Summary
ריכוז סוכרוז אופטימלי נקבע למיצוי גליקוגן בכבד באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. תוספת של שלב רתיחה של 10 דקות לעיכוב אנזימים מפרקים גליקוגן הוכחה כמועילה.
Abstract
גליקוגן בכבד הוא פולימר גלוקוז היפר-מסועף המעורב בשמירה על רמות הסוכר בדם אצל בעלי חיים. תכונות הגליקוגן מושפעות מהמבנה שלו. לפיכך, שיטת מיצוי מתאימה המבודדת דגימות מייצגות של גליקוגן חיונית לחקר מקרומולקולה זו. בהשוואה לשיטות מיצוי אחרות, שיטה המשתמשת בשלב צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז יכולה למזער את הנזק המולקולרי. בהתבסס על שיטה זו, פורסם לאחרונה המתאר כיצד צפיפות תמיסת הסוכרוז המשמשת במהלך הצנטריפוגה השתנתה (30%, 50%, 72.5%) כדי למצוא את הריכוז המתאים ביותר לחילוץ חלקיקי גליקוגן במגוון רחב של גדלים, מה שהגביל את אובדן החלקיקים הקטנים יותר. שלב הרתחה של 10 דקות הוכנס כדי לבדוק את יכולתו לנטרל אנזימים מפרקים גליקוגן ובכך לשמר גליקוגן. ריכוז הסוכרוז הנמוך ביותר (30%) ותוספת שלב הרתיחה הוכחו כמיצוי הדגימות המייצגות ביותר של גליקוגן.
Introduction
גליקוגן הוא פולימר מורכב והיפר-מסועף של גלוקוז המצוי בבעלי חיים, פטריות וחיידקים1. ביונקים, הגליקוגן בכבד מתפקד כחוצץ גלוקוז בדם, המשמר את ההומאוסטזיס, בעוד הגליקוגן בשריר פועל כמאגר גלוקוז לטווח קצר כדי לספק אנרגיה ישירות2. מבנה הגליקוגן מתואר לעתים קרובות על-ידי שלוש רמות (מוצגות באיור 1): 1. שרשראות ליניאריות נוצרות על-ידי מונומרים של גלוקוז באמצעות (1→4)-α קשרים גליקוזידיים, כאשר נקודות ההסתעפות מחוברות באמצעות (1→6)-α קשרים גליקוזידיים; 2. חלקיקי β מסועפים מאוד (~ 20 ננומטר קוטר) אשר, במיוחד ברקמות כגון שרירי השלד, פועלים כמולקולות גליקוגן עצמאיות 3,4; 3. חלקיקי גליקוגן α גדולים יותר (בקוטר של עד 300 ננומטר) המורכבים מיחידות גליקוגן β קטנות יותר, המצויות בכבד5, בלב6 ובכמה מינים שאינם יונקים7. חלקיקי α בכבד מעכברים סוכרתיים הם שבירים מולקולרית, עם נטייה להתפרק לחלקיקי β כאשר הם מומסים בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), בעוד α חלקיקים מבקרות שאינן סוכרתיות נשארים בדרך כלל ללא שינוי. השערה אחת היא כי שבריריות זו עלולה להחמיר את מאזן הגלוקוז הלקוי בדם שנראה בסוכרת, כאשר חלקיקי α השבריריים עלולים לגרום לשיעורים גבוהים יותרשל חלקיקי β 8,9,10,11 המתפרקים במהירות רבה יותר.
שיטות מיצוי גליקוגן מסורתיות מנצלות את התנאים הקשים יחסית של חשיפת רקמת הכבד לתמיסת אלקליין חמה12 או לתמיסות חומצה כגון חומצה טריכלורואצטית (TCA)13 או חומצה פרכלורית (PCA)14. בעוד שהן יעילות בהפרדת הגליקוגן ממרכיבים אחרים של רקמת הכבד, שיטות אלה בהכרח פוגעות במבנה הגליקוגן במידה מסוימת15,16. למרות ששיטות אלה מתאימות למדידה כמותית של תכולת הגליקוגן, הן אינן אידיאליות למחקרים המתמקדים בקבלת מידע מבני על הגליקוגן עקב נזק מבני זה. מאז פיתוח שיטות אלה, פותח הליך מיצוי מתון יותר המשתמש בחיץ טריס קר (הוכח כמעכב פירוק גלוקוזידאז) עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז 17,18,19. כאשר ה- pH נשלט ב~8, שיטה זו אינה מכפיפה את הגליקוגן להידרוליזה חומצית או בסיסית שנצפתה בהליכים קודמים.
