Summary
Het protocol heeft tot doel methoden te bieden voor encefalomyosynangiose - enting van een vasculaire temporalis-spierflap op het piale oppervlak van ischemisch hersenweefsel - voor de behandeling van niet-moyamoya acute ischemische beroerte. De werkzaamheid van de aanpak bij het verhogen van angiogenese wordt geëvalueerd met behulp van een voorbijgaand midden-hersenslagader occlusiemodel bij muizen.
Abstract
Er is geen effectieve behandeling beschikbaar voor de meeste patiënten die lijden aan ischemische beroerte, waardoor de ontwikkeling van nieuwe therapieën noodzakelijk is. Het vermogen van de hersenen om zichzelf te genezen na een ischemische beroerte wordt beperkt door onvoldoende bloedtoevoer in het getroffen gebied. Encefalomyosynangiose (EMS) is een neurochirurgische procedure die angiogenese bereikt bij patiënten met de ziekte van Moyamoya. Het gaat om craniotomie met plaatsing van een vasculaire temporalis spiertransplantaat op het ischemische hersenoppervlak. EMS is nooit onderzocht in de setting van acute ischemische beroerte bij muizen. De hypothese achter deze studie is dat EMS de cerebrale angiogenese verbetert aan het corticale oppervlak rond het spiertransplantaat. Het hier getoonde protocol beschrijft de procedure en biedt de eerste gegevens die de haalbaarheid en effectiviteit van de EMS-aanpak ondersteunen. In dit protocol werden muizen na 60 minuten voorbijgaande middelste hersenslagader occlusie (MCAo) gerandomiseerd naar MCAo- of MCAo + EMS-behandeling. Het EMS werd 3-4 uur na occlusie uitgevoerd. De muizen werden 7 of 21 dagen na MCAo of MCAo + EMS-behandeling geofferd. Temporalis graft levensvatbaarheid werd gemeten met behulp van nicotinamide adenine dinucleotide gereduceerd-tetrazolium reductase assay. Een angiogenese-array van muizen kwantificeerde angiogene en neuromodulerende eiwitexpressie. Immunohistochemie werd gebruikt om transplantaatbinding met de hersenschors en verandering in vaatdichtheid te visualiseren. De voorlopige gegevens hier suggereren dat getransplanteerde spieren 21 dagen na EMS levensvatbaar bleven. Immunostaining toonde succesvolle transplantaatimplantatie en toename van de vaatdichtheid in de buurt van het spiertransplantaat, wat wijst op een verhoogde angiogenese. Gegevens tonen aan dat EMS de fibroblastgroeifactor (FGF) verhoogt en de osteopontinespiegels na een beroerte verlaagt. Bovendien verhoogde EMS na een beroerte de mortaliteit niet, wat suggereert dat het protocol veilig en betrouwbaar is. Deze nieuwe procedure is effectief en wordt goed verdragen en heeft het potentieel om informatie te verstrekken over nieuwe interventies voor verbeterde angiogenese na acute ischemische beroerte.
Introduction
Ischemische beroerte is een acute neurovasculaire verwonding met verwoestende chronische gevolgen. De meeste overlevenden van een beroerte, 650.000 per jaar, in de VS lijden aan permanente functionele handicap1. Geen van de beschikbare behandelingen verleent neuroprotectie en functioneel herstel na de acute fase van ischemische beroerte. Na een acute ischemische beroerte zijn zowel directe als collaterale bloedvoorraden verminderd, wat leidt tot disfunctie van hersencellen en netwerken, wat resulteert in plotselinge neurologische tekorten 2,3. Herstel van de bloedtoevoer naar het ischemische gebied blijft het belangrijkste doel van beroertetherapie. Het verbeteren van angiogenese om de bloedtoevoer in het ischemische gebied te bevorderen, is dus een veelbelovende therapeutische aanpak; eerder bestudeerde methoden voor het bevorderen van angiogenese na een beroerte, waaronder erytropoëtine, statines en groeifactoren, zijn echter beperkt door onaanvaardbare niveaus van toxiciteit of vertaalbaarheid4.
