Summary
En optimal sackaroskoncentration bestämdes för extraktion av leverglykogen med hjälp av sackarosdensitetsgradientcentrifugering. Tillsatsen av ett 10 minuters koksteg för att hämma glykogennedbrytande enzymer visade sig vara fördelaktigt.
Abstract
Leverglykogen är en hypergrenad glukospolymer som är involverad i upprätthållandet av blodsockernivån hos djur. Glykogenets egenskaper påverkas av dess struktur. Därför är en lämplig extraktionsmetod som isolerar representativa prover av glykogen avgörande för studien av denna makromolekyl. Jämfört med andra extraktionsmetoder kan en metod som använder ett sackarosdensitetsgradientcentrifugeringssteg minimera molekylära skador. Baserat på denna metod beskriver en nyligen publicerad publikation hur densiteten hos sackaroslösningen som användes under centrifugeringen varierades (30 %, 50 %, 72,5 %) för att hitta den mest lämpliga koncentrationen för att extrahera glykogenpartiklar av en mängd olika storlekar, vilket begränsar förlusten av mindre partiklar. Ett 10 minuters kokningssteg infördes för att testa dess förmåga att denaturera glykogennedbrytande enzymer och därmed bevara glykogen. Den lägsta sackaroskoncentrationen (30 %) och tillsatsen av kokningssteget visade sig extrahera de mest representativa proverna av glykogen.
Introduction
Glykogen är en komplex, hypergrenad polymer av glukos som finns i djur, svampar och bakterier1. Hos däggdjur fungerar leverglykogen som en blodsockerbuffert och bevarar homeostas, medan muskelglykogen fungerar som en kortvarig glukosreservoar för att ge energi direkt2. Glykogenets struktur beskrivs ofta med tre nivåer (visas i figur 1): 1. Linjära kedjor bildas av glukosmonomerer via (1→4)-α glykosidbindningar, med förgreningspunkter som är anslutna via (1→6)-α glykosidbindningar; 2. Starkt förgrenade β partiklar (~20 nm i diameter) som, särskilt i vävnader som skelettmuskulatur, fungerar som oberoende glykogenmolekyler 3,4. 3. Större α glykogenpartiklar (upp till 300 nm i diameter) som består av mindre β glykogenenheter, som finns i levern5, hjärtat6 och i vissa icke-däggdjursarter7. Lever α partiklar från diabetiska möss är molekylärt ömtåliga, med en benägenhet att brytas ned till β-partiklar när de löses i dimetylsulfoxid (DMSO), medan α partiklar från icke-diabetiska kontroller i allmänhet förblir oförändrade. En hypotes är att denna bräcklighet kan förvärra den dåliga blodsockerbalansen som ses vid diabetes, där de sköra α partiklarna potentiellt resulterar i högre andelar av den snabbare nedbrutna β partikel 8,9,10,11.
Traditionella glykogenextraktionsmetoder utnyttjar de relativt hårda förhållandena för att exponera levervävnaden för het alkalisk lösning12 eller sura lösningar såsom triklorättiksyra (TCA)13 eller perklorsyra (PCA)14. Även om dessa metoder är effektiva för att separera glykogenet från andra komponenter i levervävnaden, bryter dessa metoder oundvikligen ned glykogenstrukturen iviss utsträckning. Även om dessa metoder är lämpliga för kvantitativ mätning av glykogenhalten, är de inte idealiska för studier som fokuserar på att få strukturell information om glykogenet på grund av denna strukturella skada. Sedan utvecklingen av dessa metoder har en mildare extraktionsprocedur utvecklats som använder kall Tris-buffert (som visat sig hämma glukosidasnedbrytning) med sackarosdensitetsgradientultracentrifugering 17,18,19. Med pH kontrollerat vid ~8 utsätter denna metod inte glykogenet för den sura eller alkaliska hydrolys som setts i tidigare procedurer.