צפיפות סוכרוז אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של רקמת כבד הומוגנית יכולה להפריד חלקיקי גליקוגן מרוב חומר התא. במידת הצורך, ניתן לבצע טיהור נוסף על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל הכנה, וכתוצאה מכך איסוף של גליקוגן מטוהר עם חלבונים הקשורים לגליקוגן מחוברים20. למרות ששיטה זו, בתנאים מתונים יותר, נוטה יותר לשמר את מבנה הגליקוגן, קשה למנוע אובדן חלק מהגליקוגן בסופרנטנט, במיוחד חלקיקי גליקוגן קטנים יותר שהם פחות צפופים15. גורם אפשרי נוסף לאובדן הגליקוגן הוא שהתנאים המתונים יותר מאפשרים פירוק אנזימטי מסוים, וכתוצאה מכך תפוקת הגליקוגן נמוכה יותר בהשוואה לשיטות מיצוי קשות יותר. מחקר שנערך לאחרונה דיווח על אופטימיזציה של שיטת מיצוי הגליקוגן בכבד כדי לשמר את המבנה של גליקוגן21. כאן נבדקו ריכוזי סוכרוז שונים (30%, 50%, 72.5%) כדי לקבוע אם ריכוזי סוכרוז נמוכים יותר מזערו את אובדן חלקיקי הגליקוגן הקטנים יותר. הרציונל היה שהצפיפות הנמוכה יותר תאפשר לחלקיקים קטנים וצפופים פחות לחדור את שכבת הסוכרוז ולהצטבר בכדורית עם שאר הגליקוגן.
במחקר זה, שיטות המיצוי עם ובלי שלב הרתחה של 10 דקות הושוו כדי לבדוק אם אנזימי פירוק גליקוגן יכולים להיות דנטורציה, וכתוצאה מכך מיצוי של יותר גליקוגן שהיה גם ללא פירוק חלקי. התפלגות גודל מולקולרית שלמה והתפלגויות אורך שרשרת הגליקוגן שימשו לקביעת מבנה הגליקוגן המופק, בדומה לאופטימיזציה של מיצוי עמילן שפורסמה קודם לכן22. כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC) עם זיהוי אינדקס שבירה דיפרנציאלי (DRI) שימשה להשגת התפלגות הגודל של הגליקוגן, המתארות את המשקל המולקולרי הכולל כפונקציה של גודל מולקולרי. אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) שימשה לניתוח התפלגות אורך השרשרת, המתארות את המספר היחסי של שרשראות גלוקוזיד בכל גודל נתון (או מידת פילמור). מאמר זה מתאר את המתודולוגיה של חילוץ גליקוגן מרקמות הכבד בהתבסס על מחקר האופטימיזציה הקודם21. הנתונים מצביעים על כך שהשיטה המתאימה ביותר לשימור מבנה הגליקוגן היא ריכוז סוכרוז של 30% עם שלב רתיחה של 10 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כבדי עכברים ששימשו לאופטימיזציה של הליך זה21 היו מ-12 עכברי רקע זכרים מסוג BKS-DB/Nju (בני 7.2 שבועות, ראו טבלת חומרים). השימוש בבעלי חיים אושר על ידי בית החולים רנמין של ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת ווהאן, גיליון IACUC מס '. WDRM 20181113.
1 רקמות בעלי חיים
- לשקול כבד עכבר (1-1.8 גרם של כבד שלם מכל עכבר).
- להקפיא במהירות את כבד העכבר בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 ° C.
2. הכנת חיץ וריאגנטים
- הכינו מאגר בידוד גליקוגן המכיל 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF ו-5 mM נתרן פירופוספט עם מים נטולי יונים, וכוונן את ה- pH ל- 8.
- הכינו תמיסת סוכרוז 30% (w/w) (נמצאה האופטימלית ביותר עבור גליקוגן21 בכבד).
- הכן מאגר נתרן אצטט (1 M, pH 4.5), מאגר חומצה אצטית (0.1 M, pH 3.5), תמיסת נתרן הידרוקסידי (0.1 M) ונתרן cyanoborohydride (1 M).