Encefalomyosynangiose (EMS) is een chirurgische ingreep die de cerebrale angiogenese bij mensen met de ziekte van Moyamoya verbetert, een aandoening van vernauwde schedelslagaders die vaak leidt tot een beroerte. EMS omvat gedeeltelijke loslating van een vasculair deel van de temporalis-spier van de patiënt van de schedel, gevolgd door craniotomie en enting van de spier op de aangetaste cortex. Deze procedure wordt goed verdragen en induceert cerebrale angiogenese, waardoor het risico op ischemische beroerte bij patiënten met de ziekte van moyamoya wordt verminderd 5,6. De procedure speelt dus grotendeels een preventieve rol bij deze patiënten. De angiogenese veroorzaakt door deze procedure kan ook een rol spelen bij het bevorderen van neurovasculaire bescherming en herstel in de setting van ischemische beroerte. Dit rapport ondersteunt de hypothese dat angiogenese veroorzaakt door EMS het potentieel heeft om het begrip van en therapeutische opties voor cerebrale ischemie uit te breiden.
Naast EMS zijn er verschillende farmacologische en chirurgische benaderingen om angiogenese te verbeteren, maar ze hebben verschillende beperkingen. Farmacologische benaderingen zoals toediening van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) blijken onvoldoende of zelfs schadelijk te zijn vanwege verschillende beperkingen, waaronder de vorming van chaotische, ongeorganiseerde, lekkende en primitieve vasculaire plexussen, die lijken op die in de tumorweefsels 7,8 en geen gunstige effecten hebben in klinische onderzoeken9.
Chirurgische benaderingen omvatten directe anastomose zoals oppervlakkige temporale arterie-midden hersenslagader anastomose, indirecte anastomose zoals encephalo-duro arterio-synangiose (EDAS), encefalomyosynangiose (EMS) en combinaties van directe en indirecte anastomose10. Al deze procedures zijn zeer technisch uitdagend en veeleisend bij kleine dieren, met uitzondering van EMS. Terwijl de andere procedures complexe vasculaire anastomose vereisen, vereist EMS een relatief eenvoudig spiertransplantaat. Bovendien maakt de nabijheid van de temporalis-spier tot de cortex het een natuurlijke keuze voor enten, omdat het niet volledig hoeft te worden weggesneden of losgekoppeld van de bloedtoevoer, zoals nodig zou zijn als een meer verre spier zou worden gebruikt voor enten.
EMS is onderzocht in chronische cerebrale hypoperfusiemodellen bij ratten 7,11. EMS met behulp van een temporalis-spiertransplantaat is echter nooit onderzocht bij acute ischemische beroerte bij knaagdieren. Hier beschrijven we een nieuw protocol van EMS bij muizen na een ischemische beroerte via het midden van het occlusiemodel van de hersenslagader (MCAo). Dit manuscript dient als een beschrijving van methoden en vroege gegevens voor deze nieuwe benadering van EMS bij muizen na MCAo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van UConn Health en uitgevoerd in overeenstemming met de Amerikaanse richtlijnen. Het volgende protocol zou moeten werken bij elke soort of stam van knaagdieren. Hier werden 8- tot 12 weken oude, leeftijds- en gewichtsgematchte C57BL / 6 wild-type mannelijke muizen gebruikt. Muizen kregen standaard chow dieet en water ad libitum. De standaardhuisomstandigheden werden gehandhaafd op 72,3 ° F en 30% -70% relatieve vochtigheid met een licht / donkercyclus van 12 uur.
1. Voorbereiding vóór de operatie
- Steriliseer alle instrumenten door voorafgaand aan de operatie te autoclaveren. Ontsmet het bedieningsoppervlak met 70% ethanol en verwarm het bedieningsoppervlak tot 37 °C met een elektrisch verwarmingskussen.
- Gebruik een inductiekamer om de muis te verdoven met 4% -5% isofluraan voor inductie. Lever 1,5% -2,0% isofluraan via neuskegel voor onderhoud tot het einde van de operatie. Zorg er voorafgaand aan de operatie voor dat de muis goed wordt verdoofd door het gebrek aan een reactie op een stevige achtervoetkneling en het verlies van de houdingsreactie en de rechtzettingsreflex te beoordelen.
- Plaats de muis aan de linkerkant op het operatieoppervlak en breng oogzalf aan om beide ogen te beschermen.
- Scheer haar over het chirurgische veld (d.w.z. rechter laterale schedel tussen oog en oor) met elektrische tondeuses. Reinig het chirurgische veld in concentrische cirkels naar buiten vanuit het midden van de chirurgische plaats, met 70% ethanol gevolgd door povidonoplossing, en herhaal deze stappen 2x.
OPMERKING: Omdat de operatieplaats dicht bij het oog ligt, is het verwijderen van 150% van het gebied rond een chirurgische plaats mogelijk niet mogelijk om irritatie of accidenteel letsel aan het oog te voorkomen. - Dien een enkele dosis van 0,25% bupivacaïne (tot 8 mg/kg lichaamsgewicht) toe door subcutane injectie als preoperatieve analgesie op de plaats van de operatie.
