini fark ettik. Daha sonra egzersizin bu ithalat kapasitesini geri getirebileceği olasılığını araştırdık. Nitekim, 6 haftalık gönüllü tekerlek koşusu eğitiminin ardından, mitokondriyal içeriği ve işlevini kurtarmak için ithalat yolunun uyarlanabilir plastisitesini gösteren nakavt hayvanlarındaki seviyeleri kontrol etmek için protein ithalatı geri getirildi24 (Şekil 4).
Şekil 1: Önceki çalışmaya dayanarak iskelet kasından SS ve IMF mitokondrilerinin izole edilmesi için iş akışının şeması8. Bu protokol, iskelet kası içindeki coğrafi konumlarına göre fonksiyonel mitokondrilerin izolasyon edilmesini sağlar. SS mitokondrileri daha hızlı ve kolay bir şekilde kurtarılırken, IMF mitokondrileri miyofibrillerden çıkarmak için proteaz ile daha fazla sindirim adımı gerektirir. Bu alt ihlallerin izolasyonunun birlikte yapılabileceğini unutmayın. Güncelleştirilmiş, benzer bir yordam yakın zamanda yayımlanmıştır25. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mitokondriyal matrise protein ithalatı. (A) MDH için normal ithalat oranları SS ve IMF mitokondrilerinde (şerit 4 ve 7) ve öncüL MDH'nin çeviri ürününde (şerit 1) gösterilmiştir. Alt bant ithal olgun MDH'i temsil eder. Valinomisin eklenmesi, MDH protein ithalatını SS ve IMF mitokondri matrisine inhibe eder, çünkü bu uncoupler membran potansiyelini dağıtır (şerit 2 ve 5). Triton-X, iç zarı çözünen ve böylece bu alt ihlallere (şerit 3 ve 6) MDH ithalatını engelleyen bir deterjandır. Protein ithalatı, 4 dk, 7 dk, 10 dk, 15 dk ve 30 dk olmak üzere artan sürelerde gerçekleştirildi. Bu veriler, ithalatın zamana bağlı bir süreç olduğunu ve ayrıca SS ve IMF mitokondrilerinin ithalat için farklı oranlara veya kapasitelere (B) sahip olduğunu göstermektedir. TL, çeviri kulvarı; VAL, valinomisin; TRI, Triton-X; CTL, kontrol; SS, subsarcolemmal; IMF, intermyofibriller. Bu rakam Takahashi M & Hood DA20'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Protein ithalatı uyarlanabilir ve mitokondriyal içerik tahminlerine sıkıca bağlıdır. Sprague Dawley sıçanları, egzersiz eğitiminin bir modeli olan kasılmaya neden olmak için elektriksel uyarılmaya maruz kaldı. (A) Tom40'ın OM'ye ithalatı, herhangi bir zaman noktasındaki kontrollere kıyasla kronik olarak uyarılmış hayvanlardan kasta 1,6 kat daha yüksekti. (B) Oct mitokondriyal matrise ithalat her kuluçka noktasında artırıldı ve genel olarak, bu kronik olarak uyarılmış kastan mitokondrilerde 1.4 kat artışa neden oldu. (C) İthalat, COX aktivitesi tarafından değerlendirildiği gibi mitokondriyal içerik indeksi ile pozitif olarak ilişkilidir, r = 0.69. Bu ölçümler, mitokondriyal içeriği ve ithalat oranını azalttığı gösterilen denervasyona maruz kalan hayvanlardan alınmıştır. Con, kontrol; Den, denervated; Uyarıcı, uyarılmış; TL, çeviri kulvarı; * s < 0.05. Şekil 3A ve 3B, Singh B & hood DA23'ten Joseph A-M & Hood DA22 ve 3C'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Eğitim , ithalat kusurlarını in vivo olarak kurtarır. Bax/Bak çift nakavt hayvanları mitokondriyal matrise % 37 oranında azaltılmış protein ithalatı sergiler. Altı haftalık gönüllü tekerlek, ithalat kusurunu kontrol seviyelerine kurtardı. WT, wildtype; DKO, çifte nakavt; TL, çeviri kulvarı; * p < genotipin 0.05 ana etkisi; ¶ p < eğitimin 0.05 ana etkisi. Bu rakam Zhang Y ve ark.24'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Arabellek 1: | Arabellek 1 + ATP: | Arabellek 2: | Resüspensyon ortamı: | Nagarse proteaz |
| 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | Tampon 2'de 10 mg/mL |
| 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 10 mM PASPAS | NOT: Taze olun ve buzda tutun |
| 5 mM EDTA | 5 mM EDTA | 5 mM EGTA | 0.2% BSA | |
| 50 mM Tris | 50 mM Tris | 50 mM Tris | ||
| 1 mM ATP | 1mM ATP |
Tablo 1: Arabellekler ve resüspensyon ortamı.
