Summary
تم تحديد تركيز السكروز الأمثل لاستخراج الجليكوجين في الكبد باستخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز. أثبتت إضافة خطوة الغليان لمدة 10 دقائق لتثبيط إنزيمات تحلل الجليكوجين أنها مفيدة.
Abstract
الجليكوجين في الكبد هو بوليمر جلوكوز مفرط التفرع يشارك في الحفاظ على مستويات السكر في الدم لدى. تتأثر خصائص الجليكوجين ببنيته. ومن ثم ، فإن طريقة الاستخراج المناسبة التي تعزل عينات تمثيلية من الجليكوجين أمر بالغ الأهمية لدراسة هذا الجزيء الكبير. بالمقارنة مع طرق الاستخراج الأخرى ، فإن الطريقة التي تستخدم خطوة الطرد المركزي لتدرج كثافة السكروز يمكن أن تقلل من الضرر الجزيئي. بناء على هذه الطريقة ، يصف منشور حديث كيف اختلفت كثافة محلول السكروز المستخدم أثناء الطرد المركزي (30٪ ، 50٪ ، 72.5٪) للعثور على التركيز الأنسب لاستخراج جزيئات الجليكوجين من مجموعة متنوعة من الأحجام ، مما يحد من فقدان الجسيمات الأصغر. تم تقديم خطوة الغليان لمدة 10 دقائق لاختبار قدرتها على تشويه الإنزيمات المهينة للجليكوجين ، وبالتالي الحفاظ على الجليكوجين. تبين أن أقل تركيز للسكروز (30٪) وإضافة خطوة الغليان لاستخراج العينات الأكثر تمثيلا من الجليكوجين.
Introduction
الجليكوجين هو بوليمر معقد مفرط التفرع من الجلوكوز الموجود في والفطريات والبكتيريا1. في الثدييات ، يعمل الجليكوجين في الكبد كمخزن مؤقت للجلوكوز في الدم ، ويحافظ على التوازن ، بينما يعمل الجليكوجين العضلي كخزان للجلوكوز على المدى القصير لتوفير الطاقة مباشرة2. غالبا ما يتم وصف بنية الجليكوجين بثلاثة مستويات (كما هو موضح في الشكل 1): 1. تتشكل السلاسل الخطية بواسطة مونومرات الجلوكوز عبر روابط جليكوسيدية (1→4) -α ، مع توصيل نقاط فرعية عبر (1→6) -α روابط جليكوسيدية. 2. جزيئات β متفرعة للغاية (~ 20 نانومتر في القطر) والتي ، خاصة في الأنسجة مثل العضلات الهيكلية ، تعمل كجزيئات جليكوجين مستقلة 3,4 ؛ 3. جزيئات الجليكوجين α الأكبر (يصل قطرها إلى 300 نانومتر) والتي تتكون من وحدات الجليكوجين β الأصغر ، والتي توجد في الكبد5 ، القلب6 ، وفي بعض الأنواع غير الثديية7. جزيئات α الكبدية من الفئران المصابة بالسكري هشة جزيئيا ، مع ميل إلى التحلل إلى جزيئات β عند إذابتها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، في حين أن الجسيمات α من الضوابط غير السكرية تظل دون تغيير بشكل عام. إحدى الفرضيات هي أن هذه الهشاشة قد تؤدي إلى تفاقم ضعف توازن الجلوكوز في الدم الذي يظهر في مرض السكري ، حيث من المحتمل أن تؤدي جزيئات α الهشة إلى نسب أعلى من الجسيمات β المتدهورة بسرعة8،9،10،11.
تستخدم طرق استخراج الجليكوجين التقليدية الظروف القاسية نسبيا لتعريض أنسجة الكبد لمحلول قلوي ساخن12 أو محاليل حمضية مثل حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) 13 أو حمض البيركلوريك (PCA) 14. في حين أن هذه الطرق فعالة في فصل الجليكوجين عن المكونات الأخرى لأنسجة الكبد ، إلا أن هذه الطرق تؤدي حتما إلى تدهور بنية الجليكوجين إلى حد ما15,16. على الرغم من أن هذه الطرق مناسبة للقياس الكمي لمحتوى الجليكوجين ، إلا أنها ليست مثالية للدراسات التي تركز على الحصول على معلومات هيكلية عن الجليكوجين بسبب هذا الضرر الهيكلي. منذ تطوير هذه الطرق ، تم تطوير إجراء استخراج أكثر اعتدالا يستخدم المخزن المؤقت البارد Tris (يظهر أنه يمنع تدهور الجلوكوزيداز) مع الطرد المركزي الفائق لتدرج كثافة السكروز17،18،19. مع التحكم في درجة الحموضة عند ~ 8 ، لا تخضع هذه الطريقة الجليكوجين للتحلل المائي الحمضي أو القلوي الذي شوهد في الإجراءات السابقة.