Ultracentrifugering av homogeniserad levervävnad med sackarosdensitet kan separera glykogenpartiklar från majoriteten av cellmaterialet. Vid behov kan ytterligare rening utföras genom preparativ storleksuteslutningskromatografi, vilket resulterar i insamling av renat glykogen med bifogade glykogenassocierande proteiner20. Även om denna metod, med mildare förhållanden, är mer benägen att bevara glykogenets struktur, är det svårt att förhindra att en del av glykogenet går förlorat i supernatanten, särskilt mindre glykogenpartiklar som är mindre täta15. En annan potentiell orsak till glykogenförlust är att de mildare förhållandena tillåter viss enzymatisk nedbrytning, vilket resulterar i lägre glykogenutbyten jämfört med hårdare extraktionsmetoder. Ny forskning rapporterade optimering av lever-glykogenextraktionsmetoden för att bevara strukturen hos glykogen21. Här testades olika sackaroskoncentrationer (30 %, 50 %, 72,5 %) för att avgöra om lägre sackaroskoncentrationer minimerade förlusten av mindre glykogenpartiklar. Motiveringen var att den lägre densiteten skulle göra det möjligt för mindre, mindre täta partiklar att tränga in i sackaroslagret och aggregera i pelleten med resten av glykogenet.
I denna studie jämfördes extraktionsmetoderna med och utan 10 minuters koksteg för att testa om glykogennedbrytningsenzymer kunde denatureras, vilket resulterade i extraktion av mer glykogen som dessutom var fritt från partiell nedbrytning. Fördelningar av hela molekylstorleken och glykogenkedjans längdfördelningar användes för att bestämma strukturen hos det extraherade glykogenet, liknande en stärkelseextraktionsoptimering som publicerats tidigare22. Storleksuteslutningskromatografi (SEC) med differentiellt brytningsindex (DRI) detektion användes för att erhålla storleksfördelningarna av glykogen, som beskriver den totala molekylvikten som en funktion av molekylstorleken. Fluoroforassisterad kolhydratelektrofores (FACE) användes för att analysera kedjelängdsfördelningarna, som beskriver det relativa antalet glukosidkedjor av varje given storlek (eller polymerisationsgrad). Denna artikel beskriver metodiken för att extrahera glykogen från levervävnad baserat på den tidigare optimeringsstudien21. Data tyder på att den metod som är mest lämpad för att bevara glykogenstrukturen är en sackaroskoncentration på 30 % med ett koksteg på 10 minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muslever som användes för att optimera denna procedur21 var från 12 BKS-DB/Nju-bakgrundsmöss av hankön (7,2 veckor gamla, se materialtabellen). Djuranvändning godkändes av Renmin Hospital of Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM-20181113.
1 Vävnader från djur
- Väg muslever (1-1,8 g hel lever från varje mus).
- Frys muslevern snabbt i flytande kväve och förvara den vid -80 °C.
2. Beredning av buffert och reagenser
- Förbered glykogenisoleringsbuffert innehållande 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF och 5 mM natriumpyrofosfat med avjoniserat vatten och justera pH till 8.
- Bered 30 % (vikt/vikt) sackaroslösning (har visat sig vara mest optimal för glykogen21 i levern).
- Bered natriumacetatbuffert (1 M, pH 4,5), ättiksyrabuffert (0,1 M, pH 3,5), natriumhydroxidlösning (0,1 M) och natriumcyanoborhydrid (1 M).
- Bered 8-aminopyren-1,3,6-trisulfonatlösning (APTS) genom att tillsätta 5 mg APTS till 50 μl 15 % isättika.
- Bered ammoniumnitratlösning innehållande 50 mM ammoniumnitrat med 0,02 % natriumazid.
3. Extraktion av glykogen (figur 2)
- Överför den frysta levervävnaden (~1 g) till ett 15 ml rör som innehåller 6 ml glykogenisoleringsbuffert.
- Håll den på is, homogenisera levervävnaden med hjälp av en vävnadshomogenisator.
- Överför hälften av suspensionen (3 ml) till ett nytt rör och koka i 10 minuter (visat sig vara optimalt för glykogenstrukturstudier21). Håll den andra halvan av suspensionen (3 ml) på is för att extrahera glykogen som innehåller associerade proteiner som inte är denaturerade.
OBS: Okokta samples ska alltid förvaras på is under glykogenextraktionsstegen. Om glykogenproteiner inte är viktiga för studien kan hela provet genomgå koksteget på 10 minuter. - Ta bort en 8 μl alikvot från varje rör, lägg alikvoter på is och använd dem för bestämning av glykogenhalten (se avsnitt 4).