| Reaksiyon hacminin yüzdesi | 1 Reaksiyon karışımı | |
| Reticulocyte Lysate | 64.10% | 11,8 μL |
| Amino asitler (-methionine) | 2.20% | 0,4 μL |
| Steril H2O | 21.60% | 3,97 μL |
| 35 S-methionine | 7.20% | 1,33 μL |
| Mrna | 5.40% | 1,0 μL |
| Toplam Birim | 18,5 μL | |
| NOT: | ||
| 1) En son 35S-methionine ekleyin; | ||
| 2) Lisat'ı buz üzerinde yavaşça çözün ve donma/çözülme döngülerini ikiyle sınırlayın. Lysate'in varışta aliquoted olması önerilir | ||
| 3) mRNA'nın hacmi, steril H2O hacmini buna göre değiştirerek çeviri verimliliğini optimize edecek şekilde ayarlanabilir. | ||
Tablo 2: Çeviri reaksiyon karışımı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondriler, hücreler içindeki sentezleri ve genişlemeleri için hem nükleer hem de mitokondriyal genomların ifade ve koordinasyonuna benzersiz bir şekilde bağlıdır. Bununla birlikte, nükleer genom mitokondriyal proteomun büyük çoğunluğunu (%99) kodlar ve bu, protein ithalat makinelerinin mitokondriyal biyogenezin desteklenmesindeki öneminin altını çizmektedir. İthalat aynı zamanda önemli bir sinyal olayı olarak hizmet eder, çünkü ithalat başarısızlığı, katlanmış protein yanıtının ve /veya mitophagy'nin başlatılmasını teşvik edebilir15,16,26. İthalat, sağlam bir membran potansiyeli olan birden fazla fonksiyonel kanal ve refakatçinin ifadesine ve ATP'nin mevcudiyetine dayandığından, mitokondriyal protein ithalatının değerlendirilmesi organelin sağlığı ve enerji durumu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Protein ithalat kapasitesinin mitokondrilere değerlendirilmesi, organellerin standart diferansiyel santrifüjleme teknikleri kullanılarak çevre dokudan izole edilmesini gerektirir. İthalat, mitokondriyal enzim aktivitelerinin Vmax'ını zaman ve substrat konsantrasyonuna bağlı ve hücresel sitosolik etkilerden bağımsız olarak son derece kontrollü bir şekilde değerlendireceği şekilde değerlendirilir. Burada sunulan izolasyon yöntemi veya benzer yorumlamaları, mitokondriyal solunum ve enzim aktivitelerini değerlendirmek için uzun yıllardır kullanılmaktadır8,9,10,11. Bu teknik, iskelet kasında küçük küresel yapılardan, kas hücresi içindeki subsarkolemal veya intermyofibriller konumlarına bağlı olarak, yüksek dallı bir retiküler ağa kadar oldukça karmaşık olan in situ27'de var oldukları için mitokondrilerin normal morfolojisini bozduğu için sınırlamaları olmadan değildir. Ek olarak, proteaz nagarse kullanımı inceleme altına alınmıştır3,28. Bu yöntemde, nagarse yerine tripsin kullanan bir güncelleme yakın zamanda yayınlanmıştır25 ve trypsin diğerleri tarafından kas mitokondri29'ı izole etmek için kullanılmıştır. Gerçekten de, proteazes30 veya insan kasından küçük biyopsi boyutunda örnekler için tasarlanmış teknikler de dahil olmak üzere işlevsel olarak bozulmamış mitokondri veren herhangi bir alternatif izolasyon yöntemi kullanılabilir31. Burada sunulan yöntem, SS mitokondrisini hızlı ve kolay bir şekilde izole etme avantajına sahiptir, ancak IMF alt ihlalinin izolasyonu ile daha fazla verim ve mitokondri saflığı elde edilebilir. Dikkatli bir şekilde yapılırsa, bu izolasyon protokolü, uygun durum 3 ve 4 solunum oranlarını gösteren yüksek solunum kontrol oranına sahip fonksiyonel olarak bozulmamış organellere neden olabilir8.
