Summary
このプロトコルは、脳筋結合症(虚血性脳組織の髄面に血管側頭筋皮弁を移植する)の方法を提供することを目的としています-非モヤモヤ急性虚血性脳卒中の治療用。血管新生の増加におけるこのアプローチの有効性は、マウスの一過性中大脳動脈閉塞モデルを使用して評価されます。
Abstract
虚血性脳卒中を患っているほとんどの患者に利用可能な効果的な治療法はなく、新しい治療法の開発が不可欠です。虚血性脳卒中後の脳の自己治癒能力は、患部での不十分な血液供給によって制限されます。脳筋シナジア症(EMS)は、モヤモヤ病患者の血管新生を達成する脳神経外科手術です。それは虚血性脳表面に血管側頭筋移植片を配置する開頭術を含む。EMSは、マウスの急性虚血性脳卒中の設定で研究されたことはありません。この研究を推進する仮説は、EMSが筋移植片周囲の皮質表面での脳血管新生を促進するというものです。ここに示すプロトコルは、手順を説明し、EMSアプローチの実現可能性と有効性をサポートする初期データを提供します。このプロトコールでは、一過性中大脳動脈閉塞(MCAo)の60分後に、マウスをMCAoまたはMCAo+EMS処置のいずれかに無作為化した。EMSは閉塞後3〜4時間で実施した。MCAoまたはMCAo+EMS処置の7または21日後にマウスを屠殺した。側頭筋移植片の生存率は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型テトラゾリウムレダクターゼアッセイを用いて測定した。マウス血管新生アレイは、血管新生および神経調節タンパク質発現を定量化した。免疫組織化学を用いて、脳皮質との移植片結合および血管密度の変化を可視化した。ここでの予備データは、移植された筋肉がEMSの21日後に生存可能なままであったことを示唆しています。免疫染色は、移植片移植の成功と筋移植片近傍の血管密度の増加を示し、血管新生の増加を示しました。データは、EMSが線維芽細胞成長因子(FGF)を増加させ、脳卒中後のオステオポンチンレベルを低下させることを示しています。さらに、脳卒中後のEMSは死亡率を増加させなかったため、プロトコルが安全で信頼できることが示唆されました。この新しい手順は効果的で忍容性が高く、急性虚血性脳卒中後の血管新生の増強のための新しい介入の情報を提供する可能性があります。
Introduction
虚血性脳卒中は、壊滅的な慢性後遺症を伴う急性神経血管損傷です。米国の脳卒中生存者のほとんどは、年間65万人で、永続的な機能障害に苦しんでいます1。利用可能な治療法のいずれも、虚血性脳卒中の急性期後の神経保護と機能回復をもたらしません。.急性虚血性脳卒中の後、直接血液供給と側副血液供給の両方が減少し、脳細胞とネットワークの機能不全につながり、突然の神経学的欠損を引き起こします2,3。虚血領域への血液供給の回復は、脳卒中治療の最も重要な目標であり続けています。したがって、虚血領域における血液供給を促進するために血管新生を増強することは、有望な治療アプローチである。しかし、エリスロポエチン、スタチン、成長因子など、脳卒中後の血管新生を促進するために以前に研究された方法は、許容できないレベルの毒性または翻訳可能性によって制限されてきました4。
脳筋膜症(EMS)は、脳卒中につながることが多い頭蓋動脈が狭窄した状態であるモヤモヤ病のヒトの脳血管新生を促進する外科的処置です。EMSには、頭蓋骨からの患者の側頭筋の血管部分の部分的な剥離、それに続く開頭術および罹患皮質への筋肉の移植が含まれる。この手順は忍容性が高く、脳血管新生を誘発し、モヤモヤ病患者の虚血性脳卒中のリスクを軽減します5,6。したがって、この手順は、これらの患者において主に予防的役割を果たす。この手順によってもたらされる血管新生はまた、虚血性脳卒中の設定における神経血管の保護および回復を促進する役割を有する可能性がある。本報告は、EMSがもたらす血管新生が脳虚血の理解と治療選択肢を広げる可能性があるという仮説を支持しています。