يمكن للطرد المركزي الفائق المتدرج لكثافة السكروز لأنسجة الكبد المتجانسة فصل جزيئات الجليكوجين عن غالبية مواد الخلية. إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء تنقية إضافية عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحضيري ، مما يؤدي إلى جمع الجليكوجين المنقى مع البروتينات المرتبطة بالجليكوجينالمرفقة 20. على الرغم من أن هذه الطريقة ، مع ظروف أكثر اعتدالا ، من المرجح أن تحافظ على بنية الجليكوجين ، إلا أنه من الصعب منع فقدان جزء من الجليكوجين في المادة الطافية ، وخاصة جزيئات الجليكوجين الأصغر التي تكون أقل كثافة15. سبب آخر محتمل لفقدان الجليكوجين هو أن الظروف الأكثر اعتدالا تسمح ببعض التدهور الأنزيمي ، مما يؤدي إلى انخفاض غلة الجليكوجين مقارنة بطرق الاستخراج الأكثر قسوة. أفادت الأبحاث الحديثة عن تحسين طريقة استخراج الكبد والجليكوجين للحفاظ على بنية الجليكوجين21. هنا ، تم اختبار تركيزات السكروز المختلفة (30٪ ، 50٪ ، 72.5٪) لتحديد ما إذا كانت تركيزات السكروز المنخفضة تقلل من فقدان جزيئات الجليكوجين الأصغر. كان الأساس المنطقي هو أن الكثافة المنخفضة ستسمح للجسيمات الأصغر والأقل كثافة باختراق طبقة السكروز وتجميعها في الحبيبات مع بقية الجليكوجين.
في هذه الدراسة ، تمت مقارنة طرق الاستخراج مع وبدون خطوة غليان مدتها 10 دقائق لاختبار ما إذا كان يمكن تغيير طبيعة إنزيمات تحلل الجليكوجين ، مما أدى إلى استخراج المزيد من الجليكوجين الذي كان أيضا خاليا من التحلل الجزئي. تم استخدام توزيعات الحجم الجزيئي الكامل وتوزيعات طول سلسلة الجليكوجين لتحديد بنية الجليكوجين المستخرج ، على غرار تحسين استخراج النشا المنشور سابقا22. تم استخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) مع اكتشاف معامل الانكسار التفاضلي (DRI) للحصول على توزيعات حجم الجليكوجين ، والتي تصف الوزن الجزيئي الكلي كدالة للحجم الجزيئي. تم استخدام الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE) لتحليل توزيعات طول السلسلة ، والتي تصف العدد النسبي لسلاسل الجلوكوزيد لكل حجم معين (أو درجة البلمرة). تصف هذه الورقة منهجية استخراج الجليكوجين من أنسجة الكبد بناء على دراسة التحسين السابقة21. تشير البيانات إلى أن الطريقة الأكثر ملاءمة للحفاظ على بنية الجليكوجين هي تركيز السكروز بنسبة 30٪ مع خطوة غليان مدتها 10 دقائق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كبد الفأر المستخدم لتحسين هذا الإجراء21 كانت من 12 ذكورا من الفئران الخلفية BKS-DB / Nju (7.2 أسابيع من العمر ، انظر جدول المواد). تمت الموافقة على استخدام من قبل مستشفى رنمين التابع للجنة رعاية والأخلاقيات بجامعة ووهان ، إصدار IACUC رقم. 20181113 WDRM.
1 الأنسجة الحيوانية
- وزن كبد الفأر (1-1.8 غرام من الكبد الكامل من كل فأر).
- قم بتجميد كبد الفأر بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
2. إعداد العازلة والكواشف
- تحضير عازلة عزل الجليكوجين تحتوي على 5 mM Tris ، 150 mM NaCl ، 2 mM EDTA ، 50 mM NaF ، و 5 mM بيروفوسفات الصوديوم مع الماء منزوع الأيونات ، وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.