- Centrifugera resten av suspensionen vid 6 000 × g i 10 minuter vid 4 °C.
- Överför supernatanterna till ultracentrifugrör och centrifugera dem vid 3,6 × 105 g i 90 minuter vid 4 °C.
- Kassera de återstående supernatanterna och återsuspendera pelletsen i 1,5 ml glykogenisoleringsbuffert.
- Skikta proverna över 1,5 ml 30 % sackaroslösning i 4 ml ultracentrifugrör och centrifugera vid 3,6 × 105 g i 2 timmar vid 4 °C.
- Kassera de återstående supernatanterna och återsuspendera pelletsen i 200 μl avjoniserat vatten.
- Tillsätt 800 μl absolut etanol till suspensionerna och blanda väl så att glykogen23,24 fälls ut. Förvara blandningarna vid -20 °C i minst 1 timme så att de kan fällas ut.
- Centrifugera proverna vid 6 000 × g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanterna och återsuspendera pelletsen i 200 μl avjoniserat vatten.
- Upprepa denna etanolutfällningsprocess 3 gånger och återsuspendera den slutliga glykogenpelleten i 200 μL avjoniserat vatten.
- Avlägsna en alikvot på 8 μl från varje rör för bestämning av glykogenhalten (se avsnitt 4).
- Frys de återstående supernatanterna i flytande kväve och frystorka (frystorka) över natten. Förvara de torra glykogenproverna i frysen vid -20 °C.
OBS: De torra glykogenproverna ska vara stabila vid -20 °C; Det finns dock inga uppgifter som anger hur länge de varar utan några strukturella förändringar.
4. Bestämning av glykogeninnehåll (figur 3)
- Tillsätt 8 μl glykogensupernatanter (se avsnitt 3.13 och 3.4), 5 μl amyloglukosidas (3269 E/ml) och 100 μl natriumacetatbuffert (1 M, pH 4,5) till ett mikrocentrifugrör och fyll röret till 500 μL-märket med avjoniserat vatten.
- Förbered kontroller som använder avjoniserat vatten istället för amyloglukosidas.
- Inkubera proverna vid 50 °C i 30 minuter medan reglagen hålls på is.
- Centrifugera vid 6 000 × g vid 4 °C i 10 minuter och blanda 300 μl av varje erhållen supernatant med 1 ml glukosidasoxidas/peroxidas (GOPOD)-reagens.
- Konstruera en kalibreringskurva genom att blanda 300 μL avjoniserat vatten innehållande 0, 10, 20, 30, 40 och 50 μg D-glukos med 1 ml GOPOD-reagens.
- Inkubera blandningarna vid 50 °C i ytterligare 30 minuter.
- Läs av absorbansen (510 nm) för varje prov med hjälp av 96-hålsplattor (150 μL per brunn) med hjälp av en UV-vis-spektrofotometer.
- Subtrahera absorbanserna för kontrollprover (utan amyloglukosidas) från absorbanserna för experimentella prover och beräkna sedan glykogenhalten baserat på standardkurvan för D-glukos.
5. Råutbyte, glykogenutbyte och renhetsbestämning
- För råutbytet, väg det frystorkade glykogenprovet och beräkna utbytet i procent av den våta levervävnaden.
OBS: Detta utbyte bör justeras för att korrigera för de alikvoter som tas i varje glykogenhaltssteg. - För glykogenrenhet, bestäm glykogenhalten i de slutliga pelletsen, enligt beskrivningen i avsnitt 4. Beräkna renheten i procent av den fastställda glykogenhalten i förhållande till råutbytet (se steg 5.1).
- För glykogenutbytet bestäms glykogenhalten i de homogeniserade proverna utan kokning och före centrifugering, enligt beskrivningen i avsnitt 4. Beräkna glykogenutbytet i procent av glykogenhalten i de slutliga pelletarna (se steg 5.2) till glykogenhalten i det ursprungliga homogenatet.
6. Analys av kedjelängdsfördelningar (figur 4)
- Väg upp 0,5 mg frystorkat glykogen i 1,5 ml rör.
- Tillsätt 90 μL avjoniserat vatten och 1,5 μL natriumazid (0,04 g/ml) till rören.