- הכינו תמיסת 8-אמינופירן-1,3,6-טריסולפונט (APTS) על ידי הוספת 5 מ"ג APTS ל-50 מיקרוליטר של 15% חומצה אצטית קרחונית.
- הכינו תמיסת אמוניום חנקתי המכילה 50 mM אמוניום חנקתי עם 0.02% נתרן אזיד.
3. מיצוי גליקוגן (איור 2)
- העבר את רקמת הכבד הקפואה (~ 1 גרם) לצינור 15 מ"ל המכיל 6 מ"ל של מאגר בידוד גליקוגן.
- שמירה על קרח, homogenize רקמת הכבד באמצעות homogenizer רקמות.
- מעבירים מחצית מהמתלה (3 מ"ל) לצינור חדש ומרתיחים במשך 10 דקות (הוכח כאופטימלי למחקרי מבנה הגליקוגן21). שמור את החצי השני של התרחיף (3 מ"ל) על קרח כדי לחלץ חלבונים הקשורים המכילים גליקוגן שאינם מפורק .
הערה: דגימות לא מבושלות תמיד צריכות להישמר על קרח במהלך שלבי מיצוי הגליקוגן. אם חלבוני הגליקוגן אינם חשובים למחקר, הדגימה כולה יכולה לעבור את שלב הרתיחה של 10 דקות. - הסר aliquot 8 μL מכל צינור, לשמור את aliquots על קרח, ולהשתמש בהם לקביעת תכולת הגליקוגן (ראה סעיף 4).
- צנטריפוגה את המתלה הנותר ב 6,000 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את הסופרנאטנטים לצינורות אולטרה-צנטריפוגה, וצנטריפוגות אותם ב-3.6 × 105 גרם למשך 90 דקות ב-4°C.
- יש להשליך את הסופרנאטנטים הנותרים ולהשהות מחדש את הכדוריות ב-1.5 מ"ל של מאגר בידוד הגליקוגן.
- שכב את הדגימות מעל 1.5 מ"ל של תמיסת 30% סוכרוז בצינורות אולטרה-צנטריפוגות 4 מ"ל וצנטריפוגות ב 3.6 × 105 גרם במשך שעתיים ב 4 ° C.
- השליכו את הסופרנאטנטים הנותרים והשהו מחדש את הכדוריות ב-200 מיקרוליטר של מים שעברו דה-יוניזציה.
- מוסיפים 800 μL של אתנול מוחלט לתרחיפים ומערבבים היטב כדי לזרז גליקוגן23,24. אחסנו את התערובות בטמפרטורה של -20°C למשך שעה לפחות כדי לאפשר משקעים.
- צנטריפוגה הדגימות ב 6,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנטים והשהו מחדש את הכדוריות ב-200 מיקרוליטר מים שעברו דה-יוניזציה.
- חזור על תהליך משקעים אתנול זה 3x והשהה מחדש את גלולת הגליקוגן הסופית ב 200 μL של מים deionized.
- הסר אליציטוט של 8 μL מכל צינור לצורך קביעת תכולת הגליקוגן (ראה סעיף 4).
- מקפיאים את הסופרנאטנטים הנותרים בחנקן נוזלי ומייבשים בהקפאה (ליופיליז) למשך הלילה. אחסנו את דגימות הגליקוגן היבש במקפיא בטמפרטורה של -20°C.
הערה: דגימות הגליקוגן היבש צריכות להיות יציבות ב -20 °C; עם זאת, אין נתונים המציינים כמה זמן הם נמשכים ללא שינויים מבניים.
4. קביעת תכולת הגליקוגן (איור 3)
- הוסף 8 μL של supernatants גליקוגן, (ראה סעיפים 3.13 ו 3.4), 5 μL של עמיloglucosidase (3269 U / mL), ו 100 μL של חיץ נתרן אצטט (1 M, pH 4.5) לצינור microcentrifuge ולמלא את הצינור עד 500 μL סימן עם מים deionized.
- הכן פקדים המשתמשים במים נטולי יונים, במקום עמילוגלוקוזידאז.
- יש לדגור על הדגימות בטמפרטורה של 50°C למשך 30 דקות, תוך שמירה על הבקרות על קרח.
- צנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 × גרם ב-4°C למשך 10 דקות, וערבבו 300 מיקרוליטר של כל סופרנאטנט שנוצר עם 1 מ"ל של מגיב גלוקוזידאז אוקסידאז/פרוקסידאז (GOPOD).