- تحضير 30٪ (وزن / وزن) محلول السكروز (وجد أنه الأكثر مثالية للجليكوجينفي الكبد 21).
- تحضير العازلة خلات الصوديوم (1 M ، درجة الحموضة 4.5) ، عازلة حمض الخليك (0.1 M ، درجة الحموضة 3.5) ، محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.1 M) ، و cyanoborohydride الصوديوم (1 M).
- تحضير محلول 8-أمينوبيرين-1،3،6-ثلاثي سلفونات (APTS) بإضافة 5 ملغ من APTS إلى 50 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي 15٪.
- تحضير محلول نترات الأمونيوم الذي يحتوي على 50 mM نترات الأمونيوم مع 0.02 ٪ أزيد الصوديوم.
3. استخراج الجليكوجين (الشكل 2)
- انقل أنسجة الكبد المجمدة (~ 1 جم) إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 6 مل من محلول عزل الجليكوجين.
- إبقائه على الجليد ، تجانس أنسجة الكبد باستخدام خالط الأنسجة.
- انقل نصف المعلق (3 مل) إلى أنبوب جديد واغلي لمدة 10 دقائق (ثبت أنه الأمثل للدراسات الهيكلية للجليكوجين21). احتفظ بالنصف الآخر من المعلق (3 مل) على الثلج لاستخراج الجليكوجين الذي يحتوي على البروتينات المرتبطة التي لا يتم تغيير طبيعتها.
ملاحظة: يجب دائما حفظ العينات غير المغلية على الثلج أثناء خطوات استخراج الجليكوجين. إذا لم تكن بروتينات الجليكوجين مهمة للدراسة ، يمكن أن تخضع العينة بأكملها لخطوة الغليان لمدة 10 دقائق. - قم بإزالة قسمة 8 ميكرولتر من كل أنبوب ، واحتفظ بالحصص على الجليد ، واستخدمها لتحديد محتوى الجليكوجين (انظر القسم 4).
- أجهزة الطرد المركزي التعليق المتبقي عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نقل المواد الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، وأجهزة الطرد المركزي لهم في 3.6 × 105 غرام لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المواد الطافية المتبقية وأعد تعليق الكريات في 1.5 مل من محلول عزل الجليكوجين.
- ضع العينات فوق 1.5 مل من محلول السكروز 30٪ في أنابيب الطرد المركزي الفائق 4 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 3.6 × 105 جم لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المواد الطافية المتبقية وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
- أضف 800 ميكرولتر من الإيثانول المطلق إلى المعلقات واخلطها جيدا لترسيب الجليكوجين23,24. قم بتخزين المخاليط في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل للسماح بهطول الأمطار.
- أجهزة الطرد المركزي العينات عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المواد الطافية وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
- كرر عملية ترسيب الإيثانول هذه 3x وأعد تعليق حبيبات الجليكوجين النهائية في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
- قم بإزالة قسامة 8 ميكرولتر من كل أنبوب لتحديد محتوى الجليكوجين (انظر القسم 4).
- قم بتجميد المواد الطافية المتبقية في النيتروجين السائل وتجميدها جافة (lyophilize) طوال الليل. قم بتخزين عينات الجليكوجين الجافة في الفريزر عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب أن تكون عينات الجليكوجين الجافة مستقرة عند -20 درجة مئوية ؛ ومع ذلك ، لا توجد بيانات تشير إلى المدة التي تستغرقها دون أي تغييرات هيكلية.
4. تحديد محتوى الجليكوجين (الشكل 3)
- أضف 8 ميكرولتر من طافات الجليكوجين ، (انظر القسمين 3.13 و 3.4) ، و 5 ميكرولتر من الأميلوجلوكوزيداز (3269 وحدة / مل) ، و 100 ميكرولتر من محلول أسيتات الصوديوم (1 M ، درجة الحموضة 4.5) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واملأ الأنبوب إلى علامة 500 ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات.
- قم بإعداد عناصر التحكم التي تستخدم الماء منزوع الأيونات بدلا من الأميلوجلوكوزيداز.
- احتضان العينات على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع الحفاظ على أدوات التحكم على الجليد.
- أجهزة طرد مركزي عند 6000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، واخلط 300 ميكرولتر من كل مادة طافية ناتجة مع 1 مل من كاشف الجلوكوزيداز أوكسيديز / بيروكسيديز (GOPOD).