EMSの他に、血管新生を改善するためのいくつかの薬理学的および外科的アプローチがありますが、それらにはいくつかの制限があります。血管内皮増殖因子(VEGF)投与などの薬理学的アプローチは、腫瘍組織に見られるものに似ており、臨床試験では有益な効果を有さない、混沌とした、混乱した、漏出性のある、原始的な血管神経叢の形成を含むいくつかの制限のために不十分または有害でさえあることがわかっています7,8。
外科的アプローチには、表在側頭動脈-中大脳動脈吻合などの直接吻合、脳二重動脈シナジア症(EDAS)、脳筋結合症(EMS)などの間接吻合、および直接および間接吻合の組み合わせが含まれます10。これらの手順はすべて、EMSを除いて、小動物では非常に技術的に困難で要求が厳しいものです。他の手順では複雑な血管吻合が必要ですが、EMSでは比較的単純な筋移植が必要です。さらに、側頭筋が皮質に近接しているため、より遠い筋肉を移植に使用する場合のように、完全に切除したり血液供給から切り離したりする必要がないため、移植に自然な選択になります。
EMSは、ラット7,11の慢性脳低灌流モデルで研究されています。しかし、側頭筋移植を用いたEMSは、げっ歯類の急性虚血性脳卒中において研究されたことがない。ここでは、中大脳動脈閉塞モデル(MCAo)を介した虚血性脳卒中後のマウスにおけるEMSの新しいプロトコルについて説明します。この原稿は、MCAo後のマウスにおけるEMSのこの新しいアプローチの方法と初期のデータの説明として機能します。
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Protocol
すべての実験は、UConn Healthの施設動物管理および使用委員会によって承認され、米国のガイドラインに従って実施されました。次のプロトコルは、げっ歯類のあらゆる種または系統で機能するはずです。ここでは、8〜12週齢の年齢と体重が一致したC57BL / 6野生型雄マウスを使用しました。マウスには、標準的な飼料飼料および水を 自由摂取させた。標準的な住宅条件は、72.3時間の明暗サイクルで70%〜70%の相対湿度で12%〜12%に維持されました。
1.手術前の準備
- 手術前にオートクレーブ滅菌してすべての器具を滅菌してください。操作面を70%エタノールで消毒し、電気加熱パッドで操作面を37°Cに温めます。
- 誘導チャンバーを使用して、誘導のために4%〜5%イソフルランでマウスを麻酔します。手術終了まで維持のために、ノーズコーン を介して 1.5%〜2.0%のイソフルランを送達する。手術の前に、しっかりとした後ろ足のつまみに対する反応の欠如と姿勢反応と直正反射の喪失を評価することにより、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。
- マウスを手術面の左側に置き、両目を保護するために目の軟膏を塗ります。
- 電気バリカンで手術野(つまり、目と耳の間の右外側頭蓋骨)の上で髪を剃ります。手術部位の中央から外側に同心円状に手術野を洗浄し、70%エタノールとそれに続くポビドン溶液で、これらの手順を2回繰り返します。
注意: 手術部位が目に近いため、手術部位の周囲の領域を150%除去しても、眼への刺激や偶発的な損傷を回避できない場合があります。 - 手術部位での術前鎮痛として、皮下注射により0.25%ブピバカイン(最大8 mg / kg体重)の単回投与を投与します。.