- Stel een chirurgische microscoop in op 4x vergroting. De microscoop wordt gebruikt voor alle chirurgische stappen.
2. Chirurgische ingreep
OPMERKING: De operatiestappen zijn weergegeven in figuur 1. Voor dit protocol werden drie muizen toegewezen aan de schijngroep, drie muizen voor EMS alleen, 12 muizen voor MCAo en 23 muizen voor MCAo + EMS-groep.
- MCAo operatie
OPMERKING: MCAo is een goed gekarakteriseerd model van ischemische beroerte bij knaagdieren, zoals beschreven door ons en anderen 12,13,14. De operatiestappen worden hier in het kort beschreven. Focale voorbijgaande cerebrale ischemie werd geïnduceerd door een 60 min rechter MCAo onder isofluraan anesthesie gevolgd door reperfusie gedurende 7 of 21 dagen.- Maak een ventrale halsincisie in de middellijn gevolgd door eenzijdige rechter MCAo door een 10-11 mm lang 6,0 siliconen rubberen gecoat monofilament uit de interne halsslagader bifurcatie te bevorderen via een externe halsslagaderstomp. Voer bij schijnmuizen identieke operaties uit, behalve voor de voortgang van de hechting in de interne halsslagader.
- Meet rectale temperaturen met behulp van een temperatuurregelsysteem en houd de temperatuur tijdens de operatie op ~ 37 ° C met een automatisch verwarmingskussen.
- Gebruik laser Doppler flowmetrie om de cerebrale bloedstroom te meten voorafgaand aan het inbrengen van de hechtdraad door de Doppler-sonde tegen de laterale schedel te plaatsen (overeenkomend met het MCA-territorium) en de waarde8 te registreren. Om occlusiereductie tot 15% van de cerebrale bloedstroom bij baseline te bevestigen, gebruikt u dezelfde procedure nadat de hechting is gevorderd. Om reperfusie te bevestigen, gebruikt u dezelfde procedure nadat de hechting is verwijderd.
- Voer alle dieren met natte puree tot het offer en/of 1 week na de operatie om te zorgen voor voldoende voeding voor chronische eindpunten, omdat dieren foktekorten hebben na een beroerte.
- EMS-chirurgie
- Na 60 minuten MCAo, randomiseer muizen in MCAo-only of MCAo + EMS-groepen. Voer EMS 4 uur na MCAo (MCAo + EMS-groep) of schijnchirurgie uit voor geselecteerde experimenten (EMS-only groep). Verander in een nieuw paar steriele chirurgische handschoenen voor de operatie.
OPMERKING: De muizen herstelden van anesthesie na 60 minuten MCAo en werden opnieuw verdoofd vóór de EMS-operatie. - Voor groepen die EMS (MCAo + EMS of EMS-only groepen) ontvangen, maakt u een 10-15 mm huidincisie met een schaar, die zich uitstrekt van 1-2 mm rostral tot het rechteroor tot 1-2 mm caudaal tot het rechteroog.
OPMERKING: Steriele scharen werden gebruikt om onbedoelde schade aan de temporalis-spieren eronder te voorkomen. - Trek huidflappen in met behulp van klemmen en identificeer visueel de temporalis-spier en de schedel.
- Ontleed de temporalisspier botweg weg van de schedel met een schaar met een spreidtechniek. Voer een 2-3 mm myotomie ventraal gericht langs de caudale rand van de spier uit om ventrale reflectie te vergemakkelijken.
- Voer een craniotomie ~ 5 mm in diameter uit op de schedel onder de gereflecteerde temporalis-spier met behulp van een microboor.
- Verwijder de dura mater met een pincet om het piale oppervlak van de hersenen bloot te leggen. Wees uiterst voorzichtig om accidenteel letsel aan de hersenen te voorkomen.
- Hecht de dorsale rand van de temporalis-spier aan het onderhuidse weefsel van de dorsale huidflap met 6-0 monocrylfilamenten, waardoor deze gelijk is aan de blootgestelde hersenschors.
- Sluit de huidincisie met 6-0 monofilament hechting. Plaats de muis terug in de kooi en controleer tot herstel van de anesthesie. Breng de muis terug naar de behuizing.