- قم ببناء منحنى معايرة عن طريق خلط 300 ميكرولتر من الماء المشين الذي يحتوي على 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 50 ميكروغرام من الجلوكوز D مع 1 مل من كاشف GOPOD.
- احتضان المخاليط على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
- اقرأ الامتصاص (510 نانومتر) لكل عينة باستخدام 96 لوحة بئر (150 ميكرولتر لكل بئر) باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية.
- اطرح امتصاص عينات التحكم (بدون أميلوجلوكوسيداز) من امتصاص العينات التجريبية ، ثم احسب محتوى الجليكوجين بناء على منحنى معيار الجلوكوز D.
5. العائد الخام ، محصول الجليكوجين ، وتحديد النقاء
- بالنسبة للمحصول الخام ، قم بوزن عينة الجليكوجين المجففة بالتجميد واحسب المحصول كنسبة مئوية من أنسجة الكبد الرطبة.
ملاحظة: يجب تعديل هذا العائد لتصحيح الحصص المأخوذة في كل خطوة من خطوات محتوى الجليكوجين. - لنقاء الجليكوجين ، حدد محتوى الجليكوجين في الكريات النهائية ، كما هو موضح في القسم 4. احسب النقاء كنسبة مئوية من محتوى الجليكوجين المحدد بالنسبة إلى العائد الخام (انظر الخطوة 5.1).
- بالنسبة لإنتاجية الجليكوجين ، حدد محتوى الجليكوجين للعينات المتجانسة دون غليان وقبل أي طرد مركزي ، كما هو موضح في القسم 4. احسب محصول الجليكوجين كنسبة مئوية من محتوى الجليكوجين في الكريات النهائية (انظر الخطوة 5.2) إلى محتوى الجليكوجين المحدد في التجانس الأولي.
6. تحليل توزيعات طول السلسلة (الشكل 4)
- تزن 0.5 ملغ من الجليكوجين المجفف بالتجميد في أنابيب سعة 1.5 مل.
- أضف 90 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات و 1.5 ميكرولتر من أزيد الصوديوم (0.04 جم / مل) إلى الأنابيب.
- أضف 5 ميكرولتر من محلول حمض الأسيتيك (0.1 م ، درجة الحموضة 3.5) و 2 ميكرولتر من محلول الأيزو أميلاز (180 وحدة / مجم) إلى الأنابيب لإزالة الجليكوجين.
- احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- أضف 5 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.1 M) إلى العينات لزيادة الرقم الهيدروجيني إلى 7.0.
- قم بتجميد العينات في النيتروجين السائل وتجميدها (lyophilize) طوال الليل.
- أضف 2 ميكرولتر من محلول APTS (5 ملغ من APTS في 50 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي 15٪) و 2 ميكرولتر من سيانوبوروهيدريد الصوديوم (1 متر) إلى الجليكوجين المجفف بالتجميد.
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 4000 × غرام لمدة 2 دقيقة.
- احتضان العينات عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في الظلام.
ملاحظة: يمكن تغطية الأنبوب بورق الألمنيوم لحماية المحتويات من الضوء. - أضف 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى العينات وقم بدومها حتى يذوب كل الراسب.
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 4000 × غرام لمدة 2 دقيقة.
- نقل حصص من 50 ميكرولتر إلى قوارير دقيقة من الكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE) لتحليلها.
ملاحظة: تظهر البيانات على أنها الوفرة النسبية للسلاسل (غير المتفرعة) (Nde (X)) لكل درجة من درجات البلمرة (DP ، الرمز X).
7. تحليل توزيعات الحجم الجزيئي (الشكل 5)
- قم بإذابة 0.5 مجم من الجليكوجين المجفف بالتجميد في 50 مللي مول من نترات الأمونيوم و 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 1 مجم / مل.
- احتضان العينات في خلاط حراري عند 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات عند 300 دورة في الدقيقة.
- قم بحقن العينات في نظام SEC باستخدام عمود مسبق وأعمدة 1000 Å و 10000 Å عند 80 درجة مئوية بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة (انظر جدول المواد). استخدم كاشف معامل الانكسار لتحديد الوزن النسبي للجزيئات عند كل حجم شطف.
