Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל מכרסמים משופר של איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה

Published: March 7, 2022 doi: 10.3791/63510
Automatic Translation
*1,2,3, *3, 3, 4, 5, 3, 5, 6, 1,2, 7
1Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, 2Department of Cardiology, Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, 3First College of Clinical Medicine, Biological Technology Center for Innovation in Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 4School of Health Preservation and Rehabilitation, Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education, 5Department of Cardiology, Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 6Department of Cardiology, Yancheng TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, 7Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine (TCM) Prevention and Treatment of Tumor, Nanjing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

מודל איסכמיה-רפרפוזיה שריר הלב של לב חולדה משופר על ידי שימוש ב- retractor מתוצרת עצמית, צינור פוליוויניל כלוריד ושיטת קשר ייחודית. אלקטרוקרדיוגרמה, טריפנילטרזוליום כלוריד וכתמים היסטולוגיים, ותוצאות ניתוח הישרדות באחוזים הראו כי לקבוצת המודל המשופרת יש שיעורי הצלחה והישרדות גבוהים יותר מאשר לקבוצת המודל הקיימת כבר.

Abstract

איסכמיה שריר הלב ופגיעה ברפרפוזיה (MIRI), המושרה על ידי מחלת לב כלילית (CHD), גורמת נזק לקרדיומיוציטים. יתר על כן, עדויות מצביעות על כך שטיפול טרומבוליטי או התערבות כלילית מלעורית ראשונית (PPCI) אינם מונעים פגיעה ברפרפוזיה. עדיין אין מודל חייתי אידיאלי עבור MIRI. מחקר זה נועד לשפר את מודל MIRI בחולדות כדי להפוך את הניתוח לקל יותר ובר ביצועי יותר. שיטה ייחודית להקמת MIRI מפותחת על ידי שימוש בצינור רך במהלך שלב מפתח של התקופה האיסכמית. כדי לחקור את השיטה הזו, שלושים חולדות חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות: קבוצת שאם (n = 10); קבוצת מודל ניסיוני (n = 10); וקבוצת מודל קיימת (n = 10). ממצאים של צביעת טריפנילטרזוליום כלוריד, אלקטרוקרדיוגרפיה ואחוז הישרדות מושווים כדי לקבוע את הדיוקים ושיעורי ההישרדות של הניתוחים. בהתבסס על תוצאות המחקר, הוסק כי שיטת הניתוח המשופרת קשורה לשיעור הישרדות גבוה יותר, מקטע ST-T גבוה יותר וגודל אוטם גדול יותר, אשר צפוי לחקות את הפתולוגיה של MIRI טוב יותר.

Introduction

מחלות לב איסכמיות הן הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם. לתמותה קרדיווסקולרית יש תפקיד מכריע בבריאות הציבור ובאפידמיולוגיה ברחבי העולם1. איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה ממלאים תפקידים חיוניים במחלת לב איסכמית, המתייחסת לתהליך פתופיזיולוגי מורכב הכולל דלדול של אדנוזין טריפוספט2, ייצור מופרז של מיני חמצן תגובתי3, תגובות דלקתיות4, ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה עקב עומס יתר של סידן5, המפעיל אוטם שריר הלב חריף באמצעות תפקוד מטבולי ונזק מבני6.

עם זאת, המנגנונים המפורטים העומדים בבסיס איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה (MIRI) עדיין אינם ידועים. העבודה הנוכחית נועדה לפתח מודל חייתי ייחודי המדמה כראוי את ההצגה הקלינית והטיפול ב-MIRI. אחרת, בתהליך של מחקר מודל MIRI, בעלי חיים גדולים7 (כגון חזירים) דורשים ניתוח התערבותי, וזה יקר. בעלי חיים קטנים (כגון ארנבות8, עכברים 9,10,11,12 וחולדות 13) זקוקים לניתוח עדין תחת מיקרוסקופיה10, שקים נשלטים מרחוק 8,11, או סחיטת הלב מתוך חלל 9, הדורשת רמה גבוהה של טכנולוגיה ועלולה לגרום למספר סיבוכים לאחר הניתוח המפריעים לדיוק הממצאים. מודל MIRI אידיאלי עם שיעור הישרדות גבוה יותר ועלות נמוכה יותר ימלא תפקיד מכריע במחקר פתולוגי.

מחקר זה נועד להילחם בסוגיות אלה על ידי הקמת מודל נגיש וישים יותר של MIRI בחולדות כדי להקל על המחקר על הפתולוגיה של MIRI, אשר יכול להוביל לגילוי של טיפולים קליניים עבור MIRI.