- 4倍の倍率で手術用顕微鏡を設置します。顕微鏡はすべての手術ステップに使用されます。
2.手術手順
注:手術の手順は 図1に示されています。このプロトコルのために、3匹のマウスを偽群に、3匹のマウスをEMS単独に、12匹のマウスをMCAoに、23匹のマウスをMCAo+EMS群に割り付けた。
- MCAo手術
注:MCAoは、私たちや他の人が説明しているように、げっ歯類の虚血性脳卒中の十分に特徴付けられたモデルです12,13,14。手術の手順はここで簡単に説明されています。限局性一過性脳虚血は、イソフルラン麻酔下で60分間の右MCAoとそれに続く7または21日間の再灌流によって誘発されました。- 内頸動脈分岐部から外頸動脈断端 を介して 長さ10〜11 mmの6.0シリコーンゴムコーティングモノフィラメントを進めることにより、正中線腹頸部切開を行い、続いて片側右MCAoを行います。偽マウスでは、縫合糸が内頸動脈に進んだことを除いて、同一の手術を行う。
- 温度制御システムを使用して直腸温度を測定し、自動加熱パッドで手術中の温度を~37°Cに維持します。
- レーザードップラー流量測定を使用して、ドップラープローブを外側頭蓋骨(MCA領域に対応)に配置し、値8を記録することにより、縫合糸挿入前に脳血流を測定します。ベースラインの脳血流の15%への閉塞の減少を確認するには、縫合が進んだ後に同じ手順を使用します。再灌流を確認するには、縫合糸を取り外した後も同じ手順を使用します。
- 動物は脳卒中後の飼育不足があるため、慢性エンドポイントに十分な栄養を確保するために、犠牲までおよび/または手術後1週間まで、すべての動物に湿ったマッシュを与えます。
- EMS手術
- MCAoの60分後、マウスをMCAoのみまたはMCAo + EMSグループにランダム化します。MCAo(MCAo + EMSグループ)または一部の実験(EMSのみのグループ)の偽手術の4時間後にEMSを実行します。手術前に新しい滅菌手術用手袋に交換してください。
注:マウスはMCAoの60分後に麻酔から回復し、EMS手術の前に再麻酔されました。 - EMSを受けるグループ(MCAo + EMSまたはEMSのみのグループ)の場合は、ハサミで10〜15 mmの皮膚切開を行い、1〜2 mmの吻側から右耳、1〜2 mmの尾から右目まで伸ばします。
注:滅菌ハサミは、下の側頭筋への偶発的な損傷を防ぐために使用されました。 - クランプを使用して皮膚フラップを引っ込め、側頭筋と頭蓋骨を視覚的に識別します。
- 側頭筋を頭蓋骨から鈍く解剖し、はさみを使用して広げます。腹側反射を促進するために、筋肉の尾側の境界に沿って腹側に向けられた2〜3 mmの筋切り術を実行します。
- マイクロドリルを使用して、反射側頭筋の下の頭蓋骨で直径~5mmの開頭術を行います。
- ピンセットで硬膜を取り除き、脳の眼底面を露出させます。脳への偶発的な損傷を避けるために細心の注意を払ってください。
- 側頭筋の背側境界を背側皮膚皮弁の皮下組織に6-0本のモノクリルフィラメントで縫合し、露出した大脳皮質と同じ高さにします。
- 6-0モノフィラメント縫合糸で皮膚切開を閉じます。マウスをケージに戻し、麻酔から回復するまで監視します。マウスを住宅施設に戻します。
- MCAoの60分後、マウスをMCAoのみまたはMCAo + EMSグループにランダム化します。MCAo(MCAo + EMSグループ)または一部の実験(EMSのみのグループ)の偽手術の4時間後にEMSを実行します。手術前に新しい滅菌手術用手袋に交換してください。
3.術後の考慮事項
- マウスの病気と手術部位の感染を毎日監視します。水分補給をサポートするために、皮下生理食塩水(体重1%)を毎日与えます。.
- 手術後7日まで重度の脱水症(体重減少>20%)を監視します。>20%体重減少の場合は体重で1%容量の皮下生理食塩水の追加ボーラスを投与する。
- 注射、生理学的モニタリング、およびその他のテストは、特別な考慮なしに進めてください。
注:この手順では、手術後の治療にオピオイドまたは非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)を使用することは、社内の施設動物ケアおよび使用委員会15,16,17,18と協議して、脳卒中の結果または梗塞のサイズに対するこれらの薬剤の既知の効果のために回避されました。ただし、他のモデルとのEMS手術には、術後鎮痛の使用が強く推奨されます。これについては、施設動物管理使用委員会(IACUC)にご相談ください。
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Representative Results
合計41匹のマウスをこの研究に使用しました。MCAoにおける1匹およびMCAo+EMSにおける2匹の3匹の死亡後、合計38匹のマウスを、示された結果を得るために使用した。
統計学
各実験のデータは、平均±標準偏差(S.D.)として表されます。有意性は、2つのグループを比較するための対応のないスチューデントのt検定または2つ以上のグループに対する一元配置分散分析のいずれかを使用して決定され、多重比較を補正するためのNewman-Keuls事後検定が使用されます。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(還元)-テトラゾリウムレダクターゼ(NADH-TR)染色