- باستخدام معايير بولولان (PSS) مع كتل مولية تتراوح من 342 إلى 1.22 × 106 ، ارسم منحنى معايرة عالمي SEC لتحويل وقت الشطف إلى Rh (نصف القطر الهيدروديناميكي). التعبير عن البيانات من كاشف معامل الانكسار التفاضلي (DRI) كتوزيع وزن SEC w (log Rh) كدالة ل Rh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في حين أن الإجراء الموصوف أعلاه هو الطريقة المثلى (30٪ سكروز مع إضافة خطوة غليان مدتها 10 دقائق) ، يتم توفير البيانات هنا للجليكوجين المستخرج عبر ثلاثة تركيزات من السكروز (30٪ ، 50٪ ، 72.5٪) ، مع وبدون خطوة غليان ، كما هو موضح سابقا21. وفقا للبروتوكول ، يتم إعطاء النقاء والعائد الخام وإنتاج الجليكوجين للجليكوجين الجاف المستخرج بظروف مختلفة في الجدول 1 ، المستنسخ من21. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في المحصول الخام وإنتاج الجليكوجين بين المجموعات المستخرجة مع الظروف المختلفة. في المقابل ، تأثر نقاء الجليكوجين بشكل كبير بكل من تركيزات السكروز (الجدول 1 ، P < 0.001) وإضافة خطوة الغليان (الجدول 1 ، P < 0.0001). تم استخراج الجليكوجين بأعلى درجة نقاء باستخدام تركيز السكروز بنسبة 30٪ جنبا إلى جنب مع خطوة الغليان لمدة 10 دقائق ، ولهذا السبب تم تحديده ليكون الأفضل من بين الظروف التي تم اختبارها.
تم استخدام توزيعات الحجم الجزيئي لتقييم آثار الظروف المختلفة على حجم الجزيئات في المستخلص النهائي. تم الحصول عليها باستخدام نظام SEC المائي ، كما هو موضح سابقا25. سمح تطبيع كل توزيع بنفس القيمة القصوى بمقارنة النسبة النسبية من الجسيمات α إلى β من كل طريقة ، كما هو موضح في الشكل 6 ، المستنسخة من21. يظهر الجدول 2 R h الذي يحدث عنده الحد الأقصى (Rh ، max) ومتوسط Rh (
) ، مستنسخا من21. تم تعريف جزيئات الجليكوجين ذات Rh < 30 نانومتر على أنها جسيمات β11. تم حساب محتوى الجسيمات β على أنه المساحة تحت المنحنى (AUC) ل (Rh < 30 nm) / AUC (إجمالي Rh). كان للعينات المسلوقة متوسط قيم Rh أقل ومحتوى جسيمات β أعلى من العينات غير المغلية (الجدول 2 ، P < 0.05). أدى انخفاض تركيزات السكروز إلى انخفاض القيم وارتفاع β محتويات الجسيمات (الجدول 2 ، P <0.05). أدى إدخال خطوة الغليان أيضا إلى انخفاض قيم Rh ، القصوى (الجدول 2 ، P<0.05) ، في حين أن تركيز السكروز لم يكن له تأثير كبير.
توفر توزيعات طول السلسلة (CLDs) العدد النسبي للسلاسل لكل طول معين (عدد وحدات الجلوكوز المتصلة ، أو درجة البلمرة) ، التي تم الحصول عليها باستخدام FACE. تظهر CLDs في الشكل 7 ، مستنسخة باستخدام بيانات من21. تم حساب متوسط طول السلسلة (ACL) على النحو التالي (ΣX XN de (X)) / (ΣX Nde (X)) (الجدول 2). كانت قوائم التحكم في التحكم في الوصول للعينات غير المغلية أصغر بكثير وأكثر تنوعا من تلك الموجودة في العينات المسلوقة (الجدول 2 ، P < 0.05). ومع ذلك ، فإن تركيز السكروز لم يؤثر بشكل كبير على ACLs. هذا يدعم الفرضية القائلة بأن غلي العينات لمدة 10 دقائق كخطوة ما قبل الاستخراج من شأنه أن يحافظ على بنية الجليكوجين. الآلية المقترحة هي تغيير طبيعة الإنزيمات المهينة للجليكوجين.