Protocol

המחקר אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית (אישור מס ' 202004A002). המחקר פעל בקפדנות על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) בנוגע לשימוש בחיות מעבדה (פרסום NIH מס '85-23, מתוקן 2011). שלושים חולדות ספראג-דאולי זכרות (משקל, 300 ± 50 גרם; גיל, 12 ± 14 שבועות) שימשו בעבודה זו.

1. הכנת בעלי חיים

  1. יש לשלול מהחולדות מזון ומים למשך 12 שעות לפני הניתוח. צום טרום ניתוחי נועד למנוע שאיפה ריאתית14.
  2. לעקר את כל המכשירים לפני הניתוח באמצעות מעקר קיטור בלחץ גבוה.
  3. מרדימים את החולדות על ידי מתן נתרן פנטוברביטלי (1.5%, 75 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך-צפקית (ראו טבלת חומרים).
  4. להעריך את היעילות של הרדמה על ידי ביצוע בדיקת בוהן צביטה.
    הערה: החולדה נחשבת מורדמת מספיק אם לא נצפו רפלקסים כאשר כף ידה האחורית מוחזקת על ידי הפינצטה.
  5. יישרו את החלק האמצעי של שני מהדקי נייר כדי ליצור צורת "S". משוך מטה את החלק הרחב של כל "S" כדי ליצור נסוג קטן.
  6. חותכים צינור פוליוויניל כלוריד בקוטר 2 מ"מ (PVC) לחתיכות באורך 7 מ"מ. הכנס תפר באורך 10 ס"מ 4-0 לתוך צינור PVC, וקשר את קצוותיו.
  7. ליגט את העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי (LAD) ואת צינור ה- PVC יחד באמצעות תפר 6-0. חותכים חריץ באמצע צינור ה-PVC באמצעות מספריים אופתלמיים, ומשתמשים בחריץ כדי להשחיל את התפר 6-0 דרך הצינור כדי למנוע ממנו ליפול.
    הערה: צינור ה-PVC ומחזירי הצורה "S" מוצגים באיור משלים 1.

2. הליך ניתוח

  1. בצע ניתוח כדי ליצור את מודל חולדות MIRI המשופר בהתאם לשלבים הבאים.
    הערה: קבוצת מודל בעלי החיים שנוצרה על ידי שיטת MIRI המשופרת מכונה קבוצת המודל הניסויי לאורך כל המאמר.
    1. לאחר ההרדמה (שלב 1.2), לתקן את הגפיים של החולדה עם סרט על ידי הנחת החולדה על הלוח הכירורגי במצב שכיבה. גילחו את הצוואר ואת אזור החזה הקדמי עם קרם דפילטורי, ונקו את העור עם 75% אלכוהול וקרצוף יודופור.
    2. חותכים את עור הצוואר לאורך הקו הצווארי החציוני באמצעות מספריים אופתלמיים.
    3. הפרד את שרירי הצוואר באמצעות פינצטה אופתלמית, והנח נסיגה (שלב 1.4) בכל צד כדי לסגת מהם עוד יותר.
      הערה: יש צורך לחשוף את קנה הנשימה כראוי, שכן הוא קריטי למניעת דימום מבלוטת התריס במהלך שלב זה.
    4. לאחר חשיפת קנה הנשימה, זהה את הרווח בין טבעות קנה הנשימה הרביעי והחמישי. מרחב זה הוא נקודת הניקוב.
    5. סמן נקודה זו באמצעות הקצה הקהה של קצה מחט. בצע חתך של 3 מ"מ במקביל לסחוס הקריקואידי בנקודה זו.
    6. הכניסו טרוקר יניקה (ראו טבלת חומרים) לקנה הנשימה דרך החתך (שלב 2.1.5), ואוורור מכני של החולדה כדי לשמור על נשימה תקינה בקצב של 80 נשימות לדקה ונפח גאות של 8 מ"ל/ק"ג.
    7. לאחר מכן, בצע חתך של 4-5 ס"מ מה-xiphoid לאמצע החלל האינטרקוסטלי השמאלי השני תוך החזקת האזמל בזווית של 45°. בעדינות ובאיטיות, הפרידו את השרירים הקדמיים של פקטורליס מז'ור וסראטוס באמצעות פינצטה אופטלמית כדי לגשת לחלל הבין-כוכבי.
    8. בצע חתך של 1.5 ס"מ באופן רוחבי בין הצלעות השלישית והרביעית השמאלית באמצעות מספריים עיניים.
    9. במידת הצורך, חתכו את הצלע הרביעית כדי לחשוף את הלב המכוסה על ידי הריאה השמאלית. זה נותן נראות טובה יותר.
    10. כדי למנוע פציעות, מניחים כדורי צמר גפן ספוגים בתמיסת המלח הפיזיולוגית מעל הריאות בחלל בית החזה. לנתח את קרום הלב באמצעות פינצטה אופטלמית, להרים את תוספת הפרוזדורים השמאלית על ידי פינצטה, ולזהות את האוסטיום הכלילי הנמצא בשורש עורק אבי העורקים.
    11. בקטע שבין הריאה השמאלית לאוריקל, ליגט את ה-LAD ואת הצינור הקצר שהוכן מראש (שלב 1.6) יחד באמצעות תפר כירורגי 6-0, ולקשור אותו באמצעות תפר החלקה. מניחים את ה-slipknot בחריץ של צינור ה-PVC, ומהדקים את הצינור הקשור ואת ה-LAD באמצעות החלקה שנייה למשך 45 דקותו-15 (איור 1A,B).
    12. תעד את שינוי הצבע בחלק הקדמי של החדר השמאלי ואת גובה מקטע ST באלקטרוקרדיוגרמה (א.ק.ג.) במהלך תקופת האיסכמיה.
      הערה: החלק הקדמי של החדר השמאלי הופך חיוור בתקופת האיסכמיה.
    13. הידקו את שרירי החזה והעור באמצעות קליפס עורק, וכסו את הפצע בגאזה מלוחה לחה.
    14. שחררו את ה-slipknot, והסירו את הצינור הקצר שהוכן מראש לאחר 45 דקותו-15 (איור 1C).
    15. יש לשמור על החולדות מורדמות במהלך רפרפוזיה במשך שעתיים.
  2. בצע ניתוח ליצירת מודל החולדה בעקבות הליך16 שפורסם בעבר.
    הערה: קבוצת מודלים זו של בעלי חיים מכונה קבוצת המודל הקיימת לאורך כל המאמר.
    1. לפני קשירת העורק הכלילי LAD, בצע את אותם צעדים כמו קבוצת המודל הניסויי.
    2. במהלך התקופה האיסכמית, ליגט את העורק הכלילי הפרוקסימלי LAD של כל חולדה עם סלימקנוט רק באמצעות תפר כירורגי 6-0 באותה תנוחה כמו קבוצת המודל הניסויי ולקשור את החלקה למשך 45 דקות.
    3. לאחר הקשירה, שחררו את ההחלקה עם פינצטה, תפרו את החתכים של החולדה עם מחט תפר ופינצטה, והשאירו את החיה בהרדמה עמוקה של 1.5% נתרן פנטוברביטלי לאורך כל תקופת הרפרפוזיה 17,18,19 למשך שעתיים לפני קצירת לבבות החולדה.