この染色は、Turocziら19のように移植された筋肉の長期的な生存率を評価するために行われました。簡単に説明すると、屠殺時に、移植された筋皮弁を注意深く切除し、4%パラホルムアルデヒドで30分間固定し、-80°Cの最適切断温度(OCT)培地で凍結保存した。 側頭筋組織の厚さ12 μmの凍結切片をNADH-TR酵素組織化学反応のために染色しました。スライドを、0.05 M トリス緩衝液(pH 7.6)中のニトロブルーテトラゾリウム(1.8 mg/dL)およびNADH(15 mg/dL)の溶液中で37°Cで30分間インキュベートしました。未使用のテトラゾリウム試薬は、アセトンの濃度を増やしてから減少させることを使用して除去しました。NADH-テトラゾリウム染色筋の定量的評価は、40倍の倍率で撮影された筋肉画像に対して行った。
免疫染色試験
免疫染色を使用して、皮質との筋移植結合と、筋肉と皮質の接合部での血管密度を視覚化しました20,21。脳組織との筋肉結合の可視化には、EMS手術を受けたマウスを用いた。それぞれの時点の終わりに、マウスをアベルチン注射(50 mg / kg体重)で麻酔し、続いて5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む1x PBSで灌流し、4%パラホルムアルデヒドで固定しました。頭蓋骨は、脳皮質からの側頭筋(商標)移植片の偶発的な剥離を防ぐために注意深く切断された。次に、脳皮質上のTM移植片を残りの側頭筋から分離した。脳を注意深く取り出し、4%パラホルムアルデヒドで一晩後固定した。次に、固定された脳を1x PBS中の30%スクロースで脱水し、脳がバイアルの底に沈むまで(約1〜3日)。30μmサイズの組織切片を凍結ミクロトームで切断し、スライドに取り付けた。
同側脳皮質の血管の免疫染色のために、MCAoおよびMCAo+EMSマウスを屠殺し、灌流し、固定し、上記のように処理した。30μmサイズの脳スライスを凍結ミクロトーム上で切片化し、ガラス側に取り付けた。抗原賦活化はクエン酸緩衝液(pH 6.0)を用いて行い、切片をブロッキング緩衝液とともにインキュベートした後、一次抗体、抗アルファ骨格筋アクチン1:200、およびLectin-Dy59421,22を用いて一晩インキュベートした。マウスあたり3つの冠状脳切片(n = 5匹/グループ、合計= 15切片)をブレグマから0.45 mmから0.98 mmの間で採取し、染色し、虚血性コアと半影領域の接合部で20倍の倍率で定量化するために視覚化しました。盲検観察者は、ImageJソフトウェアを使用して脳実質のレクチン陽性血管密度を定量化しました。
筋移植はEMS後21日で生存可能なままです
この手術を成功させるための前提条件の1つは、移植された側頭筋の長期的な生存能力です。TM移植片は、移植された筋肉と対照筋で手術後7日目に筋細胞の一時的な損傷を示しました(71.32%の筋細胞の生存±16.64%対97.19%±3.81%)。しかし、移植された筋肉と対照の筋肉のこの差は消え、筋肉は手術後21日で完全に回復しました(98.22%±3.965対96.87%±2.27%; 図2A)。
筋肉移植は脳組織との緩い結合を作ります
側頭筋の脳皮質表面への移植の成功は、このモデルの成功のための最も重要な要件です。EMS + MCAoモデルとEMSのみモデルの両方で、側頭筋移植はEMSの21日後に皮質表面に接着し、手術、移植片移植、および接着が成功したことを示唆しています(図1Bおよび図2B)。
EMS後の病変周囲皮質の血管密度の増加
急性脳卒中は、脳血流の急激な減少、側副血管の動員の妨げ、異常な血管発芽、および機能不全の血管新生につながり、脳卒中の結果の低下に寄与します23。EMSは、脳卒中後の病変周囲皮質の血管表面積と統合密度を有意に増加させます(p < 0.05対MCAoのみ; 図3)。
血管新生および神経調節タンパク質の分析
マウス血管新生アレイを使用して、MCAoのみのMCAoマウスとMCAo+EMSマウスのMCAoの7日後および21日後の血管新生および神経調節タンパク質の発現を製造元の指示に従って比較しました24。ImageJソフトウェアを使用して、タンパク質ドットブロットの各データポイントのピクセル密度を定量化しました。データは、各ブロットの標準の平均密度に対する各分析タンパク質の密度の比として記録した。
線維芽細胞増殖因子(FGF)酸性はEMS後にアップレギュレーションされ、オステオポンチンはダウンレギュレーションされます
タンパク質アレイの結果は、強力な血管新生因子であるFGF酸性のタンパク質レベルの有意な増加(0.677 ± 0.007 vs 0.585 ± 0.014、p = 0.045)と、炎症状態で発現する多機能分子であるオステオポンチンレベルの低下(0.692 ± 0.007 vs 0.758 ± 0.014、p = 0.048)を示し、血管新生と神経保護の改善を示唆しています(図4A)。
脳卒中後のEMSの死亡率転帰
MCAoとEMSはどちらも侵襲的な外科技術であり、マウスにいくらかの死亡率を引き起こす可能性があります。この実験では、MCAo手術後21日目のマウスの死亡率は10%〜11%であり、これはMCAo14の60分を受けたマウスの許容死亡率です。MCAo後にマウスにEMSを実施しても死亡率は増加せず(図4B)、MCAo後もEMS手術の耐性が示唆されました。