- Na 60 minuten MCAo, randomiseer muizen in MCAo-only of MCAo + EMS-groepen. Voer EMS 4 uur na MCAo (MCAo + EMS-groep) of schijnchirurgie uit voor geselecteerde experimenten (EMS-only groep). Verander in een nieuw paar steriele chirurgische handschoenen voor de operatie.
3. Postoperatieve overwegingen
- Controleer de muizen dagelijks op ziekte en de chirurgische plaats op infectie. Geef dagelijks een onderhuidse normale zoutoplossing (1% volume per lichaamsgewicht) om de hydratatie te ondersteunen.
- Controleer op ernstige uitdroging (verlies van lichaamsgewicht >20%) tot 7 dagen na de operatie. Dien een extra bolus van subcutaan normaal zoutoplossing 1% volume per lichaamsgewicht toe als >20% gewichtsverlies.
- Ga verder met injecties, fysiologische monitoring en andere tests zonder speciale overwegingen.
OPMERKING: In deze procedure werd het gebruik van opioïden of niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) voor de behandeling na de operatie vermeden vanwege de bekende effecten van deze middelen op de uitkomst van een beroerte of de grootte van het infarct in overleg met de interne institutionele dierverzorging en het gebruikscomité 15,16,17,18. Het gebruik van postoperatieve analgesie wordt echter sterk aangemoedigd voor EMS-chirurgie met andere modellen. Raadpleeg hiervoor de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In totaal werden 41 muizen gebruikt voor deze studie. Na drie sterfgevallen, één in MCAo en twee in MCAo + EMS, werden in totaal 38 muizen gebruikt voor het verkrijgen van de getoonde resultaten.
Statistiek
Gegevens van elk experiment worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (S.D.). Significantie werd bepaald met behulp van ofwel ongepaarde student t-test voor het vergelijken van twee groepen of eenrichtings-ANOVA voor meer dan twee groepen, met een Newman-Keuls post-hoc test om te corrigeren voor meerdere vergelijkingen.
Nicotinamide adenine dinucleotide (gereduceerd)-tetrazolium reductase (NADH-TR) kleuring
Deze kleuring werd gedaan om de levensvatbaarheid op lange termijn van de getransplanteerde spier te beoordelen, zoals in Turoczi et al.19. Kortom, op het moment van opoffering werd de geënte spierflap zorgvuldig weggesneden, gedurende 30 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gecryopreserveerd in een optimaal snijtemperatuurmedium (OCT) bij -80 °C. Verschillende 12 μm dikke cryosecties van temporalis spierweefsel werden gekleurd voor NADH-TR enzym-histochemische reactie. Dia's werden gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C in een oplossing van nitroblauw tetrazolium (1,8 mg/dl) en NADH (15 mg/dl) in een Tris-buffer van 0,05 M (pH 7,6). Ongebruikt tetrazoliumreagens werd verwijderd met toenemende gevolgd door dalende acetonconcentraties. Kwantitatieve beoordeling van NADH-tetrazolium-gekleurde spieren werd uitgevoerd op spierbeelden gemaakt bij 40x vergroting.
Immunostaining studies
Immunostaining werd gebruikt om spiertransplantatiebinding met cortex en bloedvatdichtheid op de kruising van spier en cortex te visualiseren20,21. Voor visualisatie van spierbinding met hersenweefsel werden hier muizen gebruikt die een EMS-operatie hadden ondergaan. Aan het einde van elk respectievelijk tijdstip werden muizen verdoofd met een avertine-injectie (50 mg / kg lichaamsgewicht), gevolgd door perfusie met 1x PBS met 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en fixatie met 4% paraformaldehyde. De schedel werd zorgvuldig doorgesneden om onbedoelde loslating van temporalis spier (TM) graft uit de hersenschors te voorkomen. TM-transplantaat boven de hersenschors werd vervolgens gescheiden van de resterende temporalis-spier. De hersenen werden zorgvuldig verwijderd en 's nachts gefixeerd in 4% paraformaldehyde. De vaste hersenen werden vervolgens uitgedroogd met 30% sucrose in 1x PBSuntil de hersenen verzonken naar de bodem van de injectieflacon (ongeveer 1-3 dagen). Weefselsecties van 30 μm groot werden gesneden met vriesmicrotoom en op dia's gemonteerd.