3. הערכה של צביעת טריפנילטרזוליום כלוריד

  1. בסוף הרפרפוזיה, החולדות מורדמות תוך שהן עדיין מורדמות עמוקות. להקריב את החולדות ולקצור את ליבם16,20 מיד. שטפו את הלבבות בתמיסת PBS, ואחסנו אותם בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות כדי להקשיח את הרקמות.
  2. לאחר מכן, חתכו את הלבבות לפרוסות של 2 מ"מ עם להב מיקרוטום, דגירו אותם עם 2% triphenyltetrazolium chloride (TTC) (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות, ותיקנו אותם בפורמלין נייטרלי ב-10%.
  3. צלם את פרוסות הלב, וחשב את אזורי האוטם באמצעות תוכנת עיבוד תמונה של תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים).
    הערה: בשל הכתם, אתרי האוטם נראים לבנים בהירים, בעוד שרקמות רגילות נראות אדומות כהות.

4. צביעה היסטולוגית

  1. לקצור את הלבבות בהרדמה עמוקה של 1.5% נתרן פנטוברביטלי בסוף תקופת הרפרפוזיה.
  2. תקן את הלבבות ב 10% פורמלין ב 4 ° C במשך 48 שעות.
  3. לאחר מכן, חתכו את הלבבות במיקרוטום ל-6 פרוסות לפחות (בעובי 5 מיקרומטר) והבטיחו לפחות שלוש פרוסות להמטוקסילין ואוזין (H&E) ומאסון להכתים20,21.
  4. צפו במגלשות תחת מיקרוסקופ אור, וצלמו אותן.

5. הערכת א.ק.ג.

  1. חלקו באופן אקראי את בעלי החיים לקבוצות מודלים ניסיוניות או קיימות של MIRI או לקבוצות שיימינג כדי להעריך את השינויים באק"ג.
  2. מרדימים את כל החולדות במהלך הקשירות הכירורגיות ומעריכים את העופרת הסטנדרטית של הגפיים II במעקב אחר20,21 כדי לזהות שינויים באק"ג ולאשר איסכמיה שריר הלב.
  3. אחסן את כל התמונות בספריה דיגיטלית.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנות גרפים מדעיות וסטטיסטיקה (ראה טבלת חומרים).
  2. להביע את כל הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע. לאחר מבחני נורמליות ולוגי-נורמליות של כל קבוצה, בצע ניתוח חד-כיווני של שונות ומבחני t22 כדי לקבוע הבדלים משמעותיים בין הקבוצות. שקול ערך p <0.05 כמובהק סטטיסטית.