図 1.中大脳動脈閉塞(MCAo)後の段階的EMS手順:(A)ステップ1。皮膚切開は右中大脳動脈領域に対して行われます。皮膚と皮下組織が反射し、頭蓋骨と側頭筋が露出します。ステップ2.側頭筋は頭蓋骨から離れて解剖され、腹側に反射します。ステップ3.開頭術が行われ(4〜5 mm)、硬膜が穏やかに除去されます。ステップ4.側頭筋は、露出した皮質を覆うために脳表面に直接配置されます。ステップ5.側頭筋の背側縁は、脳表面と同じ高さの背側皮膚フラップの皮下組織に縫合される。ステップ6。切開部を閉じ、マウスを麻酔から外してケージに戻す。図のこの部分は25から変更されています。(B)MCAo誘発性脳卒中の脳筋シナジア症(EMS)治療の概念図。略語:FGF =線維芽細胞成長因子。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.免疫染色研究。 (A)側頭筋移植は生存能力を維持します。虚血皮質組織上の側頭筋移植(EMS)は、高い生存率を維持します。(写真左)中大脳動脈閉塞(MCAo)+脳筋結合症(EMS)手術後7日目のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(還元)-テトラゾリウムレダクターゼ染色筋肉組織細胞(反対側からのナイーブ筋)および移植筋の代表的な画像。黒い矢印()は損傷した細胞を示す。(右)生/死筋細胞の定量化。EMS後7日目の筋細胞は、軽度の損傷(p < 0.1;t検定)を示し、21日目に完全に回復しました。(n = 5匹/時点=このグループの合計10匹)データは平均± S.D.スケールバー= 20μmです。 (B)EMS手術の21日後に移植された側頭筋と脳皮質の結合。抗アルファ骨格筋アクチン(緑)およびレクチン-Dy594(赤;血管マーカー)抗体で染色したEMS組織(n=3匹)。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脳筋結合症(EMS)手術は、脳卒中の21日後に虚血性病変の血管密度を増加させます。 (A)(左)中大脳動脈閉塞(MCAo)または(右)MCAo+EMSを施し、内皮細胞の基底膜の糖タンパク質に結合するL.esculentum(トマト)レクチン-Dy594で染色したマウスの冠状脳切片の代表的な画像。グラフは定量化された領域です。MCAo+EMSマウスは、血管画分面積(B)および集積密度(C)のパラメータを用いて、より高い内皮ネットワークを示した。**p < 0.01(対応のないt検定)が、MCAoのみのマウスは虚血性病変に近い損傷を示した(破線)。N = 5匹/グループ= 合計10匹。データはS.D.スケールバー= 100μm±平均です。 略語:コントラ=反対側。イプシ=同側。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:脳筋結合症は脳卒中後の血管新生タンパク質を調節します 。 (A)マウス血管新生アレイ(ARY015)を用いて、病変周囲皮質からの脳組織溶解物における中大脳動脈閉塞(MCAo)およびMCAo+EMS(MCAo後21日目)後の53のマウス血管新生関連タンパク質の相対レベルを同時に評価しました。定量分析の結果、EMS手術は、同側MCAoと比較して、脳卒中後のオステオポンチンを有意に減少させ、線維芽細胞増殖因子(FGF)酸性タンパク質を増加させました(*p < 0.05または**p < 0.01)。データはSD±平均です。n = 3匹のマウス/グループ/時点=合計15匹のマウス。(B)EMSは脳卒中後の死亡率を増加させなかった(MCAo)。カプランマイヤー生存曲線は、EMS + MCAOが脳卒中後の死亡率をMCAO単独と比較して変化させなかったことを示しています(p = 0.54)。EMS n = 3 の場合。MCAo n = 11の場合。MCAo + EMS n = 21 の場合。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、MCAo誘発脳卒中のマウスモデルにおける成功したEMS手順について説明しています。データは、移植された組織が生存可能なままであり、EMS手術後もずっと脳皮質と結合を形成する可能性があることを示しています。これらの知見は、脳卒中部位に血管栄養環境を徐々に発達させるために脳筋移植を使用する理論的根拠を支持している。EMSは、同じ環境で梗塞した大脳組織を修復する可能性のある有望な治療法です。
プロトコルの重要なステップは、ステップ2.2.4を含む:このステップは、TMに避けられない外傷を引き起こし、皮質と結合し、栄養因子を放出する能力を低下させる可能性がある。TMトラウマを可能な限り制限するように注意してください。組織外傷を軽減するための代替戦略は、頭蓋骨の背側境界でのみTMを鈍く解剖し、筋切開を控えることです。この場合、TMは(完全に反射されるのではなく)頭蓋骨から持ち上げられ、開頭術は筋肉の下の開頭ドリルで行われます。これにより、このステップを実行するために利用できるスペースの量が減少しますが、TMトラウマが軽減される可能性があります。さらに、ステップ2.2.5および2.2.6では、開頭術および硬膜の操作中の下にある脳皮質の損傷を防ぐために、細心の注意と実践が必要です。