Voor immunostaining van bloedvaten in de ipsilaterale hersenschors werden MCAo- en MCAo + EMS-muizen opgeofferd, doordrenkt, gefixeerd en verwerkt zoals hierboven. Hersenplakken van 30 μm groot werden op een ijskoude microtoom gesneden en aan een glazen kant gemonteerd. Het ophalen van antigeen werd gedaan met behulp van citraatbuffer (pH 6,0) en secties werden geïncubeerd met blokkerende buffer gevolgd door incubatie 's nachts met primaire antilichamen, anti-alfa-skeletspieractine 1:200 en Lectine-Dy594 21,22. Drie coronale hersensecties per muis (n = 5 muizen/groep; totaal = 15 secties) werden genomen tussen 0,45 mm en 0,98 mm van bregma, gekleurd en gevisualiseerd voor kwantificering bij 20x vergroting op de kruising van de ischemische kern en penumbragebieden. Een geblindeerde waarnemer kwantificeerde lectine positieve vaatdichtheid in het hersenparenchym met behulp van ImageJ-software.
Spiertransplantaat blijft levensvatbaar op 21 dagen na EMS
Een voorwaarde voor het succes van deze operatie is de levensvatbaarheid op lange termijn van de getransplanteerde temporalisspier. Het TM-transplantaat toonde voorbijgaande schade aan spiercellen 7 dagen na de operatie in getransplanteerde spier versus controlespier (71,32% spierceloverleving ± 16,64% vs. 97,19% ± 3,81%). Dit verschil tussen getransplanteerde en de controlespier verdween echter en de spieren herstelden volledig 21 dagen na de operatie (98,22% ± 3,965 versus 96,87% ± 2,27%; Figuur 2A).
Spiertransplantaten maken losse bindingen met hersenweefsel
Het succesvol enten van de temporalis-spier op het oppervlak van de hersenschors is een belangrijke vereiste voor het succes van dit model. In zowel het EMS + MCAo- als het EMS-only model hechtten de temporalis-spiertransplantaten zich 21 dagen na EMS aan het corticale oppervlak, wat wijst op succesvolle chirurgie, transplantaatimplantatie en binding (figuur 1B en figuur 2B).
De bloedvatdichtheid neemt toe in de perilesionele cortex na EMS
Acute beroerte leidt tot acute vermindering van de cerebrale bloedstroom, belemmerde rekrutering van collaterale bloedvaten, abnormale vasculaire kieming en disfunctionele angiogenese, die bijdragen aan slechte beroerte-uitkomsten23. EMS verhoogt het oppervlak van het bloedvat en de geïntegreerde dichtheid in de perilesionele cortex na een beroerte aanzienlijk (p < 0,05 versus alleen MCAo; Figuur 3).
Analyse van angiogene en neuromodulerende eiwitten
Een angiogenese-array voor muizen werd gebruikt om de expressie van angiogene en neuromodulerende eiwitten 7 dagen en 21 dagen na MCAo te vergelijken bij MCAo-only versus MCAo + EMS-muizen volgens de instructies van de fabrikant24. ImageJ-software werd gebruikt om de pixeldichtheid te kwantificeren voor elk datapunt van de eiwitpuntvlek. Gegevens werden geregistreerd als de verhouding van de dichtheid van elk geanalyseerd eiwit tot de gemiddelde dichtheid van de normen voor elke vlek.
Fibroblast groeifactor (FGF)-zuur is upregulated en osteopontine is downregulated na EMS
Eiwitarrayresultaten toonden een significante toename van eiwitniveaus van FGF-zuur (0,677 ± 0,007 versus 0,585 ± 0,014, p = 0,045), een krachtige angiogene factor, en een afname van osteopontinespiegels, een multifunctioneel molecuul dat tot expressie komt in inflammatoire omstandigheden (0,692 ± 0,007 vs. 0,758 ± 0,014, p = 0,048) in de MCAo + EMS-groep 21 dagen na beroerte, wat wijst op verbeterde angiogenese en neuroprotectie (figuur 4A).
Sterfte-uitkomsten voor EMS na beroerte
Zowel MCAo als EMS zijn invasieve chirurgische technieken die enige sterfte bij muizen kunnen veroorzaken. In dit experiment was er tussen 10% -11% mortaliteit bij muizen 21 dagen na MCAo-operatie, wat een geaccepteerd sterftecijfer is voor muizen die werden onderworpen aan 60 minuten MCAo14. Het uitvoeren van EMS op muizen na MCAo verhoogde de mortaliteit niet (figuur 4B), wat wijst op tolerantie van EMS-chirurgie, zelfs na MCAo.