Representative Results

צביעת TTC
מקטעי לב של חולדות שעברו את הליך MIRI הקיים או המשופר או ניתוח הבושה הוכתמו ב-TTC, והתמונות אוחסנו באופן דיגיטלי ונותחו באמצעות ImageJ. חולדות שעברו את נהלי MIRI שכבר היו קיימים או משופרים סבלו מאוטם שריר הלב, בעוד שחולדות מקבוצת ה-sham לא עשו זאת (איור 2B). בהשוואה לחולדות בקבוצת ה-sham, לחולדות בקבוצות המודל הקיימות (p < 0.0001) ובניסוי (p < 0.0001) בקבוצות המודל של MIRI היה הבדל משמעותי בגודל האוטם שריר הלב, ולקבוצת המודל הניסויית היה גודל אוטם שריר הלב גדול יותר מאשר לקבוצת המודל הקיימת (p = 0.0176) (איור 3B).

כתמים היסטולוגיים
ניתוח של דגימות שהוכתמו באמצעות כתמי H&E ו-Masson22,23 הראה כי בהשוואה לקבוצת ה-sham, הקרדיומיוציטים הן של קבוצת הניסוי והן של קבוצות המודל הקיימות חוו נזק קריטי ונוקליאוליזה והסתננו על ידי נויטרופילים רבים (איור 3).

בדיקת א.ק.ג.
מקטעי האק"ג ST-T של חולדות בקבוצות המודל הקיימות והניסיוניות של MIRI היו גבוהים בהשוואה לאלה של חולדות בקבוצת ה-sham (איור 4A), וההבדלים בין המודל הניסיוני לבין קבוצות ה-sham (p < 0.0001) או בין המודל הקיים לבין קבוצות ה-sham (עמ' < 0.0001) היו משמעותיים (איור 4B). יתר על כן, מקטע ST-T היה גבוה יותר בקבוצת המודל הניסיוני מאשר בקבוצת המודל הקיימת (p = 0.0274) (איור 4C).

אחוזי הישרדות
שיעור ההישרדות היה שונה באופן משמעותי בין שתי קבוצות המודל של MIRI (איור 4D). ארבע מתוך עשר החולדות מתו בקבוצת המודל הקיימת. שיעור התמותה היה 40% בתקופת הרפרפוזיה. לעומת זאת, אף אחת מהחולדות בקבוצת המודל הניסויי לא מתה במהלך הניתוח, מה שמדגים כי למודל המשופר הנוכחי היה שיעור הישרדות גבוה יותר (p = 0.0291).