このEMSモデルは、定評のあるMCAoモデルの自然な付属物です。MCAoモデルは、ヒト患者に共通する虚血および血管網損傷の病態生理学を厳密にシミュレートするため、MCAo+EMSモデルはヒトへの翻訳可能性が高い可能性が高い。ここで紹介するEMSモデルは、自家組織のみに依存する前臨床環境で虚血性脳卒中について研究された最初の治療介入です。さらに、TM移植片は有機的で自家であるため、さまざまな時点で栄養因子の放出を最適なレベルに調節するのに役立つ隣接する損傷した脳とのパラクリンシグナル伝達相互作用を示す可能性があります。
脳卒中は血管新生促進環境を作り出し、血管新生自体を刺激するが26、脳卒中後の固有の応答は、血管新生因子の閾値以下のレベルのために損傷領域における血管供給を改善するのに十分ではない。ここで、EMSは脳卒中のみの動物と比較してFGF酸性タンパク質発現をさらに増強した。このタンパク質は、他の成長因子と連携して血管新生を間接的に制御します。FGF酸性は神経栄養因子としても機能し、神経保護と神経新生を促進します27,28。FGF酸性の神経保護効果のいくつかは、AKTおよびMAPK/EPK経路の活性化によって媒介される29。FGFに加えて、タンパク質オステオポンチンの発現も低下した。オステオポンチンは炎症誘発性の多斜視性サイトカインであり、他の機能の中でもとりわけ、複数の神経病理学および組織リモデリングプロセスにおけるその役割についてますます認識されています。脳卒中におけるオステオポンチンの役割はまだ不明です30。しかし、ヒトにおける最近の研究では、脳卒中後の予後不良因子としてオステオポンチンが指摘されています。脳卒中後の血清オステオポンチンレベルの低下は、脳卒中31のヒト患者における好ましい転帰(修正ランキンスケールスコア<90日目の2)を予測するために1つの研究で示されました。別の研究では、脳卒中後のヒト患者における高レベルの血漿オステオポンチンと死亡および障害の結果との間に用量依存的な関係が示されました32。これらの臨床研究に沿って、ここでのデータは、EMS後のオステオポンチンの減少が抗炎症環境を促進して血管形成を増加させる可能性があることを示唆しています。全体として、FGF酸性とオステオポンチンの差次的発現は、このマウスモデルにおけるEMS後の血管新生を支配するメカニズムを指し示しており、血管新生に加えて神経保護と神経再生ももたらすことができる手順の可能性を高めます。
この手順には、いくつかの潜在的な制限があります。レーザードップラーまたはレーザースペックル流量計の一般的に使用される手順は、皮質上部の側頭筋の存在によって影響を受け、皮質表面での真の血液測定を妨げるため、血管密度の増加による脳の流れの測定はこの手順では困難です。したがって、この手順では、リアルタイムの流量測定が必要な場合は、より洗練された、しかしめったに利用できない小さなげっ歯類MRIスキャンが必要になる場合があります。しかし、血管密度測定の使用は、私たちのデータによって示唆されているように、血管新生を改善するEMS手順の成功を間接的にサポートします。別の制限は、MCAoの上部でのEMS介入の侵襲的な性質であり、それ自体が侵襲的な手順です。この研究では、MCAoのみと比較してEMSによる死亡率の増加はありませんでしたが、片側開頭切除術の要件により、すべてのタイプの脳卒中に対する将来の翻訳可能性が制限される可能性があります。しかし、臨床診療では、大きな虚血性脳卒中患者の>10%が頭蓋内圧の上昇を管理するために片頭蓋切除術を必要とし23、このEMSモデルは、特に脳卒中患者のこのサブグループに対して翻訳値を有する可能性がある。最後に、EMSのパフォーマンスのMCAo後4時間の時点は、ほとんどのヒト患者のrT-PAの標準治療ウィンドウ内に収まるように選択されましたが、将来の研究では、EMSの治療ウィンドウを評価するために後の時点を使用します。
全体として、EMSモデルは、虚血性脳卒中後の血管新生を誘導するための忍容性の高いオプションを提供し、その潜在的な臨床翻訳に加えて、脳卒中および血管新生の病態生理学を調べる将来の研究で使用される可能性があります。
ここで説明するEMSモデルは、前臨床試験で脳血管新生を達成するための安全な方法を提供し、望ましくない副作用や制御不能な血管新生につながることが多い薬理学的介入の必要性を排除します。大きな虚血性脳卒中の多くの患者は、頭蓋内圧の上昇を管理するために、臨床経過中に片頭蓋摘出術を必要とします。このEMS手順は、筋移植のためのマウスの片頭切除術も含み、虚血性脳卒中におけるEMSの翻訳適用のための前臨床概念実証を提供する可能性があります。したがって、このモデルは、虚血性脳卒中後の神経血管回復の知識を拡大し、脳卒中生存者のための治療法における時間の必要性であるイノベーションの開発を促進する可能性を秘めています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、Research Excellence Program-UConn Health(Ketan R BulsaraとRajkumar Vermaへ)とUConn Healthのスタートアップ(Rajkumar Vermaへ)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 monocryl suture | Ethilon | 697G | |
| 70% ethanol to sanitize operating surface | Walgreens | ||