- Tillsätt 5 μl ättiksyrabuffert (0,1 M, pH 3,5) och 2 μL isoamylaslösning (180 E/mg) till rören för att avgrena glykogenet.
- Inkubera proverna vid 37 °C i 3 timmar.
- Tillsätt 5 μl natriumhydroxidlösning (0,1 M) till proverna för att öka pH-värdet till 7,0.
- Frys proverna i flytande kväve och frystorka (frystorka) över natten.
- Tillsätt 2 μl APTS-lösning (5 mg APTS i 50 μl 15 % isättika) och 2 μl natriumcyanoborhydrid (1 M) till det frystorkade avgrenade glykogenet.
- Centrifugera proverna vid 4 000 × g i 2 minuter.
- Inkubera proverna vid 60 °C i 3 timmar i mörker.
OBS: Röret kan täckas med aluminiumfolie för att skydda innehållet från ljus. - Tillsätt 200 μl avjoniserat vatten till proverna och virvla dem tills all fällning har lösts upp.
- Centrifugera proverna vid 4 000 × g i 2 minuter.
- Överför alikvoter på 50 μl till mikroampuller med fluoroforassisterad kolhydratelektrofores (FACE) för analys.
ANM.: Data visas som den relativa förekomsten av (avgrenade) kedjor (Nde(X)) för varje polymerisationsgrad (DP, symbol X).
7. Analys av molekylstorleksfördelningar (figur 5)
- Lös 0,5 mg frystorkat glykogen i 50 mM ammoniumnitrat och 0,02 % natriumazid vid 1 mg/ml.
- Inkubera proverna i en termomixer vid 80 °C i 3 timmar vid 300 varv per minut.
- Injicera proverna i ett SEC-system med hjälp av en förkolonn och 1000 Å och 10 000 Å kolonner vid 80 °C med en flödeshastighet på 0,3 ml/min (se materialtabellen). Använd en brytningsindexdetektor för att bestämma molekylernas relativa vikt vid varje elueringsvolym.
- Använd pullulanstandarder (PSS) med molmassor från 342 till 1,22 × 106, plotta en SEC universell kalibreringskurva för att omvandla elueringstiden till Rh (hydrodynamisk radie). Uttryck data från detektorn för differentiellt brytningsindex (DRI) som en SEC-viktfördelning w (log Rh) som en funktion av Rh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medan det förfarande som beskrivs ovan är för den mest optimala metoden (30 % sackaros med tillsats av ett koksteg på 10 minuter), tillhandahålls här data för glykogen extraherat via tre sackaroskoncentrationer (30 %, 50 %, 72,5 %), med och utan kokningssteg, som tidigare beskrivits21. I enlighet med protokollet anges renheten, råutbytet och glykogenutbytet för torrt glykogen som extraherats under olika betingelser i tabell 1, reproducerad från21. Det fanns inga signifikanta skillnader i rå- och glykogenutbyte mellan de grupper som extraherades med de olika betingelserna. Däremot påverkades glykogenrenheten signifikant av både sackaroskoncentrationerna (tabell 1, P < 0,001) och av tillsatsen av ett koksteg (tabell 1, P < 0,0001). Glykogen med högsta renhet extraherades med hjälp av 30 % sackaroskoncentration tillsammans med ett koksteg på 10 minuter, vilket är anledningen till att det bestämdes vara det mest optimala av de testade förhållandena.
Molekylstorleksfördelningar användes för att bedöma effekterna av de olika betingelserna på storleken på molekylerna i det slutliga extraktet. Dessa erhölls med hjälp av ett vattenhaltigt SEC-system, som beskrivits tidigare25. Genom att normalisera varje fördelning till samma maximala värde kunde den relativa andelen α till β partiklar jämföras från varje metod, som visas i figur 6, reproducerad från21. Rh vid vilket maxima inträffar (Rh,max) och medelvärdet Rh (
) visas i tabell 2, återgivna från21. Glykogenmolekyler med Rh < 30 nm definierades som β partiklar11. Den β partikelhalten beräknades som arean under kurvan (AUC) för (R h < 30 nm)/AUC (total Rh). De kokta proverna hade lägre medelvärden för Rh och en högre β partikelhalt än de okokta proverna (Tabell 2, P < 0,05). Lägre sackaroskoncentrationer resulterade i lägre värden och högre β partikelhalter (tabell 2, P <0,05). Införandet av ett koksteg ledde också till lägre Rh,max-värden (tabell 2, P<0,05), medan sackaroskoncentrationen inte hade någon signifikant effekt.