Figure 1
איור 1: שלבים מרכזיים בניתוח המודל של איסכמיות בשריר הלב ופציעת רפרפוזיה (MIRI). נקודות ירוקות מציינות את פרוטוקול הליגטורה בתקופה האיסכמית, כולל הנחת הצינור הרך על העורקים הכליליים (A), חיבור קו התפר לחריץ של הצינור הרך שהוכן מראש (B), שחרור ההחלקה והסרת הצינור הרך עם תחילת תקופת הרפרפוזיה (סרגל קנה מידה = 1 ס"מ) (C ). LAA: תוספת פרוזדורים שמאליים, RAA: תוספת פרוזדורים ימנית, LAD: עורק קדמי שמאלי יורד, RCA: עורק כלילי ימני, IVC: Vena Cava נחות, SVC: קאווה ורידים עליונים, AO: עורק אבי העורקים, PA: עורק ריאתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: כל הליך הניתוח וההבדלים בכתמי טריפנילטרזוליום כלוריד (TTC) בין קבוצות שונות. המחזיר הקטן שהוכן מראש (סרגל קנה מידה = 15 מ"מ), צינור רך (סרגל קנה מידה = 10 מ"מ), והניתוח כולו (סרגל קנה מידה = 15 מ"מ) מוצגים (A). שלושים חולדות חולקו באופן אקראי לקבוצות הניסוי (n = 10), קבוצת sham (n = 10) והמודל הקיים (n = 10). צביעת TTC הצביעה על כך שגם בקבוצות הניסוי וגם בקבוצות המודלים הקיימות היו שינויים משמעותיים בהשוואה לקבוצת ה-sham (B). הדופן הקדמית של שריר הלב בניסוי והדופן הצדדית בקבוצות המודל הקיימות הפכו ללבן חיוור, ואישרו את מיקומו של האזור האיסכמי (סרגל קנה מידה = 5 מ"מ). "המודל הקיים" מתואר כ"מודל הישן" באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הבדלים בכתמי H&E ו-Masson בין קבוצות. שלושים חולדות ספראג דאולי זכריות חולקו באופן אקראי לקבוצות הניסוי (n = 10), קבוצת sham (n = 10) והמודל הקיים (n = 10), וההשוואה בין השינויים המורפולוגיים בתאים בין קבוצות מוצגת (סרגל קנה מידה = 2 מ"מ). המטוקסילין ואוסין (H&E) וצביעת מאסון מראים כי לתאי שריר הלב של המודל הניסיוני ולקבוצות המודל הקיימות יש נזק קריטי, נוקליאוליזה, והם מסתננים על ידי נויטרופילים רבים בהשוואה לאלה של קבוצת ה-sham (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). "המודל הקיים" מתואר כ"מודל הישן" באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
תרשים 4: הבדלים בתוצאות סטטיסטיות בין קבוצות. שלושים חולדות ספראג דאולי זכריות חולקו באופן אקראי לקבוצות הניסוי (n = 10), קבוצת sham (n = 10) והמודל הקיים (n = 10). ממצאי אלקטרוקרדיוגרמה מראים כי בהשוואה לקבוצת המודלים הקיימת, לקבוצת המודל הניסויי יש גודל אוטם שריר הלב גדול יותר (****p < 0.0001, *p = 0.0176) (A), גובה מקטע ST גבוה יותר (****p < 0.0001, *p = 0.0274) (B) ואחוז הישרדות גבוה יותר (p = 0.0291) (C ). במיוחד, חולדות מקבוצת המודל הקיימת היו בסיכון גבוה יותר למות בתחילת תקופת האיסכמיה ובתחילת תקופת הרפרפוזיה (D). "המודל הקיים" מתואר כ"מודל הישן" באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: הפרטים של המחזיר המוכן מראש וצינור ה-PVC. מוצגות ה-retractor (A) המוכנות מראש וצינור ה-PVC (B). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

ההבדל העיקרי בין השיטות הקיימות כבר לבין השיטות המשופרות היה השימוש בצינורות PVC בתהליך ההצמדה. בשיטת הניתוח הקיימת, רקמת שריר הלב נקשרה באמצעות תפר משי 6-0 בלבד, מה שגרם נזק לשריר הלב במהלך קשירת וכתוצאה מכך למוות תוך ניתוחי. יתר על כן, הפעימה של הלב תשחרר את ההחלקה. לעומת זאת, בשיטה המשופרת עם צינור ה-PVC, ניתן היה להדק את ההחלקה שהונחה בחריץ של הצינור, ולהגדיל את שטח שריר הלב המושפע מהקשירה. יתרונות אלה נצפו במהלך ההליך הניסיוני ואושרו על ידי צביעת TTC וממצאי ההישרדות באחוזים.

השלב הקריטי של שיטת הניתוח המשופרת היה הנחת הצינור הרך על העורק הכלילי הפרוקסימלי LAD, מלווה בעצבים, כלי הלימפה ורקמת שריר הלב במהלך קשירת התקופה האיסכמית. צינור רך מוכן מראש זה יכול לשמש כרית המגנה על הרקמות ההיקפיות (עצבים, מיוקרדיה וכלי הלימפה) ומפחיתה את התמותה במהלך קשירת עורקים כליליים. הניתוח שבוצע בשיטה הקיימת כבר היה דומה לניתוח לאוטם שריר הלב. ממצאי ההישרדות באחוזים הצביעו על כך שחולדות בקבוצת המודל הקיימת מתו בעיקר בתקופה האיסכמית (שתי חולדות מתו ב-2 דקות לאחר ההדבקה, ושתי חולדות מתו ב-45 דקות לאחר ההצמדה). אחרת, הסיבות הבסיסיות למוות עדיין אינן ברורות, וישנן שורה של השערות, כולל נזק נוסף למבני העצבים23, כלי הלימפה והמיוקרדיה.

לגבי פגיעה עצבית, מחקרים קודמים הצביעו על כך שבמהלך התקופה האיסכמית במודל החי, מלבד ההשפעות המקומיות הישירות של איסכמיה על מבני העצבים, יש גם כנראה ירידה משמעותית ברמות הנוירופפטיד Y (NPY) התורמות להפרעות בהובלה אקסופלסמית בעצבנות הסימפתטית24. ממצא זה מסכים עם התוצאות שדווחו על ידי Han et al.25, שגילו כי היעלמות הדרגתית של NPY התרחשה בתוך שריר הלב האוטם לאחר קשירת העורק הכלילי LAD בחולדות. עם זאת, תפקידו של NPY בהקשר זה עדיין אינו ברור. מחיקתו מחלישה תפקוד לקוי של הלב ואפופטוזיס במהלך אוטם שריר הלבהחריף 26, והיא קשורה להפרעת קצב27, לחץ דם גבוה ותפקוד מיקרו-וסקולרי כלילי28.