الشكل 1: المستويات الثلاثة لتركيب الجليكوجين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: عملية استخلاص الجليكوجين. خطوات لاستخراج وتنقية الجليكوجين من كبد الفأر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد محتوى الجليكوجين. خطوات لتحديد محتوى الجليكوجين في تجانس الكبد أو الجليكوجين الجاف المنقى أو محلول الجليكوجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل توزيعات طول السلسلة. خطوات لتحليل توزيعات طول السلسلة بواسطة نظام الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل توزيعات الحجم الجزيئي. خطوات تحليل توزيعات الحجم الجزيئي بواسطة نظام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: توزيعات وزن SEC لجليكوجين كبد الفأر الكامل (غير المتفرع). تم إجراء الاستخراج في ظل ظروف مختلفة ، وتم تطبيعه للحصول على نفس الحد الأقصى في w (log Rh). تم تقسيم كل تجانس كبد إلى ستة أحجام متساوية ، وتم استخراج الجليكوجين إما بنسبة 30٪ أو 50٪ أو 72.5٪ سكروز ، مسلوق أو غير مسلوق. تمثل المنحنيات المتوسط عند Rh معين مع توفير SD على جانبي الخط الرئيسي (n = 4-6 مع إزالة العينات التي لا تحتوي على إشارة كافية للضوضاء). (أ) الجليكوجين المستخرج بنسبة 30٪ من السكروز ، مسلوق أو غير مسلوق ؛ ب: الجليكوجين المستخرج بنسبة 50٪ من السكروز، المغلي أو غير المغلي؛ ج: الجليكوجين المستخلص بنسبة 72.5٪ من السكروز، المغلي أو غير المغلي. تم تكييف هذا الرقم من21. الاختصارات: SEC = كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ؛ SD = الانحراف المعياري ؛ Rh = نصف القطر الهيدروديناميكي ؛ w (log Rh) = توزيع وزن SEC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: توزيعات طول السلسلة، Nde(X)، للجليكوجين. تم إجراء تحليل طول السلسلة على ستة أكباد لكل من المغلي وغير المغلي باستخدام تركيزات السكروز 30٪ و 50٪ و 72.5٪ في خطوة الطرد المركزي الفائق. تمثل قيم كل DP متوسط ± SD (N = 6). (أ) الجليكوجين المستخرج بنسبة 30٪ من السكروز ، مسلوق أو غير مسلوق ؛ ب: الجليكوجين المستخرج بنسبة 50٪ من السكروز، المغلي أو غير المغلي؛ ج: الجليكوجين المستخلص بنسبة 72.5٪ من السكروز، المغلي أو غير المغلي. تم تكييف هذا الرقم من21. الاختصار: Nde (X) = توزيع طول السلسلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| العائد الخام (٪) | نقاء (٪) | محصول الجليكوجين (٪) | |
| 30٪ سكروز - ج | 2.1 ± 1.0أمبير | 13.1 ± 12.0ب | 10.7 ± 9.1أمبير |
| 50٪ سكروز سي | 1.2 ± 0.7أمبير | 23.3 ± 20.1ب | 10.2 ± 8.1أمبير |
| 72.5٪ سكروز - ج | 1.9 ± 0.8أمبير | 9.8 ± 9.0 ب | 5.3 ± 2.4أمبير |
| 30٪ سكروز ب | 0.8 ± 0.4أمبير | 67.9 ± 16.8أمبير | 16.0 ± 5.1أمبير |
| 50٪ سكروز ب | 1.1 ± 0.6أمبير | 48.6 ± 16.9أمبير | 14.8 ± 7.6أمبير |
| 72.5٪ سكروز ب | 2.0 ± 0.9أمبير | 14.7 ± 12.6ب | 6.9 ± 3.7أمبير |
| اتجاهين ANOVA | السكروز: ف = 0.053 | السكروز: P < 0.001 | السكروز: ف = 0.034 |
| درجة الحرارة: P = 0.108 | درجة الحرارة: P < 0.0001 | درجة الحرارة: P = 0.116 | |
| التفاعل: P = 0.11 | التفاعل: ف = 0.003 | التفاعل: ف = 0.801 |
الجدول 1: النقاء ، العائد الخام ، محصول الجليكوجين. العائد الخام والنقاء وإنتاجية الجليكوجين لعينات الجليكوجين في الكبد المستخرجة بنسبة 30٪ أو 50٪ أو 72.5٪ سكروز مسلوق أو غير مسلوق. - تم استخراج العينات بواسطة المخزن المؤقت البارد ؛ -b تم استخراج العينات عن طريق الغليان لمدة 10 دقائق. يتم إعطاء القيم كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) ، n = 6. الاختلافات في القيم ذات الأحرف المرتفعة المختلفة في نفس العمود ذات دلالة إحصائية (P < 0.05). تم استنساخ هذا الجدول بإذن من21.