- בניית עקומת כיול על ידי ערבוב 300 μL של מים denionized המכילים 0, 10, 20, 30, 40, ו 50 מיקרוגרם של D-גלוקוז עם 1 מ"ל של מגיב GOPOD.
- דוגרים על התערובות ב-50°C למשך 30 דקות נוספות.
- קרא את הספיגה (510 ננומטר) של כל דגימה באמצעות לוחות 96 בארות (150 מיקרוליטר לבאר) באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis.
- הפחת את הספיגות של דגימות ביקורת (ללא עמילוגלוקוזידאז) מהספיגות של דגימות ניסיוניות, ולאחר מכן חשב את תכולת הגליקוגן בהתבסס על עקומת תקן גלוקוז D.
5. תפוקת נפט גולמי, תפוקת גליקוגן וקביעת טוהר
- עבור היבול הגולמי, שקול את דגימת הגליקוגן המיובש בהקפאה וחשב את התשואה כאחוז מרקמת הכבד הרטובה.
הערה: יש להתאים תפוקה זו כדי לתקן את האליציטוטים שנלקחו בכל שלב בתכולת הגליקוגן. - לטוהר הגליקוגן, יש לקבוע את תכולת הגליקוגן בכדוריות הסופיות, כמתואר בסעיף 4. חשב את הטוהר כאחוז מתכולת הגליקוגן שנקבעה ביחס ליבול הגולמי (ראה שלב 5.1).
- עבור תפוקת הגליקוגן, לקבוע את תכולת הגליקוגן של הדגימות ההומוגניות ללא רתיחה ולפני כל צנטריפוגה, כמתואר בסעיף 4. חישוב תפוקת הגליקוגן כאחוז מתכולת הגליקוגן בכדוריות הסופיות (ראה שלב 5.2) לזו של תכולת הגליקוגן שנקבעה בהומוגנט הראשוני.
6. ניתוח התפלגות אורך שרשרת (איור 4)
- שוקלים 0.5 מ"ג גליקוגן מיובש בהקפאה בצינורות 1.5 מ"ל.
- הוסף 90 μL של מים נטולי יונים, ו 1.5 μL של נתרן אזיד (0.04 גרם / מ"ל) לצינורות.
- הוסף 5 μL של חוצץ חומצה אצטית (0.1 M, pH 3.5) ו 2 μL של תמיסת איזועמילאז (180 U / mg) לצינורות כדי לפרק את הגליקוגן.
- לדגור את הדגימות ב 37 ° C במשך 3 שעות.
- הוסף 5 μL של תמיסת נתרן הידרוקסידי (0.1 M) לדגימות כדי להגדיל את ה- pH ל -7.0.
- יש להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי ולייבש בהקפאה (ליופיליזציה) למשך הלילה.
- הוסף 2 μL של תמיסת APTS (5 מ"ג של APTS ב 50 μL של 15% חומצה אצטית קרחונית) ו 2 μL נתרן cyanoborohydride (1 M) לגליקוגן מיובש בהקפאה.
- צנטריפוגה את הדגימות ב 4,000 × גרם במשך 2 דקות.
- לדגור את הדגימות ב 60 ° C במשך 3 שעות בחושך.
הערה: ניתן לכסות את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להגן על התכולה מפני אור. - הוסף 200 μL של מים deionized לדגימות ולערבל אותם עד כל המשקע מומס.
- צנטריפוגה את הדגימות ב 4,000 × גרם במשך 2 דקות.
- העברת aliquots של 50 μL מיקרו-בקבוקונים אלקטרופורזה פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) לניתוח.
הערה: הנתונים מוצגים כשפע היחסי של שרשראות (מסועפות) (Nde(X)) עבור כל דרגת פילמור (DP, סמל X).
7. ניתוח התפלגות גודל מולקולרית (איור 5)
- ממיסים 0.5 מ"ג גליקוגן מיובש בהקפאה ב-50 מ"מ אמוניום חנקתי ו-0.02% נתרן אזיד ב-1 מ"ג/מ"ל.
- לדגור את הדגימות בתרמומיסר ב 80 ° C במשך 3 שעות ב 300 סל"ד.