יתר על כן, חסימה שלילית של זרימת הלימפה הלבבית התרחשה במהלך התקופה האיסכמית, מה שהוביל לבצקת לב קשה, תפקוד לקוי שמאלי ודימומים29, אשר עשויים להיות גורם נוסף למוות בחולדות. במהלך תהליך פתולוגי זה, ניתן לייחס את הליגטורה של העורק הכלילי LAD לחסימה של עורקים כליליים או הובלה לימפתית לבבית בתוך אזור האוטם, אשר יכול לגרום לסיבוכים נוספים, כגון שיפוץ שלילי של הלימפה של אספן אפיקרדיאלי, זרימת הלימפה מופחתת, ובצקת מתמשכת30.

לכן, זרימת הדם בכלי הלימפה ממלאת תפקיד פונקציונלי בהומאוסטזיס לבבי31 ובריפויפצעים 32, וממצאי ההישרדות באחוזים במחקר זה מצביעים על כך שההליך הכירורגי המשופר של MIRI עשוי למנוע נזק לימפטי ולקדם רפרפוזיה לימפטית על ידי הנחת הצינור הרך על העורק הכלילי LAD במהלך הליגטורה. לשם השוואה, שיטת הניתוח הקיימת נוטה יותר לקרוע את שריר הלב ולגרום לדימום מסיבי במהלך קשירת העורק הכלילי LAD, ללא אפקט הריפוד של הצינור הרך. בנוסף, קוטר הצינור הרך שהוכן מראש היה גדול בהרבה מתופר המשי 6-0, וייתכן שהצינור התכווץ וגרם לגודל אוטם גדול יותר כאשר ההחלקה נקשרה לצינור במהלך התקופה האיסכמית.

למחקר זה היו כמה מגבלות. גודל האוטם של הלב נותח בניסוי הראשוני. נוסחת ההחלפה (N = 7.75) חושבה באמצעות משוואה33 שדווחה בעבר. בהתחשב במוות אפשרי של חולדות במהלך הניתוח, N הועלה ב -25%; לפיכך, n = 10 (עשר חולדות לכל קבוצה) הוחלט. אחרת, בשיטה הקיימת כבר ליצירת מודל MIRI היה שיעור תמותה גבוה. לכן, מקרים מעטים (גודל מדגם נמוך) בקבוצת המודל הניסויי השפיעו על הממצאים הסטטיסטיים. מספר הערכות, כולל אקוקרדיוגרפיה30, צביעה כחולה של אוונס34 ומדידת אנזים שריר הלב35, היו חיוניות להערכה ולניתוח של תפקוד הלב. בשל גודל המדגם הנמוך של עבודה זו, הערכות אלה לא בוצעו ויתואר במחקר עתידי של מחקר פרמקודינמי ב- MIRI. עם זאת, בהתחשב בכך שההליך הכירורגי הקיים ליצירת מודל MIRI קשור לנזק נרחב בשריר הלב, כדאי לדווח על שיטה נוכחית זו כדי לשפר את המידול של MIRI בחולדות ולהביא אור למודל פרה-קליני זה המדמה נכונה מחלת לב איסכמית.