|
يعني Rh ، ماكس | محتوى β | متوسط ACL | |
| 30٪ سكروز - ج | 29.4 ± 1.5ب | 34.9 ± 0.6أمبير | 40.9 ± 6.2٪أ,ب | 4.8 ± 0.5ج |
| 50٪ سكروز سي | 32.0 ± 1.1أ,ب | 36.1 ± 0.5أمبير | 28.5 ± 3.0٪ ب ، ج | 5.6 ± 1.1ب,ج |
| 72.5٪ سكروز - ج | 34.3 ± 1.8أمبير | 36.2 ± 0.4أمبير | 23.7 ± 3.5٪ ج | 4.7 ± 0.9ج |
| 30٪ سكروز ب | 29.4 ± 1.2ب | 33.7 ± 3.1أمبير | 43.1 ± 5.1٪أ | 8.6 ± 1.8أمبير |
| 50٪ سكروز ب | 30.1 ± 1.2ب | 34.9 ± 0.7أمبير | 36.0 ± 7.2٪أ,ب,ج | 8.8 ± 1.7أمبير |
| 72.5٪ سكروز ب | 30.9 ± 3.5أ,ب | 33.6 ± 3.5أمبير | 34.0 ± 13.1٪ أ ، ب ، ج | 7.6 ± 1.9أ,ب |
| اتجاهين ANOVA | السكروز: ف = 0.002 | السكروز: ف = 0.442 | السكروز: P < 0.001 | السكروز: ف = 0.290 |
| درجة الحرارة: P = 0.010 | درجة الحرارة: P = 0.032 | درجة الحرارة: P = 0.016 | درجة الحرارة: P < 0.0001 | |
| التفاعل: P = 0.431 | التفاعل: P = 0.640 | التفاعل: ف = 0.441 | التفاعل: P = 0.750 |
الجدول 2: و Rh الذي يحدث فيه الحد الأقصى (Rh ، max) ومتوسط طول السلسلة (ACL). و Rh الذي يحدث فيه الحد الأقصى (Rh ، max) ، β محتوى الجسيمات ، ومتوسط طول السلسلة (ACL) من الجليكوجين المستخرج إما بنسبة 30٪ أو 50٪ أو 72.5٪ سكروز مسلوق أو غير مسلوق. -ج غير مسلوق ؛ -b ينطوي على خطوة الغليان 10 دقائق. الاختلافات في القيم ذات الأحرف المرتفعة المختلفة في نفس العمود ذات دلالة إحصائية (P < 0.05). تم استنساخ هذا الجدول بإذن من 21. الاختصارات: Rh = نصف القطر الهيدروديناميكي ؛ = ; ACL = متوسط طول السلسلة ؛ Rh ، max = Rh الذي يحدث فيه الحد الأقصى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن بنية الجليكوجين مهمة لخصائصه. على سبيل المثال ، يؤثر الحجم الجزيئي على معدل تحلل الجليكوجين10 ، ويؤثر توزيع طول السلسلة على قابليته للذوبان26. لفهم هذه العلاقات بشكل صحيح ، من المهم استخراج الجليكوجين بإجراء يعزل ، قدر الإمكان ، عينة تمثيلية وغير تالفة. تستخدم الطرق التقليدية للاستخراج إما الظروف القلوية الساخنة أو الحمض البارد. في حين أن هذه الطرق فعالة في فصل الجليكوجين عن مكونات الأنسجة الأخرى ، إلا أنها قاسية كيميائيا وقد ثبت أنها تؤدي إلى تدهور التركيب الجزيئي للجليكوجين27.
منذ ذلك الحين تم تطوير طريقة لطيفة نسبيا تستخدم الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز17,18 ، مما يسمح للجليكوجين بالتشكل في الحبيبات بينما تظل معظم مادة الخلية في المادة الطافية. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لأنسجة الكبد ، حيث تكون جزيئات الجليكوجين α حساسة للتحلل المائيالحمضي 28. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة الأكثر اعتدالا لديها آليتان محتملتان على الأقل لعزل الجليكوجين المتباعد في البنية عن تلك التي تظهر في الجسم الحي: 1) جزيئات الجليكوجين الأصغر والأقل كثافة أكثر عرضة للترك في المادة الطافية أثناء الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز17,18 ، لأنها قد لا تكون قادرة على الوصول إلى الحبيبات. 2) قد تسمح الظروف الأكثر اعتدالا لإنزيمات تحلل الجليكوجين ، والتي قد يتم تشويهها في ظروف الاستخراج القلوية / الحمضية الأكثر قسوة ، بالاستمرار في تحلل جزيئات الجليكوجين أثناء الاستخراج.