Figuur 1. Stapsgewijze EMS-procedure na occlusie van de middelste hersenslagader (MCAo): (A) Stap 1. Een huidincisie wordt gemaakt over het rechter middelste hersenslagadergebied. De huid en onderhuidse weefsels worden gereflecteerd, waardoor de schedel en temporalis-spier worden blootgesteld. Stap 2. De temporalisspier wordt weggesneden van de schedel en ventraal gereflecteerd. Stap 3. Een craniotomie wordt uitgevoerd (4-5 mm) en de dura wordt voorzichtig verwijderd. Stap 4. De temporalis-spier wordt direct op het hersenoppervlak geplaatst om de blootgestelde cortex te bedekken. Stap 5. De dorsale rand van de temporalis-spier wordt gehecht aan het onderhuidse weefsel van de dorsale huidflap, gelijk met het hersenoppervlak. Stap 6. De incisie wordt gesloten en de muis wordt uit de anesthesie gehaald en teruggebracht naar zijn kooi. Dit deel van het cijfer is gewijzigd van25. (B) Conceptueel schema voor encefalomyosynangiose (EMS) behandeling van MCAo-geïnduceerde beroerte. Afkortingen: FGF = Fibroblast groeifactor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Immunostaining studies. (A) Temporalis spiertransplantaten behouden levensvatbaarheid. Temporalis spiertransplantaten (EMS) op ischemisch cortexweefsel behouden een hoge levensvatbaarheid. (Links) Representatief beeld van nicotinamide adenine dinucleotide (gereduceerd)-tetrazolium reductase-gekleurde spierweefselcellen van controle (naïeve spier van contralaterale zijde) en getransplanteerde spier 7 dagen na middelste cerebrale arterie occlusie (MCAo) + encefalomyosynangiose (EMS) chirurgie. Zwarte pijl () toont beschadigde cellen. (Rechts) Kwantificering van levende/dode spiercellen. Spiercellen vertonen 7 dagen na EMS enige lichte schade (p < 0,1; t-test) die volledig hersteld is na 21 dagen. (n = 5 muizen/tijdspunten = totaal 10 muizen in deze groep) De gegevens zijn gemiddeld ± S.D. Schaalbalk = 20 μm. (B) Binding van getransplanteerde temporalisspier met hersenschors 21 dagen na EMS-operatie. EMS-weefsels gekleurd met anti-alfa-skeletspieractine (groen) en Lectine-Dy594 (rood; bloedvatmarker) antilichaam (n = 3 muizen). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Encefalomyosynangiose (EMS) chirurgie verhoogt de bloedvatdichtheid in ischemische laesies 21 dagen na een beroerte. (A) Representatieve beelden van coronale hersensecties van muizen onderworpen aan (links) middelste hersenslagader occlusie (MCAo) of (rechts) MCAo + EMS en gekleurd met L. esculentum (Tomaat) Lectine-Dy594, dat bindt aan glycoproteïnen in het basale membraan van endotheelcellen. Grafieken zijn gekwantificeerde gebieden. MCAo + EMS-muizen vertoonden een hoger endotheelnetwerk met behulp van parameters, namelijk vasculaire fractiegebied (B) en geïntegreerde dichtheid (C). **p < 0,01 (ongepaarde t-test), terwijl MCAo-only muizen schade vertoonden dicht bij de ischemische laesie (stippellijn). N = 5 muizen/groep= 10 muizen in totaal. De gegevens zijn gemiddeld ± S.D. Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: Contra = contralaterale zijde; Ipsi =ipsilaterale zijde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Encefalomyosynangiose moduleert angiogene eiwitten na een beroerte. (A) Een angiogenese-array bij muizen (ARY015) werd gebruikt om tegelijkertijd de relatieve niveaus van 53 angiogenese-gerelateerde eiwitten van muizen na occlusie van de middelste hersenslagader (MCAo) en MCAo + EMS (dag 21 na MCAo) in hersenweefsellysaten uit de perilesionale cortex te beoordelen. Kwantitatieve analyse toont aan dat EMS-chirurgie osteopontine aanzienlijk verminderde en de fibroblastgroeifactor (FGF) verhoogde - zuur eiwit na een beroerte (* p < 0,05 of ** p < 0,01) versus ipsilaterale MCAo. Gegevens zijn gemene ± S.D.; n = 3 muizen/groep/tijdspunt = totaal 15 muizen. (B) EMS verhoogde de mortaliteit na een beroerte (MCAo) niet. De overlevingscurve van Kaplan Meier laat zien dat EMS + MCAO de mortaliteit na een beroerte niet veranderde ten opzichte van MCAO alleen (p = 0,54). Voor EMS n = 3; voor MCAo n = 11; en voor MCAo + EMS n = 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een succesvolle EMS-procedure in een muismodel van MCAo-geïnduceerde beroerte. De gegevens tonen aan dat getransplanteerd weefsel levensvatbaar blijft en lang na ems-chirurgie banden kan vormen met de hersenschors. Deze bevindingen ondersteunen de reden voor het gebruik van een cerebraal spiertransplantaat om geleidelijk een rijk vasculaire trofische omgeving te ontwikkelen op de plaats van een beroerte. EMS is een veelbelovende therapie voor het mogelijk herstellen van infarcten hersenweefsel in dezelfde omgeving.