- הזריקו את הדגימות למערכת SEC באמצעות עמודות קדם-עמודה ועמודות 1000 Å ו-10,000 Å ב-80°C עם קצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה (ראו טבלת חומרים). השתמש בגלאי אינדקס שבירה כדי לקבוע את המשקל היחסי של מולקולות בכל נפח אלוציה.
- באמצעות תקני פולולן (PSS) עם מסות טוחנות הנעות בין 342 ל -1.22 × 106, התווה עקומת כיול אוניברסלית של SEC כדי להמיר את זמן האלוציה ל - Rh (רדיוס הידרודינמי). בטא את הנתונים מגלאי אינדקס השבירה הדיפרנציאלי (DRI) כהתפלגות משקל SEC w (log Rh) כפונקציה של Rh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעוד שההליך המתואר לעיל הוא לשיטה האופטימלית ביותר (30% סוכרוז בתוספת שלב רתיחה של 10 דקות), הנתונים מסופקים כאן עבור גליקוגן המופק באמצעות שלושה ריכוזי סוכרוז (30%, 50%, 72.5%), עם וללא שלב רותח, כפי שתואר קודם לכן21. בעקבות הפרוטוקול, הטוהר, התפוקה הגולמית ותפוקת הגליקוגן של גליקוגן יבש המופק בתנאים שונים ניתנים בטבלה 1, שהועתקהמ-21. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בתפוקת הנפט הגולמי ובתפוקת הגליקוגן בין הקבוצות שהופקו בתנאים השונים. לעומת זאת, טוהר הגליקוגן הושפע באופן מובהק הן מריכוזי הסוכרוז (טבלה 1, P < 0.001) והן מתוספת של מדרגת רתיחה (טבלה 1, P < 0.0001). גליקוגן בעל הטוהר הגבוה ביותר הופק באמצעות ריכוז סוכרוז של 30% יחד עם שלב רתיחה של 10 דקות, ולכן נקבע שהוא האופטימלי ביותר מבין התנאים שנבדקו.
התפלגות גודל מולקולרית שימשה להערכת ההשפעות של התנאים השונים על גודל המולקולות בתמצית הסופית. אלה התקבלו באמצעות מערכת SEC מימית, כפי שתואר קודם לכן25. נרמול כל התפלגות לאותו ערך מקסימלי איפשר להשוות את היחס היחסי בין α ל-β חלקיקים מכל שיטה, כפי שניתן לראות באיור 6, שהועתקמ-21. ה-Rh שבו מתרחשת המקסימום (Rh,max) וה-Rh הממוצע (
) מוצגים בטבלה 2, משוכפליםמ-21. מולקולות גליקוגן עם Rh < 30 ננומטר הוגדרו כחלקיקים β11. תכולת החלקיקים β חושבה כשטח מתחת לעקומה (AUC) של (Rh < 30 nm)/AUC (סה" כ Rh). הדגימות המבושלות היו בעלות ערכי Rh ממוצעים נמוכים יותר ותכולת חלקיקים β גבוהה יותר מאשר הדגימות הלא מבושלות (טבלה 2, P < 0.05). ריכוזי סוכרוז נמוכים יותר גרמו לערכים נמוכים יותר ולתכולת חלקיקים β גבוהה יותר (טבלה 2, P <0.05). הכנסת שלב הרתיחה הובילה גם לערכים נמוכים יותר של Rh,max (טבלה 2, P<0.05), בעוד שלריכוז הסוכרוז לא הייתה השפעה משמעותית.
התפלגות אורך שרשרת (CLDs) מספקת את המספר היחסי של שרשראות בכל אורך נתון (מספר יחידות גלוקוז מחוברות, או מידת פילמור), המתקבלות באמצעות FACE. ה-CLDs מוצגים באיור 7, משוכפלים באמצעות נתוניםמ-21. אורך השרשרת הממוצע המספרי (ACL) חושב כ- (ΣX X Nde(X))/ (ΣX Nde(X)) (טבלה 2). רשימות בקרת הגישה של הדגימות הלא מבושלות היו קטנות ומגוונות משמעותית מאלה של הדגימות המבושלות (טבלה 2, P < 0.05). עם זאת, ריכוז הסוכרוז לא השפיע באופן משמעותי על ACLs. זה תמך בהשערה כי הרתחת הדגימות במשך 10 דקות כשלב טרום מיצוי תשמור על מבנה הגליקוגן. המנגנון המוצע הוא דנטורציה של אנזימים מפרקים גליקוגן.