يهدف منشور حديث21 إلى المساعدة في حل هذه المشكلات المحتملة عن طريق اختبار سلسلة من تركيزات السكروز (وبالتالي الكثافات) ، ووجد أن استخدام تركيز 30٪ ، على عكس 72.5٪ المستخدم تقليديا ، ساعد في تقليل فقدان جزيئات الجليكوجين الأصغر. يمكن للتجارب المستقبلية اختبار تركيزات أقل لمعرفة ما إذا كانت بعض الجسيمات الأصغر لا تزال تفقد بشكل تفضيلي في المادة الطافية أثناء الطرد المركزي. اختبر هذا المنشور أيضا فعالية إدخال خطوة الغليان لمدة 10 دقائق مباشرة بعد تجانس الأنسجة لتشويه إنزيمات تحلل الجليكوجين ، وبالتالي الحفاظ على بنية الجليكوجين. وقد تبين أن هذه الخطوة ساعدت في منع تدهور الجليكوجين ، مع الحفاظ على أطوال سلسلة الجليكوجين بشكل كبير. قدمت تجارب أخرى في هذه الدراسة دليلا على أن خطوة الغليان هذه لمدة 10 دقائق من غير المرجح أن تسبب أضرارا كبيرة لبنية الجليكوجين. ومع ذلك ، قد تؤثر خطوة الغليان هذه على بنية البروتينات المرتبطة بالجليكوجين ، مما قد يؤدي إلى تمسخ البروتينات وتفككها لاحقا عن الجليكوجين. لذلك ، إذا كانت البروتينات ذات أهمية ، فقد يكون من الأفضل استخدام تركيز السكروز المنخفض (30٪) دون غليان (العينات المحفوظة على الجليد) ، مع التحذير من أن الجليكوجين قد يتحلل قليلا.
عند استخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز دون مزيد من تجارب التحسين ، فإن الطريقة الأنسب هي استخدام تركيز منخفض نسبيا من السكروز (30٪) مع إدخال خطوة غليان مدتها 10 دقائق مباشرة بعد تجانس الأنسجة. هناك بعض القيود على هذه التقنية. أولا ، تم تحسين هذا للجليكوجين في الكبد ، ومن المهم ملاحظة أنه قد لا يكون مناسبا للجليكوجين من الأنسجة الأخرى. ثانيا ، كما ذكر أعلاه ، كان أقل تركيز للسكروز الذي تم اختباره هو 30٪ ، ومن الممكن أن تكون التركيزات المنخفضة هي الأفضل. ثالثا ، لا تتوفر بعد تقنية محسنة تمنع التدهور الأنزيمي للجليكوجين مع الحفاظ على البروتين المرتبط به.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
ويعرب المؤلفان عن امتنانهما للسيد غاوشينغ وو والآنسة يونوين تشو على المساعدة التقنية التي قدمها مع FACE والسيد زينشيا هو والسيد دنغبين للمساعدة التقنية مع لجنة الأوراق المالية والبورصات. ويدعم ماس زمالة كوينزلاند المتقدمة لبحوث الصناعة، ومؤسسة ماتر، وأمناء الأسهم، ومؤسسة إل جي ماكالام إست وجورج ويبر تراستس. تم دعم هذا العمل من خلال البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو ، ومنحة مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية C1304013151101138 ، وبرنامج مواهب جيانغسو للابتكار وريادة الأعمال لعام 2017. تم إنشاء الشكل 1-5 باستخدام BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M solution |
| Acetic acid | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 solution |
| Agilent 1260 Infinity SEC system | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| BKS-DB/Nju background mice | Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenizer | IKA | T 25 | |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| P/ACE MDQ plus system | Ab Sciex, US | Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) | |
| Refractive index detector | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Sodium acetate | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4.5 solution |
| Sodium azide | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Sodium cyanoborohydride | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Sodium fluoride | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Sodium hydroxide | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M solution |
| Sodium nitrate | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Sodium pyrophosphate | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm |
References
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
- Drochmans, P. Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
- Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
- Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
- Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
- Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
- Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
- Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
- Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526 (2020).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
- Ryu, J. -H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
- Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
- Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887 (2020).
- Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch - Starke. 72, 1900214 (2020).
- Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
- Kerly, M.
- Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
- Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
- Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
- Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).