De kritieke stappen van het protocol omvatten stap 2.2.4: deze stap veroorzaakt onvermijdelijk trauma aan de TM, wat het vermogen om zich te binden aan de cortex en trofische factoren vrij te geven kan verminderen. Zorg ervoor dat TM trauma zoveel mogelijk wordt beperkt. Een alternatieve strategie om weefseltrauma te verminderen is om de TM botweg uit de schedel te ontleden alleen aan de dorsale rand en af te zien van de myotomie. In dit geval zou de TM van de schedel worden weggehaald (in plaats van volledig gereflecteerd) en zou de craniotomie worden uitgevoerd met de craniotomie-boor onder de spier. Dit vermindert de hoeveelheid beschikbare ruimte om deze stap uit te voeren, maar kan opnieuw TM-trauma verminderen. Verder is extreme zorg en oefening noodzakelijk in stappen 2.2.5 en 2.2.6, om letsel aan de onderliggende hersenschors tijdens craniotomie en manipulatie van de dura te voorkomen.
Dit EMS-model is een natuurlijke aanvulling op het gevestigde MCAo-model. Omdat het MCAo-model de pathofysiologie van ischemie en vasculaire netwerkschade, die gebruikelijk is bij menselijke patiënten, nauwkeurig simuleert, heeft het MCAo + EMS-model waarschijnlijk een hoge mate van vertaalbaarheid naar mensen. Het HIER gepresenteerde EMS-model is de eerste therapeutische interventie die is bestudeerd voor ischemische beroerte in de preklinische setting die alleen afhankelijk is van autoloog weefsel. Bovendien, omdat het TM-transplantaat organisch en autoloog is, kan het paracriene signaleringsinteracties vertonen met de aangrenzende gewonde hersenen die dienen om de afgifte van trofische factoren op verschillende tijdstippen tot optimale niveaus te reguleren.
Hoewel een beroerte een proangiogene omgeving creëert en de angiogenese zelf stimuleert26, is de intrinsieke respons na een beroerte niet voldoende om de vasculaire toevoer in het beschadigde gebied te verbeteren als gevolg van subthresholdniveaus van angiogene factoren. Hier verbeterde EMS de FGF-zure eiwitexpressie verder in vergelijking met dieren met alleen een beroerte. Dit eiwit regelt indirect de neovascularisatie in combinatie met andere groeifactoren. FGF-zuur werkt ook als een neurotrofe factor en bevordert neuroprotectie en neurogenese27,28. Sommige van de neuroprotectieve effecten van FGF-zuur worden gemedieerd door activering van AKT- en MAPK/EPK-routes29. Naast FGF was er ook een verminderde expressie van het eiwit osteopontine. Osteopontine is een pro-inflammatoir, pleotroop cytokine dat steeds meer wordt erkend voor zijn rol in meerdere neuropathologieën en weefselremodelleringsprocessen, naast andere functies. De rol van osteopontine bij een beroerte is nog onzeker30. Recente studies bij mensen wijzen echter op osteopontine als een slechte prognostische factor na een beroerte. Een afname van de serumostepontinespiegels na een beroerte werd aangetoond in één studie om gunstige uitkomsten te voorspellen (gemodificeerde Rankin-schaalscore < 2 na 90 dagen) bij menselijke patiënten met beroerte31. Een andere studie toonde een dosisafhankelijke relatie tussen hogere niveaus van plasma-osteopontine en uitkomsten van overlijden en invaliditeit bij menselijke patiënten na beroerte32. In overeenstemming met deze klinische studies suggereren de gegevens hier dat verminderde osteopontine na EMS een ontstekingsremmende omgeving kan bevorderen om de vorming van neovaten te verhogen. Over het algemeen wijst de differentiële expressie van FGF-zure en osteopontine in de richting van mechanismen die de angiogenese regelen na EMS in dit muismodel en verhoogt de kans dat de procedure die naast angiogenese ook neuroprotectie en neuroregeneratie kan veroorzaken.