איור 1: שלוש הרמות של מבנה הגליקוגן. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליך מיצוי גליקוגן. צעדים כדי לחלץ ולטהר את הגליקוגן מכבד עכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קביעת תכולת הגליקוגן. צעדים לקביעת תכולת הגליקוגן בהומוגנט הכבד, גליקוגן יבש מטוהר או תמיסת גליקוגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח התפלגות אורך שרשרת. צעדים לניתוח התפלגות אורך שרשרת על ידי מערכת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח התפלגות גודל מולקולרית. שלבים לניתוח התפלגות הגודל המולקולרי על ידי מערכת כרומטוגרפיה מימית של אי הכללת גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: התפלגות משקל SEC של גליקוגן שלם (לא מסועף) בכבד עכבר. החילוץ בוצע בתנאים שונים, מנורמל כך שיהיה אותו מקסימום ב - w(log Rh). כל הומוגנט בכבד חולק לשישה נפחים שווים, והגליקוגן הופק על ידי 30%, 50% או 72.5% סוכרוז, מבושל או לא מבושל. עקומות מייצגות את הממוצע ב-Rh נתון, כאשר ה-SD מסופק משני צדי הקו הראשי (n = 4-6 עם דגימות שאין להן מספיק אות לרעש שהוסר). (א) גליקוגן המופק מ-30% סוכרוז, מבושל או לא מבושל; (ב) גליקוגן המופק מ-50% סוכרוז, מבושל או לא מבושל; (C) גליקוגן המופק מ-72.5% סוכרוז, מבושל או לא מבושל. נתון זה הותאםמ-21. קיצורים: SEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל; SD = סטיית תקן; Rh = רדיוס הידרודינמי; w(log Rh) = התפלגות משקל SEC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: התפלגות אורך שרשרת, Nde(X), של גליקוגן. ניתוח אורך שרשרת בוצע על שישה כבדים עבור שניהם מבושלים ולא מבושלים באמצעות ריכוזי סוכרוז של 30%, 50% ו -72.5% בשלב האולטרה-צנטריפוגה. הערכים עבור כל DP מייצגים את הממוצע ± SD (N = 6). (א) גליקוגן המופק מ-30% סוכרוז, מבושל או לא מבושל; (ב) גליקוגן המופק מ-50% סוכרוז, מבושל או לא מבושל; (C) גליקוגן המופק מ-72.5% סוכרוז, מבושל או לא מבושל. נתון זה הותאםמ-21. קיצור: Nde(X) = התפלגות אורך שרשרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| תשואת הנפט הגולמי (%) | טוהר (%) | תפוקת גליקוגן (%) | |
| 30% סוכרוז-c | 2.1 ± 1.0אמפר | 13.1 ± 12.0b | 10.7 ± 9.1אמפר |
| 50% סוכרוז-c | 1.2 ± 0.7אמפר | 23.3 ± 20.1ב | 10.2 ± 8.1A |
| 72.5% סוכרוז-c | 1.9 ± 0.8אמפר | 9.8 ± 9.0 b | 5.3 ± 2.4אמפר |
| 30% סוכרוז-b | 0.8 ± 0.4אמפר | 109.3 ± 16.8אמפר | 16.0 ± 5.1אמפר |
| 50% סוכרוז-b | 1.1 ± 0.6אמפר | 48.6 ± 16.9A | 14.8 ± 7.6אמפר |
| 72.5% סוכרוז-b | 2.0 ± 0.9אמפר | 14.7 ± 12.6ב | 6.9 ± 3.7אמפר |
| ANOVA דו-כיוונית | סוכרוז: P = 0.053 | סוכרוז: P < 0.001 | סוכרוז: P = 0.034 |
| טמפרטורה: P = 0.108 | טמפרטורה: P < 0.0001 | טמפרטורה: P = 0.116 | |
| אינטראקציה: P = 0.11 | אינטראקציה: P = 0.003 | אינטראקציה: P = 0.801 |
טבלה 1: טוהר, תפוקה גולמית, תפוקת גליקוגן. תפוקה גולמית, טוהר ותפוקת גליקוגן עבור דגימות גליקוגן בכבד שהופקו ב-30%, 50% או 72.5% סוכרוז, מבושל או לא מבושל. -c היו דגימות שחולצו על ידי חיץ קר; -B היו דגימות שחולצו על ידי הרתחה במשך 10 דקות. הערכים ניתנים כממוצע ± סטיית תקן (SD), n = 6. הבדלים בערכים עם אותיות עיליות שונות באותה עמודה הם מובהקים סטטיסטית (P < 0.05). טבלה זו שוחזרה באישור21.