| Bupivacaine 0.25% solution | Midwest Vet | ||
| Clamps for tissue retraction | Roboz | ||
| Doccal suture with silicone coating | Doccal Corporation | 602145PK10Re | |
| Electric heating pad for operating surface | |||
| Isoflurane anesthesia | Piramal Critical Care Inc | ||
| Isoflurane delivery apparatus | B6Surgivet (Isotech 4) | ||
| Micro drill | Harvard Apparatus | ||
| Microdissecting tweezers, curved x2 | Piramal Critical Care Inc | ||
| mouse angiogenesis panel arrat | R& D biotech | ARY015 | |
| Needle driver | Ethilon | ||
| Ointment for eye protection | Walgreens | ||
| Operating microscope | Olympus | ||
| Operating surface | Olympus | ||
| Povidone iodine solution | Walgreens | ||
| Rectal thermometer | world precison instrument | ||
| Saline or 70% ethanol for irrigation | Walgreens | ||
| Small electric razor to shave operative site | Generic | ||
| Surgical scissors | Roboz |
References
- Stroke,
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
- Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
- Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
- Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
- Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
- Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
- Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
- Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
- Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
- Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
- Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
- Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
- Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
- Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
- Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
- Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
- Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
- Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P.
- Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
- Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
- Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
- Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
- Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
- Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
- Meller, R., et al.
- Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
- Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).