לסיכום, לשיטת הניתוח המשופרת ליצירת מודל MIRI היה שיעור הישרדות גבוה יותר, סגמנט ST-T גבוה יותר וגודל אוטם גדול יותר משיטת יצירת מודל MIRI הקיימת, מה שמרמז על כך שהמודל המשופר מדמה טוב יותר את הפתולוגיה של MIRI.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מנהל הרפואה הסינית המסורתית [SLJ0204], בית החולים המחוזי ג'יאנגסו לרפואה סינית (Y21017), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [81973763, 81973824,82004239].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Formalin Chunyu, China _
2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride Solarbio, China T8107
75% Alchol SCR, China 10009261
Artery Clip Zhonglin Dongsheng, China 6.5cm
Camera Olympus Corporation, Japan EPL5
Cotton ball Huachen, China _
Dpilatory cream Veet, China _
Eye speculum Shanghai Jingzhong, China _
Gauze Zhonggan, China _
GraphPad GraphPad Software, USA 8.0
H&E Kit Solarbio, China G1120
High-pressure steam sterilizer TOMY, Japan SX-500
ImageJ NIH, USA _
Masson Kit Solarbio, China G1340
Medical Tape Mr.Song, China _
Microscope Olympus Corporation, Japan CKX31
Microscopy TEKSQRAY, China _
Microtome Leica, Germany RM2235
Microtome Blade Leica, Germany 819
Needle holder Shanghai Jingzhong, China _
Ophthalmic scissors Shanghai Jingzhong, China _
Ophthalmic tweezers Shanghai Jingzhong, China _
Paper clip Chenguang, China ABS91613
Physiological saline solution Kelun, China _
Powerlab ECG ADINSTRUMENTS ,China 4/35
PVC tube Guanzhijia, China _
Small animal ventilator TECHMAN, China HX-101E
Sodium Pentobarbital SIGEMA, USA 1030001
Suction trocar TECHMAN, China HX-101E
Suture line Lingqiao, China 4-0
Suture needle with thread Shanghai Pudong Jinhua Medical Products Co LTD, China 6-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American heart association. Circulation. 133 (4), 38 (2016).
  2. Allen, D. G., Orchard, C. H. Myocardial contractile function during ischemia and hypoxia. Circulation Research. 60 (2), 153-168 (1987).
  3. Ashraf, M. I., et al. A p38MAPK/MK2 signaling pathway leading to redox stress, cell death and ischemia/reperfusion injury. Cell Communication and Signaling. 12, 6 (2014).
  4. Hernandez-Resendiz, S., et al. The role of redox dysregulation in the inflammatory response to acute myocardial ischaemia-reperfusion injury - adding fuel to the fire. Current Medicinal Chemistry. 25 (11), 1275-1293 (2018).
  5. Heidrich, F., et al. The role of phospho-adenosine monophosphate-activated protein kinase and vascular endothelial growth factor in a model of chronic heart failure. Artificial Organs. 34 (11), 969-979 (2010).
  6. Shen, Y., Liu, X., Shi, J., Wu, X. Involvement of Nrf2 in myocardial ischemia and reperfusion injury. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 496-502 (2019).
  7. Hinkel, R., et al. AntimiR-21 prevents myocardial dysfunction in a pig model of ischemia/reperfusion injury. Journal of the American College of Cardiology. 75 (15), 1788-1800 (2020).
  8. Torrado, J., et al. Sacubitril/Valsartan averts adverse post-infarction ventricular remodeling and preserves systolic function in rabbits. Journal of the American College of Cardiology. 72 (19), 2342-2356 (2018).
  9. Guan, L., et al. MCU Up-regulation contributes to myocardial ischemia-reperfusion Injury through calpain/OPA-1-mediated mitochondrial fusion/mitophagy Inhibition. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (11), 7830-7843 (2019).
  10. Fan, Q., et al. Dectin-1 contributes to myocardial ischemia/reperfusion injury by regulating macrophage polarization and neutrophil infiltration. Circulation. 139 (5), 663-678 (2019).
  11. Huang, C., et al. Effect of myocardial ischemic preconditioning on ischemia-reperfusion stimulation-induced activation in rat thoracic spinal cord with functional MRI. International Journal of Cardiology. 285, 59-64 (2019).
  12. Li, D., et al. Cardioprotection of CAPE-oNO2 against myocardial ischemia/reperfusion induced ROS generation via regulating the SIRT1/eNOS/NF-κB pathway in vivo and in vitro. Redox Biology. 15, 62-73 (2018).
  13. Cui, Y., Wang, Y., Liu, G. Protective effect of Barbaloin in a rat model of myocardial ischemia reperfusion injury through the regulation of the CNPY2PERK pathway. International Journal of Molecular Medicine. 43 (5), 2015-2023 (2019).
  14. Lin, M. W., et al. Prolonged preoperative fasting induces postoperative insulin resistance by ER-stress mediated Glut4 down-regulation in skeletal muscles. Int J Med Sci. 11 (5), 1189-1197 (2021).
  15. Wu, J., et al. Sevoflurane alleviates myocardial ischemia reperfusion injury by inhibiting P2X7-NLRP3 mediated pyroptosis. Frontiers in Molecular Biosciences. 26 (8), 768594 (2021).
  16. Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. Acute myocardial infarction in rats. Journal of Visualized Experiments. (48), e2464 (2011).
  17. Zhang, C. X., et al. Mitochondria-targeted cyclosporin: A delivery system to treat myocardial ischemia reperfusion injury of rats. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 18 (2019).
  18. Liu, X. M., et al. Long non-coding RNA MALAT1 modulates myocardial ischemia-reperfusion injury through the PI3K/Akt/eNOS pathway by sponging miRNA-133a-3p to target IGF1R expression. European Journal of Pharmacology. 916, 174719 (2022).
  19. Li, L., et al. Ginsenoside Rg3-loaded, reactive oxygen species-responsive polymeric nanoparticles for alleviating myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Controlled Release. 317, 259-272 (2020).
  20. Mickelson, J. K., et al. Streptokinase improves reperfusion blood flow after coronary artery occlusion. International Journal of Cardiology. 23 (3), 373-384 (1989).
  21. Verscheure, Y., Pouget, G., De Courtois, F., Le Grand, B., John, G. W. Attenuation by R 56865, a novel cytoprotective drug, of regional myocardial ischemia- and reperfusion-induced electrocardiographic disturbances in anesthetized rabbits. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 25 (1), 126-133 (1995).
  22. Fan, M. L., et al. Animal model of coronary microembolization under transthoracic echocardiographic guidance in rats. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568 (3), 174-179 (2021).
  23. Lim, M., et al. Intravenous injection of allogeneic umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cells reduces the infarct area and ameliorates cardiac function in a porcine model of acute myocardial infarction. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 129 (2018).
  24. Trautner, H., et al. Heart innervation after ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). Histochemistry. 92 (2), 103-108 (1989).
  25. Han, C., Wang, X. A., Fiscus, R. R., Gu, J., McDonald, J. K. Changes in cardiac neuropeptide Y after experimental myocardial infarction in rat. Neuroscience Letters. 104 (1-2), 141-146 (1989).
  26. Huang, W., et al. Deletion of neuropeptide Y attenuates cardiac dysfunction and apoptosis during acute myocardial infarction. Frontiers in Pharmacology. 10, 1268 (2019).
  27. Kalla, M., et al. The cardiac sympathetic co-transmitter neuropeptide Y is pro-arrhythmic following ST-elevation myocardial infarction despite beta-blockade. European Heart Journal. 41 (23), 2168-2179 (2020).
  28. Cuculi, F., et al. Relationship of plasma neuropeptide Y with angiographic, electrocardiographic and coronary physiology indices of reperfusion during ST elevation myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 99 (16), 1198-1203 (2013).
  29. Vuorio, T., Tirronen, A., Ylä-Herttuala, S. Cardiac Lymphatics - a new avenue for therapeutics. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 28 (4), 285-296 (2017).
  30. Henri, O., et al. Selective stimulation of cardiac lymphangiogenesis reduces myocardial edema and fibrosis leading to improved cardiac function following myocardial infarction. Circulation. 133 (15), 1484-1497 (2016).
  31. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21st century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  32. Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
  33. Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biology. 18 (7), 3000411 (2020).
  34. Miller, D. L., Li, P., Dou, C., Armstrong, W. F., Gordon, D. Evans blue staining of cardiomyocytes induced by myocardial contrast echocardiography in rats: evidence for necrosis instead of apoptosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 33 (12), 1988-1996 (2007).
  35. Deng, C., et al. α-Lipoic acid reduces infarct size and preserves cardiac function in rat myocardial ischemia/reperfusion injury through activation of PI3K/Akt/Nrf2 pathway. PLoS ONE. 8 (3), 58371 (2013).