Kedjelängdsfördelningar (CLD) ger det relativa antalet kedjor av varje given längd (antal anslutna glukosenheter eller polymerisationsgrad), som erhålls med FACE. CLD:erna visas i figur 7, återgivna med hjälp av data från21. Den numeriska genomsnittliga kedjelängden (ACL) beräknades som (ΣX X Nde(X))/ (ΣX Nde(X)) (tabell 2). ACL för okokta prover var signifikant mindre och mer varierade än för de kokta proverna (Tabell 2, P < 0,05). Sackaroskoncentrationen påverkade dock inte ACL:erna signifikant. Detta stödde hypotesen att kokning av proverna i 10 minuter som ett förextraktionssteg skulle bevara glykogenstrukturen. Den föreslagna mekanismen är denaturering av glykogennedbrytande enzymer.
Figur 1: De tre nivåerna av glykogenstruktur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Glykogenextraktionsprocess. Steg för att extrahera och rena glykogenet från muslever. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bestämning av glykogenhalt. Steg för att bestämma glykogenhalten i leverhomogenat, renat torrt glykogen eller glykogenlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av kedjelängdsfördelningar. Steg för att analysera kedjelängdsfördelningar med ett fluoroforassisterat kolhydratelektroforessystem. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Analys av molekylstorleksfördelningar. Steg för att analysera molekylstorleksfördelningarna med ett vattenhaltigt storleksuteslutningskromatografisystem. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: SEC-viktfördelningar av hela (ej avgrenade) leverglykogen från möss. Extraktionen utfördes under olika förhållanden, normaliserade för att ha samma maximum i w(log Rh). Varje leverhomogenat delades upp i sex lika stora volymer, och glykogen extraherades med antingen 30 %, 50 % eller 72,5 % sackaros, kokt eller okokt. Kurvor representerar medelvärdet vid en given Rh med SD på vardera sidan av huvudlinjen (n = 4-6 med samplingar som har otillräcklig signal till brus som tas bort). A) Glykogen extraherat med 30 % sackaros, kokt eller okokt. B) Glykogen extraherat med 50 % sackaros, kokt eller okokt. C) Glykogen extraherat med 72,5 % sackaros, kokt eller okokt. Denna siffra anpassades från21. Förkortningar: SEC = storleksuteslutningskromatografi; SD = standardavvikelse; Rh = hydrodynamisk radie, w(log Rh) = SEC-viktfördelning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Kedjelängdsfördelningar, Nde(X), för glykogen. Kedjelängdsanalys utfördes på sex lever, både kokta och okokta, med sackaroskoncentrationer på 30 %, 50 % och 72,5 % i ultracentrifugeringssteget. Värdena för varje DP representerar medelvärdet ± SD (N = 6). A) Glykogen extraherat med 30 % sackaros, kokt eller okokt. B) Glykogen extraherat med 50 % sackaros, kokt eller okokt. C) Glykogen extraherat med 72,5 % sackaros, kokt eller okokt. Denna siffra anpassades från21. Förkortning: Nde(X) = kedjans längdfördelning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Råoljeavkastning (%) | Renhet (%) | Glykogenutbyte (%) | |
| 30% Sackaros-c | 2,1 ± 1,0a | 13,1 ± 12,0b | 10,7 ± 9,1A |
| 50% Sackaros-c | 1,2 ± 0,7a | 23,3 ± 20,1b | 10,2 ± 8,1A |
| 72,5% Sackaros-c | 1,9 ± 0,8a | 9,8 ± 9,0 b | 5,3 ± 2,4a |
| 30% Sackaros-b | 0,8 ± 0,4a | 67,9 ± 16,8A | 16,0 ± 5,1a |
| 50% Sackaros-b | 1,1 ± 0,6A | 48,6 ± 16,9a | 14,8 ± 7,6a |
| 72,5 % Sackaros-b | 2,0 ± 0,9A | 14,7 ± 12,6b | 6,9 ± 3,7a |
| Tvåvägs ANOVA | Sackaros: P = 0,053 | Sackaros: P < 0,001 | Sackaros: P = 0,034 |
| Temperatur: P = 0,108 | Temperatur: P < 0,0001 | Temperatur: P = 0,116 | |
| Interaktion: P = 0,11 | Interaktion: P = 0,003 | Interaktion: P = 0,801 |
Tabell 1: Renhetsgrad, råoljeutbyte, glykogenutbyte. Råutbyte, renhet och glykogenutbyte för leverglykogenprover extraherade med 30 %, 50 % eller 72,5 % sackaros, kokt eller okokt. -c var prover som extraherats med kall buffert; -b var prover som extraherades genom kokning i 10 minuter. Värdena anges som medelvärdet ± standardavvikelsen (SD), n = 6. Skillnader i värden med olika upphöjda bokstäver i samma kolumn är statistiskt signifikanta (P < 0,05). Denna tabell återges med tillstånd från21.