|
ממוצע Rh,max | תוכן β | ממוצע ACL | |
| 30% סוכרוז-c | 29.3 ± 1.5ב | 56.2 ± 0.6אמפר | 40.9 ± 6.2%a,b | 4.8 ± 0.5ג |
| 50% סוכרוז-c | 32.0 ± 1.1א,ב | 36.1 ± 0.5אמפר | 28.5 ± 3.0%b,c | 5.6 ± 1.1B,C |
| 72.5% סוכרוז-c | 35.3 ± 1.8אמפר | 38.2 ± 0.4אמפר | 23.7 ± 3.5% צלזיוס | 4.7 ± 0.9ג |
| 30% סוכרוז-b | 29.3 ± 1.2ב | 54.7 ± 3.1אמפר | 43.1 ± 5.1%a | 8.6 ± 1.8אמפר |
| 50% סוכרוז-b | 30.1 ± 1.2ב | 56.2 ± 0.7אמפר | 36.0 ± 7.2%a,b,c | 8.8 ± 1.7אמפר |
| 72.5% סוכרוז-b | 30.7 ± 3.5א,ב | 54.6 ± 3.5אמפר | 34.0 ± 13.1%a,b,c | 7.6 ± 1.9א,ב |
| ANOVA דו-כיוונית | סוכרוז: P = 0.002 | סוכרוז: P = 0.442 | סוכרוז: P < 0.001 | סוכרוז: P = 0.290 |
| טמפרטורה: P = 0.010 | טמפרטורה: P = 0.032 | טמפרטורה: P = 0.016 | טמפרטורה: P < 0.0001 | |
| אינטראקציה: P = 0.431 | אינטראקציה: P = 0.640 | אינטראקציה: P = 0.441 | אינטראקציה: P = 0.750 |
טבלה 2: ו-R h שבו מתרחשת המקסימום (Rh,max) ואורך שרשרת ממוצע (ACL). ו-Rh שבו מתרחשת המקסימום (Rh,max), תכולת חלקיקים β ואורך שרשרת ממוצע (ACL) של גליקוגן המופק על ידי 30%, 50% או 72.5% סוכרוז, מבושל או לא מבושל. -c לא מבושל; - להיות מעורב צעד רותח של 10 דקות. הבדלים בערכים עם אותיות עיליות שונות באותה עמודה הם מובהקים סטטיסטית (P < 0.05). טבלה זו שוחזרה באישור 21. קיצורים: Rh = רדיוס הידרודינמי; = ; ACL = אורך שרשרת ממוצע; Rh,max = Rh שבו מתרחשת מקסימום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים קודמים הראו כי מבנה הגליקוגן חשוב לתכונותיו; לדוגמה, הגודל המולקולרי משפיע על קצב ההתפרקות של גליקוגן10, והתפלגות אורך השרשרת משפיעה על מסיסותו26. כדי להבין כראוי את היחסים הללו, חשוב לחלץ גליקוגן בהליך המבודד, ככל האפשר, דגימה מייצגת ולא פגומה. שיטות מיצוי מסורתיות השתמשו בתנאי אלקליין חם או חומצה קרה. בעוד שהן יעילות בהפרדת הגליקוגן מרכיבי רקמה אחרים, שיטות אלה הן קשות מבחינה כימית והוכחו כפוגעות במבנה המולקולרי של גליקוגן27.
מאז פותחה שיטה עדינה יחסית המשתמשת בצנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז17,18, המאפשרת לגליקוגן להיווצר בכדורית בעוד שרוב חומר התא נשאר בסופרנטנט. שיטה זו שימושית במיוחד עבור רקמת הכבד, כאשר חלקיקי α הגליקוגן רגישים להידרוליזה חומצית28. עם זאת, לשיטה מתונה יותר זו יש לפחות שני מנגנונים פוטנציאליים לבידוד של גליקוגן המתפצל במבנהו מזה שנראה in vivo: 1) חלקיקי גליקוגן קטנים וצפופים פחות רגישים יותר להישאר בסופרנאטנט במהלך צנטריפוגת צפיפות סוכרוז17,18, מכיוון שהם עשויים שלא להגיע לכדורית; 2) התנאים המתונים יותר עשויים לאפשר לאנזימי פירוק גליקוגן, אשר ינוטרו בתנאי מיצוי אלקליין/חומצה קשים יותר, להמשיך לפרק חלקיקי גליקוגן במהלך המיצוי.