Er zijn enkele mogelijke beperkingen van deze procedure. Het meten van de cerebrale stroming als gevolg van verhoogde bloedvatdichtheid is een uitdaging in deze procedure, omdat veelgebruikte procedures van laser Doppler of laser speckle flowmeter worden beïnvloed door de aanwezigheid van temporalis-spieren op de bovenkant van de cortex die echte bloedmeting op corticale oppervlak voorkomen. Deze procedure kan dus een meer geavanceerde, maar zelden beschikbare, kleine MRI-scan van knaagdieren nodig hebben als realtime stroommeting vereist is. Het gebruik van bloedvatdichtheidsmeting ondersteunt echter indirect het succes van de EMS-procedure bij het verbeteren van angiogenese, zoals gesuggereerd door onze gegevens. Een andere beperking is de invasieve aard van EMS-interventies op de top van MCAo, wat zelf een invasieve procedure is. Hoewel er in deze studie geen verhoogde mortaliteit met EMS was in vergelijking met alleen MCAo, kan de vereiste voor hemicraniectomie de toekomstige vertaalbaarheid voor alle soorten beroertes beperken. In de klinische praktijk heeft >10% van de patiënten met een grote ischemische beroerte echter hemicraniectomie nodig om verhoogde intracraniale druk te beheersen23, en dit EMS-model kan translationele waarde hebben voor deze subgroep van patiënten met een beroerte in het bijzonder. Ten slotte werd het tijdspunt van 4 uur na MCAo voor de prestaties van EMS gekozen om binnen het standaardbehandelingsvenster van rT-PA voor de meeste menselijke patiënten te vallen, hoewel toekomstige studies latere tijdstippen zullen gebruiken om het therapeutische venster voor EMS te evalueren.
Over het algemeen biedt het EMS-model een goed verdragen optie voor het induceren van angiogenese na ischemische beroerte, en naast de mogelijke klinische vertaling kan het worden gebruikt in toekomstige studies die de pathofysiologie van beroerte en angiogenese onderzoeken.
Het hier beschreven EMS-model biedt een veilige methode voor het bereiken van cerebrale angiogenese voor preklinisch onderzoek, waardoor farmacologische interventies, die vaak leiden tot ongewenste bijwerkingen of ongecontroleerde angiogenese, worden vermeden. Veel patiënten met grote ischemische beroertes hebben een hemicraniectomie nodig tijdens hun klinische beloop om de toenemende intracraniale druk te beheersen. Deze EMS-procedure, die ook hemicraniectomie bij muizen voor spiertransplantatie omvat, kan preklinisch proof of concept bieden voor translationele toepassing van EMS bij ischemische beroerte. Daarom heeft dit model het potentieel om de kennis van neurovasculair herstel na een ischemische beroerte uit te breiden en de ontwikkeling van innovatie, die de behoefte van het uur zijn, in therapeutica voor overlevenden van een beroerte te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Research Excellence Program-UConn Health (naar Ketan R Bulsara en Rajkumar Verma) en UConn Health start-up (naar Rajkumar Verma).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 monocryl suture | Ethilon | 697G | |
| 70% ethanol to sanitize operating surface | Walgreens | ||
| Bupivacaine 0.25% solution | Midwest Vet | ||
| Clamps for tissue retraction | Roboz | ||
| Doccal suture with silicone coating | Doccal Corporation | 602145PK10Re | |
| Electric heating pad for operating surface | |||
| Isoflurane anesthesia | Piramal Critical Care Inc | ||
| Isoflurane delivery apparatus | B6Surgivet (Isotech 4) | ||
| Micro drill | Harvard Apparatus | ||
| Microdissecting tweezers, curved x2 | Piramal Critical Care Inc | ||
| mouse angiogenesis panel arrat | R& D biotech | ARY015 | |
| Needle driver | Ethilon | ||
| Ointment for eye protection | Walgreens | ||
| Operating microscope | Olympus | ||
| Operating surface | Olympus | ||
| Povidone iodine solution | Walgreens | ||
| Rectal thermometer | world precison instrument | ||
| Saline or 70% ethanol for irrigation | Walgreens | ||
| Small electric razor to shave operative site | Generic | ||
| Surgical scissors | Roboz |
References
- Stroke,
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
- Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
- Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
- Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
- Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
- Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
- Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
- Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
- Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
- Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
- Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
- Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
- Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
- Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
- Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
- Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
- Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
- Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P.
- Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
- Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
- Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
- Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
- Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
- Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
- Meller, R., et al.
- Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
- Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).