Mitokondriyal protein ithalatının ölçülmesinde, iç zar boyunca ithalat, pozitif yüklü öncül dizileri çekmeye ve öncüllerin negatif yüklü matris alanına taşınmasına aracılık etmeye yardımcı olan bu elektroforetik proton güdü kuvvetine bağlı olduğundan, bu organellerin membran potansiyellerini korumaları da zorunludur. Bu koşullar altında, mitokondriyal fonksiyon ve ithalat karşılaştırmaları, örneğin egzersiz, yaşlanma ve kas disuse gibi fizyolojik olarak ilgili deneysel durumlar arasında değerlendirilebilir. Bu bakımdan, önceki çalışmalar, ithalatın kas kullanımı ve kullanım dışılık durumlarına yanıt veren ve aşırı ROS emisyonu ile inhibisyona duyarlı olan son derece uyarlanabilir bir yol olduğunu göstermiştir10,22,23,32. Bu plastisite, kısmen protein ithalat makineleri bileşenlerinin ifadesindeki uyarlanabilir değişikliklerden kaynaklanmaktadır. Bu teknik mitokondri izolasyonu dayandığından, sitosolik faktörlerden veya organeller arası çapraz konuşmadan kaynaklanabilecek ithalat yolundaki herhangi bir düzenleme deneyin yorumlanmasından çıkarılır. Bu, tekniğin hem bir sınırlaması hem de gücüdür, çünkü ithalat yolunun kapasitesinden (enzim aktivitesinin Vmax'ına benzer) sonuçlar çıkarılabilir, ancak deneysel modelle oluşabilecek geçici veya harici sinyaller kaybolabilir. Bunu atlatmak için, daha önce olduğu gibi ithalat oranlarını etkileyebilecek sitosolik ortamdaki değişiklikleri değerlendirmek için, yukarıda açıklandığı gibi izole edilmiş sitosolik fraksiyonun bir örneği ile ithalat reaksiyonunu kuluçkaya yatırmak mümkündür2. Buna ek olarak, ithalat makineleri bileşenleri işlevlerini değiştirebilecek akut, çeviri sonrası değişikliklere tabidir. Son çalışmalar, spesifik TOM ithalat reseptörlerinin fosforilasyonunun mitophagy33 ile bağlantılı olabileceğini göstermiştir. Gerçekten de, daha fazla dikkat gerektiren bir araştırma alanı, ithalat sürecinin ROS tarafından aracılık edilen iç sinyal yolları veya maya ve diğer alt organizmalarda belgelenen ithalat reseptörlerinin ve refakatçilerinin yaygın modifikasyonu ile akut modülasyonudur34,35.
Mitokondrilere protein ithalatı adaptif organel büyümesine açılan bir kapıdır ve mitokondriyal sağlığın hassas bir göstergesidir. Bu sürecin nasıl düzenlendiğini anlamak, mitokondriyal biyogenezin düzenlenmesine, UPR sinyaline ve mitophajinin başlatılmasına ışık tutabilir. Mitokondriyal protein ithalatı memeli deneysel modellerinde yaygın olarak çalışılan bir süreç değildir ve bu alandaki geniş araştırma potansiyelinin geliştirilmesi, mitokondriyal disfonksiyonun belirgin olduğu veya mitokondriyal sağlığı teşvik etmek için çekici bir terapötik hedefi temsil ettiği hastalıkların daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar tarafından finansal veya başka bir çıkar çatışması beyan değildir.
Acknowledgments
Yazarlar, mcgill üniversitesinden Dr. G.C. Shore'a, Washington Tıp Fakültesi'nden Dr. A. Strauss'a ve La Trobe Üniversitesi'nden Dr.M.T. Ryan'a bu araştırma için kullanılan ifade plazmidlerinin orijinal bağışları için teşekkür eder. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi'nden (NSERC) D. A. Hood'a fon sağlanmasıyla desteklendi. D. A. Hood aynı zamanda Hücre Fizyolojisi'nde Kanada Araştırma Başkanı'nın sahibidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
References
- Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), Pt 1 395-402 (1986).
- Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
- Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
- Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
- Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
- Holloszy, J. O.
- Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, Pt 1 383-389 (1993).
- Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
- Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
- Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
- Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
- Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
- Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
- Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
- Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
- Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
- Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
- Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
- Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
- Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
- Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
- Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
- Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
- Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
- Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 1380-1387 (1998).
- Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
- Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
- Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).