Tags

רפואה גיליון 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 07/27/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Hua-Qin Tong*1
Man-Lu Fan*1
Tong Sun1
Hao-Wen Zhang2
Jie Han3
Meng-Xi Wang1
Jian-Dong Chen3
Wei-Xin Sun4
Xiao-Hu Chen3
Mian-Hua Wu5
1First College of Clinical Medicine, Biological Technology Center for Innovation in Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine
2School of Health Preservation and Rehabilitation, Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education
3Department of Cardiology, Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
4Department of Cardiology, Yancheng TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine
5Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine (TCM) Prevention and Treatment of Tumor, Nanjing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

to:

Hua-Qin Tong*1,2,3
Man-Lu Fan*3
Tong Sun3
Hao-Wen Zhang4
Jie Han5
Meng-Xi Wang3
Jian-Dong Chen5
Wei-Xin Sun6
Xiao-Hu Chen1,2
Mian-Hua Wu7
1Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine
2Department of Cardiology, Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine
3First College of Clinical Medicine, Biological Technology Center for Innovation in Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine
4School of Health Preservation and Rehabilitation, Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education
5Department of Cardiology, Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
6Department of Cardiology, Yancheng TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine
7Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine (TCM) Prevention and Treatment of Tumor, Nanjing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

מודל מכרסמים משופר של איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tong, H. Q., Fan, M. L., Sun, T.,… More

Tong, H. Q., Fan, M. L., Sun, T., Zhang, H. W., Han, J., Wang, M. X., Chen, J. D., Sun, W. X., Chen, X. H., Wu, M. H. Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (181), e63510, doi:10.3791/63510 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter