Summary
Установленные иммунохимические методы измерения пептидных передатчиков in vivo полагаются на микродиализ или объемное извлечение жидкости для получения образца для автономного анализа. Тем не менее, они страдают от пространственно-временных ограничений. Настоящий протокол описывает изготовление и применение емкостного иммунозондового биосенсора, который преодолевает ограничения существующих методов.
Abstract
Возможность измерения биомаркеров in vivo, имеющих отношение к оценке прогрессирования заболевания, представляет большой интерес для научного и медицинского сообществ. Разрешение результатов, полученных в результате современных методов измерения определенных биомаркеров, может занять несколько дней или недель для получения, поскольку они могут быть ограничены в разрешении как пространственно, так и временно (например, микродиализ жидкостного компартмента интерстициальной жидкости, анализируемой с помощью иммуноферментного анализа [ИФА], высокоэффективной жидкостной хроматографии [ВЭЖХ] или масс-спектрометрии); таким образом, нарушается их руководство своевременной диагностикой и лечением. В настоящем исследовании сообщается об уникальном методе обнаружения и измерения пептидных передатчиков in vivo с использованием емкостного биосенсора иммунозонда (CI probe). Описан протокол изготовления и характеристика in vitro этих зондов. Приведены измерения высвобождения in vivo вызванного симпатической стимуляцией нейропептида Y (NPY). Высвобождение NPY коррелирует с симпатическим высвобождением норадреналина для справки. Данные демонстрируют подход к быстрому и локализованному измерению нейропептидов in vivo. Будущие приложения включают интраоперационную оценку прогрессирования заболевания в режиме реального времени и минимально инвазивное развертывание этих зондов на основе катетера.
Introduction
Несколько химических методов обнаружения и количественной оценки биомаркеров обычно используются как в химии белка, так и в клинической диагностике, особенно в диагностике рака и оценке прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний. В настоящее время такие методы, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), иммуноферментный анализ (ИФА) и масс-спектрометрия, основаны на сборе проб из сосудистого компартмента 1,2,3 путем объемного забора жидкости или интерстициального компартмента путем микродиализа. Микродиализ использует полупроницаемую мембранную трубку известной длины, которая помещается в интересующую область. Всасывающая жидкость перфузируется через пробирку в течение нескольких минут4 для сбора образца для анализа5, тем самым ограничивая временное разрешение. Таким образом, собранные образцы обеспечивают только усредненную стоимость с течением времени местной микроокружения и ограничены скоростью перфузии и сбором достаточного объема образца. Кроме того, эти методы требуют объединения экспериментальных данных и усреднения сигналов; поэтому они могут не учитывать изменчивость между субъектами. Важно отметить, что время между сбором проб и последующим автономным анализом исключает немедленное клиническое вмешательство и терапию.
В настоящем протоколе описано использование емкостного иммунозондового биосенсора (CI-зонда) для электрического обнаружения специфических биоактивных пептидов с временным разрешением. Нейропептид Y (NPY), высвобождаемый из постганглионарных симпатических нейронов, которые иннервируют сосудистую систему, эндокард, кардиомиоциты и внутрисердечные ганглии, является основным нейромодулирующим пептидным передатчиком в сердечно-сосудистой системе 6,7,8,9. Метод, представленный здесь, предназначен для измерения NPY, а экспериментальная осуществимость демонстрируется в модели сердца свиней. Однако этот подход применим к любому биологически активному пептиду, для которого доступно селективное антитело10. Этот способ основан на емкостном соединении между зондом из платиновой проволоки и проводящей жидкостью на функционализированном наконечнике11,12. В этом приложении взаимодействие опосредовано через антитело против целевого нейропептида (NPY), который был связан с наконечником электрода, взаимодействуя со средой проводящей жидкости. Эта функционализация была достигнута путем электроосаждения реакционноспособного полидофамина на наконечник зонда10,13 из платиновой проволоки.
Когда функционализированный антителами зонд помещается в интересующую область in vivo, вызванное эндогенное высвобождение NPY приводит к связыванию с улавливающими антителами на кончике зонда, и проводящая жидкость на поверхности электрода смещается белком NPY. Локальное изменение в электрической среде приводит к вытеснению высокомобильной, высокодиэлектрической жидкости неподвижной, статически заряженной молекулой. Это изменяет интерфейс электрод-жидкость и, таким образом, его емкость, которая измеряется как изменение тока заряда в ответ на командный потенциал ступенчатой функции. Отрицательный потенциал «сброса» используется сразу после каждого отдельного цикла измерения для отталкивания связанного NPY от антитела посредством электростатического взаимодействия, тем самым очищая сайты связывания антител для последующих раундов измерения10. Это позволяет эффективно измерять NPY с временным разрешением. Уникальный метод CI преодолевает ограничения иммунохимических методов на основе микродиализа, описанных выше, для измерения динамических уровней биомаркеров из одного эксперимента без объединения данных или усреднения сигналов в течение нескольких экспериментов9, предоставляя данные почти в режиме реального времени. Более того, способность адаптировать этот метод к любому биомаркеру, представляющему интерес, для которого существует соответствующее антитело в масштабе с временным разрешением и локализацией, обеспечивает значительный технический прогресс в иммунохимическом измерении для оценки прогрессирования заболевания и руководства терапевтическими вмешательствами.
Программное обеспечение для сбора и анализа данных было написано на заказ в IGOR Pro (полностью интерактивная программная среда). Система аналого-цифрового преобразователя (A/D) выдавала командное напряжение под управлением компьютера и получала данные от пользовательского усилителя. Усилитель обладал определенными уникальными особенностями. Они включали резистор обратной связи (переключаемый) для каждого из четырех каналов сбора, что позволяло выбирать цепи зажима напряжения обратной связи 1 МОм или 10 МОм для интеграции вариативности электрода. Блок ступени с одной головкой и взаимной схемой заземления/отсчета для всех четырех каналов сбора также был построен для размещения устройства рядом с сундуком в одном физическом модуле. Для сбора всех сообщаемых данных использовалась настройка резистора обратной связи 1 МОм.
Настройки фильтра и усиления передавались по телеграфу с усилителя и записывались в файл данных. Данные фильтровались на частоте 1 кГц с помощью 2-полюсного аналогового фильтра Бесселя, оцифрованного на частоте 10 кГц. Разница в потенциале между зондом и окружающим проводящим раствором создает емкостный слой Гельмгольца на кончике зонда. Связывание лиганда с антителом на кончике зонда приводит к изменению местного заряда и, таким образом, изменению емкости Гельмгольца. Это изменение емкостной составляющей цепи приводит к сдвигу величины впрыскиваемого заряда, необходимого для приведения зонда к потенциалу в протоколе напряжения ступенчатой функции. Таким образом, связывание конкретного лиганда с функционализированным зондом приводит к изменению измерения емкости электрода как изменение пикового емкостного тока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по исследованию животных Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и выполнены в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Руководстве Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание, 2011). Взрослые самцы йоркширских свиней весом около 75 кг использовались для исследований in vivo 10.
1. Изготовление и функционализация емкостных иммунозондов
- Вырежьте платиновую проволоку с перфторалкокси (PFA) длиной 25 см (см. Таблицу материалов) и снимите примерно 5 мм покрытия PFA с одного конца с помощью скальпеля, стараясь не разрезать платиновую проволоку.
- Вставьте зачищенный конец платинового провода в позолоченный штырь разъема диаметром 1 мм и обрежьте зубья штыря разъема вокруг зачищенного конца платинового провода плоскогубцами (см. Таблицу материалов).
- Припаяйте платиновый провод к позолоченному контакту разъема. Будьте осторожны, чтобы не использовать чрезмерное количество припоя.
- Готовят раствор дофамина, растворяя 50 мг дофамина HCl в 50 мл 10 мМ фосфат-буферного физиологического раствора (PBS, pH 6,0) путем перемешивания.
- Как только дофамин полностью растворится, поместите наконечник платиновой проволоки в сосуд, содержащий свежеприготовленный дофамин PBS. Подключите золотой контакт разъема к каналу головной сцены (см. Таблицу материалов).
- Подключите дисковый электрод AgCl (заземляющий электрод, см. Таблицу материалов) к заземляющему каналу в головной ступени. Поместите диск AgCl в сосуд, содержащий PBS, дополненный дофамином, и платиновую проволоку; будьте осторожны только для погружения дискового электрода, а не любой длины провода или припоя. Подключите шунт провода к опорным каналам головной ступени перед продолжением.
- Откройте интерактивное программное обеспечение для сбора данных (см. Таблицу материалов). Подготовьте протокол потенциала команды электроосаждения пилообразного электроосаждения со следующими параметрами: пусковой потенциал = −0,6 В; конечный потенциал = +0,65 В; скорость сканирования = 0,04 В∙с-1; продолжительность осаждения = 420 с. Начните протокол осаждения полидофамина, убедившись, что все провода подключены правильно.
- После завершения осаждения полидофамина удалите гранулу AgCl и наконечник платиновой проволоки из сосуда, стараясь не потревожить наконечник электрода из платиновой проволоки. Поместите кончик проволоки в микротрубку, содержащую PBS (pH 7,4) на 2-5 мин по мере приготовления раствора антител; Убедитесь, что наконечник проволоки не соприкасается с боковыми или нижними сторонами микропробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор антител может быть получен во время осаждения полидофамина; однако перенос платиновой проволоки из сосуда, содержащего дофамин, в микропробирку PBS после осаждения полидофамина не следует пропускать. - Готовят раствор антител. Объедините интересующее антитело с PBS (рН 7,4) в соотношении 1:20 в сосуде соответствующего размера (например, в микротрубке).
ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-NPY моноклональное антитело (см. Таблицу материалов), используемое здесь, было аликвотировано при 1 мг/мл; примером препарата антител здесь может быть 4 мкл антитела к 76 мкл PBS. - Замочите осажденный полидопамином наконечник платинового электрода в растворе антител в течение как минимум 2 ч при комнатной температуре, снова гарантируя, что наконечник платиновой проволоки подвешен в растворе и не опирается на внутреннюю поверхность микротрубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Недавняя реализация этого метода благоприятствовала использованию электрода из платиновой проволоки сразу после этого этапа вместо влажного или сухого хранения для последующего использования. - После замачивания в растворе антител кратковременно промойте наконечник недавно функционализированного емкостного иммунозонда (CI probe) в PBS (pH 7,4). Теперь зонд готов к использованию.
2. Экспериментальная установка для обнаружения и измерения пептида in vitro
- Поместите функциональный наконечник зонда CI в проточную камеру, заботясь о том, чтобы никоим образом не потревожить кончик электрода, так как это может повредить сенсорный наконечник зонда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проточная камера была создана путем заливки силиконового эластомера (см. Таблицу материалов) в 35-миллиметровую культуральную посуду с удлиненным яйцевидным наполнителем пространства в центре тарелки. После затвердевания яйцевидная форма удаляется из эластомера. Затем камеру наливают трис-буферным физиологическим раствором (TBS) и пропускают скорость потока 3 мл/мин. Убедитесь, что приток и отток поддерживают уровень жидкости в камере таким образом, чтобы не наблюдалось приливного действия суперфузата. Поток должен оставаться на месте до тех пор, пока используется зонд CI. - Перед первым экспериментальным испытанием выполните стандартный запуск TBS для кондиционирования зонда CI. Настройте следующий командный протокол напряжения: положительный шаговый потенциал = +100 мВ; отрицательный шаговый потенциал = −5 мВ; длительность шага = 20 мс; продолжительность приобретения = 600 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно обеспечить уравновешивание зонда на начальном этапе циклического командного потенциала до сбора данных. - Создайте раствор интересующего пептида, используя тот же TBS для поддержания состава суперфузата. Настройте коллекторную систему, в которой суперфьюзат можно переключать между TBS и TBS, дополненным пептидами, без введения пузырьков в систему трубок или проточную камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовался синтетический пептид NPY свиней (см. Таблицу материалов). - Настройте протокол сбора данных, чувствительный к пептидам, используя стандартные параметры TBS (см. шаг 2.2.).
ПРИМЕЧАНИЕ: В данной реализации продолжительность каждого экспериментального испытания составляла 360 с (120 с TBS, 120 s пептид-дополненный TBS, 120 s TBS).
3. Адаптация зонда CI для использования in vivo
- Перед осаждением полидофамина (стадия 1.7.) проденьте открытый наконечник электрода из платиновой проволоки через подкожную иглу 22 G, оставив примерно 2 мм за кончиком иглы. Используя щипцы, аккуратно отогните назад кончик платинового проволочного электрода, создав «колючку», которая свисает с конца подкожной иглы.
- Осторожно выньте иглу из колючего наконечника, оставив достаточно проволоки, чтобы поместить ее в сосуд без контакта иглы с жидкостью. Перейдите к шагам 1.4.-1.11.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от настроек in vivo может потребоваться разрезать длину платиновой проволоки длиной более 25 см.
- Осторожно выньте иглу из колючего наконечника, оставив достаточно проволоки, чтобы поместить ее в сосуд без контакта иглы с жидкостью. Перейдите к шагам 1.4.-1.11.
- Перед подключением датчика CI к головной станции убедитесь, что вся электрическая установка правильно заземлена. Невыполнение этого требования может привести к нежелательным электрическим помехам во время экспериментальных записей.
- Обезболивайте животных после ранее опубликованного отчета10.
- Выполните операцию, чтобы обнажить интересующую область.
ПРИМЕЧАНИЕ: Срединная стернотомия была выполнена в настоящем исследовании для обнажения сердца. Пожалуйста, смотрите Kluge et al.10 для получения подробной информации о хирургии животных. - Аккуратно извлеките функционализированный наконечник из ополаскивателя PBS (шаг 1.11.), передайте гидодермическую иглу на колючий зонд C.I. и аккуратно имплантируйте его в интересующую область, прежде чем подключать золотой штифт разъема к головной сцене. После имплантации извлеките подкожную иглу, оставив электрод на месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования зонд был помещен в среднюю боковую стенку миокарда левого желудочка10. - После обеспечения надлежащей электрической настройки приступайте к стандартным и экспериментальным протоколам испытаний (шаг 2.2. и шаг 2.4.).
- По завершении экспериментов усыплите животное в соответствии с институционально утвержденными методами.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании животных усыпляют под глубоким наркозом путем индукции фибрилляции желудочков10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изготовление и определение характеристик электродов
Был изготовлен гибкий емкостный иммунозонд (зонды CI), и репрезентативное изображение изображено на рисунке 1A. Электродный потенциал устанавливали с помощью управляемой компьютером цепи зажима напряжения (рисунок 1B), и электрод погружали в раствор полидофамина, изготовленный в PBS. Полидопамин электроосаждали на кончик13 проводящего электрода для функционализации. Командный потенциал приводил в действие напряжение зонда, и измерялся зажимной ток впрыска. Измеренный ток зажима в течение одного цикла осаждения полидофамина показан на рисунке 1С. Сразу после осаждения полидофамина наконечник электрода с покрытием пропитывали в интересующем растворе антител (рисунок 2А). Все электроды использовались сразу после этих шагов.
Измерение NPY in vitro
Функционализированный антителами зонд помещали в проточную камеру и приводили в действие цепь зажима напряжения с примером командного потенциала, и показан зарегистрированный ток (фиг.2В,С). Записи in vitro проводили в трис-буферном физиологическом растворе (TBS, pH 7,4). Форма сигнала ступенчатой функции содержит положительный ступенчатый потенциал (верхняя синяя часть, рисунок 2B) и отрицательный потенциал «сброса» (нижняя красная часть, рисунок 2B). Диапазон этого командного потенциала эффективно измеряет связывание и вызывает последующее отталкивание пептидов без ухудшения чувствительности зонда10. После изготовления каждый зонд был протестирован на первоначальное кондиционирование в соответствии с командным протоколом потенциального потенциала. Следует отметить, что зонды, которые вернули наиболее стабильный и воспроизводимый начальный профиль кондиционирования, определяемый как меньший начальный распад, за которым следует стабильная базовая линия (рисунок 2D), дали наиболее воспроизводимые измерения in vitro и in vivo. Таким образом, измерение начальной стабилизации зондов CI представляет собой важную точку контроля качества для определения пригодности зонда.
Оценка чувствительности и стабильности электродов in vitro
Емкостные иммунозонды помещали в проточную камеру и наливали TBS, дополненным известными концентрациями нейропептида Y (NPY, 5-150 пМ). Емкостные токи, измеренные как пиковая амплитуда деполяризации +100 мВ, были построены со временем. Поток NPY в проточную камеру увеличивал емкостные токи по сравнению с исходной линией (60 pM NPY, рисунок 2E). Демонстрация дозозависимой токовой реакции для 5 пМ и 75 пМ NPY показана на рисунке 3А, а стандартная кривая, измеренная при всех испытанных концентрациях, приведена на рисунке 3В. Точки данных на рисунке 3B соответствовали одному экспоненциальному соответствию для целей калибровки.
Оценка in vivo профилей высвобождения нейропептидов с помощью зонда CI
Данная методика применялась к препарату для сердца свиней для оценки его пригодности для биологического применения, как описано в предыдущих публикациях10. Короче говоря, электрод CI был продет через подкожную иглу 22 G и слегка согнут назад, чтобы создать колючку (рисунок 4A). Игла и колючий электрод были вставлены в миокард левого желудочка бьющегося свиного сердца. Затем подкожную направляющую иглу извлекали из электрода, оставляя ее на месте в миокарде. Интерстициальный NPY был измерен до и в ответ на 60 с двусторонней стимуляции звездчатого ганглия (см. Kluge et al.10 для полного описания этапов моделирования). Второй отрицательный контрольный электрод без функционализации антител помещали рядом с зондом NPY. Полученные емкостные токи зажима иммунозонда были установлены против калибровочной кривой in vitro для обеспечения временно разрешенных, вызванных изменений концентраций NPY в сердечной микросреде. Повышенный NPY наблюдался во время стимуляции двустороннего звездчатого ганглия и был построен совместно с отрицательными контрольными токами C.I (рисунок 4B, верхний график). Параллельно интерстициальные уровни норадреналина (NE) также измерялись с помощью быстрой сканирующей циклической вольтамперометрии (FSCV), метода, ранее использовавшегося для оценки высвобождения катехоламинов из изолированных клеток 14,15, изолированных тканей 16,17,18 и в препарате сердца свиней 19. Норадреналин является симпатическим нейротрансмиттером, совместно высвобождаемым при стимуляции звездчатого излучения (рисунок 4B, нижний график) и показывает синхронное высвобождение с NPY, согласующееся с вызванной симпатической реакцией. Эти данные демонстрируют, что подход КИ может использоваться одновременно с другими методами обнаружения биомаркеров для оценки промежуточных микросред с высокой временной точностью. Вкратце, сенсорный электрод имплантируется в миокард, прилегающий к зонду CI. Электродный потенциал управляется через окислительные/восстановительные потенциалы передатчика с помощью цепи зажима напряжения. Поэтому, когда электродный потенциал становится положительным по отношению к потенциалу окисления для NE, NE затем окисляется до производного хинона. Электроны генерируются реакцией окисления, измеряемой как компенсирующий ток в зажатом напряжением электроде, тем самым обеспечивая индекс локального высвобождения NE. Переключение электродного потенциала обратно на отрицательную поляризацию уменьшает хиноновый продукт для регенерации катехоламин20.
Рисунок 1: Изготовление зонда CI из платиновой проволоки. (A) Для создания каждого зонда CI использовалась платиновая проволока с покрытием PFA (длиной 25 см и диаметром 127 мкм). Около 5 мм покрытия PFA было удалено с одного конца провода, который затем был припаян к позолоченному контакту разъема (шкала = 3 см). (B) Показано изображение цепи зажима напряжения, используемой для подачи командного потенциала. (C, слева) Сенсорный наконечник электрода погружали в трубку, содержащую PBS, дополненную 5 мМ дофамина. (С, справа) Полидопамин был электроосажден на сенсорный наконечник. Электроосаждение выполняли с помощью пилообразного сигнала со следующими параметрами: от −0,6 В до +0,65 В при скорости сканирования 0,04 В∙с-1. Показаны командный потенциал (вверху) и результирующий ток (внизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Измерение NPY in vitro с помощью зонда CI. (A) Полидопамин-функционализированную проволоку погружали в PBS, дополненную антителом против NPY в течение 2 ч. Это позволило антителу ковалентно связываться с поверхностью полидофамина на кончике зонда. (B) Показан командный потенциал напряжения. Положительный шаг в командном потенциале служит для измерения тока впрыска, необходимого для зажима напряжения зонда (синий), и позволяет измерять емкостный ток. Отрицательный командный потенциал (потенциал сброса) очищает связанный пептид от антитела посредством электростатического отталкивания (красный). (C) Форма сигнала команды ступенчатой функции (верхняя трассировка; +100 мВ измерение фазы до −5 мВ фазы сброса, каждая длительностью 20 мс) обеспечивает итеративное обнаружение и количественное определение пептида с временным разрешением. Показан командный потенциал и результирующая запись тока при переливании зонда с TBS (нижняя трассировка). (D) Показано уравновешивание зонда КИ в течение 6-минутного периода (см. шаг 2.2.). (E) Показан пиковый емкостный ток, измеренный функционализированным NPY зондом C.I. Зонд CI сначала наливали с tris-буферным физиологическим раствором, затем Tris-буферным физиологическим раствором, дополненным 60 pM NPY, а затем nPY-буферным физиологическим раствором без NPY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Калибровка in vitro зонда CI. (A) Емкостные токи иммунозондов измеряли с помощью функционализированного антителом NPY зонда, дополненного трис-буферным физиологическим раствором. Суперфузат был переведен на содержание 5 пМ (красный) и 75 пМ (черный) NPY. Эти записи представляют собой зависящий от концентрации сигнал, чувствительный к низкому пикомоле NPY. (B) Емкостные иммунозонды, функционализированные антителом NPY, были протестированы на чувствительность к «доза-реакция». Записи исполнялись под суперфузией с TBS; затем TBS дополняют NPY (в pM): 1, 5, 15, 25, 60, 75 и 150, а затем в промывке TBS без NPY. Пиковые значения емкостного тока (C.I. Current) измеряли в установившемся состоянии в каждой концентрации NPY и строили график по отношению к концентрации NPY. Данные о дозе-реакции были установлены для обеспечения стандартной кривой для калибровки экспериментальных данных (адаптированных из Kluge et al.10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Дифференциальное высвобождение NPY и NE, вызванное двусторонней звездчатой стимуляцией. (A) Показан зонд CI с колючим концом для использования in vivo (шкала = 3 мм). Зонд продевают через подкожную иглу 22 G и готовят, как указано на этапе 1. и шаг 2. Перед введением датчика наконечник зонда сгибается для создания колючки, а игла извлекается при введении в миокард, тем самым оставляя колючий зонд, закрепленный в стенке миокарда левого желудочка. (B) Зонд, функционализированный антителом против NPY, был вставлен в миокард левого желудочка. Идентичный зонд без функционализации антител (ø mAb) вводили непосредственно рядом и служили отрицательным контролем. Токи CI определяли в ответ на двустороннюю звездчатую стимуляцию при 10 Гц (BSG, ширина импульса 4 мс, порог 2x). Полученные токи калибровались по стандартной кривой (рисунок 3B) и строились на графике (верхний график). Высвобождение норадреналина в том же интерстициальном месте измеряли с помощью быстросканирующей циклической вольтамперометрии (нижний график). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол описывает изготовление и тестирование емкостного иммунозонда (зонда CI), способного обнаруживать и измерять биомаркеры, представляющие интерес как в условиях in vitro , так и in vivo . Обнаружение достигается путем улавливания биомаркера на кончике электрода. Событие улавливания изменяет емкостный переход между емкостным иммунозондом платиновой проволоки и окружающей средой проводящей жидкости, измеряемый как изменение тока заряда в ответ на потенциальный сдвиг в зонде. Также был представлен уникальный протокол электрического сбора, который позволяет «сбрасывать» иммунозонд между циклами обнаружения путем электростатического отталкивания захваченного биомаркера от наконечника зонда. Этот клиренс биомаркеров позволяет проводить последующие циклы измерения, обеспечивая тем самым измерение10 с временным разрешением. В этой реализации изготовление зонда включало электроосаждение полидофамин-реакционноспособного слоя на кончике тонкого платинового проволочного электрода, к которому ковалентно связано антитело, поднятое против интересующего биомаркера. Дофамин и полидофамин отличаются тем, что полидофамин содержит функциональную группу хинонов. Хиноны действуют как мишень для нуклеофильной атаки первичных аминов с образованием ковалентной связи21. Наиболее важным шагом в этом протоколе является осторожное обращение с физическим проводом, так как любое истирание функционализированного наконечника может сделать зонд CI непригодным для использования.
Кроме того, важно обеспечить стабильность зонда CI до измерения. Может потребоваться запустить несколько контрольных стандартов в трис-буферном солевом растворе до экспериментальных испытаний; при этом экспериментатор ищет стабильную переходную кривую в результирующем токе (например, рисунок 2D). Последовательная практика изготовления может свести к минимуму этот переходный сигнал, но не устранить его.
Использование соответствующих антител при исследовании биомаркеров, представляющих интерес, является еще одним важным фактором при использовании этого метода. В данной реализации лучше всего подходят антитела, характеризующиеся как применимые в методах обнаружения неденатурированных белков (например, IHC, ELISA, гибридизация in situ ), а не для применения денатурированного белка (вестерн-блот).
Использование иммунохимических методов в клинической диагностике и оценке прогрессирования сердечных заболеваний, хотя и хорошо известно1, опирается главным образом на образцы, полученные из биопсии ткани или забора сосудистого компартмента и, во-вторых, на забор интерстициальной жидкости на основе микродиализа. Образцы могут потребовать специальной подготовки, обработки и технологии для получения точных результатов, которые, в лучшем случае, обеспечивают измерение биомаркера, представляющего интерес, при временном разрешении на минутном уровне 4,5. Описанная методология емкостного иммунозонда обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с такими подходами: 1) описанное производство и применение зонда может быть адаптировано для обнаружения многих уникальных биомаркеров, имеющих значение; 2) гибкие платиновые проволочные электроды могут быть развернуты в сосудистой системе, в органах или в других жидкостных отсеках; 3) полученный сигнал обеспечивает динамические профили высвобождения биомаркеров, представляющих интерес для отдельных субъектов, с временным разрешением; 4) зонд КИ сохраняет стабильность с течением времени; 5) стабильное регистрирующее состояние может поддерживаться даже в регионах, испытывающих высокую степень механического напряжения или движения за счет гибкости самого датчика; и 6) мобильность системы позволяет динамически считывать интересующие биомаркеры с беспрецедентным разрешением in vitro, in vivo, на скамейке и, в конечном счете, у постели больного.
Метод, описанный выше, преодолевает пространственно-временные ограничения, присущие традиционному обнаружению и измерению биомаркеров на основе микродиализа. Эта методология позволяет оценивать динамические профили высвобождения на почти мгновенной основе у отдельных субъектов без необходимости объединения данных или усреднения сигналов в течение нескольких экспериментов. Использование этого подхода служит крупным технологическим достижением в обнаружении и измерении соответствующих биомаркеров для руководства процессом принятия клинических решений и терапевтическим вмешательством.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, финансовых или иных.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Олу Аджиджолу (Центр сердечной аритмии UCLA) за экспертную поддержку экспериментов in vivo . Эта работа была поддержана NIH U01 EB025138 (JLA, CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
References
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S.
- Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction. European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).
- Farrell, D. M., et al. Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).
- Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation. JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).
- Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone. Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y. JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).
- Rigel, D. F. Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT. American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).
- Kluge, N., et al. Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G.
- Prodromidis, M. I.
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318 (5849), 426-430 (2007).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells. Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).
- Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells. Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).
- Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices. The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).
- Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).
- Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C). The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).
- Chan, S. A., et al. Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).
- Chow, R. H., von Rüden, L. Single-Channel Recording, Second Edition. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 245-275 (1995).
- Ren, Y., et al. Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating. BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).