פרסום21 שפורסם לאחרונה נועד לסייע בפתרון בעיות פוטנציאליות אלה על ידי בדיקת סדרה של ריכוזי סוכרוז (ולכן צפיפות), ומצא כי שימוש בריכוז של 30%, בניגוד לשימוש מסורתי של 72.5%, עזר למזער את אובדן חלקיקי הגליקוגן הקטנים יותר. ניסויים עתידיים יוכלו לבדוק ריכוזים נמוכים עוד יותר כדי לראות אם חלקיקים קטנים יותר עדיין הולכים לאיבוד בסופרנאטנט במהלך הצנטריפוגה. פרסום זה בדק גם את היעילות של החדרת שלב רתיחה של 10 דקות מיד לאחר הומוגניזציה של רקמות כדי לנטרל את אנזימי פירוק הגליקוגן, ובכך לשמר את מבנה הגליקוגן. הוכח כי שלב זה סייע לעכב את פירוק הגליקוגן, כאשר אורכי שרשרת הגליקוגן נשמרו באופן משמעותי. ניסויים נוספים במחקר זה סיפקו ראיות לכך ששלב הרתחה זה של 10 דקות לא היה צפוי לגרום נזק משמעותי למבנה הגליקוגן. עם זאת, שלב רתיחה זה עשוי להשפיע על המבנה של חלבונים הקשורים לגליקוגן, ועלול לגרום לדנטורציה ולדיסוציאציה של חלבונים מהגליקוגן. לכן, אם פרוטאומיקה מעניינת, שימוש בריכוז סוכרוז נמוך (30%) ללא רתיחה (דגימות שנשמרות על קרח) עשוי להיות עדיף, עם אזהרה כי הגליקוגן עלול להיות מפורק מעט.
כאשר משתמשים בצנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז ללא ניסויי אופטימיזציה נוספים, השיטה המתאימה ביותר היא לנצל ריכוז נמוך יחסית של סוכרוז (30%) עם הכנסת שלב רתיחה של 10 דקות מיד לאחר הומוגניזציה של רקמות. ישנן כמה מגבלות לטכניקה זו. ראשית, זה היה מותאם עבור גליקוגן בכבד, וחשוב לציין כי זה לא יכול להיות מתאים כמו גליקוגן מרקמות אחרות. שנית, כאמור, ריכוז הסוכרוז הנמוך ביותר שנבדק היה 30%, וייתכן שריכוזים נמוכים יותר עדיפים. שלישית, טכניקה אופטימלית המונעת את הפירוק האנזימטי של הגליקוגן תוך שמירה על הפרוטאום הקשור עדיין אינה זמינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה למר גאושנג וו ולמיס יונוון ג'ו על הסיוע הטכני עם FACE ולמר ג'נשיה הו ומר דנגבין על הסיוע הטכני עם SEC. MAS נתמכת על ידי מלגת מחקר התעשייה של קווינסלנד מתקדמת, קרן מאטר, נאמני הון ונאמנויות L G McCallam Est וג'ורג' וויבר. עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו, קרן מדעי הטבע של סין C1304013151101138 מענקים, ותוכנית הכישרונות לחדשנות ויזמות של ג'יאנגסו לשנת 2017. איור 1-5 נוצרו באמצעות BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M solution |
| Acetic acid | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 solution |
| Agilent 1260 Infinity SEC system | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| BKS-DB/Nju background mice | Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenizer | IKA | T 25 | |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| P/ACE MDQ plus system | Ab Sciex, US | Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) | |
| Refractive index detector | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Sodium acetate | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4.5 solution |
| Sodium azide | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Sodium cyanoborohydride | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Sodium fluoride | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Sodium hydroxide | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M solution |
| Sodium nitrate | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Sodium pyrophosphate | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm |
References
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
- Drochmans, P. Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
- Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
- Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
- Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
- Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
- Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
- Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
- Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526 (2020).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
- Ryu, J. -H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
- Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
- Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887 (2020).
- Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch - Starke. 72, 1900214 (2020).
- Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
- Kerly, M.
- Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
- Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
- Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
- Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).