|
Medelvärde Rh,max | β innehåll | Genomsnittlig ACL | |
| 30% Sackaros-c | 29,4 ± 1,5b | 34,9 ± 0,6A | 40,9 ± 6,2 %a,b | 4,8 ± 0,5hp |
| 50% Sackaros-c | 32,0 ± 1,1a,b | 36,1 ± 0,5A | 28,5 ± 3,0 %b,c | 5.6 ± 1.1b,c |
| 72,5% Sackaros-c | 34,3 ± 1,8A | 36,2 ± 0,4A | 23,7 ± 3,5%c | 4,7 ± 0,9hp |
| 30% Sackaros-b | 29,4 ± 1,2b | 33,7 ± 3,1a | 43,1 ± 5,1 %a | 8,6 ± 1,8a |
| 50% Sackaros-b | 30,1 ± 1,2b | 34,9 ± 0,7A | 36,0 ± 7,2%a,b,c | 8,8 ± 1,7a |
| 72,5 % Sackaros-b | 30,9 ± 3,5a,b | 33,6 ± 3,5A | 34,0 ± 13,1%a,b,c | 7,6 ± 1,9a,b |
| Tvåvägs ANOVA | Sackaros: P = 0,002 | Sackaros: P = 0,442 | Sackaros: P < 0,001 | Sackaros: P = 0,290 |
| Temperatur: P = 0,010 | Temperatur: P = 0,032 | Temperatur: P = 0,016 | Temperatur: P < 0,0001 | |
| Interaktion: P = 0,431 | Interaktion: P = 0,640 | Interaktion: P = 0,441 | Interaktion: P = 0,750 |
Tabell 2: och Rh vid vilken maxima inträffar (Rh,max) och genomsnittlig kedjelängd (ACL). och Rh vid vilken maxima inträffar (Rh,max), β partikelhalt och genomsnittlig kedjelängd (ACL) för glykogen extraherat med antingen 30 %, 50 % eller 72,5 % sackaros, kokt eller okokt. -c okokt; -b innebar ett koksteg på 10 minuter. Skillnader i värden med olika upphöjda bokstäver i samma kolumn är statistiskt signifikanta (P < 0,05). Denna tabell återges med tillstånd från 21. Förkortningar: Rh = hydrodynamisk radie; = ; ACL = genomsnittlig kedjelängd; Rh,max = Rh vid vilket maxima inträffar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare studier har visat att glykogenets struktur har betydelse för dess egenskaper; Till exempel påverkar molekylstorleken nedbrytningshastigheten för glykogen10, och kedjelängdsfördelningen påverkar dess löslighet26. För att korrekt förstå dessa samband är det viktigt att extrahera glykogen med en procedur som isolerar så mycket som möjligt ett representativt och oskadat prov. Traditionella extraktionsmetoder använde antingen heta alkaliska förhållanden eller kall syra. Även om dessa metoder är effektiva för att separera glykogenet från andra vävnadskomponenter, är de kemiskt hårda och har visat sig bryta ned den molekylära strukturen hos glykogen27.
En relativt skonsam metod har sedan dess utvecklats som använder sackarosdensitetsgradientcentrifugering 17,18, vilket gör att glykogen bildas i pelleten medan det mesta av cellmaterialet stannar kvar i supernatanten. Denna metod är särskilt användbar för levervävnad, där glykogen α partiklar är känsliga för sur hydrolys28. Denna mildare metod har dock åtminstone två potentiella mekanismer för isolering av glykogen som avviker i struktur från den som ses in vivo: 1) mindre, mindre täta glykogenpartiklar är mer mottagliga för att lämnas kvar i supernatanten under sackarosdensitetsgradientcentrifugering17,18, eftersom de kanske inte kan nå pelleten; 2) De mildare förhållandena kan göra det möjligt för glykogennedbrytningsenzymer, som skulle denatureras under de hårdare alkaliska/syraextraktionsförhållandena, att fortsätta att bryta ned glykogenpartiklar under extraktionen.
En nyligen publiceradpublikation 21 syftade till att hjälpa till att lösa dessa potentiella problem genom att testa en serie sackaroskoncentrationer (och därmed densiteter), och fann att användning av en koncentration på 30 %, i motsats till de traditionellt använda 72,5 %, bidrog till att minimera förlusten av mindre glykogenpartiklar. Framtida experiment skulle kunna testa ännu lägre koncentrationer för att se om några mindre partiklar fortfarande företrädesvis förloras i supernatanten under centrifugeringen. Denna publikation testade också effektiviteten av att införa ett 10 minuters kokningssteg direkt efter vävnadshomogenisering för att denaturera glykogennedbrytningsenzymerna och därigenom bevara glykogenstrukturen. Det visade sig att detta steg hjälpte till att hämma glykogennedbrytningen, och att glykogenkedjans längder bevarades avsevärt. Ytterligare experiment i denna studie gav bevis för att detta 10 minuters kokningssteg sannolikt inte skulle orsaka betydande skada på glykogenstrukturen. Detta kokningssteg kan dock påverka strukturen hos glykogenassocierade proteiner, vilket kan leda till denaturering och efterföljande dissociation av proteiner från glykogenet. Därför, om proteomik är av intresse, kan det vara att föredra att använda den låga sackaroskoncentrationen (30 %) utan kokning (prover som förvaras på is), med förbehållet att glykogenet kan brytas ned något.
Vid användning av sackarosdensitetsgradientcentrifugering utan ytterligare optimeringsexperiment är den lämpligaste metoden att använda en relativt låg koncentration av sackaros (30%) med införande av ett 10 minuters kokningssteg direkt efter vävnadshomogenisering. Det finns vissa begränsningar för denna teknik. För det första optimerades detta för leverglykogen, och det är viktigt att notera att det kanske inte är lika lämpligt för glykogen från andra vävnader. För det andra var den lägsta sackaroskoncentrationen som testades 30 procent, som nämnts ovan, och det är möjligt att lägre koncentrationer kan vara att föredra. För det tredje finns det ännu ingen optimerad teknik som förhindrar enzymatisk nedbrytning av glykogen samtidigt som det associerade proteomet bevaras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma mot Gaosheng Wu och Yunwen Zhu för teknisk hjälp med FACE och Zhenxia Hu och Dengbin för teknisk hjälp med SEC. MAS stöds av ett Advance Queensland Industry Research Fellowship, Mater Foundation, Equity Trustees och L G McCallam Est och George Weaber Trusts. Detta arbete stöddes av det prioriterade akademiska programmet för Jiangsu Higher Education Institutions, ett bidrag från Natural Science Foundation of China C1304013151101138 och 2017 Jiangsu Innovation and Entrepreneurship talents program. Figur 1-5 skapades med hjälp av BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M solution |
| Acetic acid | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 solution |
| Agilent 1260 Infinity SEC system | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| BKS-DB/Nju background mice | Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenizer | IKA | T 25 | |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| P/ACE MDQ plus system | Ab Sciex, US | Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) | |
| Refractive index detector | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Sodium acetate | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4.5 solution |
| Sodium azide | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Sodium cyanoborohydride | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Sodium fluoride | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Sodium hydroxide | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M solution |
| Sodium nitrate | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Sodium pyrophosphate | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm |
References
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
- Drochmans, P. Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
- Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
- Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
- Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
- Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
- Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
- Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
- Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526 (2020).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
- Ryu, J. -H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
- Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
- Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887 (2020).
- Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch - Starke. 72, 1900214 (2020).
- Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
- Kerly, M.
- Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
- Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
- Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
- Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).
